MAESTRÍA EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGÍA

DE PLANTAS DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA LA CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA GENÓMICA BIBAC DE BANANO (Musa ssp)

Leticia Peraza Echeverría Centro de lnvestigación Científica de Yucatán, A.C.

Posgrado en Ciencias y Biotecnología de Plantas

Desarrollo de un protocolo para la construcción de una biblioteca genómica BIBAC de banano (musa ssp)

Tesis que presenta para obtener el grado de Maestro en Ciencias

Leticia Peraza Echeverría

CENTRO DE INVESTIGAclóN CIENTÍFICA DE YUCATAN

Mérjda, Yucatán, México 2003

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se realizó en los laboratorios de la Unidad de Bi.otecnología del Cen{ro de lnvestigación Científica de Yucatán, A. C. (CICY), bajo la dirección del Dr Andrew C.

James K. y el Dr Dieter Kaemmer a quienes agradezco su amistad, confianza y apoyo.

Agradezco de mariera importante la beca-crédito recibida durante el primer año de la maestría, al Conseio Nacional de Ciencia y Tecnología con el número de registro 162940.

A los revisores externos, Dr. Miguel Gómez Lim y Dr. Jean Philippe Vi.elle del Centro de lnvestigación y Estudios Avanzados del l.P.N. (CINVESTAV, Unidad lrapuato), por susvaliosassugerenci.asquepermitieronenriquecerestetrabajo.

A los revisores internos Dra

Cecilia Rodri'guez G. y Dra. Blondy Canto C. por su

amistadysusexcelentescomentariosyaportaci.onesparamejorarestetrabajo. A la Dra. Mi-Kyung Lee por su valioso apoyo {écnico y amistad durante la estancja de entrenamiento en la técnica para la construcción de bibliotecas genómicas BIBAC, realizada en el laboratorio de SoW and Crop Center del Texas A & M University, bajo la direcci.Ón del Dr Hong-Bin Zhang, a quien también agradezco su amistad y confianza.

A Pablo, Tere, Rosa e llka, compañeros de posgrado, por su amistad. A todos y cada uno de mis amjgos del grupo de plátanq compañerismo, entusiasmo y apoyo.

por su amistad,

DEDICATORIA

AmimadreDalja,miabuelaEstílitaymiabueloSebastián(q.p.d)porquesinsuamor,

apoyo y enseñanza no hubiera yo llegado hasta donde me encuentro ahora. A mis hijos Ricardo, Eyner y Eri.ck por su amor jncondicíonal, su paci.encja y su entusjasmo.

A Santy, Vicky, Wi.lly y Mary por su cariño, ejemplo y confianza.

Sin ustedes hubiera sjdo imposible

Contenido Resumen Abstract lntroducción

Capítulo l

Antecedentes Generalidades del género Musa El genoma del género Musa lmportancia económica de bananos y plátanos en México Selección e Íntroducción de cultivares resístentes Obtención de nuevos clones generados en los programas de mejoramiento convencional

Banano silvestre Calcutta 4 (Musa aoum/.naía ssp Oumannicoides) lntroduccjón de plantas genéticamente mocljficadas a través de la transformación genética Vector binario tipo cosmido pCLD04541 Principales pasos para la construcción de una biblioteca genómica con insertos de ADN de alto peso molecular Objetivo general Objetivos específicos Estrategia experimental Referencias

Capítulo ll

Preparación del vector binario pcLD04541 33 lntroducción

Materiales y métodos Obtención y purificación del vector de clonación

33 33

pCLD04541 Purificación del vector pCLD04541 mediante

35

gradiente de cloruro de cesío Linearización del vector pCLD04541 con la enzima

35

BamH 1 o Hi.ndl 11

Desfosforilación del vector pCLD04541 linearizado

Resultados Obtención y purificación del vector de clonación pCLD04541 Linearización y desfosforilación del vector pCLD04541 Discusión

Referencias

36 36 37 37 37 39 41

capítulo '11

Preparación de fragmentos de alto peso molecular lntroducción Materiales y Métodos Material vegetal Extracción de núcleos de Calcutta 4 Deteminación de las condiciones óptimas para la digestión parcial del ADN genómico con las enzima BamHl o Hi.ndlll Selección de los fragmentos de ADN de 100 a 400 kb

por electroforesis de campo pulsante (ECP) Resultados Extracción de núcleos de Calcutta 4 Selección de los fragmentos de ADN de 100 a 400 kb por electroforesis de campo pulsante (ECP) Discusión Referencias

