MANUAL DE MARCADORES MOLECULARES (RAPD, ISOENZIMAS Y PROTEÍNAS ) PARA EL ESTUDIO DE PROSOPIS Y ESPECIES FORESTALES AFINES

JUANA JUÁREZ MUÑOZ CENTRO DE INVESTIGACIONES FORESTALES -ICAP

GUILLERMO CARRILLO CASTAÑEDA COLEGIO DE POSTGRADUADOS

Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo Pachuca, Hidalgo, 2005

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE HIDALGO Juan Manuel Camacho Bertrán Rector

Enrique Gerardo Macedo Ortiz Secretario General

Carlos César Maycotte Morales Director del Instituto de Ciencias Agropecuarias

Consejo Editorial

Evaristo Luvián Torres Víctor Manuel Ballesteros García Rafael Cravioto Muñoz Guadalupe Durán Osorio Consejeros

Enrique Rivas Paniagua Producción Editorial

© 2005, Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo Abasolo 600, Centro, Pachuca, Hidalgo, México, CP 42000 Correo electrónico: [email protected] Prohibida la reproducción parcial o total de esta obra sin el consentimiento escrito de la UAEH ISBN : 970 -769-032-1

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AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Programa de Mejoramiento al Profesorado (Proyecto 103.5/03/1130) por el apoyo económico brindado para esta publicació n.

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P RESENTACIÓN La biología molecular es una de las pocas ciencias que, en los últimos años, se ha distinguido por su acelerado desenvolvimiento y ha sido la base para el desarrollo de una importante serie de métodos experimentales, con los cuales se facilitan las tareas para entender fenómenos importantes en niveles moleculares hasta poblacionales. Desde el punto de vista aplicado, estos estudios facilitan la tarea del análisis de plantas y animales útiles al hombre, de las que, mediante su manipulación, se obtienen las razas de animales y los cultivos que son fuente de alimentos y muchos productos requeridos para el bienestar de la humanidad. Las técnicas que en su conjunto tratan acerca del cultivo de tejidos animale s y vegetales, del ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinante, así como de la formación de hibridomas, todas en su sentido amplio, son conocidas en forma colectiva como biotecnología. Los marcadores moleculares son características distintivas que manifiestan los organismos, los cuales pueden ser utilizados para la discriminación de fenotipos y son de peculiar importancia en el campo de la taxonomía. Ha sido desarrollada una diversidad de técnicas basadas en el análisis de los polimorfismos de las proteínas, isoenzimas y el ADN , y en ello se apoyan estas identificaciones. Si bien hemos tomado como material de estudio al mezquite (Prosopis sp) por ser una especie potencialmente importante en las regiones semiáridas de México, las técnicas descritas en el presente manual tienen uso muy amplio en el reino vegetal. Esta obra ha sido diseñada para apoyar la materia de Genética Forestal de la licenciatura de Ingeniería Forestal de la UAEH , y para las personas interesadas en el conocimiento de estas técnicas. Por tal razón, se presentan de la forma más clara posible con la intención de que puedan llevarlas a cabo en el laboratorio y a su vez para que puedan hacer el análisis de los resultados. En resumen, el lector podrá aplicarlas de manera práctica, y se recomienda que como parte complementaria se consulte la información teórica de los respectivos temas de biología molecular. Juana Juárez Muñoz Guillermo Carrillo Castañeda

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CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN 2 . GENERALIDADES 2.1. Determinación de la variabilidad genética 2.2. Metodologías basadas e n el polimorfismo del ADN 2.3. Técnicas basadas en hibridación 2.4. Técnicas basadas en la reacción de polimerización en cadena 2.5. Amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPDs) 2.6. Microsatélites 2.7. Amplificación de longitudes de fragmentos de restricción polimórficos (AFLPs) 2.8. Construcción de dendrogramas a partir de datos moleculares aplicando la taxonomía numérica 3. METODOLOGÍAS DE AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DEL ADN 3.1. Introducción 3.2. Objetivos 3.3. Material biológico 3.4. Aislamiento de ADN 3.5. Determinación de la pureza y concentración del ADN 3.6. Evaluación del grado de integridad del ADN 4. AMPLIFICACIÓN DEL DNA 5. SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS 6. ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTO Y GENÉTICO 6.1. Procesamiento de los datos y uso del programa NTSYS 7. METODOLOGÍAS BASADAS EN EL POLIMORFISMO DE PROTEÍNAS E ISOENZÍMAS 7.1. Introducción 7.2. Separación de proteínas e isoenzimas en geles de poliagrilamida 7.2.1. Objetivos 7.2.2. Material biológico 7.2.3. Preparación de extractos 7.2.4. Determinación de proteínas 7.2.5. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS 7.2.6. Identificación de peroxidasas por electroforesis en geles de poliacrilamidaSDS. 7.2.7. Identificación de la fosfatasa ácida por electroforesis en geles de poliacrilamida –SDS 7.2.8. Determinación de la actividad de fosfatasa ácida pH 5.8 8. LITERATURA CITADA Apéndice

Pag. 1 2 2 3 3 5 7 8 9 9 15 15 15 15 15 16 18 19 19 21 21 28 28 30 30 30 30 32 32 35 35 35 37 41

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LISTA DE FIGURAS

Pag. Figura 1. Secuencia del proceso de detección de los RFLPs. PstI = endonucleasa de restricción derivada de Pseudomonas Figura 2. Secuencia de pasos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa Figura 3. Estrategia general de la técnica de AFLP. Secuencias adaptadoras Figura 4. Esquema que muestra los pasos para el aislamiento de ADN Figura 5. Preparación de la mezcla de reacción para PCR, separación electroforética de los fragmentos amplificados y visualización de éstos en el gel Figura 6. Carátula de presentación del programa NTSYS-pc Figura 7. Menú principal del paquete NTSYS-pc en donde se muestran los programas que pueden ser utilizado en un análisis numérico Figura 8. Pantalla en la que se introduce la información del archivo de la matriz básica de datos Figura 9. Ejemplo integrado de la introducción de los datos para crear el archivo de la matriz básica de datos Figura 10. Menú para ejecutar el programa Output Figura 11. Matriz básica de datos verificada Figura 12. Menú para ejecutar el programa “Qualitative” Figura 13. Menú para ejecutar el programa SAHN Clustering Figura 14. Menú para ejecutar el programa Tree Figura 15. Procedimiento para la obtención de un sobrenadante para la separación electroforética de proteínas Figura 16. Procedimiento sugerido para la separación electroforética de proteínas y visualización de estas en el gel

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LISTA DE ABREVIATURAS AFLP AP-PCR DAF RAPD PCR SSR OTU mg µg M mM µM pmol µL % ng g L mL h min s pb nm rpm °C cm mm DO UV pH dNTP ADN TAE UPCMA

Polimerización en longitud de los fragmentos amplificados Iniciador arbitrario de la reacción en cadena de la polimerasa Amplificación de huellas genómicas del ADN Amplificación aleatoria del ADN polimórfico Reacción en cadena de la polimerasa Simples secuencias repetidas Unidades taxonómicas operativas Miligramo Microgramo Concentración molar Milimolar Micromolar Picomol Microlitro Porcentaje Nanogramo Gramo Litro Mililitro Hora Minuto Segundo Pares de bases Nanómetro Revoluciones por minuto Grados centígrados Centímetro Milímetro Densidad óptica Radiación ultravioleta Concentración – log H+ Desoxirribonucleótido trifosfato Ácido desoxirribonucleico Tris, ácido acético, EDTA Método de ligamiento promedio (Unweighted pair-group method with arithmetic averages)

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1. INTRODUCCIÓN

El género Prosopis de la subfamilia Mimosoidae es uno de los más primitivos de la familia Leguminosoidae; se piensa que se originó en África a finales del Mesozoico e inicios del periodo Terciario. Actualmente se encuentra distribuido con amplitud en las zonas áridas y semiáridas de América, norte de África y suroeste de Asia. El género incluye 44 especies, divididas en cinco secciones y diez series. En América se ubican 40 de las especies conocidas, 31 se localizan en Sudamérica, de las cuales 29 son nativas de Argentina, principal centro de diversificación del Prosopis y nueve en Norteamérica (Burkart, 1976 a,b; Rzedowski, 1988). Las especies de este género son capaces de desarrollarse en suelos pobres y degradados y, como todas las leguminosas, contribuyen a mejorar la calidad de los suelos mediante la aportación de materia orgánica y la incorporación de nitrógeno atmosférico al suelo. Algunas especies de la sección Algarobia son simpátricas en diversas regiones del mundo, lo cual da lugar a que se creen fenotipos nuevos por hibridación, que dificultan la clasificación taxonómica. Por tal razón, en el caso de las especies argentinas se ha recurrido al uso de marcadores moleculares (isoenzimas, RFLP, RAPD), para la identificación de ciertas especies y para el establecimiento de sus relaciones filogenéticas (Saidman, 1986; Saidman y Vilardi, 1987; Solbring y Bawa, 1975; Whitmore y Braag, 1979; Saidman et al., 1998b; Ramírez et al., 1999). En el caso de las especies mexicanas es necesario caracterizarlas con estos criterios, ya que nuestro país es considerado el segundo centro de diversificación del género y en algunas especies existen problemas en su clasificación a nivel de serie. En los últimos años se ha incrementado el interés por estudiar este género debido al potencial multipropósito de algunas especies para la reforestación de regiones áridas y semiáridas, así como para la producción de madera, carbón, forraje y alimentación para el hombre. Sin embargo, para poner en práctica programas de reforestación, de mejoramiento o bien para la explotación racional del género, se requiere conocer la constitución y variación genética de las poblaciones naturales. Para conservar la variación genética en las áreas reforestadas, también es necesario identificar las características morfológicas, fisiológicas y reproductivas que favorecen la variación genética en las poblaciones naturales.

