MANEJO DEL MICROSCOPIO OLYMPUS CARACTERÍSTICAS DEL MICROSCOPIO OLIMPUS IX81 Objetivos que poseemos actualmente: Objetivo 10x seco se puede utilizar para campo claro Objetivo 20x se puede utilizar para contraste de fases y fluorescencia Objetivo 20x se puede utilizar para campo claro Objetivo 40x de aceite se puede utilizar para contraste de fases, DIC, fluorescencia Objetivo 60x de aceite se puede utilizar para contraste de fases, DIC. Objetivo 100x de aceite se puede utilizar para fluorescencia. Todos sirven para campo claro. Poseemos cámara fotográfica monocromo para fluorescencia HAMAMATSU . Para fluorescencia U-M3DAFITR Set de filtros DAPI / FITC / T.RED Filtros de excitación BP 403/12, BP492/18 y BP 572/23 (para sistema de iluminación MT20). Cubo de filtros de emisión U-MF2 con espejo dicroico y filtro emisor de triple banda para DAPI / FITC/ T.RED.
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El espectro de emisión de la lámpara de fluorescencia de alto vacío es el siguiente:
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ADQUISICION CON EL PROGRAMA CELL 1. ENCENDIDO DE LA MAQUINA SI PROCEDE PARA OBSERVACIÓN DE CÉLULA VIVA: Encender la temperatura y el CO2 (dejar hasta que se alcancen las condiciones optimas) Si fuese necesario deberán introducirse las muestras a observar en una pequeña cámara ideada para que las condiciones de concentración de CO2 sean las idóneas. PARA TODAS LAS OBSERVACIONES: ENCENDER ORDENADOR ENCENDER MÓDULO DE MICROSCOPIO NUNCA TOCAR EL MODULO DE LA FLUORESCENCIA se enciende a través del programa. ENCENDER MODULO DE CÁMARA DE FOTOS ABRIR PROGRAMA CELL-R
Abrimos menú de microscopio
Abrimos menú de lámpara de fluorescencia (Ilumination system MT 20)
Abrimos menú de cámara de video y menú Camera Control
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Aparecen las ventanas:
2. REALIZACIÓN DE FOTOGRAFIA Y VIDEOS ABRIR O CREAR UN DATA BASE El siguiente paso tras abrir el programa es crear un archivo donde se guardarán las fotos: Ir a data base –administration-new database Pinchar New Database y se selecciona a donde crear el data base NEW Siguiente OK Nombrar el experimento => poner el nombre del experimento. Si no creas un data base a la hora de sacar una foto te dará un error.
NEXT => FINISH
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SI NO SE CREA UN DATA BASE NO SE PUEDEN COMENZAR LOS EXPERIMENTOS
3. OBSERVAR LA MUESTRA DESCRIPCIÓN DE ALGUNOS BOTONES: Antes de observar las muestras hay que chequear varios setting del microscopio para que todo funcione bien: MICROSCOPY: z-drive: aquí se indica el movimiento del objetivo. Para moverlo más lento o más rápido se debe pinchar el botón de focus ubicado en el extremo derecho inferior del microscopio. Cuidado de no subir muy rápido ya que probablemente quebrarás tu preparación. Change limits: aquí puedes cambiar los límites máximos y mínimos del movimiento en el eje Z. Hay que trabajar en los límites que se han indicado aquí, si se trabaja por fuera dará un error. Objetives: este dispositivo cambiara el objetivo con que se quiere trabajar. 1X y 1.6 X indican el aumento, pero hay que pinchar aquí y también en un botón que está al lado derecho del micro. Se suele trabajar en 1X. Fluorescente turret: Hay varias opciones U/B/G: para trabajar con fluorescencia Lamp: Indica la intensidad de la lámpara. Normalmente esto no se toca. 6
ILLUMINATION SYSTEM: En illumination setting hay que pinchar una sola vez al iniciar para encender la Lámpara y al final al terminar de trabajar. Main Switch, Burner ON/Off: Para encender la lámpara MT20/MT10. Excitation: aquí tenemos el shutter. Al pinchar se abre el pasó de la luz del shutter y al volver a pinchar se cierra. Intensity %: suele estar al 100%. CAMERA CONTROL: El icono que esta en el extremo superior izquierdo es la opción live, para ver que está en el campo de observación. El botón que esta al lado es para sacar la foto. Binning: opción para cambiar la resolución de la foto. Si se quiere mover en el campo de observación.