Capítulo lv

Obtención de clonas BIBAC

lntroducción

Resultados Ligación del vector V41 con los fragmento de ADN seleccionados en las fracciones Fl y F2 Número de colonias necesarias para tener una bi bl ioteca representativa

Referencias

Discusión general Conclusiones Perspectivas Anexo

50 61

63 65 65

66

Materiales y métodos Ligación del vector V41 con los fragmentos de ADN seleccionados en las fracciones Fl y F2 Digestión con la enzima ~ofl y deteminación del tamaño promedio de inserlo

Discusión

45

66 68 68

RESUMEN Los

bananos

y

plátanos

representan

un

cultivo

de

gran

importancia,

:,|':c::ta:mb::::oenA:?Smgs,Íseessupnoabí:spg:aA::,fuecnet:trda:á":staesdeenAsta:r,yáE::n:syue| Caribe Sin embargo, este cultivo es amenazado por plagas y enfermedades que causan cuan{iosas pérdjdas en el rendimiento, y por consecuencia en las ganancias,

ap'r%cg\raan#?scodnees#.?orp.e#t.e,33osíyiÉ_-¿;ii:'á5S;í:e_yd_uv|cu!'or*:Snuqeung'aseeF:fsag=an=ofiÉadss prograrnas de mejoramjento para la producción de híbridos resistentes a las principalesenfermedades,nosehaobtenidoalafechaningúnbananooplátanoque cubra los requerimientos necesarios que exige el mercado internacional, en respecto como por ejemplo, la palatabilidad y la fisi.ología postcosecha.

Es um necesidad entonces, el buscar nuevas altemativas para la obtención de plantas resistentes de banano que mantengan las caracteríslicas originales de palatabilidad, tamaño de racimo y el tiempo de almacenamien{o, por ejemplo Una alternativaquepuedeserutilizadacomoherramientaparaelaislamientodegenesde i.nterés (como los de resistenci'a a enfermedades), es la construccíón de bibliotecas genómicasconinsertosdeADNdegrantamaño(enpromediomayorque100kb)a

#¿redneseesrp:C::tseF:S:Ssteen;eÉac:/rfyerAm,e„d;8:asc,ye:!"'Zpaanr:°sveegcut%r:#||:r::asn':fser:::':: resistencia parcial o total a vanedades susceptibles de importancia económica, a través de la transformacjón mediada por Agnoóacíeri.um. Esta herramienta no solo podrá ser utjlizada para el aislamiemo de genes, sino también para el estudio completodelgenomadelgéneroMusa,delcualseconocemuypoco.

Ean ss'o bp:e#ann'=¡.t:3ribaa.j?,ns^er.S,e^'.3uC^C'en_ó_ _=I_ bapaio silvestre dipio.ide Musa las ?acsu%gnaat?c,sosnpesbugEt2#na,gcoida:5-t:,OP6-.c^f,--c;iS;v8i3cvoÍ_t#=:ed.:;.ao,bsi'gxóegs:£pa=Egogds?ab%eucsear condiciones Óptimas para la construcción de una biblioteca genómica BIBAC, debido a que este banano es la principal fuente de resistencia contra la Sigatoka

:t:,?zr:d:peasraui:'zc:g:a:,:n'of:epá:g:,apTacsósdme,dTej:nr:rTo,,eáteonoc:?nvaedn.c,:nca[DOEJ5Z:?t:Í cual ti.ene un tamaño de 29 kb. El vector

pCLD04541 fue purificado utilízando dos

gradientes de cloruro de cesjo, posteriormente se linearizó con la enzima BamHl o HÍ.ndTIl y se desfosforiló.

Se aislaron núcleos de hojas jóvenes obtenidas de plantas ex vtíno y se incluyeron en agarosa de bajo punto de fusión formando bloques, los cuales fueron digeridosconproteinasaKparaliberaralADNyexponerloaunadigestiónparcialcon la enzjma BamHl o Hr.ndHl, ensayando previamente diferentes concentraciones de cada una para determinar las concentracjones Ópti.mas a las cuales se obtenían fragmentos de ADN entre 100 y 400 kb Para la obtención de estos últimos se procedjódedosformas:1)realizandounaprimerayúnicaselecci.óndefragmentosde ADN,y2)efectuandoprimeraysegundaselecci.ÓndefragmentosdeADN.

