J.M. MARTÍNEZ-MARTOS, ET AL

REVISIÓN

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Las neurotoxinas naturales como herramientas farmacológicas para el estudio del sistema nervioso central J.M. Martínez-Martos, M.ªJ. Ramírez-Expósito, C. Iribar-Ibabe a, J.M. Peinado-Herreros a Resumen. Introducción. Los venenos naturales producidos por diversas especies animales son de gran utilidad para diferenciar entre los distintos tipos y subtipos de canales iónicos y receptores de neurotransmisores, implicados en los procesos de información-procesamiento-respuesta del sistema nervioso. Desarrollo. Los venenos naturales permiten diferenciar entre distintos tipos y subtipos de canales de Na+, K+ y Ca2+ en función de su estructura, características fisicoquímicas y funcionamiento en relación con el transporte iónico y la liberación de neurotransmisores. Conclusiones. El empleo de distintas técnicas de biología molecular permitirá desarrollar nuevas toxinas sintéticas, cuya utilización abre nuevas perspectivas de estudio y tratamiento de distintas enfermedades neurológicas [REV NEUROL 1998; 26: 584-91]. Palabras clave. Canales de calcio. Canales de potasio. Canales de sodio. Neurotoxinas. Sistema nervioso central. NATURAL VENOMS AS PHARMACOLOGICAL TOOLS FOR THE STUDY OF THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM Summary. Introduction. Natural venoms produced by different species of animals are very useful to distinguish between the different types and subtypes of ionic channels and neurotransmitters receptors involved in the information processing in the nervous system. Development. Natural venoms permit distinction between the different types and subtypes of Na+, K+ and Ca2+ channels. These differences are based on their structure, physical and chemical characteristics and function with regard to ionic transport and the neurotransmitters release. Conclusions. The use of different molecular biology techniques makes it possible to develop new synthetic toxins, by means of which new perspectives appear for the study and treatment of different neurological diseases [REV NEUROL 1998; 26: 584-91]. Key words. Calcium channels. Central nervous system. Neurotoxins. Potassium channels. Sodium channels.

INTRODUCCIÓN Diversos organismos terrestres y marinos producen venenos de características fascinantes. Las aplicaciones de estos venenos a través del tiempo (en usos tanto medicinales, como ceremoniales [1-3]) se recogen en una farmacopea que se ha reconvertido en la Recibido: 25.11.97. Aceptado tras revisión editorial sin modificaciones: 16.12.97. Área de Fisiología. Facultad de Ciencias Experimentales. Universidad de Jaén. a Instituto de Neurociencias. Universidad de Granada. España. Correspondencia: Dr. José Manuel Martínez Martos. Área de Fisiología.

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actualidad. La naturaleza de estas toxinas (normalmente peptídicas), su lugar de actuación (habitualmente canales iónicos y/o receptores específicos para diversos ligandos), la cinética de unión a sus sitios receptores, su mecanismo de neutralización y la posibilidad de síntesis de nuevos péptidos de interés terapéutico, son Facultad de Ciencias Experimentales. Universidad de Jaén. E-23071 Jaén. Fax: +34 953 212 141. E-mail: [email protected]  1998, REVISTA DE NEUROLOGÍA

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áreas de investigación muy consideradas [4-10]. Actualmente, algunas neurotoxinas ya han sido utilizadas para el diagnóstico y tratamiento de distintas patologías [1,11-13]. La puesta a punto de técnicas nuevas en biología, incluyendo el clonaje molecular, ha favorecido el empleo de neurotoxinas como herramientas farmacológicas, debido a la gran selectividad que presentan por canales iónicos y receptores propios del sistema nervioso central (SNC) [5,6,14-24]. La investigación con venenos animales se ha desarrollado con especial énfasis en los últimos años y ha permitido avances espectaculares, especialmente gracias a los venenos de moluscos gasterópodos (del género Conus) y de distintos tipos de arañas. Además, son de interés otras toxinas descubiertas en serpientes (como en Dendroaspis sp y Atractaspis sp), lagartos (como Heloderma sp), tunicados, dinoflagelados, avispas, abejas, hormigas y escorpiones (como Buthus sp o Androctonus sp). Los venenos de escorpiones contienen una gran cantidad de toxinas que actúan a nivel de canales iónicos de Na+, K+, Ca2+ y Cl- (Tabla I). Además, las estrechas relaciones funcionales y estructurales existentes entre estas toxinas venenosas (como las de los gasterópodos del género Conus y los de las serpientes del género Naja) o entre estas toxinas y moléculas endógenas (como las sarafotoxinas de serpiente y las endotelinas [25,26] o las toxinas de escorpiones y las defensinas de los artrópodos) sugieren la existencia de relaciones filogenéticas de gran interés [5,6,27]. CANALES IÓNICOS, RECEPTORES Y NEUROTOXINAS

