ENCUENTRO INTERNACIONAL EN FITODEPURACIÓN (Julio del 2005, Lorca) INTERNATIONAL MEETING ON PHYTODEPURATION (July 2005, Lorca, Murcia, Spain)

TÍTULO DEL TRABAJO “La biorremediación como medida correctora en los impactos ambientales de agua contaminada con metales pesados.” TÍTULO RESUMIDO “La biorremediación como medida correctora en los impactos ambientales de agua contaminada” NOMBRE DE AUTORES P. Arroyo*, G. Ansola, E. de Luis Calabuig, NOMBRE Y DIRECCIÓN DE LAS INSTITUCIONES Instituto de Medio Ambiente, Dpto. de Ecología, Universidad de León, C/ La Serna 56, 24007 León, NÚMERO DE TELÉFONO, FAX Y E-MAIL Tf: 98238001; e-mail: [email protected]. FIGURAS Y TABLAS

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LA BIORREMEDIACIÓN COMO MEDIDA CORRECTORA EN LOS IMPACTOS AMBIENTALES DE AGUA CONTAMINADA CON METALES PESADOS. P. Arroyo*, G. Ansola, E. de Luis Calabuig, Instituto de Medio Ambiente, Dpto. de Ecología, Universidad de León. RESUMEN La Biorremediación es el empleo de organismos vivos para degradar y transformar contaminantes tanto en ecosistemas terrestres como acuáticos. El objetivo de este trabajo ha sido estudiar el comportamiento de un sistema formado por un sustrato, una planta y los microorganismos asociados a su rizosfera, en relación a su eficacia para la descontaminación de aguas con metales pesados (arsénico y zinc). Se ha trabajado con diferentes sustratos, flujos y caudales. Además de estas variables abióticas, se ha estudiado la eficacia de diferentes macrófitos y se determinó la población bacteriana asociada a la rizosfera de las plantas. La eliminación de Zinc es mucho más efectiva que la del Arsénico. Así mismo, la eliminación de metales pesados es más eficaz en los sistemas de depuración en presencia de los macrófitos. En relación a la población bacteriana, el 84% de pertenece al Reino de las Proteobacterias. El 16% restante de la población se incluyen dentro del reino de los Bacteroidetes. PALABRAS CLAVE: Arsénico, Zinc, descontaminación de agua, población bacteriana. ABSTRACT Bioremediation is the direct use of living organism, such us microbes and green plants for in situ, or in place, reduction for contaminated soil and water ecosystems. Bioremediation has a great potential for reducing environmental contamination. The aim of this study was to investigate the treatment efficiency of different media with different adsorption capacities, different flows and levels in order to reduce water contamination. And it is characterized the treatment efficiency of different macrophytes. Moreover, in the present study, we investigated the bacteria associates to the rizosphere of the plants which have an important role in the treatment of water pollution. Zinc reduction has been much more effective than Arsenic reduction. And heavy metal reduction has been more effective using macrophites. Additionally, 84% of the bacteria presented in the simple are included in the Kingdom of the Proteobacterias. El 16% restante de la población bacteriana son Bacteroidetes. KEYWORDS: Arsenic, Zinc, water descontamination, bacteria.

1. INTRODUCCIÓN Los humedales son ecosistemas caracterizados por la presencia de plantas hidrófilas como juncos, carrizo, eneas y otras. El Convenio de Ramsar define los humedales como: "Son humedales las extensiones de marismas, pantanos y turberas, o superficies cubiertas de agua, sean éstas de régimen natural o artificial, permanentes o temporales, estancadas o corrientes, dulces, salobres o saladas, incluidas las extensiones de agua marina cuya profundidad en marea baja no exceda de seis metros" (Artículo 1.1 de la Convención). Los humedales se encuentran entre los ecosistemas más productivos del mundo. Proporcionan el soporte de agua y productividad primaria de la cual dependen para su supervivencia un número incontable de especies de plantas y animales. Son una alternativa más barata económicamente que los tratamientos tecnológicos como los fangos activos o los filtros (M. Scholz y J. Xu, 2001). Los humedales artificiales se han empleado ampliamente para el tratamiento de aguas residuales urbanas. Así mismo, se han aplicado al tratamiento pasivo de contaminación difusa incluyendo los drenajes ácidos de minas. Su capacidad para eliminar metales de drenajes

