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Manual de Procedimientos
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria monocytogenes
2008
AUTORES Raquel Callejo Mónica Prieto Claudia Martínez Lorena Aguerre Florencia Rocca Gisela Martínez
Servicio Bacteriología Especial Departamento de Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán” Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para América del Sur
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria monocytogenes
CONTENIDO DEL MANUAL • SECCIÓN
I:
INTRODUCCIÓN
• SECCIÓN
II:
INVESTIGACIÓN DE Listeria monocytogenes EN MUESTRAS CLÍNICAS
• SECCIÓN
III:
IDENTIFICACIÓN DE Listeria monocytogenes
• SECCIÓN
IV:
IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS DE Listeria monocytogenes POR PCR
• SECCIÓN
V:
SEROTIPIFICACIÓN DE Listeria monocytogenes CON ANTISUEROS
• SECCIÓN
VI:
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
SECCIÓN I 1. INTRODUCCIÓN El género Listeria está compuesto por bacterias gram positivas con bajo contenido G+C, estrechamente relacionado con los géneros Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Streptococcus y Staphylococcus. Son bacilos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, no capsulados, catalasa positiva, móviles entre 10 y 25ºC (Collins et al., 1991). Listeria ha sido aislada de diferentes sitios ambientales, como; suelo, agua, efluentes, de una gran variedad de alimentos y de heces humanas y animales. El habitat natural de estos microorganismos es probablemente la materia orgánica vegetal en descomposición y los rumiantes domésticos contribuyen al mantenimientos de Listeria spp. en el ambiente rural a través de un ciclo continuo de enriquecimiento oral-fecal (Fenlon, 1999). La amplia distribución de L. monocytogenes se debe a la capacidad de sobrevivir durante períodos de tiempo prolongados en diferentes medios. El género Listeria comprende seis especies: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. innocua, L. welshimeri y L. grayi. Las dos especies potencialmente patógenas son L. monocytogenes y L. ivanovii. L. monocytogenes no fue considerado un patógeno animal hasta fines de la década del 70. A principios de los años 80 emerge como uno de los patógenos humanos de origen alimentario más importante. A partir de ese momento, la literatura sobre Listeria comenzó a incrementarse y a partir de 1983 una serie de brotes epidémicos humanos en Norteamérica y Europa establecieron claramente a la listeriosis como una grave infección alimentaria (Bille, 1990). Los alimentos más frecuentemente asociados con brotes y con alto nivel de riesgo son quesos y productos lácteos, patés y salchichas, pescados ahumados, ensaladas y en general productos industrializados, refrigerados, listos para el consumo, sin requerimientos de cocción o calentamiento previo (Farber and Peterkin, 1991). Los alimentos se pueden contaminar en cualquier eslabón de la cadena productiva, así como también en el almacenamiento en frío. En la actualidad, se estima que L. monocytogenes es la principal causa de muerte originada por bacterias de origen alimentario en USA, aproximadamente se registran 2500 casos de listeriosis humana por año, incluyendo 500 muertes (Mead et al., 2006). En rumiantes, la infección por Listeria es transmitida por consumo de silaje en mal estado, en el cual la bacteria se multiplica rápidamente, dando lugar a brotes en ganado (Fenlon, 1999). El genoma de L. monocytogenes fue secuenciado recientemente y posee un cromosoma circular de 2.944.528 pb con un promedio de G+C de 39%. Se han identificado 2853 genes, sin embargo al 35.3% no se les conoce función. En el caso de L. innocua posee un único cromosoma circular de 3.011.209 pb con un contenido promedio de G+C del 37%. Dentro del género Listeria, estas dos especies presentan alto grado de homología en la secuencia del 16S rRNA, siendo las de mayor cercanía taxonómica (Von Both et al., 1999). 1.1 Serovariedades Existen hasta el momento 13 serovariedades reconocidas de L. monocytogenes; 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e y 7, clasificados en base a los antígenos somáticos (O) y flagelares (H). Sin embargo, tres de ellas (1/2a, 1/2b y 4b), han sido aisladas en más del 90% de los casos humanos y animales (Low et al., 1993). Otras serovariedades, como la 1/2c, ha sido encontrada como contaminante de alimentos (Espaze el al., 1991). Algunas de estas serovariedades son compartidas por L. innocua y L. seeligeri. L. innocua está representada sólo por tres serovariedades y es considerada una variante no patógena de L. monocytogenes. La serotipificación de L. monocytogenes es el primer método de subtificación y permite identificar rápidamente los aislamientos que necesitan ser analizados posteriormente por electroforesis en campo pulsado (PFGE). Tabla 1. Serovariedades asociadas de las diferentes especies de Listeria
Especie Listeria monocytogenes
Serovariedad 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7
Listeria ivanovii
5
Listeria innocua
4ab, 6a, 6b,
Listeria welshimeri Listeria seeligeri
6a, 6b 1/2b, 4c, 4d, 6b 2
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1.2 Epidemiología Estudios realizados determinaron que L. monocytogenes es un patógeno con estructura clonal y el potencial patogénico difiere entre los diferentes grupos clonales (Piffaretti et al., 1989; Wiedmann et al., 1997), así como en la especificidad por el huésped y la adaptación a diferentes nichos ecológicos (Boerlin and Piffaretti, 1991). Rasmussen et al. (1995) demostraron que L. monocytogenes se divide en tres linajes según la secuencia de los genes de virulencia hly, iap y el gen fla que codifica para la flagelina. Wiedmann et al., (1997) confirmaron la existencia de los tres linajes genéticamente distintos, mediante ribotipificación y PCR-RFLP del gen de virulencia hly. El linaje I contenía las serovariedades 1/2b, 3b, 3c y 4b, el linaje II comprendía las serovariedades 1/2a, 1/2c y 3a y el linaje III las serovariedades 4a y 4c. Los aislamientos del linaje I incluían los clones epidémicos de L. monocytogenes que eran responsables de un gran número de casos humanos de listeriosis (Sauders et al, 2006). Los aislamientos del linaje II provenían de alimentos y ambiente (Kathariou, 2002), mientras que los aislamientos del linaje III eran fundamentalmente de animales (Kathariou, 2002). Estudios de subtipificación identificaron cuatro clones epidémicos (ECI, ECII, ECIII, ECIV) (Chen et al., 2007), Entre los clones epidémicos, un cluster de la serovariedad 4b emergió como un grupo clonal cosmopolita, asociado a varios brotes en diferentes países, relacionados con los siguientes alimentos: coles (Nueva Escocia, 1981), queso blando (Suiza, 1983 a 1987 y California, 1981) y lengua de cerdo (Francia, 1992) (Kathariou, 2002). Ver Tabla 2. El clon epidémico ECII fue identificado en USA (1998-1999), en un brote en varios estados, asociado a salchichas y en el 2002 a un brote por carne de pavo feteada (Kathariou, 2002). El clon ECIV (serovariedad 4b), causó un brote producido por paté (Reino Unido, 1988) y por vegetales (Boston, 1983). El clon ECIII corresponde a aislamientos de la serovariedad 1/2a y fue la causa de un brote por salchichas (USA, 1989) y carne de pavo (USA, 2000). Estos aislamientos ECIII estaban relacionados epidemiológicamente, dado que se encontraron en la misma planta procesadora de alimentos y correspondían a idénticos subtipos, de acuerdo a diferentes estudios de subtipificación por métodos moleculares. Sauders et al. (2006), demostraron que muchos casos esporádicos eran también producidos por clones epidémicos. Por lo tanto, la identificación y el control de estos clones epidémicos son importantes para entender la transmisión a largo plazo de L. monocytogenes y establecer sistemas eficientes de vigilancia para este patógeno. L. monocytogenes no solamente ha sido un importante modelo para la investigación inmunológica sino que también ha servido para el análisis de los mecanismos moleculares del parasitismo intracelular (Cossard and Menguad, 1989). Tabla 2. Brotes de listeriosis en el mundo
Halifax, Canadá
1981
Nº de casos 41
Massachussets, USA
1983
49
14
4b
Leche
Fleming et al.(1985)
1983-87
122
34
4b
Queso
Bula et al.(1995)
1985
142
48
4b
Queso
Linnan et al.(1995)
1989-90
300
0
4b
Paté
McLauchlin et al. (1991)
Francia
1992
279
88
4b
Lengua de cerdo
Jacquet et al.(1995)
Francia
1993
39
0
4b
Paté de cerdo
Goulet et al.(1995)
Francia
1995
36
0
4b
Queso blando
Goulet et al.(1995)
Multiestados, USA
1998-99
40
4
4b
Carne feteada
CDC (1998)
Finlandia
1988-99
25
6
3a
Manteca
Lyytikainen et al. (2000)
Francia
1999
29
7
NI
Lengua de cerdo
WHO (2000)
Multiestados, USA
2000
29
4
4b
Pavo feteado
CDC (2002)
2000-01
12
0
4b
Queso
CDC (2002a)
2002
46
7
NI
Pollo y pavo
CDC (2002b)
Québec, Canadá 2002 NI: serovariedad no informada
17
0
NI
Queso
Gaulin et al.(2003)
País
Vaud, Suiza California, USA Reino Unido
Carolina del Norte, USA Multiestados, USA
Año
Nº de muertes 18
Serotipo
Alimento
Referencia
4b
Coles
Schlech et al.(1983)
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1.3 Patofisiología de la Infección por Listeria monocytogenes Existen dos formas de presentación clínica de la infección: a) listeriosis perinatal b) listeriosis en el paciente adulto. Las formas clínicas predominantes corresponden en ambos casos a la infección diseminada o a la infección localizada en el sistema nervioso central. Es la infección de origen alimentario con mayor tasa de mortalidad en humanos (20 al 30 % o mayor) a pesar del inicio del tratamiento antibiótico previo (McLauchlin, 1990). La infección generalmente comienza alrededor de las 20 horas después de la ingestión del alimento contaminado en los casos de gastroenteritis (Dalton et al., 1997), mientras que el período de incubación para la forma invasiva es generalmente más larga, alrededor de 20 a 30 días.(Lindan et al.,1988). Los mismos períodos de incubación han sido descritos para animales, tanto para la gastroenteritis como para la forma diseminada. Los casos esporádicos tienen una tasa de incidencia muy baja, 2 a 8 casos anuales por millón de población en Europa y USA (Farber and Peterkin, 1991). Por este motivo, L. monocytogenes parece tener un potencial patógeno más bajo que otros microorganismos de transmisión alimentaria, lo cual está de acuerdo con la dosis letal 50 (DL50), relativamente alta. El valor determinado para el ratón infectado experimentalmente por vía oral es de 109 y por vía parenteral es de 105 a 106. La dosis mínima requerida para la infección humana no ha sido determinada, pero el número de bacterias detectadas en alimentos responsables de casos esporádicos y epidémicos de listeriosis sugiere que es alto. Esta dosis también depende de otros factores como el estado inmunológico del huésped. a) Listeriosis feto materna y listeriosis neonatal La infección se produce por invasión del feto por vía placentaria y desarrollo de corioamnionitis. Como consecuencia, puede ocurrir el aborto, generalmente a partir de los 5 meses de embarazo, el parto prematuro o el nacimiento a término con infección generalizada del neonato, síndrome conocido como granulomatosis infantiséptica. Se caracteriza por la presencia de microabscesos piogranulomatosos diseminados en el cuerpo y con alta mortalidad (Klatt et al., 1986). En la madre, la infección es generalmente asintomática y puede presentarse como un síndrome gripal leve con escalofríos, fatiga, dolor de cabeza, muscular y articular alrededor de 2 a 14 días antes del aborto. La listeriosis neonatal tardía se observa con menos frecuencia. Generalmente ocurre de 1 a 8 semanas posteriores al parto y se presenta con un síndrome febril acompañado por meningitis y en algunos casos gastroenteritis y neumonía. La vía de contaminación del neonato es por aspiración de exudados maternos contaminados durante el parto. También se han registrado casos intrahospitalarios en unidades de neonatología por transmisión horizontal a través de instrumental y las manos del personal de salud (Farber et al., 1991). La mortalidad de la listeriosis neonatal tardía es más baja (10 al 20%), pero al igual que la listeriosis temprana, puede dejar secuelas tales como hidrocefalia y retraso psicomotor (Lorber, 1996). b) Listeriosis del adulto La infección mas frecuente en el adulto es la invasión del sistema nervioso central (SNC) (55 al 70% de los casos). Desarrolla generalmente como meningoencefalitis acompañada por cambios severos de la conciencia, desordenes del movimiento y en algunos casos parálisis de los nervios craneales. La mortalidad de la infección del SNC es del 20%, pero puede ser del 40 al 60% si está asociada a una enfermedad de base. En ciertos grupos de riesgo, como enfermos de cáncer, L. monocytogenes es la causa más frecuente de meningitis bacteriana (Lorber, 1996). Otra forma frecuente de listeriosis es la bacteriemia o septicemia que tiene una alta tasa de mortalidad (hasta el 70%), si esta asociada a una enfermedad inmunosupresiva. Hay otras formas clínicas atípicas (5 al 10% de casos) tales como endocarditis, miocarditis, arteritis, neumonía, pleuritis, hepatitis, colecistitits, peritonitis, abscesos localizados, artritis. En vacas la forma más frecuente es la mastitis (Blenden et al., 1987). Investigaciones de brotes alimentarios han dado la evidencia de que un síndrome gastrointestinal es la manifestación clínica de la infección por L. monocytogenes (Aureli et al., 2000).