tantodeE±tv::tooor.238akrbz,a::mf:ed:gÉ£:2d534moaon:rba,::g:,%en::,eunnt:rce::c:3;f:aoTaTe]n2o3 14 (inseftovector) Se electroporaron 20 Ltl de células competentes DH10B usando

k_5G;L2,H:edsep:%3c,8:y2;eF,asqeueá:::r:Tngeed,,onsueLeecrt¿vod:Bcco::n::tsra::C::n#:aTn€e: (blancas)Posteriormente,afindecaracterizarlasligacionesobtenidasencuantoal tamaño de inserto y el número de colonias con vector sin inserto (clonas vacías) se analizaron colon.ias al azar (de F1), aislando el ADN recombinante med.ian¢ mini preparación y digiriéndolo con la enzima Non para liberar al inserto y determinar su tamañopromedioSeseleccionarondosligaciones,unaprovenientedelasfracciones

¡,r:o;ríí:2s;:::deB¡rT:#ecnot:su:,:aeTa::g:onmHe,:,á,¡ec:nnseuftnotg::2:#oym,:d::rae„Fnasc::: Con estas ligaciones se pueden constrw dos bibliotecas genómicas BIBAC

ii;,Ía::?án:oddceá:;:;i::n:cr:r;r:,:.:;dr:d::e:rtoeng:un:o:x::t,::::n::s:r::,:ti;'ro`:o:rai:la,:o:p:rn:;":ei:; estarán listos para ser utilizados en la transformación genética de plantas Agrobacterium

mediante

ABSTRACT

countr,e:::a:::t:a|dAE;,a=úánnsdaer:stmAPs,:a:Lecrreopti,eypaahr:cu:#,:n,o.pdosord;:::ooi,:,: bananasarethesourceofanimportantinputofforeigncurrencyinLatinAmericaand

:hneor%rLbsbFoasnsesH:nw:hv:ry,teh,'dsac:3Pth:tphrroefi:teb|,:;,bayffepcet:nt§8:fh€Lseeassme:„t:::dcuacuesr: and the large banana expo" companies Although many resistant hybrids have been obtained from conven{ional breeding programs, to date none of the resistant banana hybrids developed attain international s{andards, in respect of for example, palatabi.lityandpostharvestphysiology

M js therefore necessav to search for new alternatives to obtain disease resistant banana plank that maintain their original traits such as palatiabmw bunch size and sheM life. An alternati.ve triat can be used as a tool for the isolation of

:nfteáfsset:nsgeg:ens:stasnutchw::r:s:s::enscea::necsu,,t,,::hmeui:eosf:arggeen;n::chg;rnao,::c,árnar,::

;ohTcs;r::tne3ewiha,:'tga'n:do::cbu::[:e:goh,,taDnTAAárooór:c!::,:;ogukbbs,e::,:gt';,,|:svp::::3í: to

transfer

parcially

or

totaw

this

resistance

by

Agnoóacíenum-mediated

:r,3:sí:rc::t:o:igtn:f,::n%oennooT,Fca::s:|Pcoensafnotrti:ssct:gt;bá:tx:r#sasguecnhoLb:ar,esmay lnthisworkthewimdmbananaMusaaoum7naíasspbumannícoidestype

:fa,::s%t:hcweasksn:,::te:gt:,::tnsár,::tkag%na:omk,:„£:adv,,sbeug:dsef:r,stth[:mp:,rnpossoeur:: :::#t't%T:'e3r3%dL3go4P5r4°íg,rawmh:chhTahse:esc,tz°eroufs28kf8r+t::8:B84;4aísvt::to:'nwaa? #TtrÁfi;gmu;',nogr#:di?,Uannddsd°efpcheos:;To#::'gegradlents,Subsequentlyitwashneanzed Nuclei were isolated from young leaves obtained from ex vitro plants, these were embedded in agarose plugs (LMP), and di.gested with proteinase K. A wjde range of restriction enzyme concentrations were used to obtain the optimal partial digestion conditions wm BamHl or H/ndlll in order to obtain fragments between 100

::g,42°)°fii:t::d°sper:::8U::zsews:i:c't:oS;e:ft°DR&{a;rna:r£%Tt:n+She`),nae:::zte%'Zvees:J:C*:: Iigated independenw wm the fragments from F1 (100-250 kb) and F2 (250400 kb) using molar ratjos of 1.2 or 1.4 (inseh..vector). Twenv mi.croli.tres of competent cells

LDeHdíuo:)w#rteet::eccyt:#:,a,t:ÍGW,áhnd|;-HéAo[2Á,ft::t2:,Lgiht:d.::!e:nod,p,:act::g,nnaLn: cells (white) were recorded Subsequently, with the aim of characterizing the ligations

