Enzimología - Inhibidores

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Inhibición reversible La inhibición de la actividad enzimática es un proceso de enorme importancia biológica. Muchos caminos metabólicos son regulados a través de la inhibición selectiva de una o más de las enzimas que los componen. Además de este efecto fisiológico, la inhibición puede presentar efectos perjudiciales, en el caso de muchas intoxicaciones, o beneficiosas, en el caso de los medicamentos que se comportan como inhibidores. Precisamente el uso terapéutico de los inhibidores es un estímulo para el estudio a fondo de los procesos de inhibición de enzimas. La inhibición es la disminución de la actividad enzimática por algún agente químico, un ligando, a diferencia de la desnaturalización, que es el cese permanente de la actividad enzimática por un agente físico o químico. La inhibición reversible está caracterizada por un equilibrio entre la enzima y el inhibidor, definido éste por una constante de equilibrio que mide la afinidad de la enzima (E) por el inhibidor (I). La inhibición reversible implica que desaparece el efecto inhibitorio si se remueve el inhibidor, y que va a existir inhibición en su presencia en un grado que depende de la concentración del I. La inhibición puede apreciarse como una disminución de VMAX o aumento de Km solamente, o por una combinación de efectos sobre ambos. Inhibición competitiva a. Totalmente competitiva En la Inhibición competitiva el sustrato (S) y el I compiten por la enzima libre, pudiendo unirse uno o el otro, pero no ambos simultáneamente, hay una interacción mutuamente excluyente del S y de I con la enzima. La unión de E a I conduce a la formación de un complejo no productivo. kp k+1 E + S ∏ ES Æ E + P k-1 k+2 E + I ∏ EI k-2

La constante de disociación para el inhibidor se define como:

Ki =

[E][]I = k − 2 [EI] k + 2

Acá es claro que el grado de inhibición depende de la relación de concentración entre S e I. Eventualmente, todo el I puede ser desplazado de la enzima si se aumenta suficientemente la [S], llegando a VMAX pero a costa de una mayor [S], o sea que aumenta el valor de Km aparente (Kmapp).

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Las formas en que un I puede interactuar con una enzima para dar inhibición competitiva son varias. El ejemplo más común es el de un ligando que posee una estructura análoga, muy parecida a la del sustrato, pudiendo interactuar directamente con el sitio catalítico:

S

X I

Ejemplos de inhibidores competitivos por analogía con el sustrato:

COOH H 2C

CH2

COOH

FAD FADH2 Succinato deshidrogenasa

succinato COOH H2 C COOH

malonato

COOH

H 2N

H2N

HOOC

H2NO2S

COOH

fumarato El oxalato es un inhibidor competitivo de la succinato deshidrogenasa, una enzima del ciclo de los ácidos tricarboxílicos

Sulfanilamida

PABA

Las sulfanilamidas son antibióticos sintéticos. Son inhibidores competitivos de la síntesis de folato en bacterias (inhiben a la dihidrofolato sintetasa), uno de cuyos precursores es el ác. paminobenzoico.

Otra posibilidad es que el I cause un impedimento estérico con la unión del S uniéndose en un sitio diferente al sitio activo:

S

X I

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o bien que la unión del I cause un cambio conformacional tal que se modifique la afinidad de la E por el S. Así, estaríamos en presencia de una interacción de tipo alostérico.

S I

S

I

X

Ejemplo de este tipo de inhibidores son los acilsulfatos y acilfosfonatos que inhiben de forma alostérica y competitiva a la actividad de fosfolípido fosfatasa asociada a algunas epoxido hidrolasas. Determinación de la ecuación de velocidad

Ks kp E + S ∏ ES Æ E + P + k-1 I ∏

Ki =

Ki

[E][]I = k − 2 [EI] k + 2

EI v = kp [ES] [E]t está distribuido en 3 especies: [E], [ES] y [EI]. Por lo tanto [E]t = [E] + [ES] + [EI] dividiendo la ecuación anterior por [E]t k p [ES ] v = [E]t [E] + [ES ] + [EI] como [ES ] = [S] [E] Ks

[EI] = I [E] KI

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Entonces, pasando kp al primer miembro y reemplazando [ES] y [EI] queda:

[S] [E]

v Ks = [ S I k p [E ]t [E ] + ] [E ] + [] [E] Ks Ki Simplificando [E] y reordenando: v=

[S] * Vmax ⎛ []I ⎞ ⎜ 1 + ⎟ + [S ]