1.4 Población de Riesgo Las poblaciones de riesgo son: mujeres en estado de gravidez, ancianos, neonatos, personas inmunocomprometidas (cáncer, transplantes renales, SIDA, diabetes, terapias inmunosupresoras, alcoholismo).
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1.5 Sensibilidad a los Antimicrobianos L. monocytogenes es sensible a penicilina, ampicilina, gentamicina, eritromicina, tetraciclinas, rifampicina, cotrimoxazol y vancomicina. Las fluorquinolonas y las cefalosporinas presentan poca actividad. Se han descrito en algunos aislamientos resistencias a macrólidos y a tetraciclinas que suelen estar codificadas por plásmidos, aunque también hay casos de resistencia a tetraciclinas codificada cromosómicamente. 1.5.1 Información y criterios de interpretación para pruebas de sensibilidad por microdilución en caldo 1.5.2 Condiciones del estudio Medio: Caldo Mueller Hinton y con ajuste de cationes y sangre lisada (2.5 ml al 5% v/v) Inoculo: Suspensión directa de las colonias con turbidez equivalente al estándar 0.5 de McFarland Incubación: 35 ºC, en atmósfera normal durante 20 a 24 horas 1.5.3 Recomendaciones de Control de calidad mínimo Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 1.5.4 Antimicrobianos que se prueban en el primer ensayo Penicilina o ampicilina Trimetoprima-sulfametoxazol 1.5.5 Comentarios generales - Características de desarrollo en medios de rutina: frecuentemente fastidiosos; requieren medios suplementado con sangre para un crecimiento adecuado; atmósfera normal; 20 a 24 horas - Para algunos organismos y combinaciones de antimicrobianos: la ausencia o la rara presencia de cepas resistentes excluye la definición de cualquier otra categoría además de “sensible”. Para cepas con resultados que sugieren una categoría de “no sensible” se debe confirmar la identificación del microorganismo y las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos. Por lo tanto, los aislamientos deberán ser conservados y remitidos a un laboratorio de referencia para su confirmación. Tipo de antibiótico
Antibiótico
CIM (µg/ml) Criterio de interpretación
Comentarios
S
I
R
Penicilina
≤2
-
-
Ver comentario general 2
Ampicilina
≤2
-
-
Ver comentario general 2
≤0.5/9.5
1/19-2/38
≥4/76
Penicilinas
Inhibidores del metabolismos del folato Trimetoprima-sulfametoxazol 1.5.6 Información adicional
- Resistencia Listeria monocytogenes presenta resistencia intrínseca a cefalosporinas - Razones para la realización o no del ensayo No se ha descripto resistencia a ampicilina o penicilina. El ensayo debe ser limitado a sospecha de falla de tratamiento o a pacientes alérgicos a penicilina. - Criterios interpretativos Los criterios interpretativos para penicilina y ampicilina se han publicado en la edición más reciente del documento M100 del CLSI. Criterios interpretativos para trimetoprima-sulfametoxazol se adaptan de los criterios para Streptococcus spp. de acuerdo al documento M100 del CLSI. Las citas bibliográficas utilizadas en la interpretación de los puntos de corte se incluyen en las referencias que se dan a continuación: -
Hansen JM, Gerner-Smidt P, Bruun B. Antibiotic susceptibility of Listeria monocytogenes in Denmark 1958-2001.APMIS. 2005; 113:31-36 Marco F, Almela M, Nolla-Salas J, et al. In vitro activities of 22 antimicrobial agents against Listeria monocytogenes strains isolated in Barcelona, Sapin. Diagn Microbiol Infect Dis. 2000; 38(4):259-261
1.5.7 Referencias Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidiouds Bacteria; Approved Guideline. M45-A. Vol 26 Nº 19. Replaces M45-P. Vol. 25 Nº 26. CLINICAL AND LABOARTORY STANDARTS INSTITUTE 5
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1.6 Tratamiento Los antibióticos de elección son la penicilina o la ampicilina solos o asociadas a gentamicina. La combinación de trimetoprima y sulfametoxazol se ha utilizado con éxito en pacientes alérgicos a penicilinas, considerándose en la actualidad una terapia alternativa. 1.7 Patogénesis El motivo por el que L. monocytogenes produce una grave infección, se debe a la capacidad que tiene de inducir su propia fagocitosis por células fagocíticas y no fagocíticas del huésped, seguido por la replicación en el interior de las mismas y su transferencia directa a otra célula. Como L. monocytogenes es un microorganismo intracelular, se disemina protegido de las defensas del huésped incluyendo anticuerpos y complemento (Cossart et al., 2003). Antes de alcanzar el intestino, las bacterias ingeridas deben soportar el ambiente adverso del estómago, al menos 13 proteínas de estrés oxidativo y 14 proteínas de “shock” tóxico, son inducidas bajo condiciones de estrés en L. monocytogenes (Vázquez-Boland et al., 2001b). Las bacterias ingresadas con el alimento son captados por los enterocitos o la células M próximas a las placas de Peyer en el intestino delgado, multiplicándose luego en las células fagocíticas. Las bacterias son transportadas por los macrófagos del intestino al hígado o al bazo, donde son destruidas por los neutrófilos y las células de Kupffer. Si la respuesta inmune mediada por células T del huésped es inadecuada, las listerias se multiplican en los hepatocitos y en los macrófagos y son llevadas por la sangre a varios órganos, especialmente al cerebro y/o al útero, donde atraviesan la barrera hematoencefálica o la placenta. Una intrincada serie de factores de virulencia son producidos por L. monocytogenes para facilitar cada paso en su proceso de invasión. 1.7.1 Factores de virulencia Varios factores de L. monocytogenes que median los pasos claves de la infección, han sido identificados. (a) Adhesión e invasión: Las células de Listeria inicialmente se adhieren a los enterocitos intestinales y
penetran la pared intestinal. El proceso es mediado por la internalina (InlA) y InlB (otro miembro de la familia de internalinas, caracterizada por la presencia de unidades repetitivas de leucina) y/o otros factores de internalización. En respuesta, las bacterias quedan dentro del fagosoma en las células del huésped. La entrada de L. monocytogenes dentro de la célula humana es mediada por la interacción de la proteína de superficie, internalina, con su receptor humano E-caderina. La interacción internalina-E-caderina es especie específica y se basa en la presencia de un solo aminoácido de diferencia en el residuo 16 en la molécula de E-caderina, el cual es prolina en humanos y ácido glutámico en ratón. Evidencias epidemiológicas apoyan el rol de la internalina en la listeriosis humana, no solo para atravesar la barrera intestinal, sino también para cruzar la barrera hematoencefálica y la placentaria. (b) Vacuola primaria de lisis: La listeriolisina O (LLO) y la fosfolipasa C fosfatidil inositol específica (PI –PLC)
lisan el fagosoma para permitir el escape de las bacterias de la vacuola fagocítica. (c) Desarrollo intracelular: La propagación bacteriana dentro del citosol es mediada por un transportador de
fosfato hexosa bacteriano (Hpt) y una ligasa protein lipoato (LpLA1) que permiten que L. monocytogenes capte de la célula huésped fuentes de carbono. (d) Diseminación de una célula a otra: Una vez que las bacterias se multiplicaron en el citosol de la célula
huésped, se desplazan utilizando la nucleación de filamentos de una proteína, actina (ActA). Esto produce un movimiento dirigido de las bacterias hacia la membrana celular de la célula huésped y promueve estructuras semejantes a pseudopodos que se extienden dentro de las células vecinas. Este mecanismo hace que se infecte la célula y la bacteria quede dentro de una vacuola de doble membrana (Cossart et al., 2003). (Tilney and Portnoy, 1989). (e) Lisis de la vacuola de doble membrana: La fosfolipasa C fosfatidilcolina específica (PC-PLC) de Listeria
junto con la LLO lisan la vacuola de doble membrana y liberan las bacterias que infectan la célula vecina.
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Figura 1: Ciclo de vida intracelular de L. monocytogenes. Centro: se muestra la internalización, la formación de la vacuola y el escape de la misma, la polimerización de la actina, la motilidad basada en la actina y la diseminación. Afuera: fotografías electrónicas mostrando LLO, PLCs, y ActA. El esquema del ciclo de vida y las fotografías electrónicas corresponden a la publicación de Tilney y Portnoy (1989) Los genes de virulencia de Listeria spp., se organizan dentro de unidades genéticas conocidas como islas de patogenicidad (PAIs). Las PAIs son adquiridas por la bacteria por mecanismos de transferencia de información genética horizontal, algunas veces como parte de un elemento móvil genético, por lo cual son importantes en la evolución de la virulencia bacteriana. Seis de los factores de virulencia responsables del parasitismo intracelular de L. monocytogenes ( prfA, plcA, hly, mpl, actA y plcB ), están organizados en una isla cromosomal de 9kb conocida como grupo de genes de virulencia PrfA dependiente; isla denominada como isla 1 de patogenicidad de Listeria (LIPI-1) (Figura 2) (Vázquez-Boland et al., 2001a; Vázquez-Boland et al., 2001b). El locus de virulencia está formado por tres unidades transcripcionales (Figura 2). La posición central está ocupada por el monocistrón hly , que codifica para la LLO requerida para la ruptura de la vacuola fagocítica y la liberación de la bacteria dentro del citoplasma. Corriente abajo del monocistrón hly , y en el mismo sentido de transcripción se encuentra el operón lecitinasa de 5.7Kb que comprende tres genes: mpl, actA y plcB y tres pequeños marcos de lectura abiertos (ORFs) adicionales (Figura 1). El gen act A codifica para la proteína ActA, el gen plcB para la fosfolipasa C fosfatidilcolina específica (PC-PLC), y el gen mpl codifica para la proteasa, la cual procesa extracelularmente el propéptido inactivo de la PC-PLC.
Figura 2. Organización transcripcional y física del grupo de genes de virulencia (LIPI-1) de Listeria monocytogenes.
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1.8 El Proteoma de Listeria monocytogenes La determinación completa de la estructura genética y proteica de L. monocytogenes y el conocimiento de las funciones interconectadas de la arquitectura celular de este microorganismo, son fundamentales para comprender la supervivencia y el crecimiento de este patógeno alimentario en el ambiente, en alimentos y en los casos humanos de listeriosis. Los estudios proteómicos han sido enfocados hacia la respuesta del organismo frente a un stress general, así como también hacia situaciones de stress más específicas, que son importantes para la supervivencia y crecimiento en diferentes condiciones relacionadas con alimentos, biofilms y procesos infecciosos. La propiedad de L. monocytogenes de sobrevivir y crecer a temperaturas de refrigeración hace importante determinar los mecanismos por los cuales los patógenos alimentarios llevan a cabo dicha actividad. Phan-Thanh, and Gormon (1997), encontraron 32 proteínas que eran producidas al doble, frente a un shock térmico, que consistía en llevar la bacteria de 25 ºC a 49 ºC de temperatura. Los mismos autores encontraron 38 proteínas que aumentaban al doble o más, al llevar la bacteria de 25 ºC a 4 ºC. Dos de las proteínas expresadas durante el shock al frío fueron identificadas (Bayles et al., 1996), como proteínas ribosomales S6 y factor de elongación Tu (EF-Tu). De la misma manera, L. monocytogenes tiene la capacidad de tolerar condiciones de alta osmolaridad. Es capaz de crecer en presencia de NaCl 10% y ha sido aislada de alimentos con alta concentración de sal. La exposición a 3.5% NaCl durante 30 minutos resulta en la producción de proteínas generales de stress DnaK y Crc y las enzimas alanina dehidrogenasa, gliceraldehido 3 fosfato dehidrogenasa (Gap), y Cys K que interviene en la síntesis de cisteína (Duché et al., 2002). Después de estar a 3.5% NaCl por 60 a 90 minutos, se expresan proteínas relacionadas a largos períodos de aclimatación, en condiciones de alta osmolaridad. Estas proteínas se conocen como de aclimatación a sales e incluyen Gbu, EF-Tu, GuaB, CcpA, PTS manosa específica, Pdh A y Pdh D (subunidades de la piruvato dehidrogenasa). El desarrollo y persistencia de biofilms conteniendo L. monocytogenes es una importante área de investigación, ya que los biofilms son prevalentes en las plantas procesadoras de alimentos y los biofilms pueden reducir la efectividad de los tratamientos de sanitización dispuestos para eliminar Listeria y otros microorganismos. De las 8 proteínas reguladoras de L. monocytogenes caracterizadas en biofilms (Trémoulet et al., 2002), PdhD y CysK fueron identificadas como proteínas de stress salino en medios mínimos. PdhD e YvyD eran proteínas que tenían mayor expresión en medio mínimo que en BHI con y sin el agregado de 6% de NaCl. El hallazgo que PdhD, CysK e YvyD son altamente expresadas tanto en un medio mínimo, como en un biofilm desarrollado en un medio agarificado complejo, indica que las bacterias en el biofilm están respondiendo a limitaciones nutricionales similares a las de bacterias en un medio mínimo. Los perfiles de proteínas de células planctónicas desarrolladas en glucosa fueron comparadas con los perfiles de células privadas de glucosa en biofilms. La comparación reveló que las bacterias del biofilm privadas de glucosa, incrementaban la expresión de 14 proteínas, de las cuales 5 pudieron ser identificadas. Estos avances en el conocimiento serán utilizados para desarrollar mejores estrategias de intervención y métodos de detección para salvaguardar la producción de alimentos.