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2. GENERALIDADES 2.1. Determinación de la variabilidad genética La variabilidad genética y la caracterización de las especies se han estimado generalmente con base en las características morfológicas. Durante los años recientes se ha incrementado el uso de marcadores moleculares como una herramienta más en la caracterización de los individuos, ya que en casos como el de la evolución convergente, donde la morfología coincide aun cuando las diferencias genéticas sean muy grandes, es difícil definir a las especies únicamente en función de los caracteres morfológicos. Los marcadores moleculares, considerados como un carácter adicional en los estudios taxonómicos a diferencia de los caracteres morfológicos, no están influidos por el ambiente y proporcionan un número ilimitado de caracteres moleculares que pueden ser de gran valor en la diferenciación de especies y establecimiento de relaciones filogenéticas. Un marcador molecular se define como la secuencia de ADN o de proteína que puede ser fácilmente detectado y cuya herencia puede ser monitoreada. Este término hace referencia al polimorfismo de bandas obtenido a través de las técnicas moleculares isoenzimáticas o las basadas en el análisis del ADN. La variación genética a nivel molecular puede ser detectada mediante el análisis directo del ADN o mediante el de sus productos genéticos; es decir, analizando cambios en sus proteínas o enzimas. La variabilidad genética con base en los productos del ADN se ha determinado mediante análisis isoenzimáticos. Esta técnica involucra la separación electroforética de isoenzimas en geles de almidón o poliacrilamida, seguida de la tinción del gel con un sustrato específico para la detección de la enzima. Esta metodología es relativamente económica, permite detectar varios loci en poco tiempo y detectar la herencia codominante. En organismos diploides, ambos alelos son claramente identificados y los heterocigotos pueden ser claramente distinguidos de los homocigotos, lo cual es un prerrequisito para la estimación de frecuencia de alelos en estudios de genética de poblaciones (Weising et al., 1995). El análisis isoenzimático se ha utilizado para estimar la variabilidad genética interespecífica e intraespecífica en estudios de estructura de poblaciones, delimitación de especies y caracterización de modelos de introgresión (Harrison, 1991). No obstante sus aplicaciones biológicas, el análisis isoenzimático se ve limitado debido a que la expresión de las isoenzimas es influida por el medio ambiente, así también porque su expresión puede ser temporal u órgano específica, ya que los genes que las

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codifican sólo se expresan en estadios específicos del desarrollo y bajo determinadas condiciones medioambientales, además de que el análisis isoenzimático sólo permite analizar una porción del genoma. A diferencia de las isoenzimas, los marcadores moleculares basados en el ADN tienen la ventaja de que sus polimorfismos son mucho más abundantes, ya que se encuentran distribuidos por todo el genoma, tienen un mayor grado de reproducibilidad, no son afectados por condiciones ambientales y su expresión no está limitada a ciertos tejidos.

2.2. Metodologías basadas en el polimorfismo del ADN En los últimos años se ha desarrollado una gran variedad de técnicas para la detección de polimorfismos del ADN, las cuales difieren en su principio y su potencialidad para detectar niveles de variabilidad genética, así como en otros factores tales como reproducibilidad y costo. Todo ello debe ser considerado para seleccionar la metodología que nos permita resolver de manera satisfactoria el problema que se esté planteando. Las técnicas utilizadas para la detección de polimorfismos se han dividido en los siguientes dos grupos: 1. Técnicas basadas en hibridación; y 2. Las basadas en reacción de polimerización en cadena (PCR).

2.3. Técnicas basadas en hibridación Estas técnicas involucran el corte del ADN con enzimas de restricción, separación electroforética de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño y la detección de patrones polimórficos por hibridación, con una secuencia específica de ADN marcada con algún elemento radiactivo. En este grupo se incluyen los RFLPs ( polimorfismo en longitud de fragmentos de restricción), los cuales se generan por rearreglos en el genoma que originan alteraciones en los sitios de reconocimiento para la endonucleasa que se utiliza en la digestión (Figura 1). Los RFLPs expresan herencia codominante, permiten detectar alelos, son altamente reproducibles y detectan polimorfismo intermedio. Este tipo de marcadores han sido utilizados para localizar genes específicos, para discriminar individuos muy relacionados y para establecer mapas genómicos (Demeke et al., 1997).

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Figura 1. Secuencia de detección de los RFLPs. PstI = endonucleasa de restricción 2.4. Técnicas basadasdel enproceso la reacción de polimerización en cadena derivada de Pseudomonas. Tomado de Ramírez et al., 1991.

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La técnica de reacción de polimerización en cadena (PCR) fue desarrollada por Mullis en 1985. Esta técnica se aplicó exitosamente en el diagnóstico clínico de pacientes con anemia falciforme y desde entonces se ha utilizado en diferentes áreas de la ciencia. La metodología de PCR es el proceso bioquímico in vitro, mediante el cual las cadenas complementarias individuales del ADN blanco son duplicadas por la enzima ADN polimerasa en cada uno de los ciclos (20 a 35) que integran la reacción, y al final de cada uno las nuevas cadenas vuelven a ser duplicadas por la misma enzima obteniéndose así la producción exponencial de millones de copias de los segmentos de ADN específico sometidos al proceso (Figura 2). Para la reacción se requiere de ADN blanco, iniciadores (oligonucleótidos) específicos, los cuatro desoxirribonucléotidos, la enzima ADN polimerasa y el cloruro de magnesio. Cada uno de los ciclos de la reacción consta de tres pasos (desnaturalización, alineamiento y extensión), determinados por temperaturas y tiempos específicos. En el paso de desnaturalización, las cadenas complementarias del ADN blanco se separan o se desnaturalizan, empleando rangos de temperaturas de 92 a 98° C y tiempos de 30 a 90 seg. Sin embargo, generalmente se utiliza la temperatura de 94° C y tiempo de 30 seg., condiciones en que se ha demostrado se logra un balance adecuado que permite la completa disociación del ADN genómico sin afectar la actividad de la ADN polimerasa, ya que a temperaturas y tiempos mayores puede reducirse su actividad. En el paso de alineamiento se realiza el apareamiento específico entre los iniciadores y las cadenas del ADN blanco desnaturalizado. En este paso se pueden utilizar rangos de temperatura de 35 a 60° C y tiempos de 30 a 60 seg. Esta fase es considerada la más crítica, ya que a temperaturas muy bajas de alineamiento existe mayor probabilidad de que los iniciadores se apareen a regiones noespecificas del ADN y puede originar inespecificidad en la amplificación. La temperatura de alineamiento se determina con base en la longitud del iniciador, contenido relativo de G-C, secuencia de los nucleótidos y estructura secundaria de los iniciadores. La temperatura óptima de alineamiento es la temperatura media de fusión (Tm) de los oligonucleótidos o iniciadores, la cual se calcula con la siguiente fórmula: Tm = [2(A + T) + (G + C)]. La duración de este paso está en función de factores como la estructura secundaria y la concentración del iniciador. En el paso de extensión, la ADN polimerasa extiende la longitud de los iniciadores apareados al ADN blanco, al ir polimerizando los desoxinucleótidos libres, lo cual dará origen a la formación de las nuevas cadenas complementarias a las dos cadenas sencillas presentes al inicio de la reacción. En

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1er Ciclo

2° Ciclo

n

Ciclos

ADN de doble cadena Desnaturalización (92 – 98°C)

+

Desnaturalización

+ Iniciador

Alineamiento (35 – 60°C)

3´ 5´

3´ 5´

5´ 3´

5´

3´

5´

Iniciador

3´

5´ 3´

3´

5´ 3´ 5´

5´ 3´ 5´

3´

3´

Alineamiento

5´

5´

3´

3´

5´

Extensión (70 – 74°C) 3´

5´

5´

5´

5´

5´

3´

3´ 5´

5´ 3´

3´ 5´

5´ 3´

21 Copia

5´

Polimerasa 5´ 3´

3´

5´

5´

5´

3´

3´ 5´ 3´ 5´

5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 3´

5´

3´ 5´ 3´ 5´

41 Copia

Extensión

n

Copias

Figura 2. Secuencia de pasos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (modificado de Barnum, 1998).

