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Ley N° 30035 Ley que regula el Repositorio Nacional Digital de Ciencia, Tecnología e Innovación de Acceso Abierto
UNIVERSIDAD NACIONAL “JOSÉ FAUSTINO SÁNCHEZ CARRIÓN” FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS INDUSTRIAS ALIMENTARIAS Y AMBIENTAL
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERIA AGRONOMICA
TESIS “OPTIMIZACIÓN DE CINCO MEDIOS DE CULTIVO EN CUATRO FASES DE MICROPROPAGACIÓN EN CINCO ESTADIOS ENTRE VARIEDADES DE Phalaenopsis”
PRESENTADO POR:
LILIANA ROBLES CABELLO PARA OPTAR EL TITULO DE
INGENIERO AGRONOMO
Huacho, Abril 2014
UNIVERSIDAD NACIONAL “JOSÉ FAUSTINO SÁNCHEZ CARRIÓN” FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS INDUSTRIAS ALIMENTARÍAS Y AMBIENTAL
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERIA AGRONOMICA
TESIS “OPTIMIZACIÓN DE CINCO MEDIOS DE CULTIVO EN CUATRO FASES DE LA MICROPROPAGACION EN CINCO ESTADIOS DE VARIEDADES DE Phalaenopsis”
PRESENTADO POR: LILIANA ROBLES CABELLO
Miembros de Jurado
______________________ Ing. Sergio Contreras Liza Presidente
____________________________ Ing. Dionisio B. Luis Olivas Vocal
__________________________ Blgo. Desiderio Elías Cotos Duran Secretario
___________________________ Blgo. Carmen E. Rojas Zenozaín Asesor
DEDICATORIA
A Dios, a mis padres COSME ROBLES y FLORIZA CABELLO quienes con su amor y apoyo incondicional lograron que forjara este objetivo.
A las personas que estuvieron detrás de toda esta investigación, como mi Patrocinadora Dra. Lourdes Tapia y Asesora Blga. Carmen Rojas, por el aliento constante para finalizar lo comenzado.
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto de Biotecnología de Cultivo de Tejidos de la Universidad Nacional Agraria La Molina; por su apoyo
en la realización de mi trabajo de
investigación.
A Todos Mis Maestros de mi Alma Mater, cuyos docentes que me vieron crecer académicamente son mis jurados y asesor.
INDICE GENERAL Pág. I.
INTRODUCCION
01
II.
REVISION DE LITERATURA
02
2.1 Generalidades de Phalaenopsis spp.
02
2.1.1 Antecedentes históricos
03
2.1.2 Hábitat de desarrollo y tipo de crecimiento
03
2.1.3 Descripción morfológicas de las orquídeas
03
2.1.4 Descripción morfológica de Phalaenopsis spp.
05
2.1.5 Clasificación científica de Phalaenopsis spp.
06
2.1.6 Distribución
geográfica
natural
y
ecológica
de
06
Phalaenopsis spp. 2.1.7 Requerimientos climáticos y de fertilización 2.2 Reproducción in vitro
06 13
2.2.1 Antecedentes de la reproducción in vitro de orquídeas
13
2.2.2 Reproducción in vitro.
17
2.2.3 Reproducción a partir de semillas
17
2.2.4 Reproducción asexual
18
2.2.5 Medios de cultivos
19
2.2.6 Medios de cultivos alternativos en la propagación de
23
Phalaenopsis spp.
III.
2.2.6.1 Sustancias orgánicas complejas
23
2.2.6.2 Carbón activado
24
2.2.6.3 Medio Murashigue y Scoog
25
MATERIALES Y MÉTODOS
27
3.1 Ubicación del Experimento
27
3.2 Materiales
27
3.2.1 Material Vegetal
27
3.2.2 Materiales de Laboratorio
27
3.2.3 Material fotográfico
28
3.3 Tratamientos
29
3.4 Diseño Estadístico
29
3.5 Métodos
29
3.6 Características Evaluadas 3.6.1 En Protocormos
29
3.6.2 En Plantas
29
3.7 Conducción del Experimento
IV.
29
30
3.7.1 Proceso de Selección de Material
30
3.7.2 Medios de Cultivo
30
3.7.3 Condiciones de Cultivo
31
RESULTADOS Y DISCUCIÓN
32
4.1 Números de Brotes de Protocormos de Phalaenopsis spp.
32
4.2 Plantas Pequeñas de Phalaenopsis spp.
33
4.3 Plantas medianas de Phalaenopsis spp.
34
4.4 Plantas grandes de Phalaenopsis spp.
36
4.5 Comparación de los Tratamientos con Respecto a los Estadios
37
V.
CONCLUSIONES
39
VI.
RECOMENDACIONES
40
VII.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
41
VIII. ANEXOS
45
INDICE DE TABLAS Pág. Tabla 1. Temperaturas óptimas para “orquídeas” (Gil, 2007)
08
Tabla 2. Fertilización de propósito múltiple (Gil, 2007)
09
Tabla 3. Función de dosis de fertilización (Gil, 2007)
10
Tabla 4. Tipo de sustrato de acuerdo al grosor de la raíz (Gil, 2007)
12
Tabla 5. Componentes de los Tratamientos
29
Tabla 6. Análisis de varianza en la influencia de los medios de cultivo con
33
respecto a numero de brotes Phalaenopsis spp en el estadio protocormo Tabla 7. Análisis de varianza en la influencia de los medios de cultivo con
34
respecto al tamaño de la planta Phalaenopsis spp. en el estadio pequeño. Tabla 8. Análisis de varianza en la influencia de los Medios de cultivo con
35
respecto al tamaño de la planta Phalaenopsis spp. en el estadio mediano Tabla 9.
Análisis de varianza en la influencia de los Medios de cultivo con
37
respecto al tamaño de la planta Phalaenopsis spp.en el estadio Grande Tabla 10. Análisis de varianza en la influencia de los Estadios Pequeño, Mediano
38
y Grande Medios de Phalaenopsis spp. con respecto a los Tratamientos Tabla 11. Composición y preparación del medio Murashige y Skoog
54
Tabla 12. Componentes del T0
55
Tabla 13. Componentes del T1
56
Tabla 14. Componentes del T2
57
Tabla 15. Componentes del T3
58
Tabla 16. Componentes del T4
59
Tabla 17. Componentes del T5
60 51
INDICE DE FIGURAS Pág. Figura 1. Prueba de Tukey para determinar el incremento del número de
33
brotes con respecto a los medios de cultivos de Phalaenopsis spp. en el estadio protocormo. Figura 2. Prueba de Tukey para determinar el incremento de crecimiento con
34
respecto a los medios de cultivos de Phalaenopsis spp. en el estadio pequeño Figura 3. Prueba de Tukey para determinar el incremento de crecimiento con
36
respecto a los medios de cultivos de Phalaenopsis spp. en el estadio Mediano Figura 4. Prueba de Tukey para determinar el incremento de crecimiento con
37
respecto a los medios de cultivos de Phalaenopsis spp. en el estadio Grande Figura 5. Prueba de Tukey
para determinar el Análisis Combinado entre los
39
Estadios GRANDE, MEDIANO Y PEQUEÑO de phalaenopsis spp. en influencia con los Tratamientos.
Figura 6. Descripción preparación medios de cultivo
46
Figura 7. Selección solo del estadio protocormo
46
Figura 8. Siembra del estadio protocormo
47
Figura 9. Estadio de protocormo sembrados
47
Figura 10. Aislamiento de plantas pequeñas
48
Figura 11. Siembra de plantas pequeñas
48
Figura 12. Plantas pequeñas sembrados
49
Figura 13. Separación de plantas medianas
49
Figura 14. Siembra de plantas medianas
50
Figura 15. Plantas medianas sembrados
50
Figura 16. Selección de plantas grandes
51
Figura 17. Siembra de plantas grandes
51
Figura 18. Plantas grandes sembrados
52
Figura 19. Sellado de los frascos sembrados
52
Figura 20. Experimento instalado en la sala de incubación
53
RESUMEN En nuestro país, las “orquídeas” son plantas ornamentales muy apreciadas por su belleza, y en consecuencia su diversidad existencia se encuentran amenazadas por diversos factores como la depredación, el comercio ilegal, etc. Este trabajo de investigación propone una herramienta de mitigación de este problema, con la micro propagación de
Phalaenopsis spp. en cinco medios de
cultivo para cuatro fases de multiplicación en cinco estadios diferentes. Se evaluaron plantas de cuatro estadios: protocormo, pequeñas, medianas y grandes; donadas por el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Agraria La Molina. Los cinco tratamientos fueron: Medio Basal (T0), Medio Basal + Agua de Coco (T1), Medio Basal + Plátano Maduro (T2), Medio Basal +Plátano Verde (T3), Medio Basal + Plátano Verde + Agua de Coco (T4) y Medio Basal + Plátano Verde + Agua de Coco + Regulador de Crecimiento (T5) El diseño experimental , con cinco tratamientos y cuatro repeticiones y sometido al Programa Estadístico SAS. Resultado significativo para el estadio protocormo se encontró en los tratamientos T3 y T5; pequeño T5 y T4; mediano T3 y T5 y grande T5 y T4 La producción del cultivo In Vitro de otras “orquídeas” utilizando estos medio de cultivo (plátano seda verde y líquido de coco) reduciría los costos de propagación y por ende ayudaría con la preservación de diferentes especies.
ABSTRACT
In our country, "orchids " are ornamental plants and high prized for their beauty, therefore its existence and diversity are threatened by various factors such as predation, illegal trade, etc. This paper proposes a tool to mitigate this problem through
micropropagation
of Phalaenopsis spp. by culture in five multiplying medium in four different stages. The material was donated by the Institute of Biotechnology of the Universidad Nacional Agraria La Molina: protocorm, small, medium and large. The five treatments were: Basal Medium (T0 ), Basal Medium + Coconut Water (T1 ) + Basal Medium Ripe Banana (T2 ) , Basal Medium + Banana Green ( T3) , Basal Medium + Green Banana + Coconut Water (T4 ) and Basal Medium + Green + Coconut Water Banana Growth Regulator (T5 ). The randomaized experimental design, with five treatments and four replications and subjected to SAS Statistical Program. Significant result for the protocorm stage were found in the T3 and T5, for small T5 and T4, medium T3 y T4 and large T5 and T4,
The in vitro cultivation production using these culture medium ( liquid silk and green banana coconut ) would reduce costs and thus help spread the preservation of different “orchid” species.
I.