í::tJ:c,tno:::oiázt:daE;thme,nn,:re::rd?gfeesTepdvw:toh,o;;efls,ecn:,yo:,:stowreer,ee:::d,::,,yns:L:cáendd theaverageinsensizeestimatedbypulsed-fieldelectrophoresis.

ave,ageT,#e,Lg3izoen:fw,e2r:i:,:Cnt:dth:noethf::Trof:gfra?nJseft,ged:;eedst:áthwpt:mHT;dY,',thwit: :Fbaavne::3ed:Fceuh"S'Zec:fníb2e2c2o7n5tbruc#oih4eosxet'hgea#:;Fo#:eBn':#:s:::°gTv',:;'baragr¿eo/: ofprobabilivofincludingaugenesinthelibravThisisthefmttransformation-ready banana genom.ic library constructed with a binary vectctr.

lNTRODUCCIÓN Los

bananos

y

plátanos,

pertenecientes

al

género

Musa,

son

F.,gTen!Io±LS?_#,con_ape_soa_rs€=ohne#osana&aioc±su*iaeotFiicg#FiasR.b!3_f_5!?=_ag_géoon?fdoeECs_r#E:,pngrc£enes 8'hp:°p'£::ed?[°9P5°5r)C'°nar°n

'OS

genomas

A

y

8

respectivamente

(Simmonds

y

Los cultivares comestibles son considerados tanto alimento básico, como

:Tg-:rhóap|:eosfu::Leeá:sgaÁa:,:,:,s;:n,g:a,p::seei::avJ:§c:ft,Joesa:ÍLo:,:i,c::,,?se:rpóupé:oseí ap^ror_:_z_ü.nt:'gaomyphga:azngsedeencvuaí,net€a:d¿€:!tF:,aa-dión de un contiguo de 1.2 Mb

trifol'ala)

Lotusiaponicus

(Fom-2) que confiere resistencia almarchitamientodelmelóncausadaporFusanum

ldentificación de clonas que comienen

D

Gentzbittel eí a/ 2002

Kaufmann eí a/ 2003

VECTOR BINARIO TIPO COSMIDO pCLD04541 El vector pCLD04541 fue construido inseftando un fragmento de 9.1 kb que contiene al sitio cos (para el empaquetamiento en lambda), el gen 35S-NPTll (qLie confiere resistencia a kanamicina) y un sitio múltiple de restricción "dark Bluescript' (dBS), dentro del sitio de restricción Scal del plásmido pSLJ1711 (Jones eí a/ ,1992); éste a su vez fue derivado del plásmido pRK290 (Difta eí a/ ,1980), (figura 2). El sitio múltiple de restricción dark Bluescript (dBS) contiene sitios para

múltiples enzimas, varios de estos son únicos en todo el plásmido, de tal manera que permiten linearizar al vector para la introducción del ADN foráneo; además, este sitio proporciona un color azul intenso, diferente al color azul que normalmente se desarrolla en colonias de E. co//. sobre 5-bromo4-cloro-3-indolid-beta-D-galactosido (X-Gal) e lsopropiltiogalactosido (lpTG), lo que contrasta mejor y permite distinguh

más fácilmente las clonas blancas positivas Esto último representa una gran ventaja en un vector binario de baja copia (5-8 copias por equivalente cromosómico). Como se muestra en la figura 2, el pRK290 contiene un gen bacteriano que confiere resistencia a tetraciclina.

Para consultar sobre su secuencia y mapa de restricción, el número de accesión es AF 184978 en el Genebank.

RI-K (69"

(4¥oS`íg|(is|2),j (28i2) sínj:5zpsr

Figura 2. Vector tipo cósmido pCLD04541 de 29 kb. dBS, sitio múltiple de re§tricción del ''dark bluescript"; *

::,no:md,:,:ea:t¡:c;,,Ógne:ná=rsés=tséns::áoap:ertarae:,:,TnEaque,am,entoen,ambda,35S-NPT„ionfiereres,stenc,aa

24

PRINCIPALES PASOS PARA LA CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA GENÓMICACONINSERTOSDEADNDEALTOPESOMOLECULAR La metodologi'a para la construcción de bibliotecas con insertos de ADN de altopesomolecularhasjdosjgnificativamentemejoradadesdequelossi.stemasBAC, PAC y PBC fueron establecidos. En la figura 3 se muestra el procedjmiento generalmente utiljzado en la cons{rucción de bibliotecas con insertos grandes (la mayoría de más de 100 kb), su clonación en bacterias y su ordenami.en{o (Zhang, 2000). Este mjsmo esquema ha sido utilizado exitosamente en la construcci.Ón de varias bibliotecas BAC, PAC y BIBAC de plantas, ani.males, insectos y microorganismos, y consi.ste en los siguientes pasos.