Tabla I. El desarrollo y empleo de neurotoxinas en investigación como ligandos selectivos se ha producido gracias a los efectos altamente específicos que tienen sobre sus receptores. Es por ello que se considera a estas sustancias como indicadores del elevado número de canales iónicos y receptores del sistema nervioso identificados en los últimos años. Neurotoxinas naturales con acción sobre canales iónicos Canales de Na+

Canales de K+

Canales de Ca2+

Canales de Cl-

Peces: Tetrodotoxina

Abejas: Apamina Péptido liberador de los gránulos de las células cebadas (MCDP)

Escarabajos: ß-Leptinotarsina-h

Bacterias: Avermectina B1a

Salamandra: Taricatoxina Pulpo: Maculotoxina Dinoflagelados: Saxitoxina Brevetoxinas: PbTX-1, 2, 3, 9 Ciguatoxina

Serpientes: α-Dendrotoxina ß1-Dendrotoxina ß2-Dendrotoxina γ-Dendrotoxina δ-Dendrotoxina

Serpientes: Calciseptina Dinoflagelados: Maitotoxina

Toxinas α de escorpión: Toxinas de escorpión: Caracoles marinos: Toxina I Escilatoxina ω-Conotoxina GVIA Toxina M7 Leiurotoxina I ω-Conotoxina MVIIA Toxina 2000 Caribdotoxina ω-Conotoxina MVIIC Toxina V Iberiotoxina ω-Conotoxina SVIA Neurotoxina IV y V Margatoxina ω-Conotoxina SVIB Toxinas β de escorpión Kaliotoxina Toxinas γ de escorpión Noxiustoxina Otras toxinas de escorpión: AaHIT4 AaIT LqhIT2 LqqIT

Toxinas de escorpión: Clorotoxina

Toxinas de anémonas: Toxina I, II y III Antopleurina A y B Caracoles marinos: µ-Conotoxina GIIIA, GIIIB y GIIIC Arañas: µ-Agatoxina I, II, III,

Arañas: ω-Agatoxina IA ω-Agatoxina IIA ω-Agatoxina IIIA ω-Agatoxina IVA ω-Grammotoxina SIA Agelenina Toxina de Holonena PLTX II FTX

La complejidad del SNC de vertebrados se atribuIV, V y VI ye, en parte, a la enorme diversidad de tipos y Curtatoxinas subtipos de receptores y canales iónicos expresados en neuronas y glía. Esta diversidad de canales y receptores se ha puesto de manifiesto gracias a Ranas: Plantas: diversas técnicas, que incluyen la expresión de ge- Batracotoxina Rianodina nes homólogos, o bien mediante splicing (corte y Pumiliotoxina A y B recombinación) alternativo de un mismo gen y la Plantas: edición de su ARNm para generar isoformas mole- Ervatamina culares con diferentes propiedades fisiológicas, far- Veratridina Granayotoxina macológicas y bioquímicas [14,15]. Las neurocien- Piretrinas cias han evolucionado desde los primeros modelos simples de Hodgkin y Huxley, que predecían los genéricos canales de Na+ y K+ relacionados con la transmisión del Na+ dependientes de voltaje (producido por un pez del género Fugu), impulso nervioso [28-33], hasta las decenas de receptores y canales y el tetraetilamonio (un inhibidor sintético específico de los canales iónicos de distinto tipo descritos actualmente en el SNC de mamí- de K+), confirmaron las predicciones de Hodgkin y Huxley sobre la feros, algunos de las cuales, incluso, se evidencian solamente bajo existencia de canales iónicos selectivos e independientes para Na+ circunstancias particulares. Es un reto para las neurociencias co- y K+ que participaban en los potenciales de acción [28-33]. El empleo de neurotoxinas naturales ha permitido llegar más nocer las propiedades funcionales de esta enorme diversidad de receptores y canales. Las neurotoxinas suponen una herramienta allá, con tres claros objetivos: el estudio de la estructura de las de gran importancia para diferenciar las características funciona- distintas isoformas de canales, sus características fisicoquímicas (con especial énfasis en su cinética de activación/inactivación) y les de cada subtipo de receptor y/o canal iónico [5,6,14,15,27]. el estudio de su fisiología. Canales de Na+ y K+ El canal de Na+ es una proteína constituida por cuatro subuniLa tetrodotoxina (TTX), un bloqueante específico de los canales de dades (α, β, γ y δ), cada una de las cuales está constituida por seis