INTRODUCCIÓN
Las “orquídeas” pertenecen a la Familia Orchidaceae, se estiman unas 25 000 especies
repartidas en 750 géneros, en Perú existen alrededor de 3 000
especies de “orquídeas”; la diversidad de microclimas en el Perú permite una gran variedad de “orquídeas”, han sido apreciadas desde épocas precolombinas por las culturas nativas del Perú. Son cosmopólitas, es decir que las podemos encontrar desde selvas hasta desiertos. La diversidad de “orquídeas” está amenazada debido principalmente por la destrucción de su hábitat, la agricultura, la ganadería, la expansión de zonas urbanas, la apertura de vías de comunicación, a tala inmoderada, el comercio ilegal de especies, la sobre colecta, etc. En el Perú, las zonas donde habitan las diferentes especies de “orquídeas” son terrenos divididos en parcelas y como consecuencia cada propietario las depreda de manera indiscriminada para luego comercializarlas en viveros locales/nacionales o internacionales. Sin embargo estas seudoempresas deberían instalar un banco de germoplasma para la preservación masiva de las especies nativas de la zona. Una de las técnicas de producción de “orquídeas” que ayudan en la conservación y su propagación es el cultivo in vitro de tejidos vegetales. La obtención de un número mayor de plantas posibilita su posterior distribución industrial a viveros comerciales, reduciendo la extracción ilegal de su hábitat natural e incluso se podría tener la posibilidad de reintroducirlas a sus sitios de origen mientras no se cause un desequilibrio en su ecosistema.
1
II.
2.1
REVISION DE LITERATURA
GENERALIDADES DE Phalaenopsis spp.
2.1.1
Antecedentes Históricos:
Las Phalaenopsis spp. Fueron descubiertas por G.E. Rumphius que las catalogó y dibujó en el “Herbarium Amboinense” publicado en 1750 con el nombre de”Angraecum AlbumMajus”. Pero fue en 1752 cuando el Botánico C.L. Blume. dió por primera vez el nombre Phalaenopsis a esa variedad de “orquídeas” procedentes de Java, Indonesia, Asia; pues por su forma recordó a las polillas de movimiento. De ahí su nombre que deriva de “Phalaena = mariposa” y “Opsis = parecido”.
2.1.2
Hábitat de Desarrollo y Tipo de Crecimiento:
El hábitat de una orquídea es el lugar donde se desarrolla y se adapta mejor;
por tanto, aquellas “orquídeas” que se desarrollan únicamente
sobre ramas y troncos de los árboles sin penetrarlos (sólo cumpliendo la función de soporte) y cuyo alimento lo obtienen del aire, agua de lluvia y desechos de la corteza del árbol, se denominan epífitas (SCO, 1965). Por otro lado, aquellas “orquídeas” que se desarrollan a nivel de suelo, en este caso el pseudobulbo se ha modificado y las raíces cumplen la función de almacenamiento, son las terrestres también las denominadas litófitas son las que crecen sobre rocas (SCO, 1965). Y algunas crecen como lianas; Incluso algunas como el género Rhizanthella son completamente subterráneas incluyendo su floración (Gil, 2007).
A partir del tipo de crecimiento que presente una orquídea se clasifican en monopoidal y simpoidal; las primeras crecen de manera erguida cuyo tallo no se ramifica, al cual se insertan las hojas y no presentan pseudobulbos; las segundas presentan un rizoma que crece de forma horizontal, del cual surgen pseudobulbos con crecimiento vertical y a medida que crece el rizoma surgen nuevos pseudobulbos que dan origen a otra planta y por último, las “orquídeas” que crecen a lo largo y hacia arriba sosteniéndose de un tutor, tal crecimiento es trepador, probablemente se puede
2
considerar un cuarto caso y es el rastrero tal crecimiento se da a nivel del suelo (SCO, 1965).
2.1.3
Descripción Morfológica de las “orquídeas”
Las “orquídeas” se consideran como la Familia más evolucionada dentro del Reino
Vegetal,
ya
que
presentan
una
gran
complejidad
y
especialización en su morfología floral y en sus tipos de polinización. Asimismo existen dentro de la Familia muy diversas formas de vida y desde el punto de vista ecológico muchos de sus integrantes son componentes importantes en diversos tipos de vegetación (Espejo, 2002).
La Familia Orchidaceae pertenece a la Clase de las Monocotiledóneas, es considerada como una de las Familias más grandes de plantas con flor que existen. (Wells y Willems, 1991).La característica principal de las raíces de “orquídeas” es que presentan alrededor de la raíz auténtica una capa de tejido esponjoso llamado velamen, que se desarrolla en las especies terrestres, epífitas o litófilas (Gil, 2007).
Las raíces son de color gris a blanco, presentando un ápice meristemático que absorbe la humedad y las pequeñas cantidades de nutrimentos que la planta necesita. Este ápice tiene una coloración verde, lo cual cumple con la función de realizar parte de la fotosíntesis de la planta. Las modificaciones y tipos de raíces que pueden presentarse en las “orquídeas” son: fibrosas, tuberosas, tipo bulbo, carnosas sin rizoma, carnosas con rizoma, raíces aéreas (Gil, 2007).
La orquídea tiene como regla general un aspecto herbáceo, aunque las hay en una variadísima gama de formas; ello se debe principalmente a su clima y hábitos característicos en su medio natural (SCO, 1965). Las hojas de las “orquídeas” son las que más carácter herbáceo presenta de todas las plantas. Como todas las monocotiledóneas las nervaduras en la hoja se distribuyen paralelas entre sí a lo largo de ella (SCO, 1965).
Varían mucho en tamaño y consistencia, pudiendo ser simples, paralelinervias,
sésiles
o
pediceladas,
alargadas
y
generalmente
persistentes. Por su colocación pueden ser alterna helicoidal, opuestas y
3
en algunos casos sólo presentan una hoja verdadera. Las hojas pueden ser terminales, insertadas a lo largo del pseudobulbo, en forma de roseta y solitarias variando en número (Gil, 2007).
Los pseudobulbos pueden tener formas muy variables de acuerdo a su género y/o especie siendo las más comunes: globoso, ovoide, oblongo, cilíndrico y segmentado, claviforme y fusiforme (Gil, 2007). Las flores de las “orquídeas” tienen una alta variabilidad puesto que han evolucionado en función de facilitar la fecundación.
Pese a la gran variedad de flores en la familia, todas tienen su diagrama floral idéntico consistente en: un labelo, esto es tres pétalos y dos pétalos laterales, tres sépalos, órganos sexuales fusionados formando una columna y ovario ínfero (SCO, 1965). El labelo, éste es un pétalo modificado, el cual presenta modificaciones en color y forma, de mayor tamaño y vistosidad, ya que es el encargado de atraer a los agentes polinizadores (Gil, 2007).
La flor de orquídea es un tipo especial de flor irregular que tiene simetría bilateral (zigomorfa). Se puede cortar solamente en un plano y se dividirá en dos mitades iguales. Cortando la flor en cualquier otro plano resultaría en dos trozos irregulares (Larson, 2004). Éstas son hermafroditas, en el interior se encuentran las estructuras reproductivas de la orquídea (antera y pistilo) que se han unido en una estructura cerosa llamada columna o ginandrio (Gil, 2007).
Dentro de la flor los granos de polen se aglutinan en pequeños paquetes llamados polinias, el número de polinias depende de la especie , por tanto el número de éstos y su disposición dentro de la flor pueden ser utilizados para la identificación de la misma, por ejemplo, Cattleya tiene cuatro, mientras que Laelia tiene ocho (Larson, 2004).
Las flores de orquídea producen copiosas cantidades de semillas. Una sola vaina puede contener entre 500 000 y un millón de semillas diminutas, dichas semillas carecen de endospermo y con frecuencia se les llama semillas desnudas. Como no contienen endospermo, no pueden germinar
4
en estado silvestre sin ayuda de algún hongo, mientras que en condiciones de
laboratorio
tienen
que
ser
germinadas
asépticamente
con
abastecimiento de todas las sustancias químicas para su nutrición contenidas en un medio de germinación (Larson, 2004). El fruto de las “orquídeas” es una cápsula dehiscente aunque en algunos casos puede ser una vaina, del mismo tipo de la vainilla (Vanilla spp.). Comúnmente las cápsulas son de formas ovoides, elípticas,
cilíndricas o
piriformes, pueden medir de 0.5 a 5 cm de diámetro y de 0.5 hasta casi 15 cm de largo dependiendo del Género y la Especie (Sheehan, 1994).
2.1.4
Descripción Morfológica de Phalaenopsis spp.
La flor tiene la forma general de una mariposa con las alas abiertas (en inglés, a la Phalaenopsis spp. se le llama “motorchid”, lo que significa “orquídea mariposa de noche”). El color de la flor se declina hacia el infinito, partiendo del blanco puro hasta tener todos los colores del arco iris. Estas “orquídeas” florecen generalmente en invierno y la floración puede durar varios meses. Las Phalaenopsis spp. son “orquídeas” monopodiales, es decir, que las nuevas hojas aparecen en el corazón de las viejas formando así una especie de mata única. Las hojas son generalmente de color uniforme y gruesas. Las raíces son muy gruesas y relativamente rígidas, lo que les vuelve particularmente fáciles de romper, sobre todo cuando están secas. Salen regularmente de la maceta, lo que es normal (no hace falta cortarlas). Si las condiciones son favorables, estas “orquídeas” crecen a lo largo del año por que se deben regar y abonar continuamente. Generalmente crecen a baja altitud, de forma epifita, situada en la parte baja de árboles con pocas hojas y en general cerca de cursos de agua. Algunas especies crecen de forma litofítica sobre rocas cubiertas de musgo.
5
2.1.5
Clasificación según Blume (1825). Reino: Plantae Subreino: Tracheobionta División: Magnoliophyta Clase: Liliopsida Subclase: Liliidae Orden: Asparagales Familia: Orchidaceae Subfamilia: Epidendroideae Tribu: Vandae Subtribu: Sarcanthinae Alianza: Phalaenopsis Género: Phalaenopsis.
2.1.6
Distribución Geográfica Natural y Ecológica de Phalaenopsis spp.
Las Phalaenopsis spp, nativas del sudeste asiático, desde las montañas del Himalaya hasta las Filipinas, Indonesia y Norte de Australia. En la naturaleza algunas especies se desarrollan bajo el dosel forestal en la humedad de la parte baja, por lo que están protegidas de la luz solar directa y otras crecen en entornos con estaciones secas y frías. Generalmente crecen a baja altitud, de forma epífita, situadas en la parte baja de árboles con pocas hojas y en general cerca de cursos de agua. Algunas especies crecen de forma litofítica sobre rocas cubiertas de musgo Todas ellas se han adaptado individualmente a estos hábitats.
2.1.7
Requerimientos Climáticos y de Fertilización
Luz Las Phalaenopsis spp, son plantas de sombra en su país de origen (por ejemplo en las Filipinas). Al contrario, en nuestras latitudes donde el sol es más suave, las Phalaenopsis spp, necesitan una luz relativamente alta para bien florecer. Una orquídea requiere la máxima cantidad de luz, sin lesionar la planta, la cual es necesaria para que ésta crezca y se desarrolle bien.
6
La cantidad de luz que los diferentes géneros de “orquídeas” pueden tolerar, sin lesionarse varía grandemente, siendo importante considerar la etapa de crecimiento de la planta (Murguía, 2004).
De acuerdo con los conocedores, una manera de saber cuánta luz darle a nuestras plantas, es observando sus características, si tiene hojas duras y carnosas necesita más luz y si sus hojas son blandas, anchas y finas necesita más sombra. Demasiada luz decolora el verde de las hojas tornándolas amarillentas y dificultando su crecimiento (Gil, 2007).