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este último paso se utilizan rangos de temperatura de 70 a 74° C y tiempos de 30 a 90 segundos (Palumbi, 1996). Con la sucesión de ciclos se logra una síntesis exponencial del segmento de ADN blanco, cuyo tamaño se define desde los primeros ciclos de la reacción. La longitud del segmento amplificado por la PCR es resultado de la suma de la longitud del iniciado más la longitud del ADN blanco flanqueada por dos iniciadores. Las metodologías basadas en PCR involucran la amplificación in vitro de una secuencia partic ular de ADN con ayuda de un iniciador que puede ser aleatoria, semialeatoria o específica, la separación de los fragmentos amplificados y la detección de patrones polimórficos por métodos de tinción. En este grupo se incluyen las técnicas de RAPDs, AP -PCR, DAF, microsatélites y AFLP, entre otras.

2.5. Amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPDs) Esta metodología fue desarrollada simultáneamente por dos grupos de investigadores: 1. Williams y colaboradores (1990), del grupo de DuPont Co. (Wilmington, USA), quienes la denominaron random amplified polymorphic DNA (RAPDs, amplificación aleatoria del ADN polimórfico); y 2. Welsh y McClelland (1990), del Instituto de Investigación de California, USA, quienes la llamaron arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR, iniciador arbitrario de la reacción de polimerización en cadena). Posteriormente Caetano-Anollés y colaboradores (1991), al realizar estudios de las huellas genómicas de plantas, la nombraron DNA amplification fingerprinting (DAF, amplificación de huellas genómicas del ADN). En la metodología de RAPDs, a diferencia de la de PCR, no se requiere conocer la secuencia del ADN blanco, y para la amplificación del ADN genómico sólo se utiliza un iniciador con secuencia aleatorias de 10 nucleótidos. Los fragmentos se separan mediante electroforesis en geles de agarosa y se tiñen con bromuro de etidio para evidenciarlos. El polimorfismo obtenido de RAPDs resulta de cambios en las secuencias del sitio de unión del ADN blanco con el iniciador originadas por mutaciones puntuales (inserciones y deleciones), las cuales impiden o evitan la asociación estable con el iniciador, o producen cambios que alteran el tamaño del fragmento amplificado, o pueden impedir la amplificación del ADN blanco. Con esta metodología es posible detectar herencia dominante y un alto grado de polimorfismo. Sin embargo, no es posible detectar alelos, y el grado de reproducibilidad entre laboratorios es

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intermedio debido a que los patrones de RAPDs pueden cambiar al modificarse la concentración de algunos componentes de la mezcla de reacción, tales como el ion Mg2+, ADN, iniciador y ADN polimerasa, así como las condiciones de amplificación (desnaturalización, alineamiento y extensión). Debido a este problema, al iniciar un estudio con una nueva especie o al cambiar de laboratorio es necesario estandarizar las condiciones experimentales de la técnica. Esta técnica se ha utilizado para estimar variabilidad genética interespecífica (Wilkie et al., 1993; Nkongolo, 1999; Shen et al., 1998) o intraespecífica (Parant et al., 1998; Fuentes et al., 1999), en estudios taxonómicos para delimitación de especies y para el establecimiento de las relaciones filogenéticas (Demeke et al.,1997; Weising et al., 1995), estudios de hibridación e introgrec ión (Crawford et al., 1993; Arnold et al., 1991), resistencia a enfermedades (Martin et al., 1991). AP-PCR (iniciador arbitrario de la reacción de polimerización en cadena). En esta metodología se emplean iniciadores de 20 a 34 pb. Los fragmentos se separa n en geles de poliacrilamida y se visualizan por autoradiografía, y el grado de resolución es moderado. DAF (amplificación de huellas genómicas del ADN). En esta metodología, a diferencia de los RAPDs, se utilizan iniciadores aleatorios de 5 a 8 pb y se ap lica un ciclo corto de alineamiento, dos temperaturas en el programa de amplificación en lugar de tres. Los fragmentos son separados en geles de poliacrilamida y visualizados con una solución de plata. Esta técnica es altamente reproducible y se ha utilizado para establecer mapas genéticos (Caetano-Anollés et al., 1991).

2.6. Microsatélites Microsatélites o SSR (simple sequence repeat) pueden constar de 2 a 6 nucleótidos, pero generalmente tienen de 2 a 3 secuencias de nucleótidos (CAT) que se repiten muchas veces, las cuales pueden variar en número y secuencia en los diferentes individuos. La principal ventaja que los microsatélites ofrecen para el análisis del genoma es su abundancia y dispersión en el ADN. Los microsatélites son marcas codominantes con un alto grado de polimorfismo y reproducibilidad. Con esta técnica se ha logrado detectar la diversidad genética de líneas de trigo muy relacionadas (Demeke et al., 1997).

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2.7. Amplificación de longitudes de fragmentos de restricción polimórficos (AFLPs) Los AFLPs (amplified fragment length polymorphisms) detectan polimorfismos del ADN, en los cuales pequeños fragmentos de restricción son selectivamente amplificados. Esta metodología involucra la digestión del ADN con dos endonucleasas (Eco R1 y Mse). Los fragmentos de restricción son ligados en sus extremos por dos diferentes adaptadores de doble cadena de 25 a 30 pb. Posteriormente se lleva a cabo una amplificación pre-selectiva, utilizando para la reacción de PCR iniciadores específicos con una base extra en el extremo 3′. Finalmente los fragmentos amplificados son sujetos a una segunda selección más rigurosa, en donde se consideran iniciadores con dos o tres bases extras (Figura 3). Los fragmentos amplificados son complementarios al iniciador y a las extensiones consideradas, razón por la cual sólo una porción del genoma fragmentado es amplificada en la reacción de AFLPs. En esta técnica, uno de los iniciadores es marcado radioactivamente y los fragmentos pueden ser detectados después de su separación en geles de poliacrilamida con autoradiografía. Esta técnica permite detectar herencia dominante, un alto grado de polimorfismo y reproducibilidad. Los AFLPs se han utilizado en estudios de diversidad genética, establecimiento de mapas genéticos e identificación de genes específicos (Vos et al., 1995; Demeke et al., 1997), así como en estudios de variación genética y estructura de poblaciones (Muller et al., 1999).

2.8. Construcción de dendrogramas a partir de datos moleculares, aplicando la taxonomía numérica Los datos moleculares generados de los patrones isoenzimaticos (RFLP, RAPD, AFLP, entre otros) son utilizados para el análisis del genoma y para hacer inferencias taxonómicas y filogenéticas. Los patrones de bandas observados después de la electroforesis son comparados entre los diferentes taxa; en la mayoría de estos estudios la similitud en patrones de bandas sugieren o indican un mismo genoma, mientras que patrones diferentes indican genomas diferentes. Las bandas son tratadas como características individuales (variables) y se registran como presentes (asignando valor de 1) o ausentes (asignando valor de 0) en los taxa analizados. Los datos resultantes son analizados utilizando los métodos numéricos aplicados en la taxonomía numérica. La taxonomía numérica se define como el agrupamiento por métodos numéricos de unidades taxonómicas con base en el conjunto de sus caracteres o como un sistema de

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ADN Genómico GAATTC CTTAAG

TTAA AATT

Restricción con Fragmento de restricción

AATTC G

TTAA- 5’

Iniciador + 1

Adaptador EcoRI 5’ A TTAAGN AATTCN

MseI y EcoRI T AATT

5’- TA Adaptador MseI NTTA NAAT

C Amplificación preselectiva Iniciador + 3

5’

5’

Iniciador + 1

Iniciador EcoRI + A y MseI + C

AAC AATTCA TTAAGT

Amplificación selectiva AATTCAAC TTAAGTTG

GTTA CAAT AAC

5’

Iniciador + 3 TTGTTA AACAAT

Electroforesis en gel de poliacrilamida Figura 3. Estrategia general de la técnica de AFLP (modificado Mueller y Wolfenbarger, 1999). Secuencias adaptadoras: Mse I EcoRI