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ácidos de minas ha sido ampliamente documentado (E. Stoltz y M. Greger, 2001; M. Leblanc, et al, 2002). Además, los humedales junto con su importante función de hábitats para la vida silvestre pueden ser usados como áreas recreacionales. Como señala P.L.Younger (2003), uno de los principales intereses del empleo de los humedales artificiales como sistema de tratamiento de aguas contaminadas es la posibilidad de integrarlos en el paisaje y conseguir una buena conexión con los ecosistemas presentes en la zona. Los humedales son un complejo sistema de plantas, microorganismos y sustrato que juntos funcionan como un filtro biogeoquímico. Las plantas de estos humedales juegan un importante papel en esta actividad de depuración (Quian, et al, 1999). Los macrófitos acuáticos son uno de los principales componentes en la mayoría de los humedales de tratamiento de aguas contaminadas. Los sistemas de depuración basados en macrófitos consisten generalmente en un monocultivo o policultivo de macrófitos, dispuestos en tanques, lagunas o zanjas poco profundas y con un tiempo de retención superior al de los sistemas convencionales (Ansola, 2003). La elección del tipo de planta depende de su adaptabilidad al clima de la región, de su capacidad de transporte de oxígeno de la superficie a la rizosfera, de su tolerancia a altas concentraciones de contaminantes así como de su capacidad para asimilarlo, de su alta presencia en la zona donde se va a instalar el sistema, de la facilidad para recolectarlas y posterior transporte y su fácil autogeneración (Ansola, 2003). La eliminación de metales pesados en humedales es el resultado de diferentes procesos biogeoquímicos, que incluyen procesos aeróbicos y anaeróbicos en la columna de agua, en la superficie de plantas vivas y en descomposición y en el sustrato (A. Sobolewski, 1999). Además, esta eliminación se debe principalmente a procesos microbiológicos (V.I. Groudeva, S.N. Groudev, A.S. Doycheva; 2000). Los drenajes ácidos de minas son un problema ambiental de primer orden. Es necesario investigar para conseguir una adecuada gestión de los mismos reduciendo o en su caso minimizando su impacto ambiental. Se trata de aguas que, en su mayor parte, presentan altas concentraciones de diferentes metales pesados (Fe, Cd, As, Zn, Cu, S,…) resultado de los procesos de extracción y tratamiento del mineral. 2. MATERIAL Y MÉTODO Se ha diseñado y construido una planta piloto experimental para el desarrollo de este trabajo. Dicha planta está situada en el Instituto de Medio Ambiente de la Universidad de León. Consta de una serie de cubetas de PVC constituyendo cada una de ellas un ecosistema y una unidad experimental. El diseño experimental es de tipo factorial. El número de unidades experimentales es de 8 con tres réplicas para cada unidad, lo que hace un total de 24 unidades experimentales. Estas unidades se disponen entremezcladas de forma aleatoria sistemática. (Figuras 1 y 2) La planta se ubica en la fachada sur del edificio. Las condiciones de insolación, temperatura y humedad son las mismas para todas las unidades experimentales.

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En la primera fase del estudio los factores o variables con los que se ha trabajado son el caudal (1 ml/min y 2 ml/min), el flujo (subsuperficial y superficial) y el tipo de sustrato (arlita y grava silícea). Se emplean dos sustratos inertes muy diferentes entre sí. La arlita, arcilla expandida con una estructura altamente porosa (46 % de porosidad) que se fabrica a partir de arcilla pura, el tamaño de las partículas oscila en un rango de entre 1 y 2 cm. Y gravas silíceas con un rango de tamaños entre 1 y 2 cm al igual que la arlita. 12 de las cubetas tienen un flujo superficial. Se han rellenado con grava o arlita hasta una altura de 35 cm y tienen la salida de efluente a una altura de 55 cm, lográndose así un flujo superficial. Las otras 12 se han rellenado con sustrato hasta 55 cm de altura, presentando un flujo subsuperficial, con entrada por la parte superior y salida por la parte inferior. Se ha trabajado con agua sintética a la que se ha añadido arsénico (V) y zinc con una concentración media de 20 ppm y 15 ppm respectivamente. En la primera fase el sistema ha funcionado sin macrófitos para conocer la influencia en la depuración del tipo de sustrato (arlita y grava silícea). Así como la importancia de las otras dos variables antes señaladas, el tipo de flujo y el caudal. Las muestras de agua se han recogido en botes de polipropileno y se ha filtrado inmediatamente a través de filtros de 0,47 micras. Estas muestras han sido acidificadas con ácido nítrico. Los elementos considerados, arsénico y zinc, se ha analizado por ICP. En la Figura 1 se muestra el sistema en esta primera fase con las 24 cubetas, los distintos flujos, caudales y sustratos. 1 ml / min