Por lo contrario la poca luz da a las hojas un tono verde obscuro, impidiendo el desarrollo y anulando la floración. En ambos casos se retrasa el crecimiento y se reduce o evita la floración. La cantidad correcta de luz produce una coloración verde lechuga generando una superficie brillosa, en los brotes nuevos y la planta florece regularmente (Gil, 2007).
Temperatura: La mayoría de los Phalaenopsis son “orquídeas” de invernadero caliente, Las temperaturas ideales son de 25 a 30ºC durante el día y de 18 a 25ºC durante la noche. Los híbridos pueden eventualmente adaptarse a temperaturas más frescas por un corto período (sin descender menos de 16ºC) con la condición de que el sustrato se mantenga seco. La planta, entra entonces, en reposo (para de crecer), por lo que hay que dejar secar el sustrato muy bien entre los riegos y no fertilizarlo. Las “orquídeas” requieren temperaturas diurnas de 13 a 32 °C y temperaturas nocturnas de 10 a 21 °C, dependiendo, como antes se dijo, de necesidades particulares de cultivo. Las “orquídeas”, en términos generales, se pueden dividir en tres categorías: de clima frío, intermedio y cálido, según donde crecen en su estado natural (Murguía, 2004). En la Tabla 1 se presentan las temperaturas óptimas para algunos tipos de “orquídeas”.
7
Tabla 1. Temperaturas óptimas para algunas orquídeas (GIL, 2007) Clima
Orquídea
Temperatura diurna Temperatura nocturna aproximada
aproximada
›10 °C
10 °C
18 a 24 °C
13 a 16 °C
21 a 30 °C
18 a 21 °C
Cymbidium Frío
Odontoglossum
Cattleya Intermedio
Cálido
Oncidium
Vanda Phalaenopsis
Riegos: Para las Phalaenopsis spp, en maceta se puede utilizar agua del grifo medianamente calcárea a temperatura ambiente. Si el agua del grifo es muy calcárea se puede filtrarla con una jarra Brita o mezclarla mitad y mitad con agua embotellada poco mineralizada (menos de 50 ppm o mg/l de residuo seco). (Gil, 2007). El regar demasiado es la manera más fácil de provocar la muerte precoz de una Phalaenopsis spp. Hay que regar abundantemente empapando bien el sustrato pero seguidamente necesita que escurra bien y el sustrato se debe secar casi completamente antes del siguiente riego. El sustrato nunca debe estar saturado de agua, lo que le llevaría a la pudrición de las raíces. (Gil, 2007). Abono: Las “orquídeas” son de lento crecimiento y con periodos largos de descanso, además tienen la dificultad para captar agua y nutrientes, sobre todo aquellas que viven sobre los árboles, por ello, estas plantas tienen bajos requerimientos nutrimentales y su fertilización es relativamente sencilla (Gil, 2007). Un programa de fertilización debe considerar factores como la especie, etapa de crecimiento de la planta, el método de cultivo, el sustrato, las condiciones de luz, temperatura y humedad; para tener un adecuado desarrollo de las plantas el proceso de fertilización está constituido por tres
8
apartados con fines específicos para el desarrollo del cultivo. (Kuan y González, 1993). a) Fertilización de Propósito Múltiple El objeto de realizar una fertilización de este tipo consiste en promover la formación de brotes, hojas, flores y frutos. Las Phalaenopsis spp. necesitan una mayor cantidad de abono en cuanto comparando con otras “orquídeas”. Sin embargo, sus necesidades, no son las mismas que de una planta verde común. (Gil, 2007).
Una solución de abono demasiado concentrado puede gravemente dañar las raíces por lo que habrá que abonar con dosis pequeñas, pero regularmente cuando la planta está creciendo (desarrollo de hojas, raíces o flores) fertilizar con cada riego con un abono para plantas verdes a la ½ o ¼ dosis que la recomendada por el fabricante, no abonar cuando la planta no crece. (Gil, 2007).
La propuesta de diferentes niveles de fertilización con la especificación de la dosis y días entre fertilización queda expuesto en el Tabla 2. Tabla 2. Fertilización de propósito múltiple (GIL, 2007) Dosis Fertilizante
(G L-1)
Días entre cada Fertilización
Triple 15-15-15
1-2
8
Triple 17-17-17
1-2
8
Triple 18-18-18
1-2
8
Triple 20-20-20
1-2
8
b) Fertilización Para Enraizamiento La
translocación de los nutrimentos desde tejidos de acumulación
hacia órganos demanda es una estrategia clave de los vegetales para compensar los desequilibrios oferta-demanda estacionales, ya que les
9
permite, parcial y provisionalmente, ser independientes de la disponibilidad externa (Gil, 2007).
La frecuencia de fertilización es regularmente cada 8 días; la solución nutritiva se aplica en forma de aspersión con una bomba de mochila mojando perfectamente las hojas, pseudobulbos y raíces. Si se maneja solución hidropónica, la aplicación se realiza mediante riego por goteo (Gil, 2007). c) Fertilización Para Diferentes Etapas de Desarrollo Los productos que contienen macro nutrientes y micronutrientes repercuten en un mejor desarrollo para las plantas. La diversidad de fertilizantes que se pueden emplear en las diferentes etapas de desarrollo de las “orquídeas”. Tal, como se observan en el Tabla 3. (Gil, 2007). Tabla 3. Función de dosis de fertilización (GIL, 2007)
Fertilizante
22-10-25
Función
+
micronutrimentos 13-36-13 + MgO + micronutrimentos 15-30-15
+
micronutrimentos 18-18-18
+
micronutrimentos 19-19-19
+
micronutrimentos
Dosis (g L-1)
Floración y desarrollo de cápsulas
1
Floración y enraizamiento
1
Floración y enraizamiento
1
Multipropósito
1
Multipropósito
1
26-12-12 + 2 MgO +
Para desarrollo vegetativo (hojas y
micronutrimentos
tallos)
1
10
Ciclo de crecimiento: La planta crece continuamente durante todo el año. Las varas florales se forman generalmente en otoño o en el transcurso del invierno. La floración tiene lugar en invierno durante varios meses y puede extenderse durante todo el año en algunos casos. (Gil, 2007). Sustrato y Trasplante: Se trasplanta cuando el sustrato está demasiado descompuesto (las cortezas de pino de la maceta están desmenuzadas y retienen cada vez más agua). Preferiblemente en el momento de la aparición de nuevas raíces en la base de la planta. Nunca trasplantarlo en sustrato para plantas verdes, este sustrato no es apto para las “orquídeas”. (Gil, 2007).
Las Phalaenopsis spp. Adaptan a un sustrato que drene bien por ejemplo cortezas de pino de calibre 1 – 1,5 cm. si domina bien los riegos, puede añadir de 20% a 30% de musgo desmenuzado o turba rubia para un mejor crecimiento. Elegir una maceta lo suficientemente grande para contener las raíces de la planta. (Gil, 2007).
Las Phalaenopsis spp. híbridas se mantienen bien en el hidrocultivo. En este caso, pueden estar años en la misma maceta sin tener necesidad de trasplante. Por el contrario, hay que esperar a la aparición de nuevas raíces en la base de la planta para efectuar el paso al hidrocultivo. (Gil, 2007). Antes de decidir sobre qué sustrato colocar las “orquídeas”, se deberá tener presente lo siguiente: exigencias de la planta, si es epífita o terrestre, si se trata de un híbrido, la procedencia de sus progenitores, la humedad relativa, la luz, cantidad de agua y el tipo de recipiente; Siendo el indicador por excelencia en la selección del sustrato el grosor de la raíz (Tabla 4). (Gil, 2007).
11
Tabla 4. Tipo de sustrato de acuerdo al grosor de la raíz (GIL, 2007)
Grosor de la raíz
Tamaño de partícula del sustrato
Gruesa
Grande
Delgada
¼ ´´ (grado de plántula o grado fino)
Mediano
½ ´´ (grado medio)
Grande
¾ ´´ (grado grueso o grande)
Floración: Las plantas maduras y con buena salud florecen generalmente por sí solas con la condición de recibir suficiente luz. En otoño e invierno, las Phalaenopsis spp. Aprecian algunas horas de sol directo cada día lo que estimula la floración. Las nuevas varas florales aparecen sobre el tronco de la planta, entre las hojas y sobre el mismo plano vertical que la nervadura de las últimas. Se forman generalmente en el otoño o en el transcurso del invierno. (Kuan y González, 1993).
Es necesario someter a las Phalaenopsis spp. a temperaturas nocturnas inferiores a 18ºC para iniciar la floración. Esta práctica de “terapia de frío” nocturna se ha comprobado, sin embargo, completamente inútil e incluso peligrosa pues debilita a la planta. (Kuan y González, 1993).
En los invernaderos de producción en masa de Phalaenopsis spp, la floración se inicia con una temperatura diurna de 23/25ºC asociada a una luz fuerte, con una temperatura nocturna del orden de 18/20ºC. Las varas aparecen por sí solas con la condición de que la planta tenga suficiente luz y que la temperatura no pase de los 28-29ºC. Si su planta con 6 hojas o más, que crece bien, pero no florece, en 9 de cada 10 casos, es debido a una falta de luz y obligarla a pasar frío nocturno no cambiará absolutamente en nada. (Gil, 2007).
Algunas Phalaenopsis spp, pueden florecer varias veces sobre la misma vara floral. Si su planta es fuerte (al menos 3 pares de hojas adultas) y tiene buena salud, puede dejar la vara floral en su sitio después de la
12
floración (sobre todo sin cortarla de ninguna manera). En algunos casos, la vara formará ramificaciones que podrían florecer de nuevo. Sin embargo, esto no es nada sistemático. En otros casos, la vara se seca por sí sola y no habrá más que cortarla a ras en la base. (Gil, 2007).
Si la planta es joven o débil (menos de 3 pares de hojas adultas) es más sabio de cortar la vara a la base, después del fin de la floración: Esto permitirá a la planta de formar hojas y raíces y de preparar la siguiente floración que será más bella. (Gil, 2007).
2.2
REPRODUCCIÓN In Vitro
2.2.1
Antecedentes de la Reproducción In Vitro de “orquídeas”:
Los primeros intentos de germinación de semillas de “orquídeas” fueron realizadas en Europa por Moore (1 849) al sembrarlas en compost o sustratos que habían sido utilizados para cultivar plantas adultas, práctica que fue adoptada por los cultivadores comerciales de su época, (Arditti, 1984).
Inicialmente, la técnica de cultivo in vitro, fue usado para la germinación de semillas de “orquídeas” a partir de frutos maduros de especies e híbridos; sin embargo a la mitad del presente siglo la práctica de cosechar frutos inmaduros (verdes) asépticamente cultivados fueron usados para superar algunas barreras de incompatibilidad y producir algunos únicos híbridos. (Mejía, 1994).
(Knudson 1922), demostró que era posible la germinación sobre un medio simple que contuviera minerales y azúcares, sin la presencia de hongos. La investigación desarrollada por (Knudson 1922) supuso una conmoción en el mundo de las “orquídeas”, al demostrar que las semillas de Cattleya, Epidendrum
y
otras
“orquídeas” eran capaces de
germinar a
simbióticamente in vitro. Sin embargo se ha comprobado que las “orquídeas” reciben a veces aminoácidos (glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico y ácido nicotínico) provenientes del hongo. (Hyner y Arditti 1973).
