Lección 5 Análisis estequiométrico de rutas metabólicas Curso Aproximación al estudio de célula mínima desde la Biología de Sistemas Montevideo 6-10 diciembre 2010 Federico Morán Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I Universidad Complutense Madrid. España

Análisis estequiométrico ⎝ Sólo requiere la topología de la red Necesario conocer: reacciones que intervienen en la red y sus estequiometrías. Posibles aplicaciones:   Identificación de modos óptimos, por ejemplo, máxima producción de un determinado compuesto generado por mol de sustrato  claras implicaciones bioltecnológicas.   Importancia de una reacción concreta en el funcionamiento de la totalidad de la red  Influencia de mutaciones knockout.   Análisis de reacciones correlacionadas  Unidades de regulación.  Identificación de rutas metabólicas  Análisis de la funcionalidad de la red  Efecto de añadir o quitar reacciones en una red   Flexibilidad y robusted de la red  Insensibilidad del sistema a cambios en sus parámetros (robusted) y capacidad del sistema a optar por distintos modos funcionales (flexibilidad)

Análisis estequiométrico

v1 v2 v3 v4 S ↔ X1 ↔ X 2 ↔ X 3 ↔ P =0

! X 1 $ ! 1 '1 0 0 d# & # X 2 & = # 0 1 '1 0 dt # " X 3 % " 0 0 1 '1

=0 =0

Balanced Networks: Suposición de estado estacionario 0=Nv

N

intermediarios

velocidades

Matriz estequiométrica

" 1 !1 0 0 $ $ 0 1 !1 0 # 0 0 1 !1

% ' ' &

$! & ## &# %# "

v1 v2 v3 v4

$ & & & &%

v1 v2 v3 v4 S ↔ X1 ↔ X 2 ↔ X 3 ↔ P

¿Qué información se puede extraer a través de la matriz estequiométrica? ! X 1 $ ! 1 '1 0 0 d# & # X 2 = # 0 1 '1 0 # & dt " X 3 % " 0 0 1 '1

=0 =0 =0

v1= v2 = v3 = v4

! # # # #"

v1 v2 v3 v4

$ ! & # & = v1 # & # &% #"

1 1 1 1

! 1$ $ # 1& & & = '# & # 1& & # & &% " 1%

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v1 v2 v3 v4

,, - ( ) ' ) (

N

intermediarios

velocidades

Matriz estequiométrica

" 1 !1 0 0 $ $ 0 1 !1 0 # 0 0 1 !1 Rango = 3

$ & & & &%

% ' Nº velocidades - rango = dimensión ' del espacio de soluciones & 4-3=1

v4

X3 v5

S ↔ X1 ↔ X 2 ↔ P v1

v2

v3

S ↔ X1 ↔ X 2 ↔ P λ1

! # # # # # "

v1 v2 v3 v4 v5

$ ! v2 + v4 $ ! & & #v # 2 # & & # # & & = v2 + v4 = ' 1 # & & # # v 4 & & # # # & % " " v4 %

La base, en general, es arbitraria

1 1 1 0 0

$ ! & # & # & + '2# & # & # % "

1 0 1 1 1

$ & & & & & %

λ1

λ1

X3 v5=v4

v4

S ↔ X1 ↔ X 2 ↔ P

v1=v2+v4

v2

λ2

S ↔ X1 λ2

X3

v3 =v2+v4

λ2

X2 ↔ P λ2

¿Qué información se puede extraer a través de la matriz estequiométrica? A) Dimensión del espacio vectorial  Todas las distribuciones de flujo de estado estacionario se pueden representar como combinación lineal de unas pocas (elementos de la base) v4

X3 v5=v4

S ↔ X1 ↔ X 2 ↔ P

v1=v2+v4

v2

v3 =v2+v4

! # # # # # "

v1 v2 v3 v4 v5

$ ! & # & # & = '1 # & # & # % "

1 1 1 0 0

$ ! & # & # & + '2# & # & # % "

1 0 1 1 1

$ & & & & & %

 Da información sobre los grados de libertad del sistema.   Información del número y clase de enzimas tal que, convenientemente elegidas, al suprimirse su actividad, se hace imposible la conversión. Para ello hay que seleccionar adecuadamente los elementos de la base, que en principio es arbitraria. Todos ellos han de incluir la entrada del producto inicial y la salida del final.

  La dimensión del espacio vectorial indica en número mínimo de velocidades que hay que medir para tener información sobre todas las velocidades de la red. v4

X3 v5=v4

S ↔ X1 ↔ X 2 ↔ P

v1=v2+v4 ¿Cuáles?

v2

v3 =v2+v4

! # # # # # "

v1 v2 v3 v4 v5

$ ! & # & # = ' 1 & # & # & # % "

1 1 1 0 0

$ ! & # & # + ' 2 & # & # & # % "

1 0 1 1 1

$ & & & & & %

v2 y v4 o v5

λ1 = v2 ,, λ2 = v4 = v5

v1 y v4 o v5

λ1+ λ2 = v1 ,, λ2 = v4 = v5

v1 y v3 no vale

Metabolic Flux Analysis (MFA) 0=Nv

= Nu vu + Nm vm

Nu vu = - Nm vm

Si, y sólo si, Nu es cuadrada, y tiene un determinante diferente de cero, vu es determinado