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J.M. MARTÍNEZ-MARTOS, ET AL Tabla II. En el sistema nervioso central, el calcio entra en el citoplasma especialmente a través de canales de calcio dependientes de voltaje; este hecho representa un paso fundamental en la regulación de un gran número de procesos celulares. Los diversos tipos de canales de calcio muestran distintas sensibilidades a diferentes agentes farmacológicos. Entre estos agentes, destacan algunos venenos naturales, que han permitido definir muchas características tanto estructurales como funcionales de estos tipos y subtipos de canales. Por tanto, estas toxinas pueden ser la base para el desarrollo de potentes herramientas para el diagnóstico y el tratamiento de diversas enfermedades neurológicas.

a

Canales de calcio dependientes de voltaje en el SNC 1. Canales selectivos de calcio voltaje-dependientes b

(extremo carboxilo terminal)

– Canales LVA (Low Voltage Activated) Tipo T (amilóride sensible) – Canales HVA (High Voltage Activated) Tipo L (isoformas L1, L2, L3 y L4; sus subunidades α1, α2, ß, γ y δ están identificadas). DHP sensible Tipo N (ω-conotoxina-GVIA sensible) Tipo P/Q (FTX y ω-agatoxina-IVA sensible) Tipo R? Tipo K? 2. Otros canales selectivos de calcio

(extremo amino terminal)

Figura 1. Diagrama esquemático de cinco sitios de unión de diferentes neurotoxinas a la subunidad α del canal de Na+. a) Los sitios de unión de la neurotoxina denominados I (definido por la unión de la tetrodotoxina (TTX) y la saxitoxina) y III (definido por la unión de la toxina α-escorpión (αScTX)) han sido determinados de forma precisa por entrecruzamiento covalente o mutagénesis dirigida. Los sitios IV (dominio extracelular; lugar de unión de la toxina β-escorpión (β-ScTX)) V (dominio hidrofóbico; lugar de unión de la brevetoxina) y II (dominio hidrofóbico; lugar de unión de la batracotoxina) y un sitio de unión del piretroide, todavía no han sido determinados de forma precisa. b) Se muestra la secuencia lineal de aminoáci+ dos de la subunidad α del canal de Na y los sitios de unión para la TTX y las toxinas del escorpión (ScTx) en los lazos estructurales del canal.