13
A pesar del descubrimiento de Knudson, se comprobó que no siempre es posible hacer un medio en el que una determinada especie de orquídea pueda germinar y desarrollar.
Se
han descrito muchos medios nutritivos, para muchos géneros y
especies diferentes (Arditti, 1967, 1982, Arditti y Ernst, 1982 y Fast, 1980). (Hardley 1982) llegó a la conclusión que
las “orquídeas” obtenían los
hidratos de carbono de los hongos. Pero está lejos de la realidad.
Posteriormente Noel Bernard; realizó una serie de experimentos que le permitieron explicar el rol del hongo micorrízico en la germinación de semillas de “orquídeas” (Bernard 1990), demostrando la importancia de esta asociación simbiótica y germinando exitosamente distintas especies e híbridos de “orquídeas” terrestres y epífitas. Otros investigadores continuaron su trabajo:
- La semilla de la orquídea consta de una testa gruesa, que encierra un embrión. La cual tiene aspecto característico en forma de red y diferente para cada especie. La testa está formada por un tejido muerto, compuesto en un 96% de aire, de tal forma que cada semilla puede ser considerada como un auténtico globo, Pierik (1989). - Went Y Thimann (1937), descubren la auxina (Ácido indol Acético). Hormona reguladora de crecimiento que estimula el desarrollo de raíces, Arditti (1990). - Caplin Y Stewart (1948), determinan que la “leche de coco” tiene un efecto en la formación de células aisladas de raíces de zanahoria, Arditti (1990). - Skoog Y Miller (1957), combinan auxinas y citoquininas, controlando la formación de brotes y raíces, Arditti (1990). - Murashige Y Skoog (1962), logran desarrollar el medio nutritivo que actualmente es el más utilizado para muchas de las especies de “orquídeas”, Arditti (1990). - SING, demostró que el 2, 3, 5 trifenil – tretazolium es útil para determinar la viabilidad de las semillas, donde los embriones viables se tiñen de rojo, mientras que los no viables quedan blancos, (León 1995).
14
- Los
Protocormos
deben
ser
transferidos
antes
que
induzcan
hiperhidricidad o felonización y luego mueran, (Delgado 2001). - A pesar del descubrimiento del medio de cultivo KNUDSON, se comprobó que no siempre es posible hacer un medio en el que una determinada especie de “orquidea” pueda germinar y desarrollarse; se han descrito muchos medios nutritivos para muchos géneros y especies diferentes, (Arditti 1982). - (Arditti 1984); (Pierik, et al, 1988), Las “orquideas” germinan a simbióticamente después de la inhibición formando un pequeño cuerpo esférico denominado protocormo, a partir de cuya base surgen rizoides y a continuación primordios de raíces y hojas, todo lo cual permite distinguir etapas bien definidas que se usan en el cálculo de índices de crecimiento, (Espinoza 2001). - Algunas especies de “orquídeas” pueden germinar de 4 a 8 semanas después de su siembra, y la multiplicación se efectúa dentro de las 12 a 16 semanas, empleando el medio de micropropagación que sirve para multiplicar todas las especies con éxito, (Donayre 2000). - Un medio de cultivo con sales M&S, suplementadas con vitaminas, azúcar, ANA y BAP, permite una rápida germinación de las semillas y un crecimiento de las plántulas, dado que se desarrollan bien las hojas y forman raíces, (Selena 1999). - El medio de cultivo utilizado en la fase de multiplicación para el cultivo de plantas ornamentales fue el M&S (1962) aumentado la concentración de BA a 2 mg/l y ANA 0.3 mg/l, (Aceves 2000). - Para la fase de enraizamiento en el cultivo de plantas ornamentales, se utiliza las mismas sales M&S en el medio de cultivo, omitiéndose la citoquinina (BA). Complementado con 1.5 g/l de carbón activado, 20 g/l de sacarosa y agregando auxina (ANA), las condiciones de incubación fueron las mismas que para las etapas anteriores, (Aceves 2000). - Mauro M. & Arditti (1994), probaron la influencia de diferentes dosis benzilaminopurina (BA) y ácido naftaleneacetico (ANA), en el medio de cultivo Murashige y Skoog (M&S) en Cattleya sp. Ellos sugirieron que para la multiplicación se utilizará el medio suplementado con la combinación de 10mg/l de BA y 0.1 mg/l de ANA, y para el desarrollo de plántulas con el incremento de hojas y raíz, se utilizara el medio suplementado con 10mg/l de ANA. (Espinoza 2001).
15
- (Arditti y Ernest, 1993), Usaron varios aditivos para el cultivo in Vitro, tal es el caso del agua de coco, la cual posee una gran cantidad de componentes, entre ellos encontramos algunas fitohormonas con diferentes concentraciones como: auxinas, citoquininas y giberelinas y, se ha usado rutinariamente en un sin número de métodos de propagación. (Espinoza 2001). - Desde que Morel y Winber demostraron la aplicación del cultivo de tejidos para una rápida propagación clonal de orquídeas, esta técnica ha sido exitosamente empleada en la producción comercial de plantas selectas de “orquídeas”. Gran cantidad de plantas
de calidad, el
establecimiento de nuevos híbridos y la multiplicación y conservación del germoplasma, son algunos beneficios que han sido alcanzados con esta tecnología. (Mejía, 1994). - La micro propagación de “orquídeas”, de forma moderna comienza en 1949, con un nuevo (cultivo de tejidos o in vitro) simple y práctico método de propagación vegetativa (clonal) de Phalaenopsis spp. “orquídea” que fue desarrollado en la Universidad de Cornell - Nueva York, cinco años antes el primer reporte publicado a partir de tallo de “orquídeas” (Arditti, 1996). - (Gavino Rotor. J 1949), concibió la idea de propagación de “orquídeas”, atendiendo la función del azúcar en el desarrollo de las plantas. El cultivo con cortes de inflorescencias de Phalaenopsis spp, y secciones nodales, cada uno con un brote en medio KC, con la idea de que se produjeran plantas. Los brotes mostraron hojas después de 14 a 60 días, la producción de raíces se dio después del desarrollo de 2 a 3 hojas, sólo 7 de 65 brotes fallaron en el proceso de desarrollo (Arditti, 1996). - (Gavino Rotor. J 1949), inventó la micro propagación de ““orquídeas”” y fue el primero en publicar un reporte científico en multiplicación clonal de una planta superior in vitro; sentando las bases del uso de un medio de cultivo nutritivo, técnicas asépticas y el uso de explantes en “orquídeas” (Arditti, 1996).
16
2.2.2
Reproducción in vitro
Las razones de esta práctica in vitro son, según (Pierik 1990). 1.
Las semillas de “orquídeas” son muy pequeñas y contienen poca o nada de reserva alimenticia. Por lo tanto, la germinación tiene más probabilidades de éxito in vitro.
2.
En la Naturaleza depende de una relación simbiótica con un hongo. Sin embargo, in vitro es posible sustituir la acción del hongo, por un medio nutritivo (a simbiótico).
3.
Como resultado de un cruce se obtiene un limitado número de semillas, eligiendo un medio nutritivo apropiado, se puede conseguir que todos germinen in vitro.
4.
La siembra in vitro permite germinar embriones inmaduros de “orquídeas”, como consecuencia se acorta el ciclo de mejora.
5.
La generación y el desarrollo tienen lugar mucho más rápidamente in vitro, ya que se realiza en un ambiente acondicionado, y sin competencia con hongos o bacterias
2.2.3
Reproducción a partir de Semillas
Debido a que las semillas de “orquídeas” son muy pequeñas y contienen poca o nula reserva alimenticia, la germinación y el subsiguiente desarrollo de la planta, dependen en la naturaleza, de la relación simbiótica con un hongo, sin embargo, es posible sustituir la acción del hongo por un medio nutritivo, a esta germinación se denomina asimbiótica (Gil, 2007). En el caso de “orquídeas” raras o las que están en peligro de extinción, metodologías in vitro de propagación pueden ser necesarias, donde el cultivo de semillas es una razonable estrategia de propagación masiva de un muestreo no destructivo de explante (Krikorian, 1991; Zettleret al., 2001). De acuerdo a (Wagner et al. 2006) la propagación de “orquídeas” se puede realizar por la germinación de semillas de forma a simbiótica o bien por la multiplicación convencional vegetativa. También las micorrizas proveen a las plantas jóvenes de azúcares y nutrimentos que necesitan en su desarrollo hasta ser autosuficientes (McKendrick, 2000).
17
Las
semillas
requieren
establecer
relaciones
simbióticas
con
microorganismos, como es el caso de un hongo específico, conocido como Rhizoctonia, ya que la capa de la cápsula es gruesa, la acción del hongo consiste en la degradación de dicha capa, sin que altere las células interiores y permite la germinación.
Cuando el mecanismo es a simbiótico, el proceso de germinación es distinto al anteriormente planteado. Sustituyendo la acción de los microorganismos, se necesita el uso de procesos químicos o físicos para liberar las semillas y posteriormente esterilizarlas, reconociendo que las semillas están desprovistas de nutrimentos, el paso a seguir es colocar las semillas en un medio nutritivo y estéril para proporcionarle las condiciones idóneas para el proceso de germinación (McKendric, 2000).
La germinación de la semilla en el medio de cultivo, produce una masa indiferenciada,
llamada
protocormo;
bajo
condiciones
óptimas,
el
protocormo continuará su crecimiento por semanas, meses o incluso años, hasta alcanzar el desarrollo de raíces y hojas. Son diversos los medios nutritivos usados para la germinación de semillas y desarrollo de varios géneros y especies de “orquídeas”. Las “orquídeas” terrestres requieren un medio pobre en sales, mientras las epífitas necesitan un medio más rico en sales (Gil, 2007).
Son diversos los trabajos realizados alrededor del mundo que evalúan procedimientos para optimizar la germinación de distintas “orquídeas”; la germinación in vitro de semillas permite un gran número de plántulas para ser producidas en un pequeño lapso de tiempo. De hecho, diversos métodos han sido reportados para la micropropagación de “orquídeas” (Pedroza y Mican, 2006). 2.2.4
Reproducción Asexual
Se pueden reproducir las “orquídeas” por vía vegetativa, o sea, por partición, esquejes o meristemos (que es como se producen la mayoría de las plantas que están en el mercado). En todos estos casos estamos obteniendo clones idénticos a la planta madre.
18
La reproducción asexual o vegetativa se efectúa sin transferencia de material genético, se realiza tomando una parte de la planta a reproducir mediante un instrumento de cortar y sembrando en un medio adecuado, dependiendo de la especie (Gil, 2007).
Desde Morel y Wimber, demostraron la aplicación del cultivo de tejidos como una rápida propagación clonal de “orquídeas”, esta tecnología fue exitosamente aplicada a la producción comercial de plantas de “orquídeas” seleccionadas. Grandes cantidades de plantas, establecimiento de nuevos híbridos y la multiplicación y preservación del germoplasma son algunos beneficios que derivan de la aplicación de esta tecnología (Yoneo, 1991).