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1.9 Bibliografía •
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Aureli P, G C Fioruci, D Caroli, G Marchiaro, O Novara, L Leone, and S Salmaso. 2000. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria monocytogenes. N Engl J Med. 342:1236–1241. Bayles D O, B A Annous, and B J Wilkinson. 1996. Cold stress proteins induced in Listeria monocytogenes in response to temperature downshock and growth at low temperatures. Appl Environ Microbiol. 62:1116–111. Blenden D C, E H Kampelmacher, and M J Torres-Anjel. 1987. Listeriosis. J Am Vet Med Assoc. 191:1546–1551. Cossart P, Pizarro-Cerda J, Lecuit M. 2003. Invasion of mammalian cells by Listeria monocytogenes: functional mimicry to subvert cellular functions. Trends Cell Biol. 13: 23–31. Chen Y, W Zhang, and S J Knabel. 2007. Multi-virulence-locus sequence typing identifies single nucleotide polymorphisms which differentiate epidemic clones and outbreak strains of Listeria monocytogenes. J Clin Microbiol. 45:835–846. Cossart P, and J Mengaud. 1989. Listeria monocytogenes, a model system for the molecular study of intracellular parasitism. Mol Biol Med. 6:463–474. Dalton C B, C C Austin, J Sobel, P S Hayes, W F Bibb, L M Graves, B Swaminathan, M E Proctor, and P M Griffin. 1997. An outbreak of gastroenteritis and fever due to Listeria monocytogenes in milk. N Engl J Med. 336:100–105. Duché O, F Trémoulet, P Glaser, and J Labadie. 2002. Salt stress proteins induced in Listeria monocytogenes. Appl Environ Microbiol 48:1494-1498. Farber J M, P I Peterkin, A O Carter, P V Varughese, F E Ashton, and E P Ewan. 1991. Neonatal listeriosis due to cross-infection confirmed by isoenzyme typing and DNA fingerprinting. J Infect Dis. 163:927– 928. Farber J M, and P I Peterkin. 1991. Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen. Microbiol Rev. 55:476– 511. Kathariou, S. 2002. Listeria monocytogenes virulence and pathogenicity, a food safety perspective. J Food Prot. 65:1811–1829. Klatt E C, Z Pavlova, A J Teberg, and M L Yonekura. 1986. Epidemic neonatal listeriosis at autopsy. Hum Pathol. 17:1278–1281. Lorber B. 1996. Listeriosis. Clin Infect Dis. 24:1–11. Linnan M J, L Mascola, X D Lou, V Goulet, S May, C Salminen, D W Hird, M L Yonekura, P Hayes, R Weaver, A Audurier, B D Plikaytis, S L Fannin, A Kleks, and C V Broome. 1988. Epidemic listeriosis associated with Mexican-style cheese. N Engl J Med. 319:823–828. McLauchlin, J. 1990. Human listeriosis in Britain, 1967–1985, a summary of 722 cases. 2. Listeriosis in nonpregnant individuals, a changing pattern of infection and seasonal incidence. Epidemiol Infect. 104:191–201. Mead, P S, E F Dunne, L Graves, M Wiedmann, M Patrick, S Hunter, E Salehi, F Mostashari, A Craig, P Mshar, T Bannerman, B D. Sauders, P Hayes, W Dewitt, P Sparling, P Griffin, D Morse, L Slutsker, and B Swaminathan. 2006. Nationwide outbreak of listeriosis due to contaminated meat. Epidemiol Infect 134:744–751. Phan-Thanh, L, and T Gormon. 1997. Stress proteins in Listeria monocytogenes. Electrophoresis 18:1464–1471. Tilney, LG, and DA Portnoy. 1989. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. J Cell Biol. 109:1597–1608. Trémoulet F, O Duché, A Namane, B Martinie, and J C Labadie. 2002. Comparison of protein patterns of Listeria monocytogenes grown in biofilms or in planktonic mode by proteomic analysis. FEMS Microbiol Lett.; 210 (1):25-31 Sauders, B D, Y Schukken, L Kornstein, V Reddy, T Bannerman, E Salehi, N Dumas, B J Anderson, J P Massey, and M Wiedmann. 2006. Molecular epidemiology and cluster analysis of human listeriosis cases in three U.S. states. J Food Prot. 69:1680–1689. Vázquez-Boland J, Domínguez-Bernal G, Gónzalez-Zorn B, Kreft J, Goebel W. 2001ª. Pathogenicity Islands and Virulence Evolution in Listeria. Microb Infect; 3: 571-584. Vázquez-Boland J, M Kuhn, P Berche, T Chakraborty, G Domínguez-Bernal, W Goebel, B GonzálezZorn, J Wehland, J Kreft. 2001.Listeria Pathogenesis and Molecular Virulence Determinants. Clin Microbiol Rev. 14(3): 584-640.
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Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
SECCIÓN II INVESTIGACIÓN DE Listeria monocytogenes EN MUESTRAS CLÍNICAS
1. HEMOCULTIVOS Consideraciones de bioseguridad •
Consideraciones generales para patógenos clase II.
•
Utilizar cabina de bioseguridad para prácticas microbiológicas con potencial formación de aerosoles.
•
Cuando se procesan hemocultivos, mantener las botellas dentro de la cabina de bioseguridad o utilizar mascara protectora.
•
Utilizar siempre guantes
•
Utilizar descartador de agujas. Nunca intentar colocar la tapa protectora sobre la aguja manualmente
•
La presencia de mujeres embarazadas e individuos potencialmente inmunodeprimidos debe estar absolutamente prohibida en áreas donde se manipule Listeria monocytogenes
1.1 Definiciones El diagnóstico bacteriológico de la bacteriemia depende del estudio de los hemocultivos. Debido a la sensibilidad de los métodos de cultivo, el procedimiento debe ser controlado cuidadosamente desde la etapa pre-analítica (recolección de la muestra) para evitar la interpretación errada de la recuperación de microorganismos que corresponden a comensales de piel. El volumen total de sangre debe ser extraído por punción venosa a partir de dos sitios anatómicos distintos para permitir la evaluación en el laboratorio ante la aparición de un microorganismo comensal de piel aislado en un solo hemocultivo 1.2 Recolección y transporte de muestra 1.2.1 Materiales • • • •
Alcohol etílico al 70% o yodo povidona Frascos para hemocultivo Guantes Jeringa y aguja para extracción venosa
1.3 Procedimiento para la obtención de muestra 1.3.1 Técnica aséptica. Instrucciones • • • • • • • • • • • • • •
Lavarse las manos con agua y jabón y secarse con gasa estéril o toalla descartable Quitar la tapa protectora del frasco y desinfectar con iodo povidona Lavar la piel del paciente con agua y jabón; secar con gasa estéril o desinfectar con alcohol etílico al 70% Colocar el lazo, palpar la vena a punzar Desinfectar la piel con iodo povidona, con movimientos circulares del centro hacia afuera. Toma de muestra El operador antes de comenzar la tarea deberá colocarse camisolín, barbijo y guantes Punzar la vena seleccionada y extraer sangre, la cantidad dependerá del tipo de frasco a utilizar, en general se usa en dilución al 10%. SI PIERDE LA VENA, DEBE DESINFECTARSE NUEVAMENTE LA PIEL, UNA VEZ SELECCIONADA LA NUEVA VENA, USAR JERINGA Y AGUJAS NUEVAS Inclinar el frasco antes de colocar la sangre para evitar reflujo Inocular la sangre y homogeneizar por rotación para evitar la coagulación Descartar el material utilizado, desinfectar sector de trabajo con lavandina, quitarse guantes y barbijo y colocar todo en la bolsa de residuos Rotular la muestra y colocarla en la bolsa de transporte Remitir al laboratorio 10
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
NOTA: El intervalo en la toma dependerá de la gravedad del cuadro y la urgencia en el inicio del antibiótico No es costo / efectivo sacar más de 2 muestras de hemocultivo, excepto en situaciones donde es necesario descartar microorganismos contaminantes Ej. Pacientes con dispositivos en los cuales se aislan estafilococos coagulasa negativa, Corynebacterium sp., que pueden NO ser contaminantes.
1.3.2 Volumen de sangre y número de muestras
CANTIDAD DE SANGRE A EXTRAER POR PUNCIÓN VENOSA Volumen recomendado de extracción Neonatos: 0,5 a 2 ml 1 mes a 2 años: 2 a 3 ml >de dos años: 3 a 5 ml Adolescentes: 10 a 20 ml
Adultos : 10 a 30 ml
Sistema de hemocultivo
Sangre a inocular
Hemocultivo pediátrico convencional
0.5 a 3.0 ml de sangre por frasco
Lisis - centrifugación
1.5 ml de sangre por cada tubo
BacT / Alert
0.5 a 3.0 ml de sangre por frasco
Hemocultivo convencional
1ml de sangre por cada 10 ml de medio líquido
Lisis - centrifugación
10 ml de sangre por cada tubo
BacT / Alert
10 ml de sangre por botella
NÚMERO DE MUESTRAS E INTERVALOS DE TIEMPO ENTRE LAS TOMAS Diagnóstico presuntivo
Endocarditis con bacteriemia continua de baja magnitud
Número de muestras e intervalos de tiempo entre tomas a. Aguda: Tomar 2 muestras de sitios diferentes durante las 2 primeras horas de evaluación y comenzar la antibiótico terapia b. Subaguda: se tomarán 2 hemocultivos y se esperará el resultado (95 % de ellos serán positivos en 48 horas), caso contrario se solicitan nuevos hemocultivos c. Sospecha de endocarditis e ingesta previa de antibiótico: pacientes con antecedentes de ingesta de antibiótico en 2 semanas previas, dependiendo de condición clínica, pueden requerir más de una serie de hemocultivos separadas de 24 - 48 horas Listeria monocytogenes
Sepsis aguda, meningitis, osteomielitis, artritis, neumonía, pielonefritis
Tomar 2 muestras de dos sitios diferentes antes de comenzar la terapia antimicrobiana En casos de presunción de bacteriemia intermitente (abscesos, artritis, osteomielitis) se podrían justificar obtener tres muestras en 24 horas
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Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
1.4 Flujograma
Hemocultivo
Microscopía
Agar Sangre Agar tripteína soya Caldo nutritivo
Colonia sospechosa β-hemólisis + cocobacilo Gram + catalasa +
Pruebas bioquímicas confirmatorias (Ver SECCIÓN III)
Serotipificación
1.5 Procesamiento de hemocultivo en el laboratorio 1.5.1 Materiales • Ansa • Descartador de agujas • Estufa 35-37 ºC • Incinerador de ansas • Jeringa de 3 ml con aguja • Placas con agar tripticasa soya • Placas con agar tripticasa soya con sangre ovina al 5%
1.5.2 Procedimiento • • •
Incubar las botellas de hemocultivo a 35 ºC durante 5 días. Mantener las condiciones de incubación para permitir la recuperación del microorganismo y en lo posible incubar con agitación o rotación de las botellas. Examinar las botellas diariamente tanto si la detección de desarrollo positivo es automatizada o por inspección visual.
En caso de sistemas manuales de detección de desarrollo, realizar al menos un subcultivo a ciegas en agar sólido a partir de las botellas que no presentan signos visibles de desarrollo bacteriano En caso de aparición de signos de desarrollo bacteriano en la botella, subcultivar inmediatamente en agar sangre y realizar un extendido en portaobjeto para coloración de gram
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Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
1.6 Caracterización inicial y reporte de resultados 1.6.1 Materiales. Equipamiento • • • • •
Ansa Cabina de bioseguridad Incinerador de ansas Microscopio con lente de inmersión 100X de magnificación Portaobjeto de vidrio
NOTA: el uso de cabina de bioseguridad evitará la contaminación del cultivo o la muestra, así como protegerá al operador 1.6.2 Reactivos y medios • • • • • • •
Aceite de inmersión Agar tripteína soya con 5 % de sangre ovina para prueba de CAMP Bilis esculina agar Equipo colorantes para Gram Estrías de agar tripticasa soya Medio SIM Peróxido de hidrógeno al 3% (prueba de catalasa)
1.6.3 Procedimiento Día 1 •
Observación de bacilos pequeños o cocobacilos gram positivos
•
Desarrollo de colonias pequeñas con beta hemólisis positiva
•
Siembra de bilis esculina, prueba de CAMP y medio SIM a temperatura ambiente
Comentarios En los primocultivos, muchas veces L. monocytogenes no evidencia beta hemólisis Las pruebas se detallan en la SECCIÓN III
Día 2 •
Bilis esculina positiva, movilidad positiva (“paraguas”), prueba de catalasa positiva a partir de medio sin sangre
Identificación presuntiva de L. monocytogenes Confirmar según detallado en la SECCIÓN III
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Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
2. LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO
Consideraciones de bioseguridad •
Consideraciones generales para patógenos clase II.