OBSERVACIÓN PARA CAMPO CLARO Colocar los filtros para campo claro, ( son uno por cada lado debajo de la platina) Encender la luz Pulsar el botón para dirigir la luz a los oculares o a la cámara Pinchar la pantalla de imagen
Luego la cámara de video En el menú de Camera Control Regulamos el tiempo de exposición En el menú microscopio Seleccionamos Fluorecence turret cambiamos a DIC En el microscopio hay que realizar los siguientes pasos: 7
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Introducir el polarizador (arriba) Analizador y DIC puesto (analizador el de la izquierda) DIC el de la derecha con las letras hacia abajo. EL FILTRO DIC(3) Sólo en caso de fluorescencia.
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PARA OBSERVAR FLUORESCENCIA Comprobar que los filtros de campo claro están sacados para hacer fotografía de fluorescencia. En el menú de lámpara de fluorescencia (Ilumination system MT 20), vamos seleccionando el filtro de iluminación que vayamos necesitando para obtener la imagen deseada.
Con el Experiment manager que se explica más adelante podemos hacer fotografía de diferentes filtros y después componerlos en RGB para su examen.
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4. UTILIZACIÓN DEL EXPERIMENT MANAGER Pulsamos el botón:
Se abre la ventana:
Con los botones siguientes establecemos las características que debe de tener nuestra película (filtros, fotografía, tiempos de exposición, veces que deben de repetirse, cuantos Z vamos a realizar, etc.)
Pinchar botón Time Lapse en Propiedades Controlar tipo de imagen y el intervalo. El icono multicolor lo nombramos y nos da el nombre del experimento Es esencial para hacer inmunofluorescencia para enlazar varios colores Comprobar que las fotos están sacadas para hacer fotografía en fluorescencia. Se coloca el icono de cámara de fotos dentro de Time Lapse Con el botón Get Current Camera Setting coge los valores que están en el menú de Camera Control Otros botones: En Multicolor Image existe un submenú => Display que si se pincha esta ventana y se pincha Display, hacemos que la imagen vaya refrescándose de la imagen que se van adquiriendo, esto se sabe ya que en el experiment Manager en el recuadro que introducimos aparece un pequeño icono con un monitor. Display nos sirve para ver en pantalla la observación.
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Una vez realizados todos esos procesos que queramos que realice el microscopio, vamos a la ventana que aparece:
Pulsar Boton Verify
El botón
El botón
se ilumina y este nos indica que el experimento está bien diseñado.
hace que se ejecute el experimento que hemos diseñado
Después de terminada la observación se va al Data base y se observa el experimento. Se pincha dos veces la imagen adquirida y se abre la imagen en el área de documentos.
5. PARA HACER UNA PELÍCULA Se realiza la misma operación que para observar una muestra, y configurar el Experiment Manager para que realice las secuencias de fotos de la manera deseada. Después de terminada la observación se va al Data base y se observa el experimento. Se pincha dos veces la imagen adquirida y se activa el icono.
Se determinará los frames y demás características que deseemos para la realización de la película, así como su formato y demás.
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6. CUIDADOS: La limpieza del microscopio es fundamental para obtener buenas fotos. La platina donde se pone la muestra tiene que limpiarse con etanol y no dejar aceite de inmersión en ninguno de los dos lados. Dejar los polarizadores para el DIC afuera, ya que si alguien que no sabe que existen no podrá sacar fotos. No almacenar las fotos en el disco duro, ya que ocupan mucho espacio. Tratar de llevar un disco duro externo y transferirlo una vez terminado el experimento.
7. PARA ACABAR Y APAGAR EL MICROSCOPIO Se cierra el programa NO HAY QUE GUARDAR EL ARCHIVO QUE SE LLAMA NORMAL.WOS Habría que esperar 1 a dos horas antes de volverse a utilizar si se apaga la cámara de Xn Apagar el módulo del microscopio y el módulo de la cámara No se apaga el módulo MT-20
Jose Luis Luque Ojeda Agradecimientos Jean Mathieu Bart Jenny Campos 15