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clasificación basado en la similitud total de los organismos (Sneath y Sokal, 1973). La taxonomía numérica tiene como objetivo colocar en grupos a los taxa (género, especie, etc.) o unidades taxonómicas operativas (OTU, operation taxonomic unit ), con base en caracteres como tamaño, color, forma, secuencia de nucleótidos y patrón de bandas generados por las diferentes técnicas moleculares, usando métodos numéricos aplicados a los estados de los caracteres o matrices de distancias entre ellos, para generar el árbol de relaciones de semejanzas o dendrograma. La construcción de los dendro gramas puede realizarse a partir de caracteres cuantitativos o cualitativos. Los patrones de bandas (tamaño de fragmento o posición en el gel) y los caracteres morfológicos (como la forma de la hoja) son considerados caracteres cualitativos. Una vez definidos los caracteres, se codifican en una matriz básica de datos (MBD) para estimar el grado de similitud entre las OTU analizadas. Existen diferentes coeficientes para estimar el grado de similitud; la selección de uno u otro tipo dependerá de los caracteres utilizados y de la manera en que éstos se codifiquen. Entre los coeficientes más comúnmente utilizados se encuentran los siguientes: 1. Coeficientes de distancia. Miden la distancia entre las OTU en espacios definidos de diferentes maneras. La medida más familiar de distancia es la euclidiana, la cual se basa en el teorema de Pitágoras, por lo que la distancia entre las OTU i y la OTU j estará dada por la siguiente ecuación: 2

d ij =

p

∑ ( xik- xjk )2 K=1

donde dij representan la distancia entre las OTU’s i y j; xik, el estado del carácter k para el OTU i; y xjk, el estado del carácter k para el OTUj. Este tipo de coeficiente se recomienda cuando los caracteres son continuos o multiestado ordenados. Esta expresión considera que los caracteres no se encuentran correlacionados, lo cual no ocurre en la práctica, por lo que el empleo de estas distancias no se justifica ya que representaría una medida inadecuada de las OTUs. Este problema puede resolverse realizando una trasformación a componentes principales. 2. Coeficientes de asociación. En general, estos coeficientes estiman coincidencia y diferencias en los estados de caracteres entre dos OTUs. Requieren que los datos sean de tipo binario, aunque algunos, como el SMC (simple matching coefficient), pueden utilizarse con datos multiestado cualitativos. Existe un gran número de coeficientes de asociación; entre los más utilizados está el mencionado anteriormente y el de Jaccard (Romesburg, 1984).

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El SMC se calcula de la siguiente manera: 0.0 ≤ Cjk ≤ 1.0

a+d

Cjk =

a + b + c+ d

donde Cik indica el grado de similitud entre las OTU’s j y k; a es el número de caracteres en el cual el mismo estado es compartido por ambas OTU (1, 1); b es el número de caracteres en los cuales un estado es poseído por la primera OTU pero no por la segunda (1, 0); c es el número de caracteres en los cuales un estado está ausente en la primera OTU pero no en la segunda (0, 1); y d es el número de caracteres en los cuales el mismo estado está ausente en ambas OTU (0, 0). Este coeficiente da el mismo peso al número de coincidencias a = (1, 1) y d = (0, 0). El máximo valor de C jk = 1.0 indica una similitud perfecta, la cual ocurre cuando b = c = 0. El coeficiente de Jaccard excluye las coincidencias negativas y, al igual que el anterior, varía en su magnitud de 0 a 1. Este coeficiente se define de la siguiente manera: Cjk =

a

0.0 ≤ Cjk ≤ 1.0

a+b+c Representa la proporción del número de coincidencias negativas contra el total del número de caracteres, menos el número de coincidencias negativas. En este coeficiente, d se omite del cálculo por considerar ilógico que exista similitud entre las OTU por la ausencia de una característica. 3. Coeficientes de correlación. Estos coeficientes cuantifican la similitud a partir de la separación angular formada por dos líneas que parte del origen de las coordenadas y pasa por las OTU i y j. El coeficiente de Pearson está en función de esos ángulos y representa la correlación producto- momento. Está representado por la ecuación siguiente: n - ( x - x- ) ∑ ( xik - x) ij k

r =

i =1 2

n

n

n =1

i =1

[ ∑ ( xij - -xi )2 ] [ ∑ ( xik - x-k)2 ]

12

donde xj es la media de todos los valores de los estados de las OTU j; y xk es la media de todos los valores de lo s estados de la OTUk. Los valores de este coeficiente oscilan entre 1 y –1 para la máxima y la mínima respectivamente (Kohlmann, 1994). Una vez calculados los índices de similitud utilizando cualquiera de los coeficientes expuestos anteriormente, se efectúan los análisis de agrupamiento, los cuales representan las similitudes obtenidas de la matriz de unidades taxonómicas bajo un arreglo en forma de árbol llamado dendrograma. Los métodos de agrupamiento sintetizan la información de la matriz de similitud y arregla a las OTU de una manera jerárquica sin solapamientos por medio de algoritmos SAHN (secuenciales, aglomerativos, jerárquicos, excluyentes). Existen varias técnicas para formar los algoritmos; los métodos más comúnmente utilizados son las técnicas jerárquicas aglomerativas. Estos métodos se basan en una serie de fusiones sucesivas en donde las OTU se fusionan en grupos. Estas técnicas requieren para operar una matriz de proximidad inter-OTU, en donde cada OTU se considera un agrupamiento de un único miembro. Se comienza por agrupar a las dos OTU de máxima similitud (o distancia menor), posteriormente se calculan las proximidades de cada OTU restante con este primer grupo de dos miembros de acuerdo con un algoritmo específico. El proceso continúa hasta que todas las OTU llegan a formar un solo agrupamiento. Entre los métodos más comúnmente utilizados se encuentran los siguientes: 1. Método de ligamiento promedio (UPGMA, unweighted pair-group method using arithmetic averages). Define la proximidad entre dos agrupamientos como el promedio entre todos los pares de las OTU que conforman uno de los agrupamientos (Kohlmann, 1994; Romesburg, 1984). 2. Método de ligamiento de centroides (UPGMC, unweighted method using centoids). Define la proximidad entre dos grupos como la distancia entre los centroides (medias aritméticas) de los dos grupos; es decir, cada grupo es representado para efectos de agrupamiento por un punto que es la media aritmética de los elementos de dicho grupo (Kohlmann, 1994; Romesburg, 1984). 3. Método de ligamiento simple o del vecino más cercano. En este caso, la distancia entre dos grupos se calcula como el mínimo de las distancias entre todos los posibles pares de elementos en ambos grupos ( Romesburg, 1984). 4. Método de ligamiento completo o del vecino más lejano. En este método, la distancia entre dos grupos es definida como el máximo de las distancias entre todos los posibles pares de

13

entidades en los dos grupos ( Romesburg, 1984). De estos métodos el más recomendado es el UPGMA, porque puede usarse con cualquier coeficiente de similitud y juzga la similitud entre pares de grupos de manera menos extrema.

14

3. METODOLOGÍAS DE AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DEL ADN 3.1. Introducción El aislamiento de ácidos nucleicos de bacterias, plantas o animales es un requerimiento fundamental en los procedimientos de caracterización del genoma y mapeo que involucran el uso de marcadores genéticos, así como para la identificación y aislamiento de genes para ingeniería genética. La factibilidad de estos estudios en algunos casos puede ser limitada por la calidad y pureza de las muestras de ADN; por ejemplo: para análisis que involucran el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el ADN aislado no debe presentar degradación ni contener contaminantes que interfieran con la reacción (Brown, 1992). Entre las dificultades encontradas en el aislamiento de ADN se incluyen la degradación del ADN por la presencia de ADNasas o metabolitos secundarios y el coaislamiento de polisacáridos contaminantes que inhiben a las endonucleasas de restricción. Se han desarrollado diferentes métodos para el aislamiento de ADN cromosómico y plasmídico. En general, en cualquiera de los métodos, el primer paso para el aislamiento del ADN involucra el rompimiento de las células (bacterias, vegetales o animales) mediante métodos mecánicos o físicos, seguido de la solubilización de las membranas, para que el ADN sea liberado en un amortiguador de extracción que incluye un detergente (SDS o CTAB) para este fin, así como otros compuestos que lo protegen de la acción de endonucleasas. Algunos métodos involucran un paso de desproteinización mediante fenol o una mezcla de fenol/cloroformo. Finalmente, los ácidos nucleicos se precipitan con isopropanol o etanol (Towner, 1992; Wilkie, 1997).

3.2. Objetivos Aislar el ADN de diferentes especies o individuos de una población de Prosopis. 3.3. Material biológico Hojas de los diferentes individuos o especies son colectadas y conservadas en nitrógeno líquido hasta el momento de procesarlas. 3.4. Aislamiento de ADN El ADN genómico de las plantas es aislado a partir de 2g de tejido foliar, siguiendo el método de