•
Utilizar cabina de bioseguridad para prácticas microbiológicas con potencial formación de aerosoles.
•
Cuando se procesan hemocultivos, mantener las botellas dentro de la cabina de bioseguridad o utilizar mascara protectora.
•
Utilizar siempre guantes
•
Utilizar descartador de agujas. Nunca intentar colocar la tapa protectora sobre la aguja manualmente
•
La presencia de mujeres embarazadas e individuos potencialmente inmunodeprimidos debe estar absolutamente prohibida en áreas donde se manipule Listeria monocytogenes
2.1 Recolección y transporte de muestra 2.1.1 Materiales • Tubo plástico estéril tapa rosca 2.1.2 Muestra •
El LCR se obtiene por punción lumbar o a partir de derivaciones ventriculares
•
El LCR se obtiene por aspiración transcutánea, por lo tanto se trata de un fluido estéril y cualquier microorganismo recuperado en la siembra del material debe ser considerado un patógeno potencial.
2.1.3 Transporte y recepción • Remitir al laboratorio en forma urgente y alertar que la muestra está en tránsito •
No refrigerar
•
Rotular la muestra con información demográfica, fecha, hora y sitio de recolección (punción lumbar, derivación ventricular)
•
Procesar la muestra en forma inmediata
•
Registrar las características fisicoquímicas del LCR (volumen, celularidad, características macroscópicas)
IMPORTANTE: Las características fisicoquímicas del LCR en una infección por Listeria pueden confundirse con las observadas en las meningitis virales, pudiendo desorientar el diagnóstico. El LCR se caracteriza por la presencia de más de 1000 células por mm3, pudiendo encontrarse según la evolución del cuadro, polimorfonucleares o mononucleares; la proteinorraquia varía desde un valor normal hasta aproximadamente 700 mg/100 ml; la glucorraquia baja en la mitad de los casos. El aspecto del LCR rara vez es purulento. El microorganismo puede observarse o no al Gram pero habitualmente desarrolla en los medios de cultivo comunes.
2.2 Microscopía de la muestra 2.2.1 Materiales. Equipamiento • Ansa • Cabina de bioseguridad • Incinerador de ansas • Microscopio con lente de inmersión 100X de magnificación • Portaobjeto de vidrio Nota: el uso de cabina de bioseguridad evitará la contaminación del cultivo o muestra, así como protegerá al operador 2.2.2 Reactivos • Aceite de inmersión • Equipo de colorantes para Gram 14
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
2.2.3 Procedimiento Día 1
Comentarios
•
Colocar 5 a 6 gotas de la muestra en un portaobjeto y extender
•
Dejar secar dentro de la cabina de bioseguridad
•
Colorear con la técnica de Gram, observar e interpretar
•
La observación de cualquier número de cocobacilos Gram positivos debe ser informado inmediatamente al médico tratante
El número de L. monocytogenes en el LCR puede ser menor a 103 UFC/ml, por lo tanto la concentración por centrifugación para la coloración de Gram es importante para el diagnóstico rápido
2.3 Aislamiento e identificación 2.3.1 Materiales. Equipamiento • Ansa • Cabina de bioseguridad • Incinerador de ansas • Estufa de cultivo 35 – 37 ºC con atmósfera de 5% de CO2 2.3.2 Medios de cultivo • Agar tripteína soya • Agar tripteína soya con 5% sangre ovina • Caldo nutritivo 2.3.3 Procedimiento Día 1 • •
•
Centrifugar la muestra para concentrar Aspirar el fluido desde el fondo del tubo utilizando una pipeta estéril y colocar 2 ó 3 gotas en una placa de agar tripticasa soja con sangre ovina al 5% y en una placa de agar tripticasa soya sin sangre. Sembrar en técnica de aislamiento en cuatro cuadrantes Inocular también en caldo tioglicolato o caldo nutritivo. Incubar placas a 35 - 37 ºC en atmósfera de 5% de CO2 por 24 - 48 horas. Incubar caldos a 35 – 37 ºC en atmósfera normal Día 2
•
•
•
Examinar las placas y caldos a las 24 horas para detectar evidencia macroscópica de desarrollo bacteriano. En caso negativo, reincubar Realizar coloración de Gram y prueba de catalasa de colonias sospechosas en placa de agar tripteína soya Subcultivar en estría de agar tripteína soya Día 3
•
A partir del subcultivo en estría proseguir la identificación confirmatoria (Ver SECCIÓN III)
Comentarios
El número de L. monocytogenes en el LCR puede ser menor a 103 UFC/ml, por lo tanto la concentración por centrifugación mejora la recuperación por cultivo
Comentarios Colonias sospechosas: pequeñas convexas, transparentes-grisáceas con beta hemólisis difusa La observación microscópica de bacilos pequeños o cocobacilos gram positivos, la presencia de colonias pequeñas con beta hemólisis difusa y catalasa positiva representa una fuerte sospecha de L. monocytogenes que debería ser informada al médico tratante en forma inmediata Comentarios En caso de microscópica positiva a partir del Gram directo de la muestra con cultivos negativos a las 24 horas, reincubar las placas y caldos por al menos una semana y observar diariamente
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Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
2.4 Flujograma LCR
Análisis fisicoquímico
Centrifugar Microscopía Agar sangre Agar tripteína soya Caldo nutritivo
Colonia sospechosa β-hemólisis + cocobacilo Gram + catalasa +
Pruebas bioquímicas confirmatorias (Ver SECCIÓN III)
Serotipificación
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Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
3. MATERIA FECAL El procedimiento se adaptó con modificaciones menores del descrito por Sauders y col. (2005) 3.1 Recolección y transporte de muestra 3.1.1 Materiales • Frasco estéril tapa rosca para coprocultivo 3.1.2 Muestra • El estudio de L. monocytogenes en materia fecal puede ser requerido en caso de cuadros de gastroenteritis febril asociado al consumo de alimentos contaminados o estudios de portación en investigaciones epidemiológicos. •
La muestra debe obtenerse en el período agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos. Se recoge una muestra de una evacuación espontánea reciente, en frasco estéril. En caso de no poderse obtener la muestra, se realiza una hisopado rectal. Para los estudios epidemiológicos de portación fecal, las muestras de heces son más productivas que los hisopados rectales.
3.1.3 Transporte y recepción • Remitir al laboratorio refrigerada en forma urgente y alertar que la muestra está en tránsito • Rotular muestra con información demográfica, fecha, hora y sitio de recolección (punción lumbar, derivación ventricular) • Procesar la muestra en forma inmediata • La muestra debe ser procesada inmediatamente se puede mantener a 4 ºC por 48 horas. • Para muestras que requieran mayor tiempo de almacenamiento, congelar a –20 ºC y enviar al laboratorio acondicionada con hielo seco 3.2 Aislamiento e identificación 3.2.1 Materiales. Equipamiento • Ansa • Cabina de bioseguridad • Incinerador de ansas • Estufa de cultivo 35 – 37 ºC • Microscopio con lente de inmersión 100X de magnificación • Portaobjeto de vidrio 3.2.2 Consideraciones de bioseguridad • Consideraciones generales para patógenos clase II. • Utilizar cabina de bioseguridad para prácticas microbiológicas con potencial formación de aerosoles. • Utilizar siempre guantes • La presencia de mujeres embarazadas e individuos potencialmente inmunodeprimidos debe estar absolutamente prohibida en áreas donde se manipule Listeria monocytogenes 3.2.3 Reactivos y Medios de cultivo • Aceite de inmersión • Agar tripteína soya • Agar tripteína soya con 5% sangre ovina • Caldo Fraser • Caldo nutritivo • Medios selectivos (agar Oxford modificado MOX) • Equipo para coloración de Gram • Peróxido de hidrógeno al 3%
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Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
3.2.4 Procedimiento
Día 1 •
Colocar 1 g o 1 ml de materia fecal en 10 ml de caldo UVM
•
Incubar 24 horas a 30 ºC Día 2
•
Sembrar 0.1 ml de UVM en medio selectivo agar MOX
•
Sembrar 0.1 ml de UVM en 10 ml de caldo Fraser
•
Incubar a 30 ºC por 24 horas Día 3
•
•
Observar presencia de colonias sospechosas en el agar Oxford y subcultivar hasta 5 colonias en medio sólido (agar sangre, agar tripticasa soya), y medio líquido (caldo nutritivo). Incubar medios sólidos a 35 ºC por 18-24 horas y medio líquido a 22 ºC
Comentarios
Comentarios
Comentarios
A las 24 horas las colonias típicas de L. monocytogenes en agar MOX, son pequeñas, rodeadas de halo de ennegrecimiento debido a la hidrólisis de esculina
Sembrar 0.1 ml de caldo Fraser en agar MOX e incubar a 30ºC por 24 horas Día 4
•
Observar beta hemólisis, realizar prueba de catalasa coloración de gram y observar movilidad en fresco
•
Si el desarrollo de colonias sospechosas en agar selectivo es negativo a las 24 horas, observar nuevamente y en el caso de aparición de colonias proseguir como descripto en día 3
Comentarios La observación de bacilos o cocobacilos gram positivos, móviles, beta hemolíticos, catalasa positiva, indica sospecha de Listeria monocytogenes. Confirmar identificación según descripto en la SECCIÓN III
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Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
3.3 Flujograma Suspender 1g o 1 ml de materia fecal en 10 ml de Caldo UVM Incubar 48 horas a 30 ºC
MOX
Fraser
Incubar 24 horas a 30 ºC
Incubar 24 horas a 30 ºC
Sembrar en MOX
Incubar 24 horas a 30 ºC Colonias sospechosas
Agar sangre Agar tripteína soya Caldo nutritivo
Colonia sospechosa β-hemólisis + cocobacilos Gram + catalasa +
Pruebas bioquímicas confirmatorias (Ver SECCIÓN III)
Serotipificación
Referencias Sauders B, D Pettit, B Currie, P Suits, A Evans, K Stellrecht, D Dryja, D Slate and M Wiedmann. 2005.Low Prevalence of Listeria monocytogenes in human stool. J Food Prot. 68: 178-81.
4. OTROS MATERIALES •
Materiales de sitios normalmente estériles: Además de sangre y líquido cefalorraquídeo; líquido articular, liquido amniótico, líquido pericárdico, líquido pleural, placenta y tejido fetal. La siembra se realiza en los medios indicados en el procedimiento descripto para líquido cefalorraquídeo
•
Materiales de sitios no estériles : Se deberá incluir un paso de enriquecimiento en caldo nutritivo incubado en frío (4 ºC) y/o siembra en caldos y medios selectivos según el procedimiento descripto para materia fecal. 19
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
SECCIÓN III: IDENTIFICACIÓN DE Listeria monocytogenes 1. TABLA 1. Diferenciación de géneros relacionados Listeria
Lactobacillus
Erisypelothrix
Enterococcus
cocobacilar
bacilar
bacilar
cocos
Catalasa
+
-
-
-
Vancomicina
S
R
R
S/R
Movilidad
+
-
-
-/+
Producción SH2
-
-
+
-
Bilis Esculina
+
-
-
+
NaCl 6.5%
+
-
-
+
Beta hemólisis
V
-
-
V
Microscopía
• Bacilos
Gram positivos positiva • Metabolismo fermentador • Lipofilismo negativo • Pigmento negativo • Catalasa
Listeria spp.
L. grayi
L. innocua
L. ivanovii
L. ivanovii subesp. londoniensis
L. monocytogenes
L. seeligeri
L. welshimeri
2. TABLA 2. Diferenciación fenotípica de especies del género Listeria
-
-
++
++
+
+
-
-
-
+
+
+ -/+
+ -
-
+ V -
V +
+ +
+ +
+ +
V + + No determinado No determinado
-
-
-
-
-
No determinado No determinado
Específico
4ab 6a 6b
5
5
1/2a,1/2b,1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7
1/2a, 1/2b 1/2c, 4b 4d, 6b
1/2b, 4c 6a, 6b
-
-
+
?
+
-
-
No patógeno
Suelo, alimento, Heces. Patógeno animal
Características
Hemólisis beta Prueba de CAMP S. aureus R. equi Fermentación de: Manitol L-ramnosa D-Xilosa Hidrólisis de hipurato Reducción de nitratos
Serotipo
Patogenicidad murina Ecología
No patógeno
Suelo, alimento, heces. Patógeno No patógeno humano y animal
No patógeno
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Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
SECCIÓN IV
1. PROTOCOLO PCR-MULTIPLEX PARA IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS DE Listeria monocytogenes
Consideraciones de bioseguridad •
Consideraciones generales para patógenos clase II.