Los
explantes
son
exitosos
a
partir de
fragmentos vegetativos,
inflorescencias jóvenes, hojas y raíces. Sobre la preferencia del origen del explante es terminal o axilar de las yemas de la acción vegetativa de los brotes de las plantas superiores. El explante de yemas apicales incluye el meristemo apical con 3 a 4 nudos con la presencia de hojas jóvenes. Brotes axilares como explantes, consiste del cubo del brote adherido al nudo. Los explantes por raíces consisten de 3 a 5 mm de extensión de raíz (Yoneo, 1991).
En
la
reproducción
a
partir
de
meristemos
se
extraen
células
meristemáticas de la yema de crecimiento de la planta bajo condiciones ambientales estériles, su posterior multiplicación y transferencia final de las nuevas plantas. Este método es utilizado para clonar variedades destacadas por su interés botánico y calidad y floración, tal técnica presenta varias ventajas: permite multiplicar a voluntad los ejemplares de una orquídea, ya que el proceso de división puede repetirse a medida que crecen los fragmentos. Estos meristemos clonados se desarrollan en un medio nutritivo y dichos individuos presentan características idénticas a la de sus progenitores (Gil et al. , 2007).
2.2.5
Medios de Cultivo
Los medios nutritivos empleados en los cultivos de tejidos fueron establecidos a partir de las exigencias internas de las plantas, con modificaciones para atender las necesidades específicas in vitro. Así
19
mismo varios compuestos son adicionados para suprimir las necesidades metabólicas, energéticas y estructurales de la célula ya que las mismas vías bioquímicas básicas que operan en las plantas son mantenidos en los cultivos in vitro (Stancato, 2008).
El medio de cultivo es el que le confiere al material vegetal los nutrimentos necesarios para su desarrollo, se define por sus propiedades químicas y físicas (Vidalie, 1976). Los componentes del medio de cultivo se clasifican en cuatro categorías: 1. Sales minerales 2. Sustancias orgánicas 3. Reguladores de crecimiento 4. Productos naturales complejos. Los tejidos cultivados tienen necesidades específicas con respecto a los siguientes iones: K+, NO3-, NH4+, Ca2+ y Mg2+; los iones K+, NO3- y NH4+ son los que ejercen influencia importante en el crecimiento de los tejidos (Vidalie, 1976); con frecuencia se añade fósforo en bajas concentraciones (Vidalie, 1976). En lo que respecta a los micronutrimentos, se sabe que el hierro es esencial para el crecimiento tisular, que generalmente se agrega en forma de quelato (Fe–EDTA) a una concentración de 20 a 40 mg L-1. En el caso de otros micronutrimentos, algunos tejidos son sensibles al ácido bórico (H3BO3), al manganeso y al zinc, estos elementos se introducen al medio de cultivo en concentraciones del orden de 0.02 a 0.10 m M L-1. Siguiendo en la línea de micronutrimentos, se desconoce o se sabe muy poco acerca de la influencia del Cu, Mo, Co, I y Na sobre el crecimiento de los tejidos; sin embargo, se agregan al medio de cultivo como medida de precaución en concentraciones bajas, del orden de 0.00003 a 0.03 m M L1. El uso de sustancias orgánicas como azúcares, vitaminas y aminoácidos dentro del cultivo de tejidos es importante; con respecto a los azúcares, las necesidades suelen cubrirse con concentraciones de 2 a 3%; las necesidades de vitaminas se cubren con el uso de vitaminas del grupo B, es el caso de la vitamina B1, que es esencial, presente en concentraciones de 0.1 a 10 mg L-1; en el caso del mio-inositol se encuentra presente en
20
concentraciones de 10 a 100 mg L-1, su función es mejorar el crecimiento, pero no parece ser esencial.
Con respecto a los requerimientos de aminoácidos, éstos se agregan en forma de una mezcla compleja a la que se le conoce como ―caseína hidrolizada‖, pero se puede adicionar asparagina, glutamina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico y tirosina, solos o mezclados. Se deben usar los isómeros L, los isómeros D son ineficaces. Los tejidos muestran necesidades específicas en lo que se refiere a los reguladores del crecimiento o fitohormonas, se ha demostrado que a concentraciones bajas (0.01 mg L-1), influyen de manera sensible en el crecimiento de los tejidos vegetales.
En
los
medios
de
cultivo
se
utilizan
cuatro
citocininas:
2-
isopenteniladenina (2iP) y la zeatina, que son naturales; y la N6 – benciladenina (BA o BAP) y la cinetina (6 furfuril- aminopurina), que son sintéticas. El caso de la cinetina resulta ser menos eficiente si se le compara con las otras tres citocininas. La concentración más usada de los reguladores de crecimiento descritos es de 0.01 a 10 mg L-1. El uso de giberelinas es recurrente, pero sólo el ácido giberélico 3 (AG3), se utiliza en forma frecuente, se adiciona en el medio de cultivo para estimular el crecimiento de los meristemos, inducir el alargamiento de los tallos o incluso para activar el crecimiento de los embriones somáticos (Vidalie, 1976). El metabolismo de los tejidos se puede modificar por completo, dependiendo de que se encuentren en un medio sólido o en uno líquido, la decisión acerca de qué tipo de medio elegir, no tiene que ser una decisión arbitraria (Vidalie, 1976).
El pH del medio también se considera como un factor crítico. En la práctica el pH inicial se ajusta a valores comprendidos entre 5.5 y 5.8 durante la preparación del medio, durante el proceso el pH frecuentemente disminuye; sin embargo, se sabe muy poco sobre los efectos de esta variación.
21
Aunque en muchos casos la composición mineral de Murashige y Skoog (1962) da resultados satisfactorios, se debe considerar que no siempre es la mejor opción, lo conveniente es seleccionar una composición en función del conocimiento de la fisiología de la especie con respecto a la nutrición mineral. El medio MS es muy rico en sales totales y a menudo se le puede diluir a la mitad. La formulación de medios exitosos para el crecimiento de “orquídeas” in vitro es relativamente simple. Muchos se presentan en un apéndice de un libro escrito por Arditti. Dos de los medios que más se usan son Knudson C y Vacin y Went los cuales son adicionados con reguladores de crecimiento y aditivos orgánicos (Yoneo, 1991).
No obstante, los resultados que se puedan obtener para una especie de orquídea con un medio específico, generalmente no se aplica a otras especies de “orquídeas”. Las técnicas biotecnológicas, en la actualidad han tomado mayor auge, sin embargo hasta el momento para muchas especies vegetales, los sistemas de propagación tradicional no satisfacen las diversas demandas de estos cultivos, al igual que existen especies endémicas y/o en peligro de extinción, que como vía alternativa para su rescate y conservación no logran satisfacer las demandas de conservación y propagación (Rosales et al., 2003). Con el afán de buscar nuevas alternativas a los retos que se presentan en la conservación y propagación de “orquídeas”, el uso de técnicas sistematizadas se presenta en el escenario científico. En el año 1997, surgió el denominado Sistema de Inmersión temporal, creado en el CIRAD de Francia , este sistema, se logró a partir de la aplicación de un flujo de aire a uno de sus frascos, el cual hacía subir el medio de cultivo y luego de bañar los explantes, el medio descendía por gravedad (Rosales et al., 2003). Con este método se logra una mayor tasa de multiplicación, enraizamiento y aclimatación así como niveles elevados de supervivencia a nivel de campo.
22
2.2.6
Medios
de
Cultivo
Alternativos
en
la
Propagación
de
Phalaenopsis Los medios de cultivos empleados tienen diversas composiciones y se emplean
como
líquido
o
geles
(Roca
y
Mroginski,
1991).
Los
constituyentes básicos incluyen todos los elementos minerales esenciales para el desarrollo de la planta, macro y micro nutrientes; un azúcar (usualmente sacarosa, sucrosa o glucosa); vitaminas como la tiamina, glicina entre otros; sustancias reguladoras del crecimiento; y otros compuestos. Entre estas juegan un papel esencial las auxinas y las citoquininas cuyas proporciones relativas favorecen el desarrollo del tallo y el de la raíz, citado en (Ruíz 2003). Usando las sustancias químicas necesarias y las combinaciones apropiadas de nutrientes, así como su forma química adecuada, ha sido posible establecer cultivos para casi todas las partes de la planta en diversas especies vegetales, citado en (Ruíz 2003). 2.2.6.1 Sustancias orgánicas complejas usadas en la germinación asimbiótica de semillas de “orquídeas” Un gran número de aditivos se usan para favorecer la germinación a simbiótica de semillas de “orquídeas” y el subsecuente desarrollo y diferenciación de los protocormos. (Arditti, 1967). Los más frecuentemente usados son el endospermo líquido de coco, el jugo de “tomate” y el fruto del “plátano”. (Steward And Simmonds 1954) reportaron que las capas formativas del fruto del “plátano” poseen sustancias que estimulan la división en células de zanahoria; con solo esta evidencia disponible, (Khalifah 1966 b) llegó a la conclusión de que estas sustancias responsables de la división celular eran las citokininas. Encontraron que el fruto del “plátano” contiene pequeñas cantidades de compuestos inductores de la división celular [zeatina, zeatin-ribosido y 6(2- isopentilamino) purina] pero que comparados con el endospermo líquido del coco su actividad era extremadamente baja: 20 ml. de este aditivo daban una respuesta similar a 500 g de “plátano”. Sin embargo, existen evidencias de que el efecto del “plátano” sobre el desarrollo de las
23
“orquídeas” puede deberse a la presencia de otros compuestos distintos a las citokininas, pues se ha reportado la presencia de compuestos afines a giberelinas y auxinas en el mismo (Khalifah, 1966a, Cu1966b).
(Valmayor 1972), reportó que el endosperma líquido del coco solamente permite una pobre diferenciación en protocormos de Dendrobium, Vanda y Cattleya, mientras que su combinación con extractos de “plátano” resulta en un buen desarrollo de raíces y tallos.
(Stancato 2008) confirma que el uso de pulpas de frutos tales como: “manzana”, “plátano” y “tomate”, reportaron mejores resultados en el desarrollo de “orquídeas” epífitas de Brasil (Laelialongipes, L. tenebrosa y Miltonia spectabilis) que con el uso de medios tradicionales en el cultivo de tejidos (MS, Knudson y Vacin y Went). Sin embargo, el éxito en el desarrollo de una especie vegetal no se define exclusivamente por el uso adecuado de un medio.
2.2.6.2
Carbón Activado
El carbón activado utilizado en cultivo de tejidos es el carbón resultante de la combustión de tejidos vegetales (madera, residuos de madera, papel, lignina, etc). Actualmente es incluido con frecuencia en la formulación de medios de cultivo In Vitro de “orquídeas”, tanto para la siembra de plántulas como de protocormos obtenidos a partir de semillas o de Meristemos (Yam Et. Al.1990).
Algunos solutos de una solución son adsorbidos por el carbón activado cuando entran en contacto con este; el grado de adsorción depende de la temperatura, el pH, y la composición química de la sustancia adsorbida, siendo mayormente adsorbidos los compuestos moderadamente polares y poco solubles, como fenoles, fito – hormonas y vitaminas, en comparación con los muy polares o los apolares: azucares, sorbitol, manitol, inositol, etc. que no son adsorbidos, (Weatherhead Et. Al., 1979).