Ki ⎜ ⎝

K i ⎟⎠

Es claro de esta ecuación que al tender [I] a 0 la ecuación se convierte en la Michaelis Menten. Si E posee una alta afinidad por I, es decir una Ki baja, el efecto se logra con bajas [I]. Por otro lado, al tender [S] a ∞, el denominador tiende a ser igual a [S] y v tiende a VMAX. Es decir, a alta [S] se revierte la inhibición, alcanzando la VMAX. Los gráficos van a adoptar la siguiente forma:

v Vmax

Vmax/2

1/v

Km

Kmapp

[I1]

[S]

[]I 1 1 1 Km = + (1 + ) v Vmax Vmax K I [S ]

1/[S]

-1/Km

)

-1/Km

1+

[I1] Ki

)

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b. Parcialmente competitiva

Ks

∏ ES

E Ki

∏

∏ EI

kp Æ E+P

K´s

Ki´

∏ ESI

kp Æ EI + P

En este caso, el S y el inhibidor no son v mutuamente excluyentes del sitio catalítico, el complejo EI puede unir S (con menor afinidad) y el complejo ES puede unir I (con menor afinidad también) para dar el complejo ternario ESI. El complejo ESI parcial puede descomponerse para dar el producto, con la misma velocidad que en ausencia del I. total Da el mismo tipo de gráficos que la pura o [I] totalmente competitiva. Se distingue entre ambas graficando la velocidad obtenida a diferentes concentraciones de inhibidor y con una concentración de S no saturante. En el caso de que sea total, la inhibición a muy alta [I] lleva la actividad a 0. Si es parcial, aunque la enzima esté saturada con I, al descomponerse ESi va a haber una velocidad residual que se mantiene aunque se aumente mucho [I]. Inhibición no competitiva

No se afecta la unión de S con E, pero se ve alterada VMAX. Hay dos posibilidades: a - EIS no se descompone en EI + P y la velocidad es la que corresponde a la ruptura de ES (en este caso el efecto del inhibidor es reducir la cantidad de enzima activa). b - EIS se descompone a una velocidad menor y la velocidad es la resultante de la suma de ambas reacciones.

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a. No competitiva completamente

kp Æ E+P

k+1 ∏ ES k-1

E

∏

k-5 k+5

EI

k+4 ∏ ESI k-4

∏

k-3 k+3

De este esquema es claro que la velocidad disminuye la bajar la [ES], del cual depende la velocidad final observada. En condiciones de equilibrio existen sólo 2 constantes de equilibrio a considerar dado que, por definición, la combinación e S o I no afecta la afinidad de la enzima por el otro. Así, KS =

k -1 k − 4 = k +1 k + 4

KI =

k -3 k −5 = k +3 k +5

v = kp [ES] y k p [ES ] v = [E]t [E] + [ES ] + [ESI] + [EI]

considerando que la concentración de los complejos es:

[ES ] = [S] [E]

[EI] = I [E] KI

Ks

[ESI] = [S] [EI] = [S][]I [E] KS

reemplazando en la ecuación anterior:

v = k p [E ]t

v Vmax

[S] [E] Ks

[E] + [S] [E] + []I [E] + [S][]I [E] Ks

Ki

[S]

=

K SK i

[S] Ks = [S] + []I + [S][]I Ks(1 + []I ) + [S](1 + []I ) 1+ K s K i K SK i Ki Ki

K IK S

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[S] * Vmax /(1 + []I ) Ki v= Ks + [S] Así, llevando [I] a ∞ v tiende a 0 y esto no se puede revertir incrementando [S]. Los dobles recíprocos toman esta forma:

(1 +

[]I )

KI []I 1 1 Km = + (1 + ) v Vmax Vmax K I [S ]

1/v

)

app

1/Vmax = 1 +

[I1] Ki

[I1]

)V

max

-1/Km

1/[S]

El análisis de estado estacionario da ecuaciones que contienen el cuadrado de las concentraciones de S e I y en consecuencia los doble recíprocos no son lineales. b. Parcialmente no competitiva

Se da cuando ESI se descompone en EI + P, siendo la velocidad v = k [ES] + k´ [ESI]

E

EI

kp Æ E+P

k-5 k+5

∏

∏

k-3 k+3

k+1 ∏ ES

k-1 k+4 ∏ ESI k-4

k´p Æ EI + P

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En este caso en exceso de inhibidor la velocidad tiende a un mínimo distinto de 0. La enzima con inhibidor unido puede unir S también, pero la descomposición del complejo ESI transcurre a una velocidad menor. Inhibición mixta a. Totalmente mixta La inhibición mixta se caracteriza por gráficos doble recíprocos que se intersectan no sobre un eje sino en algún cuadrante. VMAX siempre va a disminuir, mientras que Km puede subir o bajar. Este tipo de inhibición puede aparecer por distintas razones y de varias maneras. El caso particular que se presenta aquí es el de una inhibición mixta con asociación de inhibición no competitiva pura y parcialmente competitiva para enzimas que obedecen a cinéticas de equilibrio. Se asume que están afectadas las afinidades de E y EI por el sustrato y que ESI es inactivo. KS ∏ ES

