División de Ciencias Biológicas y de la Salud Departamento de Biotecnología

Licenciatura Ingeniería Bioquímica Industrial

MANUAL DE PRÁCTICAS DEL LABORATORIO DE INGENIERÍA ENZIMÁTICA

Dr. Sergio Huerta Ochoa Depto. Biotecnología

Prólogo del Manual Introducción: El manual de prácticas del laboratorio es un apoyo didáctico para la UEA Optativa Ingeniería Enzimática de la licenciatura de Ingeniería Bioquímica Industrial. Objetivo: El objetivo general del laboratorio es que el alumno aplique y asimile los fundamentos cinéticos de reacciones enzimáticas mediante la determinación de datos experimentales obtenidos en laboratorios virtuales utilizando el software comercial “Laboratorio de Enzimas” Ver. 6.12S. (Newbyte Educational Software), y el software “EnzymeLab”, este último de acceso gratuito para fines didácticos.

Nota: Las prácticas aquí mostradas han sido adaptadas del manual del software “Laboratorio de Enzimas” Ver. 6.12S. (Newbyte Educational Software) a los requerimientos de la UEA “Ingeniería Enzimática”

PRÁCTICA No. 1

Determinación de la curva de progreso y la velocidad inicial de una reacción enzimática Introducción: La pepsina y la tripsina son enzimas proteasas, lo que indica que descomponen las moléculas de las proteínas como parte del proceso digestivo. La pepsina se encuentra en el estómago. La tripsina es secretada del páncreas al duodeno. Ambas se liberan en forma de cimógeno inactivo y entran en acción en el estómago y el lumen del tracto intestinal. Proteasa Proteína   → Péptidos

Objetivo: Mediante la determinación de la curva de progreso y la velocidad inicial de la reacción de dos proteasas, que el alumno aplique y asimile los conceptos de velocidad inicial de reacción enzimática y que adquiera un conocimiento cualitativo de cómo la concentración de enzima y la de substrato afectan a dichas velocidades. Procedimiento: La curva de progreso puede obtenerse detectando la cantidad de sustrato que reacciona durante el tiempo de reacción. 1. Escoja Laboratorio de investigación, haga clic en Restablecer y borre toda la gráfica. 2. Asegúrese de que los siguientes datos pre-establecidos estén correctos Sustrato Enzima Producto Inhibidos Temperatura pH

Proteína Tripsina Péptidos Ninguno

100 15 0 0 37.0 8.0

Proteína Pepsina Péptidos Ninguno

100 15 0 0 37.0 2.0

3. Haga clic en el botón de inicio y prepárese para activar el botón de pausa cuando el experimento haya llegado a 12 minutos. 4. Registre las concentraciones de sustrato y producto en la Tabla 5. Empiece un nuevo experimento haciendo clic en Restablecer. 6. Repita los pasos 3-5 para la pepsina 7. Lleve los niveles de sustrato al Gráfico 1 y los de producto al Gráfico 2

Resultados: Tabla 1 Tiempo (Segundos)

Tripsina Concentración de producto (mM)

Pepsina Concentración de producto (mM)

0 30 60 90 120 150 180 Diagrame a continuación los datos de sustrato (Gráfico 1) y producto (Gráfico 2) de la Tabla 1 para cada una de las proteasas y calcule la velocidad inicial de la reacción, mediante la determinación de la tangente a la curva de progreso al inicio de la reacción. Gráfico 1. Curva de progreso Substrato vs tiempo 100 80 60 40 20 0 0

5

10

15

20

25

30

Gráfico 2. Curva de progreso Producto vs tiempo 100 80 60 40 20 0 0

5

10

15

20

25

30

PRÁCTICA No. 2

Determinación de los parámetros cinéticos (KM, Vmax y kcat) Introducción: Michaelis y Menten en 1913, para explicar la relación observada entre la velocidad inicial y la concentración inicial de sustrato propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente presentan el siguiente mecanismo:

[E ] + [S ]

k1 →

← k−1

[ES ] k→[E ] + [P] cat

En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre. Este mecanismo considerando condiciones de equilibrio rápido o estado pseudo-estacionario conduce a la expresión de velocidad:

v=

V max [S ] K M + [S ]

Objetivo: Utilizando el programa EnzymeLab determinar los parámetros cinéticos (KM y Vmax) de una reacción enzimática para que el alumno aplique y asimile los conceptos de velocidad máxima de reacción (Vmax), constante de Michaelis-Menten (KM), y constante catalítica de una reacción enzimática (kcat). Procedimiento: Utilizando el programa EnzymeLab determinar los parámetros cinéticos de la reacción enzimática de la curva de velocidad de reacción versus concentración de sustrato. 1. En el primer día de trabajo determina la estrategia experimental con base en los objetivos de la práctica. 2. Elije la enzima con la que deseas trabajar, anota los datos que se te dan. 3. Selecciona las condiciones de reacción a utilizar. 4. Continúa obteniendo velocidades iniciales de reacción a diferentes concentraciones de sustrato. 5. Al final del día realiza el análisis cinético y anota lo valores de K M y V max que obtiene el programa con regresión no-lineal. 6. Compara los parámetros obtenidos por un método de regresión lineal con los que da el EnzymeLab utilizando regresión no-lineal.

Resultados: Tabla 1. Concentración de sustrato (Unidades)

Velocidad inicial de reacción (Unidades)

Diagrame a continuación los datos de la Tabla 1 (Gráfico 1), determine manera gráfica y con un método de regresión lineal el valor de Vmax y KM.