Las sales inorgánicas muy disociadas no son adsorbidas por el carbón activado, pero sí lo son los de muy baja solubilidad como cationes di- o poli – valentes. Es por ello en estos casos importante el uso de agentes
24
quelantes (EDTA) que incrementan la solubilidad de los mismos (Yam Et. Al., 1990).
Varios mecanismos se han propuesto para explicar el efecto benéfico del carbón activado en el cultivo de “orquídeas”: (Weatherhead Et. Al., 1978). En primer lugar, la contribución de minerales en forma de impurezas estaría enriqueciendo el medio de cultivo. Segundo, la capacidad para adsorber metabolitos fitotóxicos que estarían siendo liberados al medio de cultivo por los tejidos (fenoles y sus oxidados, hidroxiquinonas, ácidos para – hidro – benzoico). Tercero, la adsorción de sustancias producidas durante la esterilización en el medio de cultivo, como el hidroximetil-furfural, resultado de la deshidratación delas hexosas que afectan el crecimiento y desarrollo de las plántulas. Cuarto, la adsorción de etileno que inhibe el crecimiento y la diferenciación de las plántulas y protocormos. Para el cultivo de “orquídeas” se utiliza carbón activado en medios de germinación de semillas y en medios de desarrollo como para etapas posteriores (replante) a una concentración de 2 g/l. 2.2.6.3 Medio Murashigue y Scoog La elaboración de los medios de cultivo se realiza diluyendo las soluciones madre previamente realizadas. Además, se añade la fuente de carbono y el agente gelificante, que normalmente es agar. Se pueden hacer distintos medios de cultivo manteniendo la misma
concentración de algunas
sustancias, por ejemplo sales minerales y vitaminas, y modificando o eliminando otras como los reguladores de crecimiento. Tomando como base las sales minerales, vitaminas y fuente de carbono de Murashige
y Skoog se pueden realizar múltiples medios de cultivo
variando los reguladores de crecimiento o su concentración. El Medio de Cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) se realiza con las siguientes Sustancias; (Tal como se muestra en la Tabla 6 del ANEXO).
25
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1
UBICACIÓN DEL EXPERIMENTO El presente trabajo de investigación se realizó, en el laboratorio del Instituto de Biotecnología del Cultivo de Tejidos de la Universidad Nacional Agraria
La Molina – Lima. Siendo financiado con recursos
propios del laboratorio. 3.2
MATERIAL 3.2.1 MATERIAL VEGETAL Se tomó material vegetal de los cuatro estadios: Protocormo, Pequeño, Mediano y Grande del cultivo de “orquídeas” del género Phalaenopsis spp. Donados por el Instituto de Biotecnología
de Cultivo de Tejidos de la
Universidad Nacional Agraria La Molina. 3.2.2
MATERIALES DE LABORATORIO
MATERIALES PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIOS -
Sales Nutritivas Murashige – Scoog.
-
Carbón Activado
-
Agua Destilada
-
Azúcar
-
Plátano Seda Verde
-
Plátano Seda Maduro
-
Agua De Coco
-
Superthrive (Regulador de Crecimiento)
-
Frascos
-
Jarras
-
Parafilm
-
Probeta 1litro.
-
Probeta 500 Ml.
-
Bagueta
-
Pipeta 2ml.
-
Pipeta 5 Ml.
-
Pipeta 10 Ml.
-
Pizeta
-
Placas Petri.
26
MATERIALES PARA LA SIEMBRA -
Explantes de Phalaenopsis spp. en los cuatro estadios
-
Platos de aluminio
-
Papel bond
-
Pinza recta
-
Pinza curva
-
Mango de bisturí N° 21
-
Hoja de bisturí N° 21
-
Mascarilla
-
Alcohol
-
Mechero
-
Mandil
EQUIPOS -
Balanza analítica - Sentaurius
-
Potenciómetro - Hanna
-
Microondas
-
Autoclave
-
Cámara de flujo laminar
3.2.3
MATERIAL FOTOGRAFICO
- Cámara fotográfica digital 3.2.4
MATERIAL DE OFICINA
- Cuaderno - Lápiz - Vernier - Hojas bond - Plumón indeleble - Computadora - Memoria USB.
27
3.3
TRATAMIENTOS Tabla 5. Componentes de Tratamientos TRATAMIENTO
3.4
MEDIOS DE CULTIVO
T0
MS
T1
MS+ agua de coco
T2
MS+ plátano maduro
T3
MS+ plátano verde
T4
MS+ plátano verde+ agua de coco
T5
MS+ plátano verde +agua de coco + regulador crec.
DISEÑO ESTADÍSTICO Se utilizó el Diseño Completamente Azar (DCA), con TUKEY un nivel de significancia del 95%, sometido al programa SAS 2009; en los estadios PROTOCORMO, PEQUEÑO, MEDIANO Y GRANDE, Con 6 tratamientos en 4 repeticiones. En la cual se investigó la optimización de seis medios de cultivo para la micro propagación del cultivo de “orquídeas” del género Phalaenopsis spp.
3.5
MÉTODOS Se aplican las técnicas de cultivo in vitro en la propagación de las especies de “orquídeas”, a partir de semillas. Aquí se tomaron plantas en cuatro estadios, como Protocormo, Pequeño, Mediano y Grande; de las cuales fueron donadas por el Laboratorio del instituto Biotecnología de la Universidad Nacional Agraria La Molina.
3.6
CARACTERISTICAS EVALUADAS 3.6.1 -
EN PROTOCORMOS NUMERO DE BROTES: Se eligieron 8 PROTOCORMOS que estuvieron en buenas condiciones sanitarias, en ellos se evaluaron mensualmente y luego se promediaron expresándose en N° Brotes por PROTOCORMO.
3.6.2
EN PLANTAS Se evaluó 5 plantas de los Estadios Pequeños, Medianos y para el Estadio Grande 2 plantas por Unidad Experimental.
28
TAMAÑO DE PLANTAS: Se eligieron 3 plantas PEQUEÑAS,
-
MEDIANAS y 2 plantas para los GRANDES, que estuvieron en buenas condiciones sanitarias, se realizaron 3 evaluaciones cada 30 días.
3.7
CONDUCCION DEL EXPERIMENTO
3.7.1 -
PROCESO DE SELECCIÓN DE MATERIAL
En cámara de flujo laminar, se tomaron plantas de Phalaenopsis spp. In vitro de un año de edad aproximadamente, la cual en cada frasco se hallaron plantas de los cuatro estadios y se procedieron a sembrar en los seis los tratamientos
-
En seguida se procedió a seleccionar el primer estadio llamado protocormo, con una pinza recta debidamente flameado y fue sembrado sobre seis medios diferentes, (tratamientos en
investigación) diez
protocormos por tratamiento. (Tal como se muestran en las Figuras 7, 8 y 9 del ANEXO). -
Luego se tomaron plantas pequeñas, medianas y grandes; de igual manera se trasplantó siete explantes por tratamiento. (Tal como se muestran en las Figuras: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18; del ANEXO).
-
Por último los frascos sembrados se procedió al sellado, etiquetado y luego el experimento fue instalado en la sala de incubación a condiciones de 22 ºC, con un fotoperiodo de 16 horas luz; (Tal como se muestran en las Figuras 19 y 20; del ANEXO).
3.7.2
MEDIOS DE CULTIVO
PROCEDIMIENTO DE LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO -
Para el medio basal MS T0; se procedió a pesar los materiales sólidos, (macronutrientes, micronutrientes, vitaminas, azúcar, agar-agar, carbón activado).
-
En una probeta de 600 ml. Se preparó el stock de las sales, vitaminas, azúcar, enrazando para 6 litros.
-
En seguida, distribuir 100 ml. en una probeta para luego enrazarlo a 1000ml.
29
Medir el PH. 5.5; agregar 6 gr./litro de agar-agar, cocinar por 10 minutos
-
luego incorporar 2 gr./litro de carbón activado y nuevamente cocinar por 5 minutos más, distribuir en los 28 frascos que es igual a 1 litro de medio de cultivo. - Finalmente se autoclavó, a 121 C° por 25 minutos para luego ser trasladado a cámara de flujo laminar, se selló y almaceno en los anaqueles durante una semana antes de usar, esto para observar si hubiera alguna contaminación. -
En los demás tratamientos el proceso fue lo mismo, con la diferencia de los siguientes nutrientes orgánicos y reguladores de crecimiento.
T1: MEDIO BASAL MS, se agregó 200 ml./ litro de agua de “coco”
T2: MEDIO BASAL MS, se agregó 100 gr./litro de “plátano seda maduro”
T3: MEDIO BASAL MS, se agregó 100 gr./litro de “plátano seda verde”
T4: MEDIO BASAL MS, se agregó 100 gr/litro de “plátano seda verde” + 200 ml. /litro de agua de “coco”.
T5: MEDIO BASAL MS, se agregó 100 gr/litro de “plátano seda verde” + 200 ml. /litro de agua de “coco” + REGULADOR DE CRECIMIENTO
-
Tal como se observa en las Tablas (06, 07, 08, 09, 10 y 11; del ANEXO) se definen los componentes de cada Tratamiento.
3.7.3
CONDICIONES DE CULTIVO
Los explantes sembrados, se incubaron a 22 ºC, con un fotoperiodo de 16 horas luz y 8 horas de oscuridad con una intensidad luminosa de 25003000 lux provista por fluorescentes de luz blanca.
30
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1
NUMERO DE BROTES EN PROTOCORMOS Phalaenopsis spp.
Tabla 6. Análisis de varianza en la influencia de los medios de cultivo con respecto a numero de brotes phalaenopsis spp. en el estadio protocormo FUENTE DE VARIACION
G.L
S.C
C.M
TRATAMIENTOS
5
36.7083
7.3416
ERROR
18
8.25
0.4583
TOTAL
23
44.9583
C.V%
11.8599
-
-
PROMEDIO
5.708
-
-
SIGNIF. **
-
**Altamente significativo
Figura 1. Prueba de tukey
para determinar el incremento del número brotes con
respecto a los medios de cultivos de phalaenopsis spp. en el estadio protocormo
En la Tabla 6, se presenta el análisis de varianza del estadio protocormo con respecto al número de brotes en influencia de los 6 tratamientos de Phalaenopsis spp. se ha observado un promedio de 5.7, Con valores para el C.V. 11.85 % . En la Figura 1, Según la prueba de TUKEY con respecto al número de brotes en el estadio de PROTOCORMO de Phalaenopsis spp. existe mínima diferencia estadística entre los tratamientos T3 (MS + Plátano Verde) con 7.5 y T5 (MS + Plátano Verde + Agua de Coco) con 7.25, destacan al influir en un mayor
31
número de brotes, siendo superior significativamente a los demás Tratamientos, como el T4 (MS + Plátano Verde + Agua de Coco) con 5.5, que supera T2 (MS + Plátano Maduro) con 5.0, T0 (MS) con 4.7, T1 (MS + Agua de Coco) con 4,2. Estos resultados encontrados confirman lo reportado por (Espinoza 2001), quien menciona que el Agua de Coco contiene fitohormonas que ayudan a un mejor desarrollo de las plántulas, siempre y cuando las concentraciones son variadas y que ayuden al desarrollo de las mismas. 4.2
PLANTAS PEQUEÑAS Phalaenopsis spp. Tabla 7. Análisis de varianza en la influencia de los medios de cultivo con respecto al tamaño de la planta phalaenopsis spp. en el estadio pequeño. FUENTE DE VARIACION
G.L
S.C
C.M
TRATAMIENTOS
5
0.11637
0.02327
ERROR
18
0.02782
0.00154
TOTAL
23
0.14419
C.V%
2.72
-
-
PROMEDIO
1.44
-
-
SIGNIFIC. **
-
**Altamente significativo
Figura 2. Prueba de Tukey para determinar el incremento de crecimiento con respecto a los medios de cultivos de phalaenopsis spp. en el estadio pequeño
32
En la Tabla 7, representa el análisis de Varianza del estadio PEQUEÑO, con respecto al tamaño de planta en cm. influencia de los 5 tratamientos de Phalaenopsis spp. con valores para el C.V 2.72 % y un promedio de 1.44, los mismos que adoptan la confiabilidad de los resultados obtenidos durante la investigación y la alta determinación entre la variable evaluada y los tratamientos en estudio.