segmentos transmembrana (denominados S1 a S6). Estructuralmente se han podido identificar más de cinco lugares de unión de toxinas en los dominios funcionales de la subunidad α de los canales de Na+ utilizando varias neurotoxinas como sondas específicas (Fig. 1, Tabla I), e incluso se ha sugerido que algunos de estos lugares de unión de las toxinas son los responsables de las propiedades de activación, inactivación y permeabilidad del canal de Na+ [34-38]. Utilizando batracotoxina (una toxina de carácter lipofílico aislada de la rana venenosa Phyllobates aurotaenia), se ha podido comprobar que ésta se une a la subunidad α del canal, en especial, al segmento transmembrana IS6 de la región del dominio I, lo que hace suponer que este lugar es el responsable de la selectividad del canal [39]. El empleo de TTX ha demostrado que en las neuronas pequeñas del ganglio de la raíz dorsal (desempeñan un importante papel en los mecanismos nociceptivos), se expresan dos tipos de corrientes de Na+, que difieren en su cinética de inactivación y en su sensibilidad a esta toxina. Esto ha permitido que a partir de estas células se haya clonado la subunidad α de un nuevo canal de sodio dependiente de voltaje denominado PN3, caracterizado por su resistencia a la TTX [40]. El uso de TTX radiomarcada proporciona también un método adecuado para la investigación de la solubilidad y purificación de los canales de Na+, así como para conocer la densidad de canales en las membranas nerviosas (mediante experimentos de binding [41]). Se ha planteado así la necesidad de encontrar nuevas toxinas específicas, como las obteni-

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– Canales liberadores de calcio delretículo sarcoplasm ático y las m itocondrias – Canales de calcio operados porreceptor 3.Otros canales de calcio voltaje-dependientes sin selectividad porelcalcio – Canales de Na+, K+, etc.

das a partir del veneno del escorpión Tityus discrepans, capaces de actuar sobre los canales de Na+. De ellas, cuatro, denominadas TdII-1 a TdII-4, son muy activas y estructuralmente diferentes [42], lo que implica que su uso permitirá descubrir nuevas características de los canales. También se ha purificado y caracterizado una toxina polipeptídica de la larva de Myrmeleon bore, que se caracteriza por ser 130 veces más potente que la TTX [43]. Los canales de Na+ también poseen sitios receptores para neurotoxinas que actúan inhibiendo la inactivación de la corriente de Na+. Los sitios a los que se unen las α-toxinas de escorpión o toxinas semejantes a las α de escorpión son particularmente interesantes porque esta unión a nivel extracelular puede afectar los procesos de inactivación a nivel de segmentos intramembranosos del canal. Así, se ha examinado la interacción de dos neurotoxinas de escorpión radiomarcadas, la AaHII y la Lqh-α-IT con canales de Na+ tanto de mamífero como de insectos, demostrando la existencia de clusters o lugares específicos de unión de cada toxina al canal [44]. Otra toxina, la Bot-IT2, purificada del veneno del escorpión Buthus occitanus tunetanus, demuestra un efecto modulador sobre los canales de Na+ (mediante modificación de su cinética de activación, posiblemente transformando estos canales, normalmente rápidos, en otros más lentos [45-47]). También se han encontrado toxinas que modifican la cinética de los canales de sodio dependientes de voltaje. Se trata de la µ-agatoxina-I y la µ-agatoxina-IV, aisladas del veneno de la araña de tela en embudo Agelenopsis aperta. Estas toxinas muestran motivos estructurales secundarios y terciarios comunes con diversas toxinas peptídicas filogenéticamente relacionadas y que interaccionan con un amplio rango de tipos de canal [48]. El empleo de las toxinas naturales permite la definición estructural de los canales iónicos y la aproximación fisiológica. Se