Grafico 1. Velocidad de reacción vs concentración de sustrato 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

20

40

60

80

100

PRÁCTICA No. 3

Determinación de la constante de inhibición (KI) de una reacción enzimática para inhibición competitiva, no-competitiva o mixta Introducción: Los inhibidores reversibles se unen a las enzimas mediante interacciones no covalentes tales como los puentes de hidrógeno, las interacciones hidrofóbicas y los enlaces iónicos. Las enzimas en una ruta metabólica pueden ser inhibidas por los productos resultantes de sus respectivas rutas. La inhibición reversible puede ser descrita cuantitativamente en términos de la unión del inhibidor a la enzima y al complejo enzima-sustrato, y sus efectos en las constantes cinéticas de la enzima. En el esquema clásico de Michaelis-Menten, una enzima (E) se une a su sustrato (S) para formar el complejo enzima-sustrato (ES), y este complejo se rompe para liberar el producto (P) y la enzima (E). En la catálisis enzimática en presencia de un inhibidor (I), este puede unirse tanto a (E) como a (ES) con las constantes de disociación KI o KI', respectivamente, afectando la velocidad de la reacción. Objetivo: Determinar los parámetros cinéticos (KM y Vmax) en presencia y ausencia de un inhibidor, para que el alumno aplique y asimile los conceptos de inhibición de reacción enzimática, pueda identificar el tipo de inhibición que se presenta y su constante de inhibición (KI). Procedimiento: Utilizando el programa EnzymeLab determina la cinética tipo Michaelis-Menten un ausencia y presencia de inhibidor para la enzima que elijas determinando la velocidad de reacción a diferentes concentraciones de sustrato. 1. 2.

3.

Escoja la enzima con la que deseas trabajar, anota los datos que se te dan. En el primer día de trabajo determina la cinética tipo Michaelis-Menten en ausencia del inhibidor. Al final del día realiza el análisis cinético y anota lo valores de K M y V max que obtiene el programa con regresión no-lineal. En el segundo día de trabajo realiza el mismo procedimiento agregando una cierta concentración de inhibidor y mantenla constante durante los ensayos. Al final del día ' realiza el análisis cinético y anota los valores de K M' y V max que obtiene el programa

4.

con regresión no-lineal. Compara los parámetros obtenidos en ausencia y presencia del inhibidor para determinar el tipo de inhibidor.

5.

Calcula la(s) constante(s) de inhibición ( K I ).

PRÁCTICA No. 4

Efecto del pH en una reacción enzimática Introducción: El pH del medio afecta la forma molecular de la enzima y por lo tanto la tasa de reacción, cada enzima tiene un pH óptimo, el cual está entre pH 6 - 8 para la mayoría de las enzimas.

Objetivo: Determinar el efecto del pH en la actividad enzimática.

Procedimiento: Utilizando el programa EnzymeLab determina la cinética tipo Michaelis-Menten al pH óptimo, posteriormente determina el efecto del pH sobre la velocidad máxima, utiliza el siguiente procedimiento: 1. Escoja la enzima con la que deseas trabajar, anota los datos que se te dan. 2. En el primer día de trabajo determina la cinética tipo Michaelis-Menten al pH que indica la ficha técnica. Al final del día realiza el análisis cinético y anota lo valores de K M y V max que obtiene el programa con regresión no-lineal. 3. Calcule [S] = 25 KM. 4. En el segundo día de trabajo realice experimentos a una concentración de sustrato de [S] = 25 KM a diferentes pH iniciales. 5. Registre las velocidades de reacción a diferentes pH. 6. Lleve los datos a un gráfico y con la metodología vista en clase determina los pK’s más importantes del sitio activo y discuta los resultados observados.

PRÁCTICA No. 5

Efecto de la temperatura en una reacción enzimática Introducción: La maltasa (α-D-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.20) es una enzima que convierte la maltosa (disacárido) en las dos glucosas de las que está compuesta. Está presente en intestino delgado, en el borde de cepillo de las vellosidades intestinales. Pertenece a la familia de las disacaridasas, que son las enzimas que se encargan de romper los disacáridos en los monosacáridos que los forman. maltasa Maltosa  → Glucosa

Objetivo: Determinar el efecto de la Temperatura en la actividad enzimática.

Procedimiento: Primero, fijar la concentración de sustrato donde la enzima está en condiciones de saturación (v ≈ Vmax). 1. Escoja Laboratorio de investigación, haga clic en Restablecer y borre toda la gráfica. 2. Asegúrese de que los siguientes datos pre-establecidos estén correctos Sustrato Enzima Producto Inhibidor Temperatura pH

Maltosa Maltasa Glucosa Ninguno

100 15 0 0 37 7.0

3. Haga clic en el botón de inicio y deje llevar a cabo la reacción durante 2 minutos tome la lectura de la velocidad de la reacción. 4. Registre las velocidades de reacción a diferentes Temperaturas en la Tabla 1 5. Lleve los datos al Gráfico 1 y discuta los resultados observados. 6. Determine la energía de activación (Ea) de la enzima.

Resultados: Registre los datos cinéticos de la velocidad de reacción enzimática a diferentes temperaturas.

Tabla 1. Temperatura (°C) 20 25 30 35 40 45 50 60 70

Velocidad de reacción (Unidades)

Diagrame a continuación los datos de la Tabla 1 (Gráfico 1)

Gráfico 1.

Velocidad de reacción vs Temperatura 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 30

35

40

Determine la Energía de Activación (Ea).

45

50

55

60