" 1 !1 0 !1 0 $ $ 0 1 !1 0 1 # 0 0 0 1 !1

%" ' $$ '$ &$ #

v1 v2 v3 v4

% " 1 0 0 % " v1 % ' " -1 -1 % " v 2 % $ ' $ ' ' = 0 -1 1 v 3 + $ '& $# v 4 '& ' $ ' #1 0 ' $$ '$ ' '& # 0 0 1 & # v 5& Det. = 1

¿Qué información se puede extraer a través de la matriz estequiométrica? B) Los Modos Elementales de Flujo  Un modo es el conjunto de reacciones que dan lugar a una distribución de flujo no nula en el estado estacionario. v4

X3 v5

S ↔ X1 ↔ X 2 ↔ P v1

v2

v3

v1 v2 v3 v1 v4 v5 v3 v2 v4 v5 v1 v2 v3 v4 v5

! # # # # # "

v1 v2 v3 v4 v5

$ ! & # & # & = '1 # & # & # % "

1 1 1 0 0

$ ! & # & # & + '2# & # & # % "

 Un modo es elemental si no puede ser descompuesto en dos distribuciones de flujo más simples.  Tales modos se pueden caracterizar indicando las enzimas implicadas y las proporciones de flujo que se distribuyen por las reacciones catalizadas por dichas enzimas.  Dentro de los modos elementales se encuentran todas las rutas metabólicas posibles.   Nº de modos >> Dimensión del espacio vectorial

1 0 1 1 1

$ & & & & & %

v4

Modos elementales de flujo Modo 1

Modo 2

S ↔ X1 ↔ X 2 ↔ P λ1

λ2

λ1

X3

S ↔ X1

Modo 3

λ2

X2 ↔ P

λ2

λ3

λ1

λ2

X3

λ3

X1 ↔ X2 λ3

! # # # # # "

1 1 1 0 0

$ & & & & & %

! # # # # # "

1 0 1 1 1

$ & & & & & %

"0 % $ !1' $ ' $0 ' $ ' $1 ' $# 1 '&

X3 v5

S ↔ X1 ↔ X 2 ↔ P v1

v2

v3

¿Qué información se puede extraer a través de la matriz estequiométrica? C) Subconjunto de reacciones   Aquellos conjuntos de reacciones en las que, en condiciones de estado estacionario, sus reacciones operan siempre estequiométricamente. Subconjunto 1

S ↔ X1 v1

Subconjunto 2

v4 X3 v5 X1 X2

Subconjunto 3

X1 ↔ X2 v2

X3

v4

X2 ↔ P v3

v5

S ↔ X1 ↔ X 2 ↔ P v1

! # # # # # "

v1 v2 v3 v4 v5

$ ! & # & # & = '1 # & # & # % "

v2

1 1 1 0 0

v3

$ ! & # & # & + '2# & # & # % "

1 0 1 1 1

$ & & & & & %

Cualquier efecto sobre una de las velocidades afecta igualmente a todas las del mismo subconjunto -> Unidades de regulación Una velocidad puede pertenecer a más de un modo elemental, pero SOLO a un subconjunto de reacciones

Tanto la solución general como los modos elementales se pueden representar en función de los subconjuntos de reacciones.

S ↔ X1 ↔ X 2 ↔ P v1

v2

v3

X3 v5

v4

S ↔ X1 v1

v4

X2 ↔ P

Modo 1

Modo 2

v3

X3

v5

X1 ↔ X2 v2

Modo 3

!1$ # 0& # & #" 1 &% !1$ #1& # & #" 0&% "0 % $1 ' $ ' $# !1'&

! VS1 $ # VS 2 & # & #" VS 3 &%

¿Qué información se puede extraer a través de la matriz estequiométrica?

D) Leyes de conservación

Externos: A y B; internos: todos los demás

Ley de conservación: NAD+ + NADH = cte

ALGUNAS HERRAMIENTAS

Software: METATOOL

Herramienta computacional que lleva a cabo de forma algorítmica las operaciones elementales que permiten obtener los vectores básicos y elementales compatibles con la estequiometría y las restricciones externas impuestas del sistema. Además proporciona todos los subconjuntos enzimáticos, así como las leyes de conservación.

Metabolitos Externos Metabolitos Internos reversibles Enzimas irreversibles

E4

X3

E5

Reacciones

S ↔ X1 ↔ X 2 ↔ P E1

E2

E3

http://www.bioinf.mdc-berlin.de/projects/metabolic/metatool/

X3 v 5 S ↔ X1 ↔ X 2 ↔ P v4

} }

v1

Número de conexiones en cada nodo

Frecuencia de nodos con un número determinado de conexiones

Dimensión del espacio vectorial y una base

λ2

X3

λ2

X1 ↔ X2 λ2

S ↔ X1 ↔ X 2 ↔ P λ1

λ1

λ1

v2

v3

Modelos con restricciones Irreversibilidades

El espacio convexo ⎝ Base convexa

Subconjunto 1

Subconjunto 2

Subconjunto 3

S ↔ X1 v1

X2 ↔ P v3

La base convexa, en general, no es arbitraria

! # # # # # "

v1 v2 v3 v4 v5

$ ! & # & # & = '1 # & # & # % "

1 1 1 0 0

$ ! & # & # & + '2# & # & # % "

!1 " 0,, !2 " 0 En general, las irreversibilidades imponen restricciones severas en el análisis estequiométrico

1 0 1 1 1

$ & & & & & %