a)

Preparación del vector. El vector debe estar totalmente purificado y ser de la más alta calidad (Íntegro y m de ADN bacteriano), se debe realizar una djgestjón apropiada (nunca sobredi.gerido o poco digerjdo) y desfosforilarlo completamente.

b)

Extracción de núcleos. Se extraen núcleos de las hojas y estos son jncluidos en agarosa, donde posteriormente son someti.dos a di.gesti.ón con la enzima protei.nasa K (para di.gerir las proteínas nativas entre las que se encuentran las de la membrana nuclear) y dejar libre al ADN genómico.

c)

Djgestjón

parcial

del ADN

genómico.

La

parte técnica

más

djfícil

del

procedimiento es la obtención de fragmentos de ADN del tamaño requerido (100400kb),estosúltimossonobtenidosatravésdeunadjgestiónparcialdel

áepeNccFoenaa,¿%::sounmgo¿;c::ara;caor:tseaT,duot,,,::n¿ooseí:ocTruoef:reds:sadgear::ajp: pulsante (ECP).

d)

Ligacióm La inserción de los fragmentos selecci.onados en el vector es otro de los pasos cruciales, debido a que se debe optimjzar la relación inseho:vector.

e),Er3rbs,í:tremc:c,::tbr::tsefrá:::,c,,g:ná,:,cÉc:Óo7,d:o:,oe|aASDPNoS,:,cvá#,:::taemabs,F:::: el número total de clonas requeridas para tener completa la biblioteca dependen estrechamente de las células competentes utiljzadas. Una ligación eficienti3 introduci.da en células competentes con una efici.encja de {ransformación menor a 10" colonias/Hg de ADN requerjrá, entre otros, de un mayor número de eventos de transformación, de un mayor número de cajas

Petri, lo que al m encarecerá de manera impohante la construcción de la biblioteca. Por lo tanto, se recomienda utjlizar siempre células comerciales como las DH10B de GibcoBRL que poseen una efi.ciencia de transformación mayor a 10`° colonias/Hg de ADN.

25

Objetivo general Establecer las condiciones Óptimas para la construcción de la biblioteca

genómica del banano silvestre Musa acum/naía ssp burmannicoídes tipo Calcutta 4, utilizandounvectordetipoCromosomaBacterianoArtificialBinario(pCLD04541).

O bjetivos es pecificos 1.-

Purificar el vector binario pCLD04541 a través de una lisis alcal.ina y

utilizando dos gradientes de cloruro de cesio

Linearizar al vector con la enzima

BamHl o Hi.ndlll y desfosforilarlo.

2.- Obtener núcleos de hojas de Calcutta 4, incluirlos en agarosa de bajo punto de fusión y digerirlos con proteinasa K. El.iminar la proteinasa K lavando los plugs con PMSF 3.- Digerir parcialmente al ADN genómico con la enzima BamHl o Hi.ndlll para

obtener fragmentos entre 100 y 400 kb. 4.-Ligar los fragmentos seleccionados de 100 a 250 kb y de 250 a 400 kb al vector pCLD04541 (linearizado y desfosforilado) utilizando una relac.ión 1.2 o 14

(inseno.vector) para cada zona (Fl o F2). 5.- Transformar células de E. co// DH10B (por electroporación) con las l.igaciones realizadas, util.izando 1.5 o 2 LLl de cada una,.

6.- Caracterizar las ligaciones en cuanto al tamaño promedio de inserto y el número de clonas sin inseho. Calcular con base en el tamaño promedio de .inseho el número total de clonas que serían necesarias para tener representado 10x el genom.a haploide de Calcutta 4 con un 99 % de probab.ilidad de encontrar cualqu.ier secuencia de interés.

E§trateg ia experimenta l Se purificó, Imearizó y desfosforiló el vector pCLD04541, paralelamente se

extrajeron núcleos de hojas ióvenes de Calcutta 4 crecidas en invernadero y se incluyeronenbloquesdeagarosadenominados"plugs".Éstosfueronexpuestosauna