15

Dellaporta (1983) modificado como se describe a continuación (Figura 4): 1. Adicionando nitrógeno liquido, 2g de tejido foliar fresco es macerado en un mortero previamente congelado a -20º C. 2. La muestra pulverizada se trasfiere a un tubo Falcon de 50 mL de capacidad, se agregaron 20 mL de amortiguador de extracción (500 mM de NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM EDTA, 1.3 % de SDS, 0.2 % de β-Mercaptoetanol y 1% de polivinilpirolidona) y se incuba a 65º C durante 15 min. Posteriormente se agregan 6.5 ml de la solución A (5 M de acetato de potasio), mezclando suavemente y se incubó en hielo escarchado por 30 minutos. 3. Las muestras se centrifugarán a 10º C durante 30 min. a 4000 rpm. 4. El sobrenadante se trasfiere a otro tubo Falcon y se adicionaron 25 mL de isopropanol frío e incuba a -20º C por 60 min. 5. Con un gancho de vidrio se trasfiere el ADN a un tubo eppendorf de 1.5 mL de capacidad. Inmediatamente se agregarán 700 µL de solución B (50 mM de Tris-HCl pH8,10 mM de EDTA) y 4 µL de una solución de RNasa (10 mg/mL), mezclando suavemente y se incuba a 37º C por 2 horas. 6. La reacción enzimática se detiene agregando 75 µL de acetato de sodio 3M y 500 µL de isopropanol frío e incubando a -20º C durante 2 horas. 7. Con un gancho de vidrio, el ADN se colecta y trasfiere a otro tubo eppendorf de 1.5 mL de capacidad, después se lava dos veces con etanol al 80%. 8. La muestra o muestras se mantienen durante 12 h en un desecador con vacío, posteriormente el ADN se resuspende en 0. 5 mL de TE pH 8 (10 mM de Tris-HCl pH 8 y 1 mM de EDTA) y se guarda a 4º C. 3.5. Determinación de la pureza y concentración del ADN La pureza y concentración del ADN se determina por métodos espectrofotométricos. Para determinar la pureza de las preparaciones se tomarán muestras alícuotas de 10 µL y se disolverán en 1.5 mL de agua destilada estéril. Posteriormente se determinarán las lecturas a longitudes de onda de 260 y 280 nm en un espectrofotómetro Spectronic 2000. Con el cociente obtenido entre estas lecturas se estimará la pureza de los ácidos nucleicos en cada una de las muestras. Los valores entre 1.8 y 2.0 de densidad óptica (DO) indican alto grado de pureza. Considerando que la concentración de ADN de una solución puede ser determinada con los valores de absorbencia a

16

17

260 nm (A260) y que un valor de 1.0 A

260 =

50 µg/mL de ADN, la concentración de ADN en las

muestras se calculó utilizando la siguiente ecuación:

 1500 µL   50µg  Concentración ADN (µg/mL) =     DO260  x µL   mL  Donde: x = volumen de ADN usado. 1500 µL = volumen de agua utilizado para disolver la muestra de ADN; el volumen puede variar en función de la capacidad de las celdas utilizadas para medir la absorbencia. 50 µg/mL = concentración de ADN determinada para un valor de 1.0 A260. DO260 = valor obtenido en las muestras a esta longitud de onda.

3.6. Evaluación del grado de integridad del ADN El grado de degradación del ADN se estimará mediante la separación electroforética de las muestras de ADN en geles de 0.8% de agarosa. La electroforesis se realizará a 40 voltios y 40 amperes, durante 4 h (tiempo en que el frente del gel recorrerá 6 cm), en amortiguador 1X TAE (Apéndice ). Utilizando una fuente de poder y una cámara de electroforesis horizontal (Figura 5). En los posos del gel se carga un volumen de 25 µL. Este volumen estará constituido por 5 µL de la muestra de ADN, 5 µL de colorante de carga (50% de glicerol, 1% de azul de bromofenol y 1% de xilen cianol) (Apéndice ) y 15 µL de amortiguador TE, pH 8. Para evidenciar el ADN, se coloca el gel en una charola de plástico (20 x 20 cm) y se sumerge en una solución de bromuro de etidio (1µg/mL) durante 30 min., posteriormente se coloca sobre un transiluminador de luz ultravioleta (UV). El ADN de alto peso molecular aparece como una banda compacta y el ADN degradado presenta un barrido de bandas a lo largo del carril.

18

4. AMPLIFICACIÓN DEL ADN Después de definir las concentraciones óptimas de la mezcla de reacción, se efectúa la amplificación de las muestras que deseen analizarse. La mezcla de reacción por muestra contendrá un volumen final de 25 µL: 10 mM de Tris HCl pH 8, 50 mM de KCl (amortiguador 10x de la taq polimerasa), 3mM de MgCl2 (Gibco), 200 µM de cada dNTP (Gibco), 20 pmol de primer (Roth o Gibco), 1.5 unidades de Taq DNA polimerasa, 60 ng de ADN (para la preparación de estas soluciones ver Apéndice ) y agua destilada estéril (Figura 5). La mezcla de reacción se cubrirá con 20 µL de aceite mineral, para evitar la evaporación. La amplificación se efectuará en un termociclador MJ Research modelo PTC 100, programado con un ciclo inicial de desnaturalización de 1 min. a 94º C. Seguido de 38 ciclos cada uno con un paso de desnaturalización a 94º C (por 30 seg. del ciclo 1 al 3, y de 15 seg. del ciclo 4 al 38), alineamiento a 35º C por 30 seg. y extensión a 72º C por 1.30 minutos. (Figura 5).

5. SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS Los productos amplificados serán separados mediante electroforesis en geles de 1.5% de agarosa. La electroforesis se realizará a 100 voltios durante 4 h (tiempo en que el frente del gel recorre 8 cm), utilizando una fuente de poder y una cámara de electroforesis horizontal (Figura 5). En los posos del gel se depositarán las muestras que contendrán, en un volumen de 25 µL, 20 µL de la muestra amplificada y 5 µL de colorante de carga. Para la electroforesis se utilizará el amortiguador TAE 1X. Para evidenciar las bandas los geles se tiñen con una solución de bromuro de etidio durante 30 min., posteriormente será fotografiado y capturado en computadora (Figura 5). Un marcador de 100 pb (Gibco) se utiliza como referencia de pesos moleculares.

19

20

6. ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTO Y GENÉTICO El tamaño de los fragmentos de ADN obtenidos con los RAPDs se calcula a partir de una curva estándar generada de los fragmentos de tamaño conocido del marcador de 100 pb (pares de bases). Después de definir los pesos moleculares de los patrones de bandas generados con los diferentes iniciadores, se construye una matriz en la que se codifica presencia (1) o ausencia (0) de bandas de ADN . En esta matriz los fragmentos obtenidos con los diferentes iniciadores se agruparán de mayor a menor número de pares de bases. Para el análisis de los fragmentos se utilizarán los programas NTSYS -PC versión 1.8 (Rohlf, 1993), Biosys versión 1.7 (Swofford y Selander, 1989) y RAPDFST (Black, 1995). 6.1 Procesamiento de los datos y uso del programa NTSYS 1. En la unidad donde este cargado el programa NTSYS, haga un doble clic en el icono de acceso directo para abrir la carpeta del programa; a continuación, para abrir el programa haga un doble clic en el archivo NTSYS.exe. En caso de no tener acceso directo haga clic en el botón inicio, seleccione programas, luego seleccione explorador de Windows y abra la carpeta NTSYS; a continuación, para abrir el programa seleccione con un doble clic el archivo NTSYS.exe. En ambos casos se despliega la siguiente pantalla de presentación (Figura 6):

NTSYS-

Versión 1.8 S/N= Copyright (c) 1993 Applied bioestatics, Inc 1630oo Licensed to ISBN: 0-925031-22-4

Figura 6. Carátula de presentación del programa NTSYS-pc. 2. A continuacion, presione cualquir tecla. Inmediatamente después el programa abre la siguiente patalla (Figura 7), en la cual aparesen los diferentes programas que constituyen el paquete NTSYS-pc:

21

NTSYS-pc (c) 1993 Applied bioestatixties, Inc FILES

DOS CONFIG

BATCH

EXEC

HELP

Progra ms

General

Cophenetics values Double center

Minimum Sparing Tree

Fourier transformationes Outptu Standaritation

Neighbor-joining trees SAHN clustering (Dls) Similarity measures Genetics

Transformation Thin -plate spline. wts.

Pool VCV matrices Interval Qualitative

Cluster & graph methods Consensus Enter= select

F1= help

F3= Exit

F10= menu

More

Figura 7. Menú principal del paquete NTSYS -pc, donde se muestran los programas que pueden ser utilizados en un análisis numérico.

3. Del menú principal del paquete NTSYS-pc (Figura 7), seleccione el menú FILE. Al entrar a éste se desplegará una pantalla de diálogo, de la cual deberá seleccionar la opción Edit. Al entrar se desplegará un cuadro en el cual deberá dar nombre al archivo, el cual coresponderá al de la matriz básica de datos. Por ejemplo a: proso.mbd. Después de dar nombre al archivo, oprima la teclca F2. Inmediatamente después se desplegará la siguiente pantalla (Figura 8):

NTEDITOR

F1= Help

F2= New

F4= Save

F5= Zoo

ESC=Quit

Figura 8. Pantalla en la que se introduce la información del archivo de la matriz básica de datos.

a) En esta pantalla deberá escribir, en la primera línea y entre comillas, un título de su archivo; ejemplo: “Población 1 de Prosopis lavigata”.

22

b) En el segundo renglón deberá escribir el número que identifica el tipo de matriz, el número de líneas que constituyen la matriz seguido de la letra L, número de columnas que forman la matriz seguido de la letra L y el número 0. Este último indica que no hay datos perdidos; ejemplo: 1 12L 9L 0 (Figura 9 ). c) En el tercer renglón se escriben suscesivamente los números de líneas que forman la matriz; ejemplo: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (Figura 9). d) En el cuarto renglón se escriben suscesivamente los números de las columnas que forman la matriz; ejemplo: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (Figura 9). e) En los siguientes renglones se introducen los datos de la matriz directamente, o se pegan si se capturaron en un procesador de textos, el cual cuente con la opción de salvar en código ASCII (Bloc de notas, Word Pard, Word).