2 ml / min

Altura cubeta: 60 cm

Altura cubeta: 60 cm

Diametro: 16 cm

Diametro: 16 cm

Flujo Superficial: Altura sustrato 35 cm Lamina de agua 55 cm

Flujo Superficial: Altura sustrato 35 cm Lamina de agua 55 cm Flujo Subsuperficial: Altura sustrato 55 cm

Flujo Subsuperficial: Altura sustrato 55 cm

Arlita

Arlita

1 ml / min

2 ml / min

Grava silícea

Gravasilícea

1 ml / min

1 ml / min

1 ml / min

1 ml / min

1000 litros

1000 litros 1000l

Figura 1. Esquema de la planta piloto.

l 0001

Figura 2. Esquema de la planta, fase 2.

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En la segunda fase del experimento (Figura 2) se ha plantado aleatoriamente 1 individuo de Typha latifolia en 12 mesocosmos, de manera que hubiera 12 microecosistemas como controles y 12 con vegetación. Se ha eliminado la variable del caudal y en este experimento sólo se ha trabajado con un caudal de 2 ml/min. Se ha añadido al tanque de agua un fertilizante NPK 18+11+18 (Universol, Water Soluble Fertilizer, 3:2:3). De forma que por cada 1000 litros de agua se añade 1 kg de dicho fertilizante. A nivel del funcionamiento de los componentes del sistema, se ha determinado la población bacteriana asociada a la rizosfera de las plantas. Para ello se ha realizado una extracción directa del ADN genómico mediante cloruro de bencilo y posterior eliminación de residuos orgánicos con cloroformo. A continuación, mediante la técnica de la Reacción en cadena de la polimerasa, y empleando los primers universales 27f y 90r, del gen ribosomal 16s, se amplifica simultáneamente el gen ribosomal de las diferentes especies presentes en la muestra. Se aislaron los amplificados de las distintas especies por su clonación en el vector pGEM. Los vectores recombinantes se utilizaron para la transformación de células competentes de E.coli. Colonias transformantes asiladas fueron utilizadas para la secuenciación de los insertos. La secuenciación se realizó en el Servició Automatizado de Secuenciación de la Universidad de León. Las secuencias obtenidas sirvieron para la identificación de las bacterias mediante su análisis comparativo con la base de datos E.M.B.L.

Figura 3. Representación esquemática del proceso seguido para la identificación de las bacterias asociadas a la rizosfera de las plantas.

3. RESULTADOS Y CONCLUSIONES El tratamiento estadístico de los datos muestra como en los meses de abril y mayo no existen diferencias significativas en la eliminación de zinc. En el caso del arsénico no existen diferencias significativas en abril. Esto se debe a que es sistema estaba en fase de inicio y estabilización. Con el paso del tiempo, y ya en el mes de junio, está probado estadísticamente que existen diferencias significativas y una clara interacción entre las variables tiempo y tratamiento. Tabla 1 y 2. Porcentaje de reducción (afluente-efluente) de Arsénico (V) y Zinc. Se calcula con la media de las tres réplicas para cada microecosistema. A: arlita, G: grava, FS: flujo superficial, FSS: flujo subsuperficial, 2: caudal de 2ml/min, 1: caudal de 1ml/min. % de Reducción media de As, Sin vegetación Microecosistema 2AFS 2GFS 2AFSS 2GFSS 1AFS 1GFS 1AFSS 1GFSS

Abril Mayo Junio Junio 30,62 16,86 11,73 42,31 14,55 12,01 58,65 30,72

4,08 7,11 23,10 23,07 29,02 19,53 43,40 24,67

2,39 6,77 3,44 3,41 8,31 2,41 1,93 7,91

8,43 2,12 5,97 7,16 5,66 5,86 7,72 11,36

% de reducción media Zn, Sin vegetación Microecosistema 2AFS 2GFS 2AFSS 2GFSS 1AFS 1GFS 1AFSS 1GFSS