;:,ruc:#edne,:,s:ánci:::ozleJ:asaa#,a:a::bne,a;nad,?Ds:uEt:,,ióD:,gcet::fT;S:,:u:ed:gae#: pulsante para cuales fueron vector,1:2 y con 1.5 o 2

separar los fragmentos originados en el rango de 100 a 400 kb, Ios ligados al vector pCLD04541 bajo dos relaciones molares de inserto: W Se transformaron, por electroporación células de E. coW (DH10B) Ltl de las ligaciones efectuadas; Ias células transformadas fueron

plaqueadas en el medio selectivo LB con tetraciclina, X-Gal e lpTG. Las cé" recombinantes (blancas) fueron analizadas para estimar el tamaño promed.io del inserto y ei número de clonas sin inserto. Con esto se determinó que relación Tolar inserto:vector y que cantidad de l.igac.ión utilizada en la transformación fueron meiores para obtener una mayor eficiencia de transformac.ión. Por último se estimó el número total de clonas que se requieren para tener una bibl.ioteca representativa de Calcutta 4_

26

DELA

Q4muTTA 4

em#bkdgeef"ug#oT3#%rrosa

.

Digestión parcial de ADN con

- BamHl o Hindlll y selecci.Ón de

L,neaá,::fco]gfno%nc,g:::+%,#,,w

fragmento de 100400 kb utilizando

ECP Vector ljnearizado

Ligación

(T4 'jgasa)

^ Plásmido con inserto Transformación de E. co//. (cepa DH10B)

Células recombinantes en medio LB selectivo con Tetracicli`na, X-Gal e

lpTG

Ordenamiento al azar de cada biblioteca

Figm2.Esciue"generalparalaconstruccióndelabiblio{ecadeCalcutta4utilizandoelvectorbinario

!:pooor:é::#:.::|:#b#ote®E,noordseen:eT:e:t:qsuee:esfi::Leoieqnuaeda,:sdec:ocnuaesm3ua€:np.ss::,::esne,gu=ndc::,::

?'-8inL::-ab::Poef:::r:-,3|np¿::i-;aé:as_aD?#:,áaó:,á::t,,gi,Gd,e,::rpnr:rp:,'t,:ga%::dmofores,Sdeffimpopu,sante,

27

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:awnekns,j?,,tsR3a#av:u:y:,:;::eT'ra:npd,,#9;#:,:::Bgá,,,g!:,;!,:£aj:ks::ees,,Sa::,,n:,a:ta,n paradi.gm

for

map-based

gene

cloning

in

plants

wim

large

genomes

Tao,Q.(aRnedv£#tnTgr#3.'n(iG983;t'8iónJ,|dpapn33s-{6asbiemaintenanceofDNA fragments over 300 kb in Echerichia con with conventi.onal plasmjd-based

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32

CAPITUL0 11

Preparacjón del vector binario pCLD04541 lNTRODUCCIÓN

ElprimervectorbinarioBACdesarrolladoparaserusadoenlatransformación

:::ae:t:j::fit:p:ieto:b:t:i:Ía!dn:due;'gga::nnd`eEaecTa::ti:acd:eíít,pp:::c;,,á::n,2,,-e2muc:oap;i;.,c:e#:o,,:: r:jjiri:::r::un`t::?ár::;,,tdee:va:aq:;e:s:|!,::;t:ae,:a3:tí":3:,:::n:sd:e::t:p:oa::n;:Zah:::iíro:o;o!r:cícéónfa?saor: Comosemencionóenelcapítuloantenor,losplásmidosycósmidoscomolos BACsyPACs,puedenmantenerestablesgrandesinsertosdeADNforáneo,además dequepermitenunamejormanipulaciónypurificacióndelADN,yunamejorselección

;asrt::3:i4:,:,aá,et:;fo(:a:d::ó:naz:,iern::d:ut;v:ogsd8!,á,g::c5;p,#:ig;vR:,ien:t:;:dL:;myuot:f;:aii:;¡r:a::;:r elaboracióndebibliotecascomplementariasyelgen/aczcomomarcadordeselección de células recombi.nantes. La preparación del vect" de clonación BAC o BIBAC es uno de los puntos más críticos duranb la construcción de bibliotecas genómicas y consiste en la purificacióm la linearización (corte del vector con una enzima de restricción), y desfosforilaciónparaevitarlarecircularizacióndelvectordurantelaligación

la

MATERIALES Y MÉTODOS ElvectorpCLD04541fuedonadoporelDrHong-BinZhangdeTexasA&M University, College Station, TX

OblenciónypurificacióndelvectordeclonaciónpCLD04541

Texas AS&e#n,:v::s,;:tco:,%á%,,astraet%onTaTdxa en e, manua, de, Dr Zhang t2ooo, de

