Laboratorio de Salud Pública: Presentación de Experiencias

con Métodos Rápidos de Detección

Juan Carlos Montero Rubio Instituto de Ciencias de la Salud Consejería de Sanidad de Castilla-La Mancha

Laboratorio de Salud Pública: Presentación de experiencias con métodos rápidos de detección

Ecología: • Abundante su presencia en biocapas – Sistemas

acuáticos antropogenicos. • Relación con protozoos como comensal o parásito. • Viven en su interior y se reproducen en muchas

ocasiones.

Rowbotham TJ 1980

• Protectores de agresiones externas. • Importante papel en la amplificación y propagación de

la Legionella (Rowbotham TJ 1980, Baranree JM 1986). • Aparente

relación con su capacidad patogénica (Breiman RF 1990, Cirillo JD 1994, Byrne B & Swanson MS 1998).

• La Legionella coloniza pero no se reproduce en la

biocapa (Donlan RM 2005, Murga R, 2001) Juan Carlos Montero Rubio

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RD 2210/95, 28 diciembre, incluye la legionelosis como EDO. R.D. 865/03 por el que se establecen criterios higiénico sanitarios para la prevención y control de la legionelosis. • Instalaciones con mayor probabilidad de proliferación y dispersión de Legionella: • Instalaciones con menor probabilidad de proliferación y dispersión de Legionella:

Análisis realizado según la norma ISO 11731, 1998. Water quality - detection and enumeration of Legionella. UNE-ISO 11731, 2007. Almacenamiento.

Siembra.

Concentración.

Incubación.

Descontaminación.

Confirmación Juan Carlos Montero Rubio

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Inconvenientes recuento en placa. (ISO 11731, 1998). • Crecimiento lento: resultados más allá de un semana. • Enmascaramiento debido a la microbiota acompañante.

• Posibles células viables y no cultivables. • Recuento de colonias de muy distinta procedencia. 1 Vacuola (103 bacterias) -1 UFC (Berk SG, 1998)

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Inhibición de Legionella por otros Microorganismos En ocasiones, la microbiota acompañante puede inhibir el crecimiento de Legionella. Ejemplo especies del género Aeromonas o Pseudomona. La presencia de algunos microorganismos en la muestra no desciende la viabilidad de Legionella pero sí su cultivabilidad. Cotuk, A. et al., 2005; Francisco Javier Castro LRSP Comunidad de Madrid

Amin A. et al., 2013; Giao M.S. et al., 2011

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Confirmación (ISO 11731) Morfología característica. “Las colonias de Legionella son frecuentemente de color blanco, gris, azul o púrpura, pero también pueden ser de color marrón, rosa, verde-amarillento o rojo intenso”

Punto 9.2.6. UNE-ISO 11731:2007 "Crecimiento excesivo de microorganismos que dificulta la posible detección de Legionella en la muestra analizada. "

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PCR a tiempo real.  Fundamento del método. • Multiplica (amplifica) pequeñas cantidades de ADN cientos de miles o millones de veces por la acción de la enzima ADN polimerasa. • La amplificación se realiza en un termociclador, aparato capaz de calentar y enfriar rápidamente las muestras. • La amplificación se mide al detectar la fluorescencia emitida por un fluoróforo excitado.

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qPCR Reacción en cadena de la Polimerasa. ISO/TS 12869:2012 (Water quality – Detection and quantification of Legionella spp. and/or Legionella pneumophila by concentration and genic amplification by quantitative polymerase chain reaction (qPCR).

General testing conditions

Expression of the results

Procedure

Test report

Technical protocol for the characterization and the validation of the method Quality controls

Concentration DNA extraction DNA amplification Quantitative detection

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Inconvenientes PCR Tiempo Real. • La legislación solo admite ISO (ISO 11731, 1998). Distintas unidades. Falta de exactitud del método de referencia

• No disponibilidad de la bacteria para estudios posteriores. • Imposibilidad de diferenciar células vivas y muertas. • Posible presencia de inhibidores de la reacción.

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Whiley H & Taylor M, 2014

 Estudios que en los últimos 10 años han comparado resultados de qPCR y Cultivo: 28



En todos los casos los resultados por qPCR es mayor que en cultivo. Solo en un caso salen resultados equivalentes.

 Sumando los resultados obtenidos en todos los estudios: • PCR: 2.856/3.967

(72%)

• Cultivo: 1.331/3.967 (34%)

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Laboratorio de Salud Pública: Presentación de experiencias con métodos rápidos de detección ANSES, 2009 Señala las ventajas de el análisis mediante PCR: - Resultados más rápidos. - Mayor detección (brotes) - Posibilidad de generar resultados específicos de L. pneumophila

Parece razonable obtener unos valores de referencia para PCR. Estos se deben obtener a través del análisis de la comparación de los resultados de ambos métodos, en una misma serie de muestras.

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Laboratorio de Salud Pública: Presentación de experiencias con métodos rápidos de detección Lee JV et al, 2011

Objetivo: Definir el umbral de acción de la PCR en tiempo real para el seguimiento de la legionela en los diferentes tipos de sistemas de agua

Estudio Multicéntrico 7 laboratorios de 6 países. Cada laboratorio al menos 6 sistemas por ambos métodos, durante al menos 6 semanas

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Laboratorio de Salud Pública: Presentación de experiencias con métodos rápidos de detección RESULTADOS

232 muestras de torres de refrigeración. Legionella pneumophila Δ=0,71 (log) Legionella sp Δ=2,03 (log)

506 muestras da agua sanitaria caliente y fría Legionella pneumophila Δ=0,62 (log) Legionella sp Δ=1,05 (log)

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Motivos de No Equivalencia •Presencia de microorganismos dañados, moribundos o muertos que no son capaces de crecer en un medio artificial pero todavía contiene ADN y pueden ser detectado por la PCR •Perdida de microorganismos a lo largo del proceso de cultivo: concentración filtración, resuspensión, tto. ácido y calor, medio selectivo con antibióticos.