•
Utilizar cabina de bioseguridad para prácticas microbiológicas con potencial formación de aerosoles.
•
Utilizar siempre guantes
•
La presencia de mujeres embarazadas e individuos potencialmente inmunodeprimidos debe estar absolutamente prohibida en áreas donde se manipule Listeria monocytogenes
1.2 Preparación de ADN templado
1.2.1 Materiales • • • • • • • •
Bolsas rojas para descarte de material patológico Bloque térmico 100 ºC Gradilla para tubo eppendorf Guantes, guardapolvo Microcentrífuga Pipeta y tips para preparación de templado Tips con filtro: 100 μl, 200 μl Tubos eppendorf estériles de 1.5 ml
1.2.2 Reactivos • •
Agua tridestilada estéril Buffer lisis para PCR
1.2.3 Procedimiento • • • • • • •
Sembrar la cepa en agar nutritivo o agar sangre en reaislamiento para obtener colonias aisladas Suspender con ansa 3 ó 4 colonias en un tubo eppendorf de 1.5 ml estéril con 50 μl de buffer lisis para PCR Calentar a 99 ºC en bloque térmico durante 15 minutos Dejar enfriar a temperatura ambiente y agregar 100 μl de agua tridestilada estéril Centrifugar a máxima velocidad durante 1 minuto Utilizar el sobrenadante como templado Guardar en freezer de -20 ºC
NOTA: Descartar material de plástico en bolsa roja
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Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
1.3 PCR 1.3.1 Materiales • • • • • • • • • • • • • •
Bolsas rojas para descarte de material patológico Cuba de electroforesis y fuente de poder Gradillas para tubo eppendorf Gradilla refrigerada para tubos de PCR Guantes, guardapolvo Hielo Kit de pipetas para PCR. Rangos: 200-1000 μl, 20-200 μl, 5-40 μl, 0.5-10 μl Pipeta y tips para siembra de geles Pipeta y tips para siembra de templado Termociclador Tips con filtro: 10μl, 100 μl, 200 μl, 1000 μl Tubos eppendorf estériles de 1.5 ml Tubos para PCR 0.2 ml estériles Sistema de documentación de geles: Software Gel Doc
1.3.2 Reactivos • • • • • •
Agarosa para biología molecular Agua tridestilada estéril Buffer de corrida 6X Buffer TAE 1X Marcadores de peso molecular Oligonucleótidos lmo0737
For: 5´AGGGCTTCAAGGACTTACCC3´ Rev: 5´ACGATTTCTGCTTGCCATTC3´
lmo1118
For: 5´AGGGGTCTTAAATCCTGGAA3´ Rev: 5´CGGCTTGTTCGGCATACTTA3´
ORF2819
For: 5´AGCAAAATGCCAAAACTCGT3´ Rev: 5´CATCACTAAAGCCTCCCATTG3´
ORF2110
For: 5´AGTGGACAATTGATTGGTGAA3´ Rev: 5´CATCCATCCCTTACTTTGGAC3´
For: 5´GCTGAAGAGATTGCGAAAGAAG3´ Rev: 5´CAAAGAAACCTTGGATTTGCGG3´ Reactivos para PCR (dNTPS, Taq polimerasa, buffer polimerasa y MgCl2) Solución de bromuro de etidio Prs
• •
1.3.3 Áreas de trabajo Estadío PCR
Área de trabajo
Preparación mezcla de reacción
Área 1
Siembra de templado
Área 2
Ciclado
Área 3
Electroforesis
Área 3
Teñido geles
Área 4
Documentación geles
Área 4
Consideraciones generales:
Trabajar siempre con guantes. Cambiar de guantes al cambiar de área de trabajo. 22
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
1.3.4 Procedimiento Realizar la PCR según el siguiente protocolo Reactivos
1 reacción
Agua tridestilada estéril
35,3 μl
Buffer 10X
5 μl
MgCl2 50mM
1.5 μl
dNTPs (2,5mM)
1 μl
Oligonucleótidos
5 μl
Taq 5U/ul
0,2 μl
ADN templado
2 μl
VOLUMEN TOTAL
50 μl
1.3.5 Preparación de mezcla de reactivos para PCR (mezcla de reacción) •
Debe realizarse en el área establecida para dicho propósito (Área 1)
•
Utilizar pipetas designadas para PCR exclusivamente
•
Calcular volúmenes de reactivos según el número de muestras
•
Añadir dos tubos extra para los controles. Control de contaminación: tubo con todos los reactivos reemplazando el volumen de ADN templado por agua tridestilada estéril. Control positivo: utilizar como templado una muestra que haya arrojado un resultado positivo previamente
•
Descongelar a temperatura ambiente, durante 15-20 minutos, todos los reactivos excepto la enzima Taq polimerasa
•
Retirar la Taq polimerasa del freezer en el momento de realizar la mezcla de reacción y mantenerla en hielo
•
Realizar la mezcla de reacción en tubo eppendorf estéril de 1.5 ml según protocolo de reacción
•
Agregar la Taq polimerasa al final
•
Rotular y colocar los tubos de PCR en gradilla refrigerada
•
Fraccionar 48 μl en cada tubo
1.4 Siembra del templado •
Trabajar en Área 2
•
Utilizar pipeta y tips exclusivos para siembra de ADN templado
•
Registrar en planillas de PCR el número de muestras y detalle de las mismas
1.5 Ciclado Cargar en el termociclador el siguiente programa de amplificación Número de ciclos 1 ciclo
35 ciclos
1 ciclo
Estadío
Temperatura
Tiempo
Desnaturalización
94 ºC
3 minutos
Desnaturalización
94 ºC
40 segundos
Annealing
53 ºC
1.15 minutos
Extensión
72 ºC
1.15 minutos
Extensión
72 ºC
7 minutos 23
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
1.6 Electroforesis • • • • • •
Preparar un gel de agarosa al 2% en buffer TAE 1X Agregar 10 μl de buffer de corrida 6X a cada muestra y sembrar 10 μl por calle Sembrar 6 μl de marcador de peso molecular 100 pares de bases (5 μl de marcador + 1 μl buffer de corrida 6X) Realizar electroforesis a 100 voltios durante 40 minutos Teñir el gel en solución de bromuro de etidio durante 30 minutos Documentar resultado
1.7 Precauciones generales • • • •
Utilizar guantes en todos los pasos, inclusive para retirar los tubos del termociclador una vez finalizado el ciclado Descartar el material de plástico (tips, eppendorf), en bolsa roja Manipular con cuidado el gel para ser teñido, evitando salpicaduras de la solución de bromuro de etidio. Utilizar siempre guardapolvo y guantes Una vez documentado, descartar el gel en bolsa roja
1.8 Interpretación de los resultados • •
Se pueden obtener 5 perfiles de bandas diferentes: P-1/2a, P-1/2b, P-1/2c, P-4b y P-list (ver figura 1) Para las cepas que no se obtengan fragmentos de amplificación, repetir una vez mas desde el paso 1
1.9 Reactivos y soluciones 1. Agua tridestilada estéril Autoclavar agua tridestilada en frascos o botellas con tapa a rosa de 100ml y 50 ml 2. Bromuro de etidio. Solución stock (10mg/ml) Agregar 1 g de bromuro de etidio a 100 ml de agua destilada. Agitar con agitador magnético durante varias horas para asegurarse que el colorante se haya disuelto. Envolver el recipiente en papel metálico o transferir la solución a un frasco color caramelo y mantener a temperatura ambiente NOTA:
El bromuro de etidio es un mutágeno poderoso y es moderadamente tóxico. Deben utilizarse guantes, máscara o barbijo, cuando se manipula la solución durante las pesadas.
Solución para teñido de geles (1 μg/ml) Solución stock de bromuro de etidio Agua destilada
10 μl 100 ml
Los materiales contaminados con bromuro de etidio deben ser descartados en recipientes debidamente identificados. 3. Decontaminación de soluciones acuosas de bromuro de etidio (Lunn y Sansone 1987) • Agregar 1 gramo de carbón activado por cada 1000 ml de solución de bromuro de etidio a descartar • Mantener 1 hora a temperatura ambiente agitando intermitentemente • Filtrar la solución a través de papel de filtro Whatman Nº1 • Descartar el filtrado • Sellar el filtro con carbón activado, colocar en bolsa plástica y descartar en bolsa de residuos patológicos Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2nd edition. Sambrook, Fritsch and Maniatis 4. Buffer de corrida (Solución 6X) El propósito del buffer de corrida es aumentar la densidad de la muestra para facilitar la carga de ADN en la calle del gel, agregar color a la muestra simplificando el proceso de carga y además posee colorantes que migran en un campo eléctrico hacia el ánodo a velocidades predecibles. El azul de bromofenol migra a través de un gel de agarosa aproximadamente 2,2 veces más rápido que el cianol xileno, independientemente de la concentración de agarosa. Azul de bromofenol Cianol xileno Glicerol Agua estéril
0.25 g 0.25 g 30 ml 70 ml
Fraccionar en frascos color caramelo y almacenar a 4 ºC 24
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
5. Buffer lisis para PCR SDS 10% 2.5 ml NaOH 1N 5.0 ml Agua tridestilada estéril 100 ml Preparar y almacenar a temperatura ambiente en frasco estéril con tapa a rosca 6. Buffer Tris acetato (TAE) Solución madre 50X (Disponible comercialmente) Tris base 242 g Ácido acético glacial 57.1 g EDTA 0.5M (pH 8) 100 ml Solución de trabajo TAE 50X 10 ml Agua tridestilada estéril 500 ml 7. Set de dNTPs (solución 10mM para 1 ml) dATP dCTP dGTP dTTP Agua tridestilada
100 ul 100 ul 100 ul 100 ul 600 ul
8. Oligonucleótidos. (solución stock) lmo0737 R + 63,1 ul TE 1X lmo0737 F + 58,3 ul TE 1X lmo1118 R + 56,2 ul TE 1X lmo1118 F + 61 ul TE 1X ORF2819 R + 49,5 ul TE 1X ORF2819 F + 43,1 ul TE 1X ORF2110 R + 47,6 ul TE 1X ORF2110 F + 55,8 ul TE 1X Prs R + 52,6 ul TE 1X Prs F + 49,1 ul TE 1X Solución de trabajo de oligonucleótidos (dilución 1/10) De la solución stock de cada oligonucleótido hacer una dilución 1/10 con agua tridestilada estéril para preparar la solución de trabajo. Preparación de mezcla de oligonucleótidos (100 ul) lmo0737 R 10 ul lmo0737 F 10 ul lmo1118 R 15 ul lmo1118 F 15 ul ORF2819 R 10 ul ORF2819 F 10 ul ORF2110 R 10 ul ORF2110 F 10 ul Prs R 2 ul Prs F 2 ul Agua tridestilada 6 ul 9. Taq polimerasa (500U) (Disponible comercialmente) Provista con el buffer polimerasa (10X) y el MgCl2 (50mM) 10. Marcador de peso molecular de ADN (Disponible comercialmente) Tamaño de los fragmentos: de 200pb a 1000pb 25
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
Figura 1
Perfil P-1/2a: corresponde a L. monocytogenes serotipo 1/2a y 3a Perfil P-1/2c: corresponde a L. monocytogenes serotipo 1/2c y 3c
Perfil P-4b : corresponde a L. monocytogenes serotipo 4b, 4d y 4e Perfil P-1/2b: corresponde a L. monocytogenes serotipo 1/2b ,3b y 7
Perfil List: corresponde a L. monocytogenes serotipo 4a y 4 c, L. innocua, L. ivanovii, L. welshimeri y L. seeligeri 26
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
SECCIÓN V 1. SEROTIPIFICACIÓN CON ANTISUEROS 1.2 Principios de la reacción de aglutinación Los microorganismos aislados convencionalmente y confirmados por caracterización bioquímica como Listeria monocytogenes, pueden ser serotipificados utilizando antisueros Cuando un antisuero específico es agregado a una suspensión celular, ocurre una reacción antígeno-anticuerpo produciendo una reacción positiva posible de ver a ojo desnudo. 1.3 Procedimiento 1.3.1 Método de aglutinación en portaobjeto para la determinación del antígeno de superficie polivalente (O) • • • • •
Sembrar una placa de agar infusión cerebro corazón, incubar 18-24 horas Preparar suspensión celular en cloruro de sodio 0.2% a partir de la placa con una concentración final de 10 mg/ml Calentar la suspensión a 121º C durante 30 minutos Centrifugar a 3.000 r.p.m. durante 20 minutos Volcar el sobrenadante y resuspender el precipitado con pequeñas cantidades de cloruro de sodio 0.2%
1.3.2 Prueba de aglutinación •
En un portaobjeto limpio marcar los bordes con marcador para vidrio para evitar el corrimiento del líquido. Pueden utilizarse vidrios de mayor superficie para más de una aglutinación procediendo de la misma forma que con el portaobjetos.