NTEDITOR “ Población 1 de Prosopis lavigata” 1 12L 9L 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 123456789 101101001 010101101 101101100 111010101 101101001 010101101 101101100 111010101 101101001 010101101 101101100 111010101

F1= Help

F2= New

F4= Save

F5= Zoo

ESC=Quit

Figura 9. Ejemplo integrado de la introducción de los datos para crear el archivo de la matriz básica de datos.

f) Después de introducir todos los datos anteriores, oprima la tecla F4 para guardar el archivo, poster iormente la tecla Enter, después cierre la ventana oprimiendo la tecla Esc.

4. Para continuar con el análisis es necesario verificar que esté bien la matriz básica de datos, para lo cual, del programa general se selecciona el menú Output (Figura 7), el cual despliega la siguiente pantalla (Figura 10):

23

OUTPUT Name of matrix

:[

]

Field width

:[9

]

No. decimal places

:[ 3

]

Page width

:[80

]

Row order matrix

:[

]

Colum order matrix

:[

]

Listing file

:[

]

F1= Help

F2= Run

F4= Select

ESC=Menu F10= Exit

Figura 10. Menú para ejecutar el programa Output.

En la opción “Name of matrix” se teclea la unidad en la cual se esté trabajando y el nombre de archivo de la matriz básica de datos. Posteriormente se oprime la tecla F2 y se despliega una ventana en la que aparece el nombre de la matriz, el tamaño (líneas x columnas), las líneas y columnas numeradas (Figura 11). En caso de existir un error, al abrir la pantalla le aparecerá un letrero que indica el tipo de error. En estos casos será necesario revisar el archivo inicial de la matriz básica de datos. Para salir de esta ventana oprima la tecla Esc.

Input matrix: C:MBAC.MBD Comments: "Matriz Bacterias 9cepas" type=1, size=212 by 9, nc=none 1

2

3

4

5

6

------------------------------------------------------1 2 3 4 5

| | | | |

0.000 1.000 0.000 1.000 0.000

0.000 1.000 0.000 1.000 0.000

0.000 1.000 0.000 1.000 0.000

0.000 1.000 0.000 1.000 0.000

0.000 1.000 0.000 1.000 0.000

0.000 0.000 0.000 1.000 0.000

Figura 11. Matriz básica de datos verificada

5. Después de verificar que esté bien la matriz básica de datos, se procede a obtener la matriz de similitud. Del programa (Dis) Similarity measure se elige el menú Qualitative (Figura 7), inmediatamente se desplegará la siguiente pantalla (Figura 12):

24

SIMQUAL

Name of output matrix

:[

Coefficient

:[SM

]

Name for output matrix By rows o cols?

:[

]

:[col

]

Positive code

:[ 1

]

Negative code

:[0

]

Sow matris?

:[ yes

]

Listing file

:[ CON

]

F1= Help

F2= Run

]

F4= Select

ESC=Menu

F10= Exit

Figura 12. Menú para ejecutar el programa “Qualitative”.

a) En la opción “input matrix” se escribe el nombre que se le asignó a la matriz básica de datos. b) En la opción “Coefficient” se selecciona el coeficiente de similitud deseado [Jaccard (J), Simple matching (SM) etc.] c) En la opción “name for output matrix” se escribe el nombre que se le asignará a la matriz de similitud; por lo general, al nombre de este archivo se le asigna como extensión la inicial del coeficiente de similitud utilizado. Ejemplo: C:MBAC.J. d) En la opción “By rows or cols” se selecciona con un clic Col. e) En la opción “Show matrix” se selecciona con un clic Yes. Las otras opciones se mantienen como aparecen en la pantalla. f) Realizado todo lo anterior, se oprime la tecla F2; inmediatamente se desplegará una pantalla en la que se muestra la matriz de similitud obtenida. Para cerrar esta pantalla se oprime la tecla Esc. Al cerrarse ésta se despliega la pantalla del menú Qualitative (Figura 12), la cual también debe cerrarse oprimiendo la tecla Esc.

6. Posteriormente se procede a obtener la matriz gráfica del fenograma o dendrograma. Para esto, del programa “Cluster & graph methods” del menú principal (Figura 7) se selecciona la opción SAHN Clustering ; inmediatamente se desplegará la siguiente pantalla (Figura 13):

25

SAHN Name of input matrix

:[

]

Name for input matrix

:[

]

Method

:[

]

In case of ties

:[warn

]

Maximum n° tied trees :[ 25 Tie toleranse :[ 0 :[ Yes Show tree?

] ] ]

Beta Listing file

] ]

F1= Help

:[ -0.25 :[ CON F2= Run

F4= Select

ESC=Exit

F10= menu

Figura 13. Menú para ejecutar el programa SAHN Clustering.

a) En la opción “input matrix” se escribe el nombre que se le asignó a la matriz de similitud. b) En la opción “name for output matrix” se escribe el nombre que se le asignará a la matriz gráfica; por lo general, al nombre de este archivo se le asigna como extensión la inicial del método de agrupamiento utilizado. Ejemplo: C:MBAC.UPGMA. c) En la opción “Method” se selecciona el método de agrupamiento deseado [UPG, UPGMA, UPGMC, UPGMS, etc.] Las otras opciones se mantienen como aparecen en la pantalla (Figura 13). d) Realizado todo lo anterior, se oprime la tecla F2; inmediatamente se desplegará una pantalla en la que se muestra la matriz gráfica. Para cerrar esta pantalla se oprime la tecla Esc. Al cerrarse ésta se despliega la pantalla del menú SAHN clustering (Figura 8), la cual también debe cerrarse oprimiendo la tecla Esc.

7. Obtención del fenograma o dendrogama. Para ver la forma final de éste se utiliza del menú principal (Figura 7) el programa “Graphis” y se elige la opción “Tree Display”, inmediatamente se desplegará la siguiente pantalla (Figura 14):

26

TREE Name of tree matrix

:[

]

Title

:[ Tree G

]

Tree style

:[ PHEN

]

Minimum for scale

:[ 0

]

Maximum for scale

:[ 0

]

Number class intervals

:[ 0

]

:[ Yes

]

Graphics mode Line length (text mode) :[ 61 Squeeze factor :[ 1 Hardcopy device :[ LASER F1= Help F4= Select

] ] ] ESC=Exit

F10= menu

Figura 14. Menú para ejecutar el programa Tree.

a) En la opción “Name of tree matrix” se escribe el nombre que se le asignó a la matriz gráfica. Las otras opciones se mantienen como aparecen en la Figura 14. Realizado lo anterior, se oprime la tecla F2 e inmediatamente se despliega una ventana en la que se muestra el fenograma en su versión final. b) Copie el fenograma oprimiendo simultáneamente la tecla Alt y la tecla ImpPnt. Posteriormente abra el programa Paint, para copiar la imagen y modificarlo como guste. c) Para salir del programa del NTSYS, cierre todas las ventanas oprimiendo la tecla Esc.

Estas técnicas y programas de análisis han sido utilizados por los autores en diferentes estudios, y como ejemplo se incluyen en este trabajo el resumen de la siguiente publicación: Para la detección de variación genética intra e interespecífica en cuatro poblaciones silvestres de Prosopis, los autores del trabajo que se presenta a continuación, al utilizar los RAPD como marcadores moleculares, encontraron que es mayor la variación genética entre las poblaciones que dentro de ellas, así como estimar el flujo genético. También pudieron identificar un total de 27 fenotipos o haplotipos y establecer las relaciones géticas entre tres especies de Prosopis (Juárez-Muñoz, J.; G. Carrillo-Castañeda; A. Arreguín; y A. Rublúo. 2002. Inter- and intra-genetic variation of four wild populations of Prosopis using rapd-pcr fingerprint. 11: 921-930).