•Inhibición por otros microorganismos presentes •En poblaciones muy activas y en crecimiento: genoma dividido, pero no división celular. •Peores resultados para Legionella spp pues el método fue diseñado originalmente para Legionella pneumophila

•PCR. Reacciones cruzadas con otros especies no aisladas o descritas. NF T90-461: validada 36 cepas de Legionella spp de varias especies y 17 especies no Legionella spp del mismo ecosistema Juan Carlos Montero Rubio

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

Enzimoinmunoensayo combinado con una retención magnética del microorganismo diana.



Cuantificación mediante método colorimétrico.



Resultado en U.F.C

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CEIA (captura magnética e inmunoensayo) 1) Captura sólo de Legionella. Especificidad • • •

Elimina la competencia en crecimiento en placa. Elimina la confusión con la morfología. La captura depende de lo dañada que esté la célula: células viables no sean cultivables

2) Las células capturadas se marcan con una enzima que produce un color. Procedimiento identificación sencillo. Limitaciones: • Bacteria no disponible para posteriores estudios. • Se desconocen otras por el momento.

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Objetivo Comparar efectividad y eficiencia de los métodos rápidos de detección y recuento de Legionella spp frente al método de la norma ISO 11731, 1998. (Water quality - detection and enumeration of Legionella. UNE-ISO 11731, 2007) para tener elementos objetivos que permitan tomar decisiones respecto a su implantación en un laboratorio de salud pública.

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Metodología (Madrid) 

Se realizó un experimento con 20 muestras de 250 mL cada una, desglosadas de la siguiente manera: 

Un control negativo.



Una muestra con 102 UFC de Legionella spp. (Bioréference, Eurofins, France).



Seis muestras con 103 UFC de Legionella spp. más un conjunto de microbiota interferente conocida, divididas en dos bloques.  

3 muestras adicionadas con Mix 1: P. aeruginosa, E. faecalis y E. coli. 3 muestras adicionadas con Mix 2: P. aeruginosa y Hongo.



Seis concentrados de muestras ambientales procedentes de torres de refrigeración positivas (MA1, MA2, MA3, MA4, MA5, MA6).



Las seis muestras anteriores adicionadas con 103 UFC de Legionella spp. Juan Carlos Montero Rubio

Laboratorio de Salud Pública: Presentación de experiencias con métodos rápidos de detección Identificación

SIM log UFC

+/-

Cultivo log UFC

+/-

CN L. spp (102) L. spp (103) + MIX 1 L. spp (103) + MIX 1 L. spp (103) + MIX 1 L. spp (103) + MIX 2 L. spp (103) + MIX 2 L. spp (103) + MIX 2 MA1

ND 3.37 2.45 3.15 3.51 3.26 3.67 3.67 0.37

+ + + + + + + -

ND 3.52 ND ND ND 3.00 3.48 NA ND

+ + + + -

MA2

2.68

+

ND

-

MA3 MA4 MA5 MA6 L. spp (103) + MA1 L. spp (103) + MA2 L. spp (103) + MA3 L. spp (103) + MA4 L. spp (103) + MA5 L. spp (103) + MA6

2.57 3.32 2.57 1.98 2.86 2.94 3.08 2.57 3.01 3.21

+ + + + + + + + + +

ND 4.36 ND 3.04 2.54 3.60 3.00 3.30 3.58 3.40

+ + + + + + + +

Tabla 3.- Resultados del experimento Cultivo – SIM realizado en la Comunidad de Madrid. Juan Carlos Montero Rubio

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Resultados (Madrid) Separación Inmunomagnética Positivo

Negativo

Total

Positivo

13

1

14

Negativo

5

1

6

Total

18

2

20

Cultivo

Tabla 4.- Tabla de contingencia relacionando positivos – negativos de cultivo en placa y SIM.

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Resultados (Madrid) Separación Inmunomagnética

Cultivo

Acción

Alerta

Satisfactorio

≥ 104 UFC l -1

≥ 103 UFC l -1

< 103 UFC l -1

Total

Acción

≥ 104 UFC l -1

0

1

0

1

Alerta

≥ 103 UFC l -1

0

6

3

9

Satisfactorio

< 103 UFC l -1

0

4

6

10

0

11

9

20

Total

Tabla 4.- Tabla de contingencia relacionando los resultados por niveles de acción de cultivo en placa y SIM.

Juan Carlos Montero Rubio

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Metodología (Castilla - La Mancha) Primer estudio: 14 muestras inoculadas con Legionella spp. (Bioréference, Eurofins, France).  Niveles de dopaje realizados:  5 muestras 104  5 muestras 103  4 muestras 102 4 muestras naturales provenientes de torres de refrigeración. Estas 18 muestras de 2 litros se procesaron por PCR y Separación Inmunomagnética (1L + 1L).

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Metodología (Castilla - La Mancha) Segundo estudio: 65 muestras naturales provenientes de diferentes equipos e instalaciones para analizar la máxima variabilidad de los métodos. Agua sanitaria (caliente y fría) Torres de refrigeración Nebulizadores Balnearios

Estas muestras, también de 2 litros, se concentraron mediante filtración en 20 mL, de los cuales se utilizaron: 10 mL para PCR 9 mL para Separación inmunomagnética 1 mL restante para cultivo en placa (sin tratamiento)

Juan Carlos Montero Rubio

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Resultados (Castilla - La Mancha) Separación Inmunomagnética Alerta

Satisfactorio

Total

Sanitaria

Torres

≥104 UFC/vol

≥103 UFC/vol