•
Colocar una gota de antisuero OI/II, una del OV/VI y una gota de solución fisiológica
•
Colocar una ansada de la suspensión celular cerca de cada gota de antisuero y solución fisiológica
•
Homogeneizar bien la suspensión
•
Colocar el portaobjeto o vidrio sobre un fondo oscuro y observar los patrones de aglutinación a ojo desnudo
•
Considerar una aglutinación positiva fuerte cuando aparezca dentro del minuto de realizada la mezcla. Se debe determinar si ocurre o no autoaglutinación entre la solución fisiológica y la suspensión celular.
1.3.3 Prueba de aglutinación en porta objetos utilizando antisueros individuales •
Cuando los aislamientos de L. monocytogenes producen aglutinación positiva con los antisueros polivalentes se debe continuar con los antisueros individuales
1.3.4 Aglutinación positiva para antisuero OI/II •
Para continuar con la serotipificación utilizar antisueros OI y OIV y proceder de igual forma que con los antisueros polivalentes
1.3.5 Aglutinación positiva para antisuero OV/VI •
Para continuar con la serotipificación utilizar antisueros OVI, OVII, OVIII y OIX y proceder de igual forma que con los antisueros polivalentes.
1.3.6 Método en tubo para la determinación del antígeno somático (H) •
Como L. monocytogenes posee solamente de 1 a 4 flagelos, se recomienda aumentar la movilidad, realizando tres pasajes del cultivo en medio infusión cerebro corazón semisólido con tubos de Craigie´s, partiendo de un cultivo fresco en medio líquido infusión cerebro corazón
•
La suspensión celular utilizada para la determinación se prepara en medio infusión cerebro corazón incubado a 30º C durante toda la noche, agregando cantidades iguales de suspensión celular y solución fisiológica con formalina al 1% v/v
•
Colocar dos gotas de cada antisuero somático en diferentes tubos y agregar 0.5 ml de la suspensión celular en cada uno
•
Agitar los tubos e incubar en baño termostatizado (50 - 52º C), durante una hora.
•
Observa si ocurre o no aglutinación. Evitar agitar los tubos durante la observación, ya que la aglutinación puede romperse fácilmente
•
Considerar una aglutinación visible a ojo desnudo como positiva 27
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
1.4 Determinación de serotipos El serotipo de los aislamientos de L. monocytogenes será determinado de acuerdo a la siguiente tabla
Serotipo
Antígeno O
Antígeno H
1/2 a
I, II, (III)
AB
1/2 b
I, II, (III)
ABC
1/2 c
I, II, (III)
BD
3a
II, (III), IV
AB
3b
II, (III), IV, (XII), (XIII)
ABC
3c
II, (III), IV, (XII), (XIII)
BD
4a
(III), (V), VII, IX
ABC
4 ab
(III), V, VI, VII, IX, X
ABC
4b
(III), V, VI
ABC
4c
(III), V, VII
ABC
4d
(III), (V), VI, VIII
ABC
4e
(III), V, VI, (VIII), (IX)
ABC
7
(III), XII, XIII
ABC
1.5 Precauciones •
Todos los cultivos e instrumentos tales como vidrios o tubos utilizados en estas pruebas deben ser esterilizados con una solución de hipoclorito de sodio al 0,1% por más de una hora o autoclavados a 121º C durante 20 minutos.
•
Estas pruebas de serotipificación deben ser utilizadas solamente para cepas de L. monocytogenes aisladas de alimentos.
•
No colocar los antisueros en el freezer, esto puede producir precipitaciones.
•
Estos reactivos contienen 0.08% de azida de sodio como conservante.
28
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
SECCIÓN VI MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 1. CALDO BASE FRASER (medio comercial) 1.1 Fundamentos:
El caldo base Fraser con el agregado de suplementos es recomendado para el enriquecimiento, aislamiento y cultivo de Listeria monocytogenes a partir de alimentos y especimenes ambientales. Proteosa peptona, hidrolizado enzimático de caseína, extracto de carne, extracto de levadura son nutrientes esenciales para el desarrollo. Cloruro de litio inhibe el desarrollo de enterococos. Todas las especies de Listeria hidrolizan esculina a esculitina que, junto con los iones férricos, forman un complejo marrón oscuro a negro. Citrato férrico amónico favorece el desarrollo de L. monocytogenes.
1.2 Ingredientes:
Proteosa peptona .......................................................5 g Hidrolizado enzimático de caseína............................ 5 g Extracto de levadura ................................................. 5 g Extracto de carne ...................................................... 5 g Cloruro de sodio .......................................................20 g Cloruro de litio ........................................................... 3 g Fosfato disódico .......................................................12 g Fosfato monopotásico ...........................................1.35 g Esculina ..................................................................... 1 g Citrato férrico amónico ............................................0.5 g Agua destilada......................................................1000 ml pH final 7.2 ± 0.2 a 25 ºC
1.3 Preparación:
Suspender 57.85 g de medio deshidratado en 990 ml de agua destilada. Calentar a ebullición hasta disolución completa. Esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos. Enfriar a 45-50 °C y agregar estérilmente el contenido de un vial rehidratado de suplemento (F2674). El suplemento de enriquecimiento Fraser contiene 25 mg de clorhidrato de acriflavina y 4 mg de ácido nalidíxico. Mezclar y fraccionar convenientemente. Mantener el medio preparado a 8 ºC protegido de la luz directa.
Nota:
Cloruro de litio es nocivo. Evite contacto corporal e inhalación de vapores. En caso de contacto con la piel, lavar con agua inmediatamente.
1.4 Características:
Medio deshidratado: homogéneo, color amarillo. Mantener en lugar seco de 2 a 25 ºC Medio preparado: amarillo, con fina precipitación. Luego del agregado del suplemento, la solución es amarillo fluorescente con ligera precipitación.
1.5 Control de calidad:
Positivo: Negativo:
desarrollo positivo, esculina positiva (con ennegrecimiento) Listeria monocytogenes ATCC 19111 desarrollo negativo, esculina negativa (sin ennegrecimiento) Enterococcus faecalis ATCC 29212; Escherichia coli ATCC 25922; Staphylococcus aureus ATCC 25923
2. CALDO CEREBRO CORAZÓN (BHI) 2.1 Ingredientes:
Extracto de cerebro de ternera..............................12.5 g Extracto de corazón de buey..................................... 5 g Triptosa.....................................................................10 g Cloruro de sodio ........................................................ 5 g Fosfato disódico ..................................................... 2.5 g Agua destilada......................................................1000 ml pH final 7,4 ± 0.2 a 25 ºC
2.2 Preparación del medio: Disolver por calentamiento y agitación. Fraccionar en tubos. Esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos. 2.3 Control de calidad:
Controlar la esterilidad del medio
29
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
3. CALDO DE ENRIQUECIMIENTO (Medio BLEB) 3.1 Medio base 3.1.1 Ingredientes:
3.1.2 Preparación: 3.2 Suplemento 1 3.2.1 Ingredientes: 3.2.2 Preparación: 3.3 Suplemento 2 3.3.1 Ingredientes: 3.3.2 Preparación: 3.4 Suplemento 3 3.4.1 Ingredientes:
3.4.2 Preparación:
Caldo tripteína soja ................................................. 30 g Extracto de levadura ................................................ 6 g Agua destilada .................................................... 1000 ml Agregar los componentes deshidratados al agua destilada y calentar suavemente hasta su completa disolución. Ajustar pH ± 7,3. Esterilizar 15 minutos a 121 ºC. Acriflavina HCl ........................................................ 23 mg Agua destilada......................................................... 10 ml Disolver acriflavina HCl en agua destilada. Esterilizar por filtración. Acido nalidíxico (sal sódica) .................................... 46 mg Solución de NaOH 0.05 M ...................................... 10 ml Disolver el ácido nalidíxico en la solución de NaOH 0.05 M. Esterilizar por filtración. Cicloheximida ......................................................57.5 mg Etanol 96% v/v .......................................................... 4 ml Agua destilada .......................................................... 6 ml Disolver la cicloheximida en mezcla etanol / agua. Esterilizar por filtración.
3.5 Preparación del medio completo La base y los suplementos deben ser guardados separadamente, protegidos de la luz y refrigerados entre 2 y 5 ºC. Para completar la preparación del medio, agregar a 225 ml del medio base: Suplemento 1 = 1 ml; Suplemento 2 = 2 ml; Suplemento 3 = 2 ml Pueden fraccionarse múltiplos de 1 ml, 2 ml y 225 ml para el uso apropiado. 3.6 Control de calidad:
Controlar la esterilidad de las soluciones. Control de desarrollo: Incubar 24-48 horas a 30-37°C Positivo: Listeria monocytogenes ATCC 19111 / Listeria grayii ATCC19120 Negativo: Escherichia coli ATCC 25922 / Staphylococcus aureus ATCC 6538P
4. CALDO LISTERIA UVM (medio comercial) Caldo selectivo de enriquecimiento 4.1 Fundamentos:
Caldo selectivo de enriquecimiento LISTERIA UVM es preparado según la fórmula descripta por Donnelly y Baigent y por MacCalin y Lee. Es utilizado para el procedimiento de enriquecimiento en dos pasos para el aislamiento de Listeria a partir de muestras de productos cárnicos.
4.2 Ingredientes:
Extracto de carne .......................................................5 g Cloruro de sodio ...................................................... 20 g Fosfato dibásico de sodio........................................ 12 g Triptosa.................................................................... 10 g Extracto de levadura ..................................................5 g Fosfato monobásico de potasio ............................1.35 g Esculina ..................................................................... 1 g Acido nalidíxico......................................................0.02 g Acriflavina HCl .....................................................0.012 g Agua destilada......................................................1000 ml
4.3 Preparación del medio: Suspender 54.4 g del medio deshidratado en 1000 ml de agua destilada. Calentar hasta disolución completa. Fraccionar. Esterilizar a 121 ºC durante 10 minutos. 4.4 Características del medio: Medio deshidratado: homogéneo, color beige Medio preparado: suavemente opalescente, con fina precipitación, color ámbar 4.5 Control de calidad:
Control positivo: Listeria monocytogenes ATCC 19111; ATCC 13932 Control negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923 30
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
5. CALDO NITRATO (Reducción de nitrato) 5.1 Fundamentos:
Algunos microorganismos utilizan el nitrato para obtención de energía reduciéndolo a nitrito o nitrógeno gas. Esta prueba determina la capacidad de un microorganismo de reducir nitrato a nitrito y/o nitrógeno gas. La presencia de nitrito en el medio se revela con alfa-naftilamina y ácido sulfanílico, formándose un compuesto de color rojo. La reducción de nitrito a nitrógeno molecular puede observarse por la producción de gas en el medio o por el agregado de zinc. Para esta prueba pueden emplearse medios líquidos y medios semisólidos
5.2 Ingredientes:
Peptona ................................................................... 20 g Nitrato de potasio ...................................................... 2 g
Agua destilada .................................................... 1000 ml 5.2.1 Para gérmenes exigentes Caldo infusión corazón............................................ 25 g Nitrato de potasio .......................................................2 g Agua destilada .....................................................1000 ml 5.3 Preparación del medio: En ambos casos ajustar pH a 7.0. Distribuir aproximadamente 4 ml en tubos 16/150 con campanitas de Durham invertidas. Autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos. Controlar que no queden burbujas dentro de las campanitas. 5.4 Realización de la prueba: Inocular a partir de cultivo de 24 horas. Incubar 48 horas a 35 ºC 5.5 Lectura e interpretación: Observar las campanitas para detectar presencia de gas. Sobre el caldo determinar la presencia de nitrito agregando 0.25 ml de reactivo A y 0.25 ml de reactivo B 5.6 Reactivos para la determinación de nitrito SOLUCION A Acido sulfanílico...............8 g Acido acético glacial….300 g Agua destilada……….1000 ml
SOLUCION B Dimetil-α-naftilamina..........5 g Acido acético glacial.......300 g Agua destilada .............1000 ml
5.7 Interpretación de resultados: Reducción de nitrato a nitrito positiva (sin producción de gas): cultivo + reactivos → rojo Reducción de nitrato a nitrito positiva (con producción de gas): cultivo + reactivos → incoloro + zinc → incoloro Reducción de nitrato a nitrito negativa: cultivo + reactivos → incoloro + zinc → rojo 5.8 Control de calidad:
Reducción de nitrato positiva con producción de gas: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Reducción de nitrato positiva sin producción de gas: Escherichia coli ATCC 25922 Reducción de nitrato a nitrito negativa: Enterococcus faecalis ATCC 29212
6. COLORACIÓN DE GRAM 6.1 Realización de la prueba: A partir de una colonia típica efectuar un extendido sobre portaobjeto. Dejar secar y fijar suavemente por calor. Teñir por el método de Gram 6.2 Lectura e interpretación: Observar al microscopio con objetivo de inmersión. Listeria spp. son cocobacilos o bacilos pequeños Gram positivos
31
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
7. HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN 7.1 Fundamentos:
Este medio evalúa la capacidad de un microorganismo de hidrolizar almidón por acción enzimática. Se utilizan placas con medio de cultivo que contiene almidón al 0,1%. Utiliza lugol como revelador (solución de yodo utilizada en coloración de Gram)
7.2 Ingredientes:
Agar-agar................................................................. 20 g Extracto de carne .......................................................3 g Cloruro de sodio .........................................................5 g Almidón soluble ....................................................... 10 g Agua destilada......................................................1000 ml Como medio basal pueden utilizar medios comerciales (Agar infusión corazón, agar tripteína soya, agar Base Sangre, otros).