27

7. METODOLOGÍAS BASADAS EN EL POLIMORFISMO DE PROTEÍNAS E ISOENZIMAS 7.1. Introducción Las proteínas son compuestos orgánicos formados por residuos de L- aminoácido. Cada tipo de proteína tiene una secuencia de aminoácidos única que le confiere a la molécula propiedades diferenciales. Las propiedades de estas moléculas se pueden entender examinando las propiedades químicas de los aminoácidos que la constituyen, que por lo general son 20 tipos de aminoácidos diferentes. Por su tamaño, las proteínas son macromoléculas que realizan prácticamente todas las actividades de la célula. Se estima que la célula típica de un mamífero puede tener unas 10 mil diferentes proteínas con diversas funciones y estructuras. Como enzimas, las proteínas aceleran la velocidad de las reacciones metabólicas; como fibras estructurales, las proteínas suministran apoyo mecánico dentro de las células y en su perímetro exterior; como hormonas, factores de crecimiento y activadores de genes, las proteínas ejecutan gran variedad de funciones reguladoras; como receptoras y trasportadoras en la membrana, las proteínas determinan la reacción celular y el tipo de sustancias que penetran o salen de la célula; como elementos contráctiles, constituyen el mecanismo biológico del movimiento. Por otra parte, actúan como anticuerpos, funcionan como toxinas, forman coágulos sanguíneos, absorben o refractan la luz y trasportan sustancia de una parte del cuerpo a otra. El término isoenzima fue acuñado por Market y Moller (1959), citado por Tanskley y Orton (1983), para describir diferentes formas moleculares de enzimas con la misma función catalítica incluyendo en el estado heterocigoto enzimas genéticamente diferentes. La investigación moderna de isoenzimas está siendo conducida por muchos mejoradores, genetistas, citogenetistas e investigadores genéticos. En los años cincuenta del siglo pasado, los estudios realizados proporcionaron evidencia de que las enzimas en las plantas existían en múltiples formas. La primera contribución mayor fue el desarrollo del gel de electroforesis de almidón por Smiths (1955), citado por Tanskley y Orton (1983). Otra contribución fue la demostración de que las enzimas podían ser visualizadas directamente en gel de almidón, cuando

28

se teñían con una sustancia específica. Hunter y Market (1957) plantearon que había especies con varias formas específicas de enzimas. Las isoenzimas son variantes de una misma enzima, que tienen todas función en un mismo individuo y desarrollan actividad catalítica. Pueden desarrollar su función como polipéptidos simples (monómeros) o como multímeros, cuyas subunidades pueden ser específicas para el mismo o diferente gen (Fransworth, 1988). El uso de isoenzimas como marcadores genéticos permite obtener una visión más precisa de la genética de las poblaciones, así como de los procesos evolutivos y de las relaciones filogenéticas entre poblaciones. Se llama polimorfismo genético a la coexistencia de dos o más alelos comunes y de varios fenotipos en una población, (Mejía de León, 1992). Las isoenzimas también han sido usadas para la caracterización de especies, variedades y líneas endogámicas y aneuploides, así como para la identificación de híbridos interespecíficos por medio de polimorfismo de isoformas de varios tipos de enzimas. Estos marcadores moleculares se asocian a caracteres fenotípicos y pueden medir el grado de apomixia en diferentes genotipos. Las enzimas que han sido corrientemente utilizadas son: esterasas, aspartato aminotransferasas, amilasas, peroxidasas, fosfatasas, etc. Las isoenzimas también son extremadamente variables en los tejidos de las plantas y los zimogramas deben ser interpretados cuidadosamente (Kosuge et al., 1983). Su expresión puede ser inducida, órgano específica o asociada a determinada etapa del desarrollo del individuo. Peroxidasa. La inducción de esta defensa antioxidante supone una estrategia general requerida para superar el incremento de estrés oxidativo debido al cambio drástico en las condiciones ambientales. El estrés lleva a incrementar la oxidación que, a su vez, induce aumento en la síntesis de compuestos antioxidantes no enzimáticos, como glutatión, ascorbato (vitamina C) y tocoferol (vitamina E), así como también incrementa la síntesis de antioxidantes enzimáticos como superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa, glutatión reductasa, ascorbato peroxidasa y catalasas (Yang et al., 1993), citado por Smith (1996). La peroxidasa está implicada en la regulación del crecimiento y desarrollo de las plantas. Su actividad está relacionada directamente con el estrés oxidativo. Las peroxidasas son enzimas antioxidantes que incluyen la superoxido dismutasa, ascorbato peroxidasa, entre otras. Las enzimas implicadas en la síntesis y regeneración reducen a los antioxidantes (Fieldes y Gerhart, 1988).

29

Catalasas. Se encargan de controlar al peroxido de hidrógeno que se forma en los peroxisomas de animales y los glioxisomas de plantas. En ciertas condiciones las plantas producen radicales libres de oxígeno, los cuales son muy destructivos para la célula. Estos radicales son catalizados por la peroxido dismutasa, la cual los trasforma en H2 O2 , y a su vez la catalasa lo cataliza a H2 O y O 2 (Foyer et al., 1994; Chen et al., 1993). Fosfatasas . Las fosfatasas son enzimas citopla smáticas solubles de gran importancia en los procesos fisiológicos y metabólicos de los organismos. Existen varios grupos de fosfatasas entre las que destaca la fosfatasa ácida, perteneciente a un grupo de fosfohidrolasas monoespecíficas, las cuales están involucradas en la hidrólisis de fosfomonoésteres; por ejemplo, participan en la formación de sacarosa en el proceso de la fotosíntesis y también están involucradas en el proceso de maduración y germinación de las semillas (Acquaah, 1992).

7.2. Separación de proteínas e isoenzimas en geles de poliac rilamida

7.2.1. Objetivos a) Observar los patrones de proteínas y isoenzimas (peroxidasas y fosfatasas) de Prosopis. b) Diferenciar mediante estos patrones entre las especies de Prosopis.

7.2.2. Material biológico Cotiledones de 8 días de semillas de Prosopis, desarrollados en medio basal MS (Murashige y Skoog, 1962), incubadas a 26 ±2º C y fotoperiodo de 16 horas, son utilizados para obtener los extractos.

7.2.3. Preparación de extractos Las proteínas son extraídas a partir del par de cotiledones de cada plántula. Para obtener el extracto, 200 mg de tejido fresco son macerados en un mortero congelado colocado sobre hielo con amortiguador de extracción (0.040 M Tris-HCl pH 8.0 y 0.015 M de 2-Mercaptoetanol) en una relación 1:1 p/v. Las muestras se centrifugaron en tubos eppendorf a 4000 x g durante 10 min. para obtener el sobrenadante claro (Figura 15). Los extractos se conservan sobre hielo hasta su uso.

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7.2.4. Determinación de proteínas El contenido de proteína de los extractos se determinará siguiendo el método de Lowry (1951). La curva patrón se realizará usando albúmina de suero bovino, cristalizada en solución acuosa (10 mg/50 ml), en el rango: 0.0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 y 0.5 mL de la solución de albúmina que corresponda a: 0, 20, 40, 60, 80 y 100 µg/mL de albúmina. Posteriormente se agregará a cada tubo 0.5 mL de NaOH 1N y 5 mL de la solución D (Na2 CO 3 . 10H2O [2%], CuSO4 [2%], Tartrato de Na y K[1%]), después de 10 min. se agrega la solución E (reactivo de Folin diluido 1:1), agitando vigorosamente las muestras. Posteriormente se conservan en oscuridad a 37° C durante 30 min. La absorbancia se determinó en un espectrofotómetro Bausch Lomb Spectronic a 580 nm.

7.2.5. Electroforesis en geles de poliacrilamida -SDS Geles de poliacrilamida-SDS al 8% se separarán en un sistema de amortiguadores, de acuerdo con Laemmli (1970). La concentración final de acrilamida para el gel separador será de 8% y 4% para el gel concentrador.

a) Preparación de la solución de acrilamida-bisacrilamida. En un vaso de precipitado colocado sobre hielo se agregaron 30 mL de agua desionizada fría, se pone en agitación constante y se agrega lentamente 1g de bisacrilamida hasta que esté perfectamente disuelta. Posteriormente se agregan gradualmente 29g de acrilamida, y finalmente se filtra y afora a 100 mL. b) Procedimiento. Las dos piezas de vidrio, previamente lavadas con agua y jabón, se limpian perfectamente con etanol al 50%, después con etanol al 96% y por último con xilol, a fin de eliminar residuos de grasa. Posteriormente se arma el molde con el empaque. c) Preparación de geles de acrilamida al 8.0%. Para preparar un gel al 8.0%, en un vaso de precipitado de 100 mL, conservado en frío, se mezclaron: 6.39 mL de solución de acrilamida-bisacrilamida (29-1%), 4.47 mL de amortiguador tris-HCl 2 M pH 8.8), 0.31 mL de solución de SDS al 10%, 0.41 mL de glicerol al 50%, y 11.77 mL de agua deionizada estéril fría.