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ha visto que el uso de toxinas activadoras de los canales de Na+ dependientes de voltaje por inhibición de la inactivación, como la α-escorpión [49], inducen muerte neuronal en cultivos de neuronas de cerebelo (la cual es abolida por TTX) y que no es de tipo apoptótico. Sin embargo, esta muerte tampoco es abolida por antagonistas del ácido glutámico, la depleción del glutamato endógeno o el bloqueo de los canales de Ca2+ dependientes de voltaje de tipo L, N y P, usando ω-conotoxina GVIA y ω-agatoxina-IVA. Ello indica la existencia de mecanismos neurotóxicos distintos a los provocados por aminoácidos excitatorios [50,51]. Al igual que ocurre con los canales de Na+, existe una gran variedad de tipos y subtipos de canales de K+ en función de su comportamiento en presencia de toxinas de diferente origen [52,53]. También se han examinado los efectos de dos homólogos de la τ-dendrotoxina, la toxina T y toxina K, sobre canales de K+ clonados y expresados en oocitos de Xenopus, denominados Kv1.1, Kv1.2 y Kv1.6. Se ha visto que la toxina T bloquea todos los canales, mientras que la K es selectiva para el canal Kv1.1. Ambas toxinas disminuyen la cinética de activación e inactivación del canal, con distinta potencia. De este modo, se demuestra la selectividad de un homólogo de la dendrotoxina por un canal clonado, sugiriendo que estas toxinas pueden dificultar los cambios conformacionales que ocurren durante el funcionamiento normal del canal, y que se llevaría a cabo de distinto modo dependiendo del subtipo del canal [54,55]. Existen otros muchos estudios que demuestran la enorme diversidad de canales de K+, como los llevados a cabo con el péptido pi1 del veneno del escorpión Pandinus imperator [56,57], los venenos noxiustoxina [58], margatoxina y toxina 1 del Centruroides limpidus, o toxinas de escorpiones del género Leiurus, Androctonus, Buthus y Mesobuthus, entre otros [59-67]. Incluso, hay canales de K+ insensibles a los venenos [68]. Canales de Ca2+ Uno de los campos que más ha empleado neurotoxinas naturales ha sido el dedicado a diferenciar las características estructurales y fisiológicas de los distintos tipos de canales de calcio dependientes de voltaje (L, T, N, P/Q, R y K) (Tabla II), que participan en mayor o menor medida en los procesos de liberación de los distintos tipos de sustancias neurotransmisoras y, en especial, de aminoácidos y neuropéptidos [51,69-81]. La descripción inicial de las corrientes de Ca2+ en el miocardio por Reuter [82] dio lugar a un intenso trabajo para definir las propiedades de los canales de calcio dependientes de voltaje (VDCC). Tsien et al [83-87] identificaron mediante estudios farmacológicos y electrofisiológicos diferentes canales que denominaron de tipo L (por long lasting o de inactivación lenta), tipo T (por transient, pequeña) y N (por neuronal, también denominados No-L No-T). Posteriormente, Llinás et al [88,89] probaron que podían existir VDCC diferentes a los descritos con anterioridad, con alto voltaje de activación. A estos canales los llamaron de tipo P (por células de Purkinje). Posteriores estudios farmacológicos, electrofisiológicos y de biología molecular han demostrado que además de los canales anteriormente mencionados, existen otros tipos de VDCC, entre los que destacan los Q, los R y los K [90]. En general, todos estos canales de Ca2+ tienen propiedades que varían con los tejidos en los que aparecen [91]. Los canales de Ca2+ de tipo L están ampliamente distribuidos en todos los tejidos, particularmente en el corazón y el músculo liso. Son altamente sensibles a las dihidropiridinas (en ocasiones se han denominado DHP-sensibles), fenilalquilaminas y benzodiacepinas. Los canales de Ca2+ de tipo T tienen unas características elec-