7.3 Preparación del medio: Solución A: en 500 ml de agua destilada disolver el agar por calentamiento Solución B: disolver el almidón en 250 ml de agua destilada, calentando suavemente. No calentar en exceso debido a que el sobrecalentamiento puede hidrolizar el almidón. Enfriar la solución A a 60 ºC. Mezclar la solución A y la solución B y completar con el agua destilada restante. Ajustar pH a 7.2 – 7.5. Fraccionar volúmenes adecuados para plaquear. Esterilizar 15 minutos a 121 ºC. Plaquear. 7.4 Reactivo revelador:
Solución de Lugol Cristales de yodo....................................................... 5 g Ioduro de potasio..................................................... 10 g Agua destilada........................................................100 ml
7.4.1 Preparación:
Solución madre: Disolver el ioduro de potasio en agua destilada. Agregar los cristales lentamente y agitar hasta disolución. Filtrar y almacenar en frasco color caramelo. Solución de trabajo: Diluir la solución madre 1:5 con agua destilada. Fraccionar en frascos color caramelo. Preparar solución fresca cada 3 semanas.
7.5 Realización de la prueba: Inocular la superficie del medio en spot o en línea con la cepa a estudiar. Pueden probarse varias cepas en una misma placa. Incubar a 35 ºC durante 48 horas. 7.6 Lectura e interpretación: Inundar la placa con lugol. La placa vira al color azul por la reacción del lugol con el almidón. Una zona clara alrededor de la siembra indica que el microorganismo ha hidrolizado el almidón. Reacción positiva: zona clara alrededor del cultivo 7.7 Control de calidad:
Control positivo: Bacillus cereus ATCC 11778 Control negativo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
8. HIDRÓLISIS DE HIPURATO 8.1 Fundamentos:
Determina la capacidad de algunos microorganismos de hidrolizar hipurato sódico produciendo ácido benzoico, manifestándose al añadir solución de cloruro férrico
8.2 Ingredientes:
Caldo infusión corazón............................................ 25 g Hipurato de sodio .................................................... 10 g Agua destilada......................................................1000 ml
8.3 Preparación del medio: Disolver el caldo en agua destilada. Agregar el hipurato de sodio y disolver por calentamiento. Ajustar pH a 7.4. Fraccionar 3 ml por tubo. Esterilizar a 121º C durante 15 minutos. Antes del uso o de la conservación, marcar el nivel del medio en cada tubo con marcador para controlar la posible evaporación. 8.4 Reactivo revelador: Cloruro férrico 12% 8.4.1 Ingredientes:
Cloruro férrico x 6 H2O ............................................ 12 g Acido clorhídrico concentrado .................................2.5 ml Agua destilada........................................................ 100 ml
8.4.2 Preparación:
A 75 ml del agua destilada agregar 2.5 ml de ácido clorhídrico por las paredes del recipiente. Luego adicionar 12 g de cloruro férrico. Disolver agitando suavemente. Llevar a 100 ml con agua destilada estéril. La solución debe ser de color anaranjado.
8.5 Realización de la prueba: Inocular el medio con 1 ó 2 colonias de cultivo de 24 – 48 horas o de caldo denso. Sembrar control negativo con Streptococcus grupo A ó un tubo sin inocular y control positivo con cepa conocida de Streptococcus agalactiae. 32
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
8.6 Lectura e interpretación: Incubar a 35 ºC durante 7 días (10-14 días para cepas de lento desarrollo). Incubar controles a igual temperatura. Antes de agregar el reactivo, llevar a volumen el caldo hasta la marca con agua destilada estéril. Si el cultivo es densamente turbio, centrifugar y usar el sobrenadante. Estérilmente, transferir 0.8 ml del sobrenadante a tubos pequeños. Agregar 0.2 ml de cloruro férrico. Agitar suavemente. Esperar 10-15 minutos, agitando ocasionalmente. La aparición de un precipitado que permanece luego de 10 minutos de leída la reacción, indica resultado positivo. Si el precipitado se redisuelve y no se mantiene luego de 10 minutos, la reacción debe ser considerada negativa. Una alternativa metodológica más rápida es realizar una suspensión densa del cultivo en 0,4 ml de solución acuosa al 1% de hipurato de sodio e incubar a 35 ºC durante 2 horas. El producto final de la hidrólisis del hipurato es glicina y se detecta agregando 5 gotas de ninhidrina (ninhidrina 3.5 g, acetona 50 ml, 1-butanol 50 ml), incubar nuevamente 10 minutos. Reacción positiva: desarrollo de color púrpura intenso 8.7 Control de calidad:
Control positivo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Control negativo: Streptococcus agalactiae ATCC 13813
9. MEDIO BASE DE ANDRADE (Utilización de hidratos de carbono) 9.1 Ingredientes:
9.2 Indicador de Andrade 9.2.1 Ingredientes:
9.2.2 Preparación:
9.3 Hidratos de carbono: 9.3.1 Ingredientes: 9.3.2 Preparación:
Proteosa peptona .................................................... 10 g Extracto de carne ...................................................... 3 g Cloruro de sodio ........................................................ 5 g Indicador de Andrade .............................................. 10 ml Agua destilada......................................................1000 ml Proteosa peptona .................................................... 10 g Fucsina ácida ..........................................................0.5 g Agua destilada........................................................100 ml Hidróxido de sodio 1N ............................................. 16 ml Disolver la fucsina ácida en agua destilada, luego agregar hidróxido de sodio 1N. Si luego de algunas horas la fucsina ácida no está lo suficientemente decolorada agregar 1 ó 2 ml más de hidróxido de sodio 1N. El contenido de colorante de los diferentes productos o lotes de fucsina ácida varía ampliamente y la cantidad de hidróxido de sodio 1N necesario para cada producto debe especificarse en el rótulo. El reactivo mejora al envejecer por lo tanto es conveniente preparar cantidades suficientes para almacenar. Se recomienda agregar al medio base esterilizado y enfriado a 60 ºC soluciones estériles de hidratos de carbono. Hidrato de carbono .................................................. 10 g Agua destilada .......................................................100 ml Preparar solución al 10% de cada hidrato de carbono con agua destilada y tubo estéril. Los hidratos de carbono que pueden ser autoclavados: adonita, dextrosa, dulcita, inositol, manita, salicina. Los medios que contengan glicerol deben autoclavarse 10 minutos a 121 ºC. Esterilizar en autoclave a 121º C durante 15 minutos Los hidratos de carbono que no deben ser autoclavados: arabinosa, celobiosa, lactosa, ramnosa, sacarosa, xilosa. Estos deben ser esterilizados por filtración. Filtrar la solución en forma estéril, a través de una membrana filtrante de 0.22 µ. Realizar control de esterilidad de la solución filtrada en caldo nutritivo.
9.4 Preparación del medio: Mezclar los ingredientes del medio base, disolver mediante calentamiento suave Ajustar el pH 7,1 – 7,2 luego de agregar el indicador. Fraccionar en volúmenes de 9 ml en tubos de vidrio con tapa a rosca. Esterilizar 15 minutos a 121 ºC. Agregar 1 ml de la solución de hidrato de carbono a 9 ml del medio base estéril. Si se preparan volúmenes pequeños, mantener la relación. Concentración final 1% 9.5 Realización de la prueba: Inocular al medio completo una ansada ó 0,1 ml de un cultivo líquido Incubar durante 24-48 horas a 35 ºC 9.6 Lectura e interpretación: Reacción positiva (acidificación): viraje al rosado Reacción negativa: medio sin cambio. Dado que algunas cepas de Listeria fermentan los hidratos de carbono lentamente, si el perfil de fermentación no es aceptable luego de 48 horas, los medios deben ser incubados durante 48 horas más. 9.7 Control de calidad:
Controlar la esterilidad de las soluciones 33
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
10. MEDIO BICAPA SANGRE DE CABALLO (HL) 10.1 Capa base 10.1.1 Ingredientes:
Agar base Columbia .............................................1000 ml
10.1.2 Preparación del medio: Preparar el medio de acuerdo a las especificaciones. Esterilizar 15 minutos a 121 ºC. Colocar 10 ml por placa de Petri de 100 mm de diámetro. Dejar solidificar. 10.2 Capa superior 10.2.1 Preparación del medio: Añadir 4 ml de sangre estéril de caballo a 100 ml del agar base enfriado a 46 ºC. Mezclar para homogeneizar. Agregar rápidamente 5 a 6 ml en la parte superior de la capa base, inclinando las placas para difundir uniformemente la capa superior. Las placas refrigeradas pueden almacenarse hasta 2 semanas. El pH final es 7,2 ± 0,2 10.3 Control de calidad:
Controlar la esterilidad del medio
11. MEDIO LMP AGAR BASE (selectivo para Listeria) 11.1 Fundamentos:
Las vitaminas y minerales, peptonas y extracto de carne proporcionan nitrógeno, el cloruro de sodio mantiene el equilibrio del medio. La glicina se utiliza para mejorar la recuperación de Listeria spp.. El cloruro de litio y feniletanol se incorporan para la inhibición de contaminantes. El suplemento selectivo Listeria se añade luego de la esterilización para inhibir estafilococos, bacilos y especies de Proteus.
11.2 Ingredientes:
Digerido de caseína pancreática............................... 5 g Proteosa peptona Nº 3 .............................................. 5 g Extracto de carne ...................................................... 3 g Cloruro de sodio ........................................................ 5 g Cloruro de litio ........................................................... 5 g Glicina anhídrido.......................................................10 g Feniletanol ...............................................................2.5 g Agar ..........................................................................15 g Agua destilada..................................................... 1000 ml pH 7.3 a 25 ºC
11.3 Suplemento selectivo (Vial por 1 ml) 11.3.1 Ingredientes: Moxalactam ............................................................0.01g 11.3.2 Preparación:
Reconstituir cada vial liofilizado agregando estérilmente 2 ml de agua destilada estéril. Invertir varias veces el vial para homogeneizar la solución.
11.4 Preparación del medio: Suspender 50.5 g del medio deshidratado en agua destilada y calentar hasta disolución. Esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos. Enfriar a 50 ºC y agregar estérilmente el suplemento. Distribuir en placas de Petri y solidificar. 11.5 Características del medio: Medio deshidratado homogéneo y claro. En solución medio color ámbar ligeramente opalescente. Suplemento liofilizado blanco o amarillento, seco. En solución limpio, amarillo pálido. 11.6 Realización de la prueba:
Inocular e incubar las placas a 35 - 37 ºC durante 18 – 48 horas
11.7 Lectura e interpretación: Observar las colonias bajo luz de transmisión oblicua. Colonias características de Listeria muestran un color gris a azul con una base de apariencia cristalina 11.8 Control de calidad:
Listeria monocytogenes ATCC 19114: Buen desarrollo Bacillus subtilis ATCC 6633: Inhibición parcial Enterococcus faecalis ATCC 29212: Inhibición completa Escherichia coli ATCC 25922: Inhibición completa Staphylococcus aureus ATCC 25923: Inhibición completa
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12. MEDIO OXFORD MODIFICADO (selectivo para Listeria) 12.1 Fundamentos:
12.2 Agar base 12.2.1 Ingredientes:
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial, contiene nutrientes necesarios para el desarrollo de Listeria spp. Es diferencial para Listeria spp. debido a que el producto de la hidrólisis de esculina en presencia de iones férricos forma un compuesto fenólico de color negro. La selectividad para Listeria spp., se obtiene por el agregado del suplemento selectivo para Agar base Oxford modificado, debido a que contiene antibióticos que inhiben total o parcialmente el desarrollo de la flora acompañante presente en la muestra.
Agar base Columbia ................................................ 39 g Esculina ..................................................................... 1 g Citrato férrico de amonio ........................................ 0.5 g Cloruro de litio ......................................................... 15 g Agua destilada..................................................... 1000 ml
12.3 Suplemento (para 500 ml de medio) 12.3.1 Ingredientes: Cicloheximida .........................................................200 mg Sulfato de colistina .................................................. 10 mg Acriflavina ................................................................2.5 mg Cefotetan ....................................................................1 mg Fosfomicina ................................................................5 mg Etanol 96% v/v........................................................ 2.5 ml Agua destilada........................................................ 2.5 ml 12.3.2 Preparación:
Disolver ingredientes sólidos en la mezcla de etanol / agua. Esterilizar por filtración.