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Gel sellador. De la solución de acrilamida-bisacrilamida preparada, se toma 1 mL y se le agrega 25 µL de una solución concentrada de persulfato de amonio (15 mg /1 mL de agua desionisada fría) y 4 µL de Temed; y con la ayuda de una pipeta pasteur se va agregando lentamente, de manera que toda la parte interna del empaque sea cubierta; y se deja gelificar durante 10 minutos. Gel separador. 20 mL de la solución de acrilamida-bisacrilamida se desgasifican durante 15 min., para posteriormente agregarle 505 µL de la solución de persulfato de amonio y 27.58 µL de Temed. Después de mezclar se vierte sobre el centro del molde con una pipeta pasteur y se deja gelificar durante 45 minutos. Gel concentrador. Los últimos 1.5 mL de la solución de acrilamida-bisacrilamida se mezclan con 2 mL de amortiguador Tris-HCL 0.5 M pH 6.8, y después de desgasificar durante 15 min. se agregan 94.80 µL de la solución de persulfato de amonio y 5 µL de Temed. Después de agitarla lentamente se procede a verter sobre el gel separador una vez colocado el peine. La gelificación en este caso toma 30 minutos.

d) Separación electroforética y tinción del gel. En el gel se colocan, independientemente en cada cubeta, las muestras que contienen:12 µL de extracto enzimático, 2 µL de colorante y 6 µL de amortiguador de carga (Tris -HCl 0.5 M, pH 6.8, glicerol, SDS 10% (p/v), 2-Mercaptoetanol). Un marcador (SDS-PAGE 0303, Bio -Rad) se utiliza como referencia de pesos moleculares. Después se llenan los tanques de la cámara de electroforesis con amortiguador de separación (Trisma base 1.5g, glicina 7.2, SDS 10% p/v), y para concentrar las muestras se aplica una corriente de 75 voltios y 40 mA durante 1 h (Figura 16). Para la separación de las muestras se utiliza una corriente de 90 voltios y 50 mA por aproximadamente 5 horas. Después de este periodo, para evidenciar las bandas, el gel se tiñe con una solución de azul brillante de coomassie (0.1% p/v) durante 30 min, y posteriormente se destiñe con ácido acético (10 % v/v) (Figura 16).

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7.2.6. Identificación de peroxidasas por electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS La actividad de peroxidasas se detecta empleando guiacol como sustrato, de acuerdo con el método de Caruso et al. (1999). Después de la electroforesis, los geles se sumergen durante 10 min. en 40 mL de una solución estabilizadora de Tris-HCl 50 Mm, pH 7.4. A continuación se incuba el gel en una solución nueva de Tris-HCl 50 Mm, pH 7.4, la cual contiene guiacol al 0.46% v/v y 13 mM de H2O 2 (esta solución se prepara al instante de utilizarse). La reacción de oxidación se deja proceder a 27º C hasta la aparición de bandas de color café. 7.2.7. Identificación de la fosfatasa ácida por electroforesis en geles de poliacrilamida–SDS Para detectar la actividad de fosfatasa ácida (E. C. 3. 1. 3. 2) se emplea una reacción acoplada Fields y Tyson (1983), usando el colorante Fast Garnet al 0.02% (Sigma), 0.06% Mg Cl2 y 0.007% de alpha naftil fosfato, en un amortiguador de acetato de potasio 0.25 M, pH 4.9. El gel se deja en contacto con la solución reveladora durante 12 h en la oscuridad. Trascurrido este tiempo, el gel se lava con agua destilada. La actividad de fosfatasa ácida se detecta por la aparición de bandas de color amarillo.

7.2.8. Determinación de la actividad de fosfatasa ácida pH 5.8 Para la determinación de la actividad de la fosfatasa presente en los extractos, se utiliza el método desarrollado por López y Carrillo (1996). En 1 mL de volumen final, la mezcla de reacción contiene: 0.5 mL de solución amortiguadora (citrato de potasio 10-4 M, pH 5.8, 0.4 mL de agua destilada y 0.1 mL de una solución de p-nitrofenil fosfato (10 µmoles/ mL). Inmediatamente después de preparar la mezcla de reacción se precalienta durante 10 min. a 30º C, y después de esto se adicionan 10 µL del extracto enzimático. La mezcla de reacción se incuba a 30º C durante 10 min. y la reacción se detiene con 3 mL de Na0H 0.1 N frío. La cantidad de p-nitrofenol producido se determina a 400 nm. Estas técnicas han sido utilizadas por los autores en diferentes estudios, y como ejemplo se incluye en este trabajo un resumen de la siguiente serie de publicaciones:

1. Para la identificación de variedades de Solanum tuberosum, del Programa Mexicano de Papa, los autores del trabajo que a continuación se presenta llevaron a cabo la separación electroforética

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de proteínas hidrosolubles de tubérculos de siete variedades comercialmente importantes de papa. Este método resultó ideal para la identificación de estas variedades, por lo que los autores lo recomiendan para el análisis rutinario de proteínas e isoenzimas de papa. (López, D. H.; y G. Carrillo-Castañeda. 1990. Identificación de variedades del Programa Mexicano de Papa por los patrones electroforéticos de proteínas solubles. Revista Latinoamericana de la Papa (ALAP) 3 (1): 56-6). 2. Se analizaron los patrones electroforéticos de proteínas hidrosolubles, así como de tres tipos de isoenzimas, para determinar su expresión en la interacción de la planta de Solanum tuberosum y microorganismos causantes de enfermedades de este cultivo. Los autores encontraron que los patrones de proteínas y de ciertas isoenzimas fueron modificados como respuesta de la planta al ataque de los microorganismos. (Flores, L. R.; G. Carrillo -Castañeda; M. A. Cadena; y L. Fucickovsy. 1992. Proteínas e izoenzimas de papa relacionadas con la interacción Solanum tuberosum (Solanáceas) Pseudomonas solanacearum (Pseudomonadaceae). Agrociencia, Serie Fitociencia 3 (1):79-90). 3. Los marcadores moleculares también dan información importante en fenómenos de desarrollo de plantas. Los autores encontraron que cuando el Lycopersicon esculentum (jitomate) se desarrolla expuesto a condiciones desfavorables como salinidad o a la presencia de drogas como antibióticos, la planta responde mediante la inducción de nuevas proteínas que le permiten adaptarse a las nuevas condiciones del ambiente. (Mejía, M. J. M.; y G. Carrillo -Castañeda. 1992. Determinación del efecto estacional trascendente en el desarrollo in vitro de ápices del tallo de Lycopersicon esculentum Mill. Agrociencia, Serie Fitociencia 3 (2):91-102). 4. En el caso de la regeneración de planta de Saccharum sp (caña de azúcar), propagada in vitro, los autores demostraron que en el proceso de desdiferenciación celular y conservación de los cultivos en estado indiferenciado, en un estudio que llevó nueve estadios de un mes cada uno, los cultivos sufren una serie de adaptaciones que pueden ser descritas mediante el análisis de la sucesión de isoenzimas asociadas a dicho proceso de desdiferenciación. Este estudio tiene importancia dado que existen procedimientos para el establecimiento de los cultivos de caña a nivel comercial, y en el método de micropropagación es importante para asegurar la mejor indicción de brotes a partir de callos. (Carrillo -Castañeda, G.; y A. Mata. 2002. Succession of esterase and peroxidase isozymes associated with the in vitro sugarcane tissue dedifferentiation and shoot induction. Biotecnología aplicada 17: 226-230).

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APÉNDICE

Preparación de las soluciones utilizadas en la amplificación del ADN • Iniciadores. Los iniciadores leofilizados Gibco y Roth se disolvieron respectivamente en 500 y 1000 µL de agua destilada o deionizada estéril, para obtener soluciones de entre 5 a 10 pmol/ µL. La cantidad de pico moles obtenida depende del peso molecular del iniciador. Las casas comerciales que distribuyen estos productos proporcio nan al adquirirlos una forma en la que especifican el peso molecular del iniciador y otras características importantes. • Mezcla de dNTPs. En un tubo eppendorf se añadieron 5 µL de cada una de las soluciones concentradas de los cuatro desoxirribonucleótidos (dNTPs) de la casa Gibco, los cuales están a la concentración de 100 mM. Posteriormente se agregaron 980 µL de agua desionizada estéril, para obtener una solución 200 µM de dNTPs. • Amortiguador TAE 10X 24.0 g de tris (hydroximetil aminometano) 5.71 mL de ácido acético glacial 10 mL de EDTA ( 0.5 M, pH 8.0) Aforar a un volumen de 500 mL con agua desionizada. • Amortiguador TAE 1X Tomar 10 mL de TAE 10X y aforar a 100 mL con agua desionizada. • Agarosa En un matraz erlenmeyer de 500 mL de capacidad se agregan 1.2 g de agarosa tipo II (Sigma) y 100 mL de amortiguador TAE 1X. La agarosa se funde en un horno de microondas, durante 1.40 min. y se dejar enfriar hasta una temperatura aproximada de 30º C. Posteriormente se vierte en la cámara de electroforesis, la cual previamente se prepara sellando los extremos y colocando el peine, para formar el molde que constituirá el gel. Estas cantidades son las requeridas para formar un gel de 15 x 15 cm de diámetro y 7 mm de espesor. • Colorante de carga: cantidades para 10 mL.

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50% glicerol

10 mL

0.1% azul de bromofenol

10 mg

0.1% xilen cianol

10 mg

Se colocan los tres componentes en un vaso de precipitados de 15 mL de capacidad, y para disolver se colocan durante 15 min. en una parrilla eléctrica con agitación. • Marcador 100 pb ADN (50 µg; 1µg/µL): cantidades para 100 µL. En un tubo eppendorf de 1 mL de capacidad, se agregan 10µL del marcador y se diluyen en 90 µL de colorante de carga, para tener una solución de 0.1 µg/µL. • Bromuro de etidio 5mg/ml La preparación de esta solució n debe hacerse con guantes y en un recipiente pequeño destinado a este fin, para evitar la contaminación del material, debido a que este compuesto es cancerígeno.

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