En la Figura 2, se observa el resultado de la prueba TUKEY con respecto al tamaño de la planta en el estadio PEQUEÑO Phalaenopsis spp. se observa una mínima diferencia estadística entre
T5 (MS +Plátano Verde + Agua Coco +
Regulador Crec.) con 1, 53 y T4 (MS +Plátano Verde +Agua Coco) con 1,50; que supera a los tratamientos T3 (MS + Plátano Verde) con 1.46 que Supera T2 (MS + Plátano Maduro) con 1,43; que supera T1 ( MS + Agua de Coco) con 1,39; que supera a T0 (MS) con 1.32. Según lo reportado por (Espinoza 2001), menciona que el agua de coco contiene fitohormonas (auxinas, citoquininas y giberelinas) que ayudan a un mejor desarrollo de las plántulas, siempre y cuando las concentraciones deben estar estandarizadas, para evitar problemas durante su desarrollo.
4.3
PLANTAS MEDIANAS DE Phalaenopsis spp.
Tabla 8. Análisis de varianza en la influencia de los medios de cultivo con respecto al tamaño de la planta phalaenopsis spp. en el estadio mediano. FUENTE DE VARIACION
G.L
S.C
C.M
TRATAMIENTOS
5
2.053
0.41075
ERROR
18
1.452
0.08069
TOTAL
23
3.506
-
C.V%
10.87
-
-
PROMEDIO
2.612
-
-
SINGNIF. **
**Altamente significativo
33
Figura 3. Prueba de Tukey para determinar el incremento de crecimiento con respecto a los medios de cultivos de phalaenopsis spp. del Estadio Mediano.
En la Tabla 8, se representa el análisis de Varianza del estadio MEDIANO, con respecto al tamaño de planta en influencia de los 6 tratamientos de Phalaenopsis spp. con valores para el C.V 10.87 % y un promedio de 2,6 los mismos que adoptan la confiabilidad de los resultados obtenidos durante la investigación y la alta determinación entre la variable evaluada y los tratamientos en estudio. En la Figura 3 se aprecia el resultado de la prueba TUKEY con respecto al tamaño de la planta en el estadio MEDIANO de Phalaenopsis spp. se observa una mínima diferencia estadística entre T3 (MS + Plátano Verde) con 2,90; T5 (MS + Plátano Verde + Agua de Coco + Regulador de Crec.) con 2,87 y T0 (MS) con 2,85; que supera a los tratamientos T4 (MS + Plátano Verde + Agua de Coco) con 2,52 que Supera T1 (MS + Agua de Coco) con 2,42 y que supera T2 (MS + Plátano Maduro) con 2,1.
Según los resultados confirman lo reportado por (ARDITTI 1990), menciona que las plántulas responde a los cambios de medio y la composición que contengan, como el caso de auxinas que actúa directamente en la formación de raíces, así como las condiciones en ambientes controladas (temperatura, luz y humedad relativa, fotoperiodo 16/8). Se menciona también que para la fase de enraizamiento, se utiliza las mismas sales M&S, omitiéndose las citoquininas (BA). Complementado con 1.5 gr/l de carbón activado, 20 gr/l de sacarosa y agregando auxinas (ANA).
34
4.4
PLANTAS GRANDES DE Phalaenopsis spp.
Tabla 9. Análisis de varianza en la influencia de los medios de cultivo con respecto al tamaño de la planta phalaenopsis spp. en el estadio grande. FUENTE DE VARIACION
G.L
S.C
C.M
TRATAMIENTOS
5
3.3700
0.6740
ERROR
18
2.270
0.1261
TOTAL
23
5.64
-
C.V%
9.3452
-
-
PROMEDIO
3.80
-
-
SINGNIF. **
**Altamente significativo
Figura 4. Prueba de Tukey para determinar el incremento de crecimiento con respecto a los medios de cultivos de phalaenopsis spp. del estadio grande.
En la Tabla 9, se representa el análisis de Varianza del estadio GRANDE, con respecto al tamaño de planta en influencia de los 6 tratamientos de Phalaenopsis spp. con valores para el C.V 9.34 % y un promedio de 3,80 los mismos que adoptan la confiabilidad de los resultados obtenidos durante la investigación y la alta determinación entre la variable evaluada y los tratamientos en estudio.
35
En la Figura 4 se aprecia el resultado de la prueba TUKEY con respecto al tamaño de la planta en el estadio GRANDE de Phalaenopsis spp. se observa una mínima diferencia estadística entre T4 (MS + Plátano Verde +Agua Coco) con 4,32 y T5 (MS +Plátano Verde + Agua Coco+ Regulador Crec.) con 4,3; que supera a los tratamientos T1 (MS + Agua Coco) con 3,67 con una mínima diferencia a T3 (MS + Plátano Verde) con 3,62; que supera a T2 (MS + Plátano Maduro) con 3,5; que supera a T0 (MS) con 3,3. Según, (Valmayor 1972), reportó que el endosperma líquido del coco solamente permite una pobre diferenciación en protocormos de Dendrobium, Vanda y Cattleya, mientras que su combinación con extractos de “plátano” resulta en un buen desarrollo de raíces y tallos. (Stancato 2008) confirma que el uso de pulpas de frutos tales como: “manzana”, “plátano” y “tomate”, reportaron mejores resultados en el desarrollo de “orquídeas”.
4.5
COMPARACION DE LOS TRATAMIENTOS CON RESPECTO A LOS ESTADIOS.
Tabla 10. Análisis de varianza en la influencia de los Estadios PEQUEÑO, MEDIANO Y GRANDE de la planta phalaenopsis spp. con respecto a los Tratamientos
FUENTE DE VARIACION
G.L
S.C
C.M
TRATAMIENTOS
35
73,914
2,111
ERROR
36
2,094
0,058
TOTAL
71
76,008
-
C.V%
9,21
-
-
PROMEDIO
2,61
-
-
SINGNIF. **
**Altamente significativo
36
Figura 5. Prueba de Tukey para determinar el Análisis Combinado entre los Estadios GRANDE, MEDIANO Y PEQUEÑO de phalaenopsis spp. en influencia con los Tratamientos.
En la Tabla 10, se representa el análisis de Varianza de los estadios GRANDE, MEDIANO Y GRANDE de Phalaenopsis spp, con respecto a los tratamientos, con valores para el C.V 9,21 % y un promedio de 2,61. En la Figura 5 se aprecia el resultado de la prueba TUKEY, del Análisis Combinado de los Estadios GRANDE, MEDIANO Y PEQUEÑO de Phalaenopsis spp. con respecto a los Tratamientos; siendo el Optimo Tratamiento entre los Estadios con una mínima diferencia estadística para el T5 (MS +Plátano Verde + Agua Coco+ Regulador Crec.) con 2,90 y T4 (MS + Plátano Verde +Agua Coco) con 2,78; que supera a los tratamientos T3 (MS + Plátano Verde) con 2,66; con una mínima diferencia que supera a T0 (MS) con 2,51; T1 (MS + Agua Coco) con 2,49 y T2 (MS + Plátano Maduro) con 2,34. Según lo Reportado por (Khalifah, 1966a, Cu1966b). Encontraron que el fruto del “plátano” contiene pequeñas cantidades de compuestos inductores de la división celular [zeatina, zeatin-ribosido y 6-(2- isopentilamino) purina] Sin embargo, existen evidencias de que el efecto del “plátano” sobre el desarrollo de las “orquídeas” puede deberse a la presencia de otros compuestos distintos a las citokininas, pues se ha reportado la presencia de compuestos afines a giberelinas y auxinas en el mismo.
37
V. CONCLUSIONES
1. El protocolo establecido durante el proceso de propagación in Vitro de Phalaenopsis spp. permitió la formación de brotes en protocormos, desarrollo y enraizamiento de las plántulas.
2. Para el Estadio PROTOCORMO, en el desarrollo de los brotes los medios de cultivo que dieron mejores resultados fueron T3 (MS + plátano verde) y T5 (MS + plátano verde + agua de coco + regulador de crecimiento) de Phalaenopsis spp.
3. Con respecto al tamaño de planta en el estadio PEQUEÑO, los mejores resultados fueron los tratamientos T5 con 1,53 cm. y T4 con 1,50 cm. evaluados en 12 semanas después de la siembra; en Phalaenopsis spp.
4. Con respecto al estadio MEDIANO tienen los mejores resultados para el desarrollo de la planta los tratamientos T3 con 2,90 cm.; T5 con 2,87 cm. y T0 con 2,85 cm. en Phalaenopsis spp. 5. Para el estadio GRANDE, los mejores resultados para el desarrollo de la planta fueron los tratamientos T4 con 4,32 cm.; T5 con 4,30 cm. en Phalaenopsis spp.
6. La utilización de sustancias orgánicas complejas como el plátano de seda homogeneizado (100 g/l) y
líquido de coco (200 ml/l), en la
composición de los medios, promueven una rápida diferenciación de los protocormos y en los demás estadios como pequeño mediano y grande en el desarrollo vegetativo y radicular de las plántulas de Phalaenopsis spp.
7. Teniendo en cuenta el mayor número de brotes por protocormo, una menor incidencia de contaminación de medio, disminuir costos y favorecer el mayor crecimiento de la planta, el mejor tratamiento fue el T3.
38
VI. RECOMENDACIONES
1. Emplear herramientas apropiadas para la siembra del cultivo in vitro de Phalaenopsis spp. “orquídeas” para evitar una contaminación masiva y que la investigación no se arruine. 2. Para la producción masiva de Phalaenopsis spp. “orquídeas” utilizar el medio de cultivo con la adición de sustancias orgánicas complejas como el “plátano seda verde” homogenizado y el endospermo líquido de “coco” (Tratamiento T4). 3. Preservar
las otras especies de “orquídeas”, ya que se encuentran en
peligro de extinción, con el cultivo in vitro utilizando sustancias orgánicas complejas, como el “plátano de seda verde” y líquido de “coco”. 4. Evaluar otros agentes gelidificantes que remplacen al agar – agar, para abaratar los costos de la producción de plantas utilizando el cultivo in vitro.