12.4 Preparación del medio: Suspender los ingredientes en agua destilada y calentar hasta disolución. Esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos. Enfriar a 50 ºC y agregar estérilmente los suplementos. Ajustar pH ±7.0. Distribuir en placas de Petri (15 ml aproximadamente) y solidificar 12.5 Realización de la prueba: Inocular e incubar las placas a 35 - 37 ºC durante 18 – 48 horas 12.6 Lectura e interpretación: Las colonias características de Listeria spp. se muestran como pequeñas, grisáceas, rodeadas de halo negro. A las 48 horas se puede observar colonias con reflejos verdosos y centro deprimido
MOX positivo
12.7 Control de calidad:
MOX negativo
Controlar la esterilidad del medio
Listeria monocytogenes ATCC 19114: Buen desarrollo. Colonias pequeñas, oscuras, con halo oscuro Listeria ivanovii ATCC 19119: Buen desarrollo. Colonias pequeñas, oscuras, con halo oscuro Escherichia coli ATCC 25922: Desarrollo inhibido Enterococcus faecalis ATCC 29212: Desarrollo inhibido Proteus mirabilis ATCC 43071: Desarrollo inhibido
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13. MEDIO PALCAM (selectivo para Listeria) 13.1 Fundamentos:
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial que contiene los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano. Es diferencial debido a que Listeria spp. hidroliza esculina que en presencia de iones férricos forma un compuesto fenólico de color negro. Es selectivo para Listeria spp., por el agregado del suplemento selectivo para agar base Palcam que contiene antibióticos que inhiben en forma total o parcial el desarrollo de la flora presente en la muestra y permiten la recuperación de Listeria spp.
13.2 Agar base 13.2.1 Ingredientes:
Agar base Columbia ................................................ 39 g D(-) manitol.............................................................. 10 g Citrato férrico de amonio ........................................ 0.5 g Esculina .................................................................. 0.8 g D(+) glucosa ........................................................... 0.5 g Cloruro de litio ......................................................... 15 g Rojo de fenol .........................................................0.08 g Agua destilada..................................................... 1000 ml 13.3 Suplemento (para 500 ml de medio) 13.3.1 Ingredientes: Agar base Columbia ................................................ 39 g Esculina ......................................................................1 g Citrato férrico de amonio .........................................0.5 g Sulfato de polimixina B...............................................5 mg Ceftazidima.............................................................. 10 mg Acriflavina ............................................................... 2.5 mg Agua destilada........................................................ 2.5 ml 13.4 Preparación del medio: Suspender los ingredientes en agua destilada y calentar hasta disolución. Esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos. Enfriar a 50 ºC y agregar estérilmente el suplemento. Ajustar pH ± 7.2. Distribuir en placas de Petri (15 ml aproximadamente) 13.5 Realización de la prueba: Inocular e incubar las placas a 35 - 37 ºC durante 18 – 48 horas 13.6 Lectura e interpretación: Las colonias típicas de Listeria spp. se observan como verde grisáceas, rodeadas de halo negro y pueden mostrar centro oscuro. A las 48 horas puede observarse colonias con centro deprimido
Palcam positivo
13.7 Control de calidad:
Palcam negativo
Controlar la esterilidad del medio
Listeria monocytogenes ATCC 19112: Muy buen desarrollo. Colonias grises a verdosas con centro y halo negro Staphylococcus aureus ATCC 25923: Desarrollo positivo. Colonias amarillas con halo amarillo Enterococcus faecalis ATCC 29212: Desarrollo positivo. Colonias grises con halo marrón verdoso
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14. MEDIO SIM 14.1 Fundamentos:
14.2 Ingredientes:
Medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. La movilidad se manifiesta por turbidez alrededor de la punción de siembra. El triptofano puede ser oxidado para formar indol. El indol producido se combina con el aldehído del reactivo de Kovac´s o de Erlich, originando un compuesto de color rojo. Los microorganismos productores de sulfhídrico se observan por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2. Tripteína ...................................................................20 g Peptona bacteriológica............................................6.1 g Sulfato de hierro y amonio ......................................0.2 g Tiosulfato de sodio ..................................................0.2 g Agar .........................................................................3.5 g Agua destilada......................................................1000 ml pH final 7.3 ± 0.2
14.3 Preparación del medio: Suspender 30 g de medio deshidratado en 1000 ml de agua destilada. Calentar agitando y hervir durante un minuto. Fraccionar aproximadamente 4 ml por tubo. Esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos. Solidificar en posición vertical 14.4 Realización de la prueba: A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con aguja recta. Se debe inocular el centro del tubo, y la punción debe alcanzar dos tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Realizar la siembra en línea recta. Incubar durante 24 horas, a 35-37 °C. 14.5 Lectura e interpretación: Observar el desarrollo alrededor de la línea de punción. En cultivos positivos se produce una zona de difusión del desarrollo más allá de la línea de siembra. Los cultivos de Listeria spp. son móviles y producen un desarrollo típico en forma de paraguas. Si fuera negativo, proseguir incubando otros 5 días y observar nuevamente 14.6 Control de calidad:
Control positivo: Listeria monocytogenes ATCC 19111; ATCC 13932 Control negativo: Enterococcus faecalis ATCC 29212
15. PRODUCCIÓN DE HEMÓLISIS 15.1 Fundamentos:
Si las características morfo-fisiológicas y la reacción de catalasa indican Listeria spp., inocular placas de agar sangre para determinar la reacción hemolítica.
15.2 Realización de la prueba: El medio utilizado es agar sangre, constituido por un medio básico, adicionado con 5% de sangre desfibrinada de carnero. Secar la superficie del agar antes de su uso. Dibujar un cuadriculado en la base de la placa marcando tantos espacios como cepas a estudiar. Tomar una colonia típica a partir de una placa de TSA / TSYEA, y depositar en forma de toque en cada espacio. Incubar 24-48 horas a 35 - 37°C. 15.3 Lectura e interpretación: En cultivos beta hemolíticos se observa una zona clara e incolora que rodea a la colonia, debido a la destrucción total de los glóbulos rojos. 15.4 Control de calidad:
Controlar la esterilidad del medio
16. PRUEBA DE CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen) 16.1 Fundamentos:
Para esta prueba se utilizan cepas de Staphylococcus aureus y Rhodococcus equi productoras de betalisina. Algunas especies de Listeria producen una proteína extracelular (factor CAMP), la cual actúa sobre los eritrocitos en forma sinérgica con la betalisina. Se pueden emplear placas de agar sangre ovina, pero es preferible usar el método de la doble capa. 16.2 Medio para capa basal * 16.2.1 Ingredientes: Agar base sangre Nº 2 ...........................................240 g Agua destilada...................................................... 1000 ml 16.2.2 Preparación del medio: Disolver la base deshidratada en agua destilada mediante ebullición. Ajustar pH a 7. Transferir a tubos o frascos. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ºC. Enfriar a 45 ºC 16.3 Medio sangre ovina ** 16.3.1 Ingredientes: Medio basal ............................................................ 100 ml Sangre ovina desfibrinada estéril ............................... 7 ml 16.3.2 Preparación del medio: Agregar sangre ovina al medio base estéril y fundido. 37
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
16.3 Medio completo 16.3.1 Preparación del medio: Distribuir 10 ml de medio basal* en placa para forma una capa. Dejar solidificar. Agregar 3 ml del medio sangre ovina**, para formar capa muy fina.
Advertencia:
Si el medio con sangre se agrega a placas de medio basal preparadas anteriormente, es necesario colocarlas previamente en estufa a 36 ºC durante 20 minutos antes de agregar la capa fina con sangre.
16.4 Cultivos patrones:
Staphylococcus aureus NCTC 1803
16.4.1 Mantenimiento:
Cultivar en estrías, incubar a 36 ºC. Subcultivar cada treinta días.
Rhodococcus equi NCTC 1621
16.5 Realización de la prueba: Trazar una línea de Staphylococcus aureus a lo largo de la placa y otra paralela y alejada de Rhodococcus equi, en forma de inóculo fino. De igual manera sembrar perpendicularmente a las cepas patrones los cultivos incógnita que se desean probar, sin tocar la línea del S. aureus ni al R. equi, pero a distancia aproximada de 5 mm. Pueden probarse simultáneamente varias cepas en la misma placa. Si se emplea el método de doble capa, incubar a 36 ºC durante 12-18 horas. Si se hiciera la prueba en monocapa de agar sangre, incubar a igual temperatura durante 24 horas. 16.6 Lectura e interpretación: Reacción positiva con S. aureus: zona de beta-hemólisis estimulada en la intersección de la cepa incógnita. Se observa como una pequeña zona redondeada de hemólisis. Si se observa una zona pequeña con R. equi, se considera negativa. Reacción positiva con R. equi: zona ancha en forma de cabeza de flecha. Ver figura 1
Figura 1: Modelo de inoculación en placa de agar sangre de carnero. Las líneas horizontales representan las estrías de cinco aislamientos. Las líneas verticales representan las estrías de S. aureus (S) y R. equi (R) Las líneas oblicuas indican las regiones de aumento de la hemólisis.
16.7 Control de calidad:
Control positivo: Listeria monocytogenes ATCC 19111; ATCC 13932 Control negativo: Listeria innocua ATCC 33090
16. PRUEBA DE CATALASA Fundamentos de la prueba: Se detecta la presencia de la enzima catalasa utilizando como sustrato peróxido de hidrógeno al 3%. Esta prueba puede ser realizada en portaobjeto o en tubo. No partir de cultivos en medios con sangre, ya que, la enzima catalasa está presente en los eritrocitos y cualquier arrastre del medio puede resultar en falsos positivos Realización de la prueba:
Tomar colonia de cultivo de 18-24 horas y depositarla sobre un porta. Añadir con pipeta una gota de peróxido de hidrógeno al 3%; no homogeneizar el cultivo con el ansa para evitar los falso positivos.
Lectura e interpretación:
Se considera positiva cuando se observan burbujas de gas (02). Las especies de Listeria son catalasa positiva, evidenciada por formación de burbujas de gas.
Control de calidad:
Control positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923 Control negativo: Enterococcus faecalis ATCC 29212
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17. PRUEBA DE MOVILIDAD Fundamentos de la prueba: Existen diferentes técnicas que permiten demostrar la movilidad bacteriana. Listeria se observa en forma de bacilos delgados, cortos, con un movimiento de rotación débil o por tumbos. Cocobacilos o bacilos largos que presenten movimiento rápido de translación, no son Listeria spp.. En medios líquidos Realización de la prueba: A partir de colonias típicas subcultivar en TSB o TSYEB. Incubar a 20 – 25ºC hasta obtener turbidez (8 a 24 horas). Preparar montaje en fresco entre porta y cubreobjeto, con una ansada del cultivo líquido y observar con inmersión en contraste de fases En medios sólidos Ingredientes: Peptona de caseína................................................. 20 g Peptona de carne ....................................................6.1 g Agar ........................................................................3.5 g Agua destilada......................................................1000 ml Preparación del medio:
Disolver ingredientes en agua, calentar suavemente. Ajustar pH 7.3. Fraccionar 5 ml por tubo. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ºC. Dejar solidificar en forma de columna.
Realización de la prueba:
Sembrar con ansa aguja en el centro del medio, introduciendo la aguja hacia el fondo y extraer siguiendo el mismo recorrido de entrada. Incubar a 25 ºC durante 48 horas.
Lectura e interpretación:
Observar desarrollo alrededor de la línea de punción. En cultivos positivos se produce zona de difusión del desarrollo a los lados de la línea de inoculación Los cultivos de Listeria spp. son móviles y producen un desarrollo típico en forma de sombrilla. Si fuera negativo, proseguir incubando otros 5 días y observar nuevamente
Control de calidad:
Control positivo: Listeria monocytogenes ATCC 19111; ATCC 13932 Control negativo: Enterococcus faecalis ATCC 29212
18. TRIPTEÍNA SOJA EXTRACTO DE LEVADURA CALDO (TSYE) Ingredientes:
Caldo tripteína soja.................................................. 30 g Extracto de levadura ................................................. 6 g Agua destilada..................................................... 1000 ml
Preparación del medio:
Suspender los componentes sólidos en agua destilada y calentar hasta disolución. Ajustar el pH a ± 7.3. Fraccionar en tubos con 6 ml de medio de cultivo. Esterilizar los tubos a 121 ºC durante 15 minutos.
Realización de la prueba: Inocular con una colonia aislada Lectura e interpretación:
Incubar a 35 - 37 ºC durante 18-24 horas o hasta desarrollo satisfactorio
Control de calidad:
Controlar la esterilidad del medio. Desarrollo: Listeria monocytogenes ATCC 19111
19. TRIPTEÍNA SOJA EXTRACTO DE LEVADURA AGAR (TSYEA) Para obtener el medio sólido, agregar a la fórmula anterior 12–18 g de agar en el momento de la disolución. Para preparar estrías fraccionar en tubos 6 ml de medio. Para preparar placas distribuir 15 ml de medio.
Realización de la prueba: Inocular con una colonia aislada Lectura e interpretación:
Incubar a 35 - 37 ºC durante 18-24 horas o hasta desarrollo satisfactorio
Control de calidad:
Controlar la esterilidad del medio. Desarrollo: Listeria monocytogenes ATCC 19111
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