Abril Mayo Junio Junio 53,25 43,91 8,98 41,23 40,37 37,43 44,88 37,53

1,52 11,99 66,72 4,34 2,67 64,04 2,83 19,56 30,00 58,18 29,68 30,99 21,29 54,87 21,52 2,91 22,76 19,16 50,20 50,20 13,99 58,51 48,63

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Se observa que el rendimiento va disminuyendo a lo largo del tiempo, se colmata el sustrato y no existe ningún tipo de extracción del metal del sistema. Durante la segunda fase del experimento Typha latifolia ha desempeñado un importante papel en la eliminación de los metales pesados, reduciéndose de forma significativa las concentraciones tanto de arsénico como de zinc, en este segundo caso de forma más notable. En el caso de la eliminación de Zinc existen diferencias significativas a lo largo de los diferentes muestreos, pero no entre tratamientos ni en la interacción tiempo-tratamiento. En la eliminación de Arsénico con la presencia de macrófitos en el sistema, sucede como para el Zinc. Existen diferencias significativas a lo largo de los diferentes muestreos, pero no entre los distintos tratamientos. El ciclo biológico de los macrófitos empleados es una explicación de estos resultados. Si consideramos el porcentaje de reducción tanto del zinc como del arsénico, vemos como en el primer muestreo, el último de junio, es cuando esta reducción es mayor. Se trata del momento en el cual las eneas están en pleno crecimiento vegetativo. Tabla 3. Porcentaje de reducción (afluente-efluente) de Arsénico. Se calcula con la media de las tres réplicas para cada microecosistema. CV: con vegetación, SV: sin vegetación. % de Reducción media de As Microecosistema 2AFSCV 2GFSCV 2AFSSCV 2GFSSCV 2AFSSV 2GFSSV 2AFSSSV 2GFSSSV

Junio

Julio

Julio

Julio

Agosto

Agosto

29,56 12,08 23,78 0,26 16,71 20,83 15,63 16,20 10,09 47,56 15,85 19,46 4,94 5,05 13,46 6,60 19,99 11,91 31,19 11,57 11,74

5,88 6,42 8,29 3,21

11,26 6,93 8,45 6,49 11,26 11,04 10,39 1,73

8,91 5,33 9,74 14,00 5,94 7,61 7,46 4,72

3,48 0,27

Tabla 4. Porcentaje de reducción (afluente-efluente) de Zinc. Se calcula con la media de las tres réplicas para cada microecosistema. CV: con vegetación, SV: sin vegetación.

% de reducción media Zn Microecosistema 2AFSCV 2GFSCV 2AFSSCV 2GFSSCV 2AFSSV 2GFSSV 2AFSSSV 2GFSSSV

Junio Julio 77,51 88,36 66,45 73,92 42,89 43,68 73,13 67,60

26,57 29,62 39,36 78,51 36,55

Julio

40,72 59,96 10,86 23,47 42,02 29,52 7,02 60,58 45,07

Julio Agosto Agosto 31,54 44,89 24,44 35,71 6,67 29,59 59,37 60,08

44,20 60,59 29,28 58,48 11,33 24,70 44,16 37,93

44,86 5,84 9,30 31,68 19,02 22,51 37,30

La eliminación de Zinc es en cualquier caso mucho más efectiva que la del Arsénico. Estos resultados concuerdan con los de otros trabajos realizados, como el de Stolz y Greger (2001) que miden la concentración de Zn y As en distintas partes de las plantas. En este estudio se refleja como para diferentes especies vegetales y distintas partes de las mismas la concentración de Zn es siempre mayor que la de As.

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No se han encontrado diferencias significativas entre los dos sustratos utilizados, con la excepción de un único caso, con un flujo superficial y caudal de 1 ml/min, sin vegetación. Tampoco existen diferencias significativas entre el empleo de flujo superficial y subsuperficial, con la excepción del uso de 1ml/min de caudal, y sustrato gravas. Tabla 5. t de Student. A: arlita, G: grava, FS: flujo superficial, FSS: flujo subsuperficial, 2: caudal de 2ml/min, 1: caudal de 1ml/min, CV: con vegetación, SV: sin vegetación. Arsénico 1AFSS-1GFSS 2AFSS-2GFSS 1AFS-1GFS 2AFS-2GFS

Zinc P(T