5. La Universidad Nacional
José Faustino Sánchez Carrión - Huacho,
necesita de un laboratorio de Biotecnología ya que las “orquídeas” y otros cultivos de la zona necesitan la preservación y la multiplicación masiva de modo que se pueda obtener Bancos de Germoplasma, para finalmente obtener plantas de calidad libres de virus y patógenos con miras a una producción comercial, utilizando el cultivo in vitro.
39
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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44
VIII.
ANEXOS
Figura 6. Preparación Medios de Cultivo - Descripción
Figura 7. Selección del Estadio Protocormo
45
Figura 8. Siembra del Estadio Protocormo.
Figura 9. Estadio de Protocormos Sembrados
46
Figura 10. Aislamiento de Plantas Pequeñas
Figura 11. Siembra de Plantas Pequeñas
47
Figura 12. Plantas Pequeñas Sembrados
Figura 13. Separación de Plantas Medianas
48
Figura 14. Siembra de Plantas Medianas
Figura 15. Plantas Medianas Sembrados
49
Figura 16. Selección de Plantas Grandes
Figura 17. Siembra de Plantas Grandes
50
Figura 18. Plantas Grandes Sembrados
Figura 19. Sellado de los Frascos Sembrados
51
Figura 20. Experimento Instalado en la Sala de Incubación
52
Tabla 11. Composición y preparación del medio Murashige y Skoog volumen de solución madre MACROELEMENTOS
mg/litro
50 x/gramos por cada lt. de medio
NH₄NO₃
1650
82.5
KNO₃
1900
95
CaCl₂.2H₂O
440
22
MgSO₄.7H₂O
370
18.5
KH₂PO₄
170
8.5
MnSO₄.H₂O
11.8
0.59
ZnSO₄.7H₂O
8.6
0.43
H₃BO₃
6.2
0.31
KI
0.83
0.0415
Na₂MoO₄.2H₂O
0.25
0.0125
CuSO₄.5H₂O
0.025
0.00125
CoCl₂.6H₂O
0.025
0.00125
FeSO₄.7H₂O
0.00556
0.000278
NA₂EDTA.2H₂O
0.00746
0.000373
50 ml./litro
MICROELEMENTOS
50 ml./litro
volumen de solución madre VITAMINAS
mg/litro
50 x/gramos
por cada lt. de medio/Enrazado a 100 ml
Myo-inositol
100
5
Glicina
2
0.1
ÁcidoNicotinico
0.5
0.025
HCL-Pirodoxina
0.5
0.025
HCL-Tiamina
0.1
0.005
2 ml./litro
Fuente: Elaboración propia basada en los protocolos de investigación del laboratorio.
53
Tabla 12. Componentes del Tratamiento Testigo
MACROELEMENTOS
mg/litro
50 x/gramos
1650 1900 440 370
82.5 95 22 18.5
170
8.5
NH₄NO₃ KNO₃ CaCl₂.2H₂O MgSO₄.7H₂O KH₂PO₄
volumen de solución madre por lt. de medio
50 ml./litro
MICROELEMENTOS MnSO₄.H₂O ZnSO₄.7H₂O H₃BO₃ KI Na₂MoO₄.2H₂O CuSO₄.5H₂O CoCl₂.6H₂O FeSO₄.7H₂O NA₂EDTA.2H₂O
VITAMINAS
11.8 8.6 6.2 0.25 0.025 0.025 0.00556
0.59 0.43 0.31 0.0415 0.0125 0.00125 0.00125 0.000278
0.00746
0.000373
0.83
mg/litro
50 ml./litro
volumen de solución madre 50 por lt. de x/gramos medio/enrazado a 100 ml
Myo-inositol Glicina Acido Nicotinico HCL-Pirodoxina
100 2 0.5 0.5
5 0.1 0.025 0.025
HCL-Tiamina
0.1
0.005
Ph
5.5
2 ml./litro
Fuente: Elaboración propia basada en los protocolos de investigación del laboratorio
Tabla 13.
54
Componentes del T1
MACROELEMENTOS NH₄NO₃ KNO₃ CaCl₂.2H₂O MgSO₄.7H₂O KH₂PO₄ MICROELEMENTOS MnSO₄.H₂O ZnSO₄.7H₂O H₃BO₃ KI Na₂MoO₄.2H₂O CuSO₄.5H₂O CoCl₂.6H₂O FeSO₄.7H₂O NA₂EDTA.2H₂O
VITAMINAS Myo-inositol Glicina AcidoNicotinico HCL-Pirodoxina HCL-Tiamina
CONSTITUYENTE Agar agar Sucrosa Carbón
mg/litro
Volumen de solución madre 50 x/gramos por cada lt. de medio
1650 1900 440 370 170
82.5 95 22 18.5 8.5
50 ml./litro
11.8 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 0.00556 0.00746
0.59 0.43 0.31 0.0415 0.0125 0.00125 0.00125 0.000278 0.000373
50 ml./litro
mg/litro
50 x/gramos
volumen de solución madre por cada litro de medio/enrazado a 100 ml.
100 2 0.5 0.5 0.1
5 0.1 0.025 0.025 0.005
2 ml./litro
gramos/litro 6 30 2
CONSTITUYENTE
ml./litro
Agua de coco
200
PH
5.5 Fuente: Elaboración Propia basada en los protocolos de investigación del laboratorio
Tabla 14.
55
Componentes del T2
MACROELEMENTOS NH₄NO₃ KNO₃ CaCl₂.2H₂O MgSO₄.7H₂O KH₂PO₄
mg/litro
50x/gramos
volumen de solución madre por cada litro de medio
1650 1900 440 370 170
82.5 95 22 18.5 8.5
50 ml./litro
11.8 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 0.00556 0.00746
0.59 0.43 0.31 0.0415 0.0125 0.00125 0.00125 0.000278 0.000373
50 ml./litro
mg/litro
50 x/gramos
volumen de solución madre por cada litro de medio/enrazado a 100 ml.
100 2 0.5 0.5 0.1
5 0.1 0.025 0.025 0.005
2 ml./litro
MICROELEMENTOS MnSO₄.H₂O ZnSO₄.7H₂O H₃BO₃ KI Na₂MoO₄.2H₂O CuSO₄.5H₂O CoCl₂.6H₂O FeSO₄.7H₂O NA₂EDTA.2H₂O
VITAMINAS
Myo-inositol Glicina Ácido Nicotinico HCL-Pirodoxina HCL-Tiamina
CONSTITUYENTE
gramos/litro
Agar – agar
6
Sucrosa
30
Carbo Activado
2
Plátano maduro
100
PH:
5.5
Fuente: Elaboración Propia basada en los protocolos de investigación del laboratorio
Tabla 15.
56
Componentes del T3
MACROELEMENTOS
mg/litro
50 x/gramos
NH₄NO₃
1650
82.5
KNO₃ CaCl₂.2H₂O Mg₄.7H₂O
1900 440 370
95 22 18.5
KH₂PO₄
170
8.5
11.8 8.6
0.59 0.43
CuSO₄.5H₂O CoCl₂.6H₂O FeSO₄.7H₂O
6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 0.00556
0.31 0.0415 0.0125 0.00125 0.00125 0.000278
NA₂EDTA.2H₂O
0.00746
0.000373
volumen de solución madre por cada lt. de medio
50 ml./litro
MICROELEMENTOS MnSO₄.H₂O ZnSO₄.7H₂O H₃BO₃ KI Na₂MoO₄.2H₂O
VITAMINAS
mg/litro
volumen de solución madre 50 x/gramos por cada lt. de medio/enrazado a 100 ml.
Myo-inositol Glicina Ácido Nicotinico HCL-Pirodoxina
100 2 0.5 0.5
5 0.1 0.025 0.025
HCL-Tiamina
0.1
0.005
CONSTITUYENTE
6
Sucrosa
30
Carbo Activado
2
PH:
2 ml./litro
gramos/litro
Agar – agar
Plátano verde
50 ml./litro
100
5.5
Fuente: Elaboración Propia basada en los protocolos de investigación del laboratorio.
Tabla 16.
57
Componentes del T4
MACROELEMENTOS
mg/litro
50 x/gramos
NH₄NO₃
1650
82.5
KNO₃ CaCl₂.2H₂O MgSO₄.7H₂O
1900 440 370
95 22 18.5
KH₂PO₄
170
8.5
11.8 8.6
0.59 0.43
CuSO₄.5H₂O CoCl₂.6H₂O FeSO₄.7H₂O
6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 0.00556
0.31 0.0415 0.0125 0.00125 0.00125 0.000278
NA₂EDTA.2H₂O
0.00746
0.000373
mg/litro
50 x/gramos
Myo-inositol Glicina Ácido Nicotinico HCL-Pirodoxina
100 2 0.5 0.5
5 0.1 0.025 0.025
HCL-Tiamina
0.1
0.005
volumen de solución madre por cada litro de medio
50 ml./litro
MICROELEMENTOS MnSO₄.H₂O ZnSO₄.7H₂O H₃BO₃ KI Na₂MoO₄.2H₂O
VITAMINAS
CONSTITUYENTE
6
Sucrosa
30
Carbo Activado
2
2 ml./litro
100
CONSTITUYENTE Agua de coco
PH:
volumen de solución madre por cada litro de medio/enrazado a 100 ml.
gramos/litro
Agar – agar
Plátano verde
50 ml./litro
ml./litro 200
5.5
Fuente: Elaboración Propia basada en los protocolos de investigación del laboratorio.
Tabla 17.
58
Componentes del T5
MACROELEMENTOS
mg/litro
50 x/gramos
NH₄NO₃ KNO₃ CaCl₂.2H₂O MgSO₄.7H₂O
1650 1900 440 370
82.5 95 22 18.5
KH₂PO₄
170
8.5
MnSO₄.H₂O ZnSO₄.7H₂O
11.8 8.6
0.59 0.43
H₃BO₃ KI Na₂MoO₄.2H₂O
6.2 0.83 0.25
0.31 0.0415 0.0125
CuSO₄.5H₂O CoCl₂.6H₂O FeSO₄.7H₂O
0.025 0.025 0.00556
0.00125 0.00125 0.000278
NA₂EDTA.2H₂O
0.00746
0.000373
volumen de solución madre por cada litro de medio
50 ml./litro
MICROELEMENTOS
VITAMINAS
mg/litro
volumen de solución madre 50 x/gramos por cada lt. de medio/enrazado a 100 ml.
Myo-inositol Glicina ÁcidoNicotinico HCL-Pirodoxina
100 2 0.5 0.5
5 0.1 0.025 0.025
HCL-Tiamina
0.1
0.005
CONSTITUYENTE
6
Sucrosa
30
Carbo Activado
2 100
CONSTITUYENTE
ml./litro
Agua de coco
200
Regulador crecimiento(supertrhive)
0.25
PH:
2 ml./litro
gramos/litro
Agar – agar
Plátano verde
50 ml./litro
5.5
Fuente: Elaboración Propia basada en los protocolos de investigación del laboratorio.
59