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trofisiológicas que los diferencian claramente de los canales de tipo L. De este modo, requieren pequeñas despolarizaciones para su activación y rápidamente se inactivan, pudiendo ser importantes para la actividad marcapasos de muchos tejidos. Los VDCC de tipo T están localizados en una gran variedad de tejidos, y se han encontrado en gran concentración en el nodo sinoatrial [92] y el nodo atrioventricular, tejidos conductores especializados del corazón [93,94], células de músculo liso [95-99] y neuronas [83,100102], donde debe ser responsable del disparo en pulsos [103]. La ausencia de bloqueantes específicos de los canales de tipo T, junto a la carencia de sondas de alta afinidad, ha impedido, de momento, definir la conformación exacta de estos canales [91]. Los canales de Ca2+ de tipo N se consideran sensibles a la ωconotoxina-GVIA, y generalmente se los ha relacionado con la liberación de neurotransmisores [104-106]. Los canales de Ca2+ de tipo P se caracterizan por su resistencia al bloqueo con dihidropiridinas y ω-conotoxina-GVIA, siendo sensibles a toxinas como la FTX (funnel web toxin) y la ω-agatoxina-IVA, derivadas del veneno de la araña de tela en embudo Agelenopsis aperta. Requieren para activarse grandes despolarizaciones, y muestran muy poca inactivación [107,108]. Estos canales pueden ser el principio de una larga serie de canales de Ca2+ en el cerebro hasta ahora solamente supuesta [109-111] y pueden ser los responsables de la liberación de neurotransmisores en numerosas áreas cerebrales [106,112]. Los canales Q se bloquean completamente por ω-conotoxina MVIIC, y parece que, junto con los de tipo N, se han implicado en la liberación de ácido glutámico en hipocampo [113,114]. Los canales de tipo R se definen como aquella corriente resistente a bloqueantes específicos de canales de tipo L, N o P. Esta corriente de entrada de calcio tiene un corto período de activación y requiere de voltajes más negativos que los que precisan otros tipos de canales [115]. Estos canales de calcio aún no han sido caracterizados, e incluso podrían confundirse con los canales de tipo Q. Deben aparecer, por tanto, neurotoxinas específicas que anulen las corrientes de calcio originadas a través de estos canales, para que pueda llevarse a cabo su caracterización. Igual ocurre con los canales de tipo K. En este sentido, recientemente se han llevado a cabo estudios farmacológicos y bioquímicos de un gran número de sustancias aisladas de organismos marinos que afectan de diferente manera a las corrientes de calcio. Se ha utilizado así la 9-metil-7bromoeudistomina D, un derivado de la eudistomina D aislado de un tunicado marino, la maitotoxina, la geografutoxina I y II, la estriatoxina, la eburnetoxina, la tesulatoxina, la goniodomina A y la zooxantelatoxina A y B, aisladas de caracoles marinos y dinoflagelados, la xestoquinona y la purealina, aisladas de una esponja de mar, y un largo etcétera de compuestos, los cuales, serán, sin duda, herramientas muy útiles para estudios bioquímicos y farmacológicos de los movimientos tanto de calcio como de otros iones a través de sus respectivos canales [116]. Receptores El empleo de neurotoxinas naturales no sólo ha permitido el estudio de canales iónicos, sino también de distintos tipos de receptores tanto de sustancias endógenas como exógenas. Así, la α-bungarotoxina y la cobratoxina han contribuido al aislamiento de los receptores nicotínicos de acetilcolina [117,118], un hallazgo que permitió su clonaje molecular. Tanto en la purificación como en el clonaje de estos receptores, las toxinas de estas serpientes venenosas han proporcionado las herramientas

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para determinar tanto la presencia como la integridad funcional de la proteína receptora. Además, el uso de distintas α-conotoxinas, aisladas de caracoles marinos del género Conus, han servido para demostrar que el receptor nicotínico de acetilcolina de cerebro muestra ligeras diferencias estructurales con el del músculo esquelético [119-121]. También los receptores muscarínicos de acetilcolina están siendo estudiados mediante toxinas específicas [122,123]. Otro tipo de receptores sobre los cuales se ha investigado su estructura y función, son los receptores para ácido glutámico, gracias a la existencia de múltiples herramientas químicas específicas que afectan las respuestas del glutamato y otros aminoácidos excitatorios. Recientemente se han obtenido varias toxinas de bajo peso molecular de arañas y avispas, como la argiotoxina 636, la argiopina, la espidamina y la joramina, que prometen ser herramientas adecuadas para la identificación de ciertos subtipos de receptores de glutámico y para el estudio de su función [124-126]. PRECAUCIONES CON EL USO DE NEUROTOXINAS Una de las características más destacadas de las neurotoxinas es la especificidad existente entre sus diferentes variantes para unirse a distintos tipos y subtipos de canales iónicos y receptores. Esta especificidad permite un uso más eficaz de éstas, ya que su unión se limita a un receptor específico, evitándose de este modo la unión gratuita de estos ligandos a otros lugares. Sin embargo, puede existir una pequeña proporción de receptores relacionados a los que también se puede unir un bajo porcentaje de alguna de las variantes de la neurotoxina utilizada. Por tanto, en el empleo de neurotoxinas debe existir una selección precisa de la variante específica que se utilice para conseguir así únicamente el efecto buscado. Otro hecho que hay que tener en cuenta es que, aunque los receptores y canales iónicos de mamíferos se vienen estudiando de forma habitual empleando neurotoxinas aisladas de distintos animales venenosos, las presas naturales de estos animales son taxonómicamente diferentes de los sistemas fisiológicos estudiados en neurobiología, normalmente desarrollados sobre mamíferos [127]. BIOLOGÍA MOLECULAR Y NEUROTOXINAS Durante bastante tiempo, la mayoría de las toxinas utilizadas han sido descubiertas y caracterizadas mediante procedimientos convencionales de purificación a partir de los venenos naturales producidos por los distintos organismos animales. Sin embargo, el descubrimiento de nuevas toxinas polipeptídicas crece enormemente, gracias al uso de la tecnología de recombinación del ADN. Esta tecnología debe servir además para optimizar las toxinas existentes mediante mutagénesis dirigida [128], dando lugar a variantes de cada toxina con nuevas propiedades y selectividad. En concreto, la revolución que supone la tecnología del ADN