;éLSDeo4P:a4q|Tesaorgrnecmé:uá:ossdó:,,d:t:CBk,tdr:pt:naco,,;g?LT|eox:rárc::sá:r:::3:,:o5ng:i,VR:,8í 10gm)conteniendo15Hgmdetetraciclina,60Hg/mlde5-bromo4-cloro-3-indolyl-

::,tt:v-:-ag3;a:!oá,:roaíte-%La,,:,n:cHhgéT;adr:,:s:t[::::áonga,:cct:,so,:,:Í,Fn|:)dyu::srec,Óe, 33

2-Seseleccionóumcoloniaazul,seinoculóen50mldemedioLBconteniendo15

53/rT`,ad:btteet:ac:;Ci`::,¥nsóec:,U:t`Vóa37C'Cenagitación(2"rpm)durantetodaianoche 3-Setomaron5mldelinóculo,seadicionarona500mldemedioLBcon15Wde

tpert:::`rc:`rnoan:nsteot:r!t'Y,?roas3:c°uFt,::ag`tac`Óna250rmdurantetodaianochese

:#:ScPuuai;udeed%-%;°rasdecreclmlentodelcuwosemidioladensidadópticaa6oo 5-Seañadieron5mldeunasoluciónstockdecloramfenicol(34mg/mlenetanoopor cadalitrodecuMysecontinuóincubandopor14horasa37°Cenagitacióna250 rpm.

6.- Se alicuotaron

células en cinco tubos de centrifuga . _ __ _i:.`i.Á de 250 ai e^hrenadante ml y se

las céiuias en

i,iiiuu `u,,v. ._

__

_

_

getr;feusguasr:enna,::2d°agpg::,,,ta5eT`To%4mi:epT°Estf:,r¿°rmenteseeliminoeisobrenadante 7-Secentrifugóa5520g(rotorJA-14deBeckman)por10rnma4°Cyseeliminóel

igobr:nMai:n::u:::ar:i3,,p2áahsMedr:STur:sP-eHng,,:pCHagipast,,,aen,om,de,aso"„ 8-Se añadió a cada tubo 1 ml de una solución de lisozima (10 mg/ml, recién

3rae,gaá:gdea,,:Ta:opTrTd::::iu-,:Fe,spHEs8,myusye,#ánat:eumnp:Latgr:a::b:eunete,ap?,::zLl: sea eficiente.

:o7osdeeasñ38`)óyas=#e£:PÓ°g:r°anmd`od:,'taubs:`£`nónm'|cr::`édne,%raedpeazr:dhaa!?a2q¥ed:eNf%9mHó unasoluciónmuyviscosaytransparentePosteriormenteseincubóentiielopor5min 10 -Se adicionó 15 ml de la solución 111 fria (5 M de KOAc, pH 4 8-5 3) y se agitó

suavemente por inversión para mezclar, formándose un precipitado blanco que consiste en el ADN cromosomal bacteriano, el ARN de am peso molecular y el compleio de potasio/SDS/proteína/membranas Finalmente se incubó en hielo por 5 min.

11-Secentrifugóa5520g(rotorJA-14deBeckman)por10mma4°Cysefftúe` sobrenadante de cada tubo a través de cuatm capas de "cheesecloth", el filtrado se colectó en tubos limpios.

12-Se añadieron 06 volúmenes de isopropanol a cada tubo y se incubó a temperatura ambiente por 10 min.

13 -Se centrifugó a 15 300 g (rotor JA" de Beckman) por 10 mm a temperatura amb.iente y se eliminó el sobrenadante. 34

14 - Se invir(ieron los tubos para que todo el líquido escurriera, se enjuagaron las

ggáe:e,sroi:r':i-t#odsec3:c:t:::,,a:o7ro|oío:,n,eamt:ei:teurraatuarTba,;nbtF;n::,cseentdr::ggnaó,ei sobrenadanteysede,Óst=:cá;.€=.óarsvti,,,=. 15.-Se disolvi.ó todo el ADN en 15 ml de TE.

PurificacióndelvectorpCLD04541(V4nmedian.egiadientedecloruro de cesio. 1 L Se vertú la solución de ADN plasmídico m ml) en una probeta graduada (de

t2o:a:8í6gíá,Seagregóío8gdec,orurodeces,osÓ„porcadam,deso„ten 2 -Se añadió 12 ml de una solución s(ock de bromuro de etidio (10 mg/mo a la solucióndeADN/Cscl,semezclómuybien,sedeterminóelvolumendeestasolución

(21"asícomoelpesodelaprobetacontodosestoscomponentesDNA+Cscl+EB

:;27|d2::,,,d:,'ópae:n:tr:::2::naár,P:aá:á;itp:;ini|epn:t:3ed:e!::osR:r3;:::tá:a:,e2d3;ugeD-N;¡.2¡8s5!,:gE;á,¥s;tig g:,:Sc',::deensttuuvb°osdednetr:edn:;,fruagna9°oi¥,%eer:í°tuqbue:edsedBee:k5jaín6yg:g'eqsu:hgreapr::'t:o': glicerol hasta casj el tope de los tubos.