E

∏

∏

KI

kp Æ E+P

KI´

K´S ∏ ESI

EI

Este esquema es similar al observado para la inhibición parcialmente competitiva, excepto que ESi no se descompone y entonces V = k [ES] Resolviendo como antes llegamos a la ecuación: Vmax v=

Vmax KS []I []I (1 + ) + (1 + ´ ) [S] Ki KI

(1 +

o

v=

[]I )

K ´I

[]I (1 + ) KS Ki 1+ * [S] (1 + []I ) K ´I

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Los gráficos doble recíprocos muestran que las intersecciones tanto en el eje x como en el y varían con la adición de I. Los gráficos se intersectan en el segundo o tercer cuadrantes. [I3]

1/v

)

app

1/Vmax = 1 +

[I3] K´i

)V

max

> [I2] > [I1]

[I3] Esta situación se da cuando Ki´> Ki porque entonces Km se va a incrementar cuando suba la [I].

[I2] [I1]

1/[S]

1/v Ki> Ki´

1/[S] Inhibición acompetitiva

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Un inhibidor acompetitivo es aquel que se define cinéticamente como el que afecta a Km y VMAX en un mismo grado. Hay más de una manera en que esto puede ocurrir. Una de ellas aparece cuando una enzima que presenta cinética de estado estacionario posee una k-1 [I2] > [I1]

[I3] [I2] [I1]

1/[S]

En la inhibición parcialmente acompetitiva ESI puede descomponerse y los dobles recíprocos se cortan en el primer cuadrante.

1/v

1/[S]

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Determinación del valor de Ki

Se utilizan gráficos secundarios, cuyos datos provienen de los datos primarios de v vs. [S] a distintas [I]. Gráficos de Dixon

Se grafica 1/v versus la concentración de I a diferentes concentraciones de S. 100

v

[I]4

1/v

80

[I]3 60

[I]2

v2 40

S3

1/v1 1/v2

[I]1

v1 20

0 0

[S]1 [S]2

[S]3

[S]

[S]4

[I]1

-Ki

[I]2

[I]3

[I]4

[I]

En la inhibición no competitiva las líneas se juntan sobre el eje x dando el valor de KI. En la inhibición acompetitiva, se obtiene un conjunto de líneas 1/v No Competitivo

S1

Acompetitivo

1/v

S2 > S1 > S0 S0

S2 > S1

S1 S2 Soo

S2

-Ki

[I]

-Ki

[I]

paralelas que tienden a aglomerarse a medida que aumenta la [S]. El valor de KI se obtiene por aproximación trabajando con concentraciones muy altas de S.

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En la inhibición competitiva se observa una familia de rectas que se intersectan sobre el segundo cuadrante, en un punto cuya abscisa determina Ki. Al tender la [S] a ∞ la recta se hace horizontal, lo que indica que la velocidad no varía con la concentración de I, ya que la enzima se halla saturada por el S y en consecuencia no es inhibida. Así, un gráfico de las pendientes de estas rectas versus 1/[S] tiene su origen en 0.

-Ki Competitivo

1/v

S1

pendiente

S2 S2 > S1

-Ki

Soo

[I]

1/[S]

La inhibición mixta presenta cruzamiento de rectas en el segundo o tercer cuadrante, con una intersección cuya abscisa determina el valor de KI.

1/v Mixto

S1

Mixto

S2

1/v

S1

S2 S2 > S1

S2 > S1

-Ki [I]

-Ki

[I]

Si bien en algún caso puede presentarse un resultado análogo al de la inhibición competitiva, graficando la pendiente versus 1/[S] se verifica que la línea no parte del origen en este caso, dado que por más que se aumente la [S] la inhibición no desaparece totalmente y la pendiente a muy alta [S] nunca llega a ser 0.

pendiente

1/[S]

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Gráficos de Cornish Bowden

Se grafica [S]/v versus [I]. Si hubiera alguna duda usando Dixon del tipo de inhibición en el caso de un inhibidor competitivo o mixto, en este caso queda claro al resultar paralelas las rectas obtenidas en el caso de la inhibición competitiva, mientras que se mantiene el perfil en el caso de un inhibidor mixto. [S]/v No Competitivo

S2 > S1

[S]/v Competitivo

S1

S2

S2 > S1

S1

S2

-Ki

[I]

-Ki

1/v

S2

Mixto

S1

Mixto

1/v

[I]

S2

S1 S2 > S1

S2 > S1

-Ki

-Ki

[I]

Acompetitivo

1/v

S2

S1 S2 > S1

-Ki

[I]

[I]