recombinante afecta de distintos modos a la aplicación de neurotoxinas polipeptídicas en las neurociencias [129]. Primero, podrían descubrirse toxinas presentes en cantidades limitadas en la naturaleza por comparación con secuencias ya existentes. Una posibilidad particularmente excitante en este sentido son las numerosas especies de avispas parásitas, arañas y caracoles, muchas de las cuales son tan pequeñas que los métodos convencionales para purificar las toxinas de sus venenos no son factibles. Esto da lugar a una aproximación más eficiente en comparación con el tiempo que se emplearía en el aislamiento e identificación de cada toxina. Una proyección aún más excitante, en segundo lugar, resulta de la cooperación de la biología molecular y la toxicología. Se trata de la posibilidad de usar la mutagénesis dirigida para manipular la especificidad de cada subtipo de neurotoxina. Experimentos llevados a cabo con variaciones de la FTX denominadas FTX-3.3 y sFTX-3.3, que mantienen su capacidad bloqueante de los VDCC [130], demuestran la posibilidad de una ingeniería de los determinantes de unión toxina-receptor, una tecnología que permitiría el diseño de variantes de toxinas con una única especificidad. Una tercera posibilidad de la biología molecular implicaría la adopción de sistemas de búsqueda tales como las librerías de epítopos de fagos de fusión. Esta estrategia utiliza módulos aleatorios de la secuencia de la toxina y los une a una proteína de la envuelta de un fago, utilizando el conjunto para hacer la búsqueda de las selectividades apropiadas subtipo-receptor. La ventaja de esta estrategia es que varios billones de secuencias pueden ser examinadas en una única búsqueda. Aunque conceptualmente ésta es una aproximación extremadamente potente y atractiva, todavía no ha sido llevada a cabo en la práctica de forma habitual. Una última aproximación para obtener nuevas proteínas activas es la incorporación total o de parte del sitio activo de una toxina, en otra toxina natural que actúe como soporte estructural. Se obtienen de este modo moléculas quiméricas que mantienen las características de ambas toxinas y son estructuralmente muy estables. Esta estrategia de transferir sitios activos a un soporte estructural tiene aplicaciones de gran importancia en el diseño de nuevos ligandos para receptores de membrana y, aún más interesante, para el diseño de vacunas [131,132]. Para finalizar esta revisión, hemos de hacer una última consideración: si bien nos hemos centrado en el empleo de neurotoxinas como herramientas farmacológicas para el estudio de los distintos tipos y subtipos de canales iónicos y receptores para neurotransmisores del sistema nervioso, no hay que olvidar que existe una enorme diversidad de toxinas naturales que pueden ser útiles para el estudio de otros muchos procesos biológicos. Aunque este tipo de investigación está dando sus primeros pasos, ya se están utilizando toxinas naturales para el estudio de ciertos aspectos del comportamiento animal [133], de la coagulación [134-144], el cáncer y procesos metastásicos [145-148], la respuesta inflamatoria [149-151], el alcoholismo [152] o la hipertensión arterial [153156], lista que, sin duda, irá aumentando en los próximos años.

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