396og%o:,¡gv#pynor:o2oS2:e:¥É#ng£:o*:eánn„3fuu,:o%n¥aw"3gcdeent:\e"c5:axnL.tsvoe\d:a#cdke#:on:o=

4 - Se sacaron los tubos de la centrífuga con mucho ciiidado Se observaron dos

viea:n:::sg:diu:b;::r:araoig:un::a:ed:e:i=hraéfruá::i,:urg:::t::,:,t::f:::::Lipgrix:,i::r:bm3:i;:,á::::y:v,:,, alvectorcircularV41Seformótambiénunapastillarojaenelfondodeltubo,que conteni'a un comple/o de ARN y bromuro de etidjo

5 -Se inserffi una agup (número 21) en la pane superior del tubo para permim la entrada de am La colecta de la banda inferior, que correspondía al vector V41, se

reahzóuki:Zban8°e:,::J:r'qnugea::nmaugyuJ,amg:'nnaunTee::;:rezadeipiásmido,fuenecesario hacerunadoblepurificaciónengradienedeclorurodecesio,repitiendodelpaso1al 5.

6 - Se recuperó la banda de ADN, se lavó con una solución de alcohol-isoami.Iico saturado con agua (bien agl.tada antes de iiearia\ h --.--.-_ _ _ ' -' 'v`,`-' , ' ' '',\J completamente el bromuro d:9:[t:dq,:, ::tt:Ses:eha:tsaar:au)e ::Sobbtuqv:eunsae ::T:,:': jncolora de ADN/Cscl.

35

::-,nu:#::::du:Óis:oa|Pás%o::irg!,:rgJ:aA!2:eN?(éia::ái:#Tpvo3r,e:Tneiniisoa:eo4:%ap:rs,e5amñ,:d,`oy:: 8 - Se eliminó el sobrenadante,

se lavó la pastilla con etanol al 70% (dos veces),

gnÁrbf#g::dd:S:,:,ot2eí088(t:t3reJfÉ20Ftneapme:*t:asn!E%:e'rom#'|:e£:::iirapc:3th"aey| ADN plasmidico en iin gel de agarosa al 1%, utilizando como estándar el ADN de lambda.

LinearizacióndelvectorpCLD04541conlaenzimaBamHlocon"M La mezcla de reacción para linearizar con la enzima BamHl se realizó

adicionandolossiguientescomponentesH20bidestiladaestéril,238hADNV41,100 Lil(10Lig),amohiguadordereacción10x(lnvitrogen),40Lil,espermidina40"20h Bamm(10U/m2Wparaunvolumenfinalde400ulSeincubóa37°Cpor2horas,

go3S;eor¿ormenteSeleañadió1tilmU)másdeenzimaysedeióincubandooühora La mezcla de reacción para linearizar con la enzima H/ndm se rea% adicionandolossiguientescomponentesH20bidestiladaesté"240Lil,ADNV4t98 Lil(5ug),amortiguadordereacción10x(lnvitrogen),40Hl,espermidina40"20Lil, H/ndm(10U/m2hparaunvolumenfinalde400LilSeincubóa37ÓCpor2horas

posteriormenteseleañadió1W(10U)másdeenzimaysedeióincubandootrahora a 37 OC_

near,zaE:r,f,=a:,ó%adme±,veocto=:,neHa,r:áf,ÍoseAa::c,oT:zc:andveo,:ema::,Ó¡4odoe,HT;ctdo:

fíc:::í¡;,te:i;e:it::iuH!,::3iM;;:g:rEÍ55n;r:fnumro,!,t:óp6!2;t;ioeiim::s;ri:du::i:c:e:n#:d:o:ri::5,lí;áíi;j:P::;d::r

10 mim se descaftó el sobrenadante y se lavó la pastilla con etano` al 70%, se centrifugó a 10 621 g por 5 min, se secó la pastilla y se disolvió en 400 H de H20 bidestest.ilada estéril.

Desfosforilación del vectoT pCLD04541 linearizado. vector l.inear.izado estuvo

La mezcla . de .__i_^ reacción para desfosforilar el 48 5 ul; vector linearizado ^^n`n^nan+a