Memòria justificativa de recerca de les beques predoctorals per a la formació de personal investigador (FI) La memòria justificativa consta de les dues parts que venen a continuació: 1.- Dades bàsiques i resums 2.- Memòria del treball (informe científic) Tots els camps són obligatoris

1.- Dades bàsiques i resums Títol del projecte ha de sintetitzar la temàtica científica del vostre document. IMPLICACIÓ DE LA INFLAMACIÓ I LA RESPOSTA IMMUNITÀRIA EN LA LESIÓ INDUÏDA PER LA ISQUÈMIA

Dades de l'investigador (benficiari de l’ajut) Nom Isabel Correu electrònic [email protected]

Cognoms Pérez de Puig

Dades del director del projecte Nom Anna Mª Correu electrònic [email protected]

Cognoms Planas Obradors

Dades de la universitat / centre al que s’està vinculat Universitat de Barcelona

Número d’expedient 2008FI_A_00905

Paraules clau: cal que esmenteu cinc conceptes que defineixin el contingut de la vostra memòria. Isquemia cerebral, Inmunitat, Inflamació, CD43, CD69, ApoE, Il-10

Data de presentació de la justificació 30.01.12

Nom i cognoms, i signatura del beneficiari/ària

Vist i plau del/de la director/a del projecte

Resum en la llengua del projecte (màxim 300 paraules) El sistema nerviós central (SNC) i el sistema immunitari (SI) estan estretament connectats. Es produeixen nombroses alteracions en el sistema immunitari després de la isquèmia i la inflamació es reconeix com una de les principals causes de la progressió de la lesió isquèmica. És molt important determinar el paper de les diferents cèl•lules implicades en la resposta immunitària i inflamatòria després de la isquèmia i el perfil de citocines que s’alliberen. A partir de l’estudi de les diferents poblacions de leucòcits en sang circulant després de la isquèmia, hem determinat que la subpoblació de monòcits (CD43high/CD11bhigh) augmenta a 48h de manera proporcional al volum d’infart. Aquesta població està formada per dos subtipus descrits de monòcits, els no clàssics (CD43high/Ly6C-) i els intermedis (CD43high/Ly6Cdim), i sembla expressar un perfil de citocines anti-inflamatòries així com una major capacitat fagocítica. Per altra banda, observem la presència de CD43 en el cervell i la seva degradació a 4 dies després de la isquèmia. També s’observa l’aparició de la fracció soluble del CD43 en el parènquima cerebral després del trencament de la barrera hematoencefàlica. Addicionalment, hem estudiat com s’alteren els canvis a nivell immunològic en ratolins deficients en CD69 i hem observat una pitjor progressió del volum d’infart en els animals CD69KO. A més a més hem volgut esbrinar el paper dels limfòcits utilitzant ratolins RAG (-/-) que tenen infarts més petits que els WT, però quan aquests careixen de CD69, tenen infarts significativament més grans. En l’estudi del procés inflamatori en la isquèmica, hem treballat amb ratolins deficient en ApoE i IL10. Pel que fa als ratolins ApoE (-/-), observem que tenen un volum d’infart més gran a les 24h i que es manté fins als 4 dies, i proposem que NFkB pot tenir un paper molt rellevant en aquest procés. Pel que fa a la IL-10, els animals deficients en aquesta citocina presenten un volum d’infart major i una expressió de citocines proinflamatòries més alt. A més a més, els ratolins IL10 KO presenten uns nivells de IL-12 més elevats de manera basal, i proposem que això és degut a la falta de la IL-10 per a inhibir la via.

Resum en anglès(màxim 300 paraules) The central nervous system (CNS) and the immune system (IS) are connected. There are many alterations in the immune system after stroke and the inflammation is known as one of the main causes of ischemic damage. In the study of different subpopulations of peripheral blood leukocytes after cerebral ischemia, we have firstly found a subtype of monocyte (CD43hihg/CD11bhigh) which increases 48h after the ischemic insult and its number correlates with the infarct volume. This population contains two subtypes of monocytes known as non classical (CD43high/Ly6C-) and intermediate (CD43high/Ly6Cdim), they seem to have a non-inflammatory profile and a high phagocytic capacity. Secondly, we observe the expression of CD43 en the brain and the degradation of this protein 4 days after the ischemia. We also detect de soluble fraction in the brain parenquima after brain blood barrier breakdown. Additionally, we have studied the immune changes in mice lacking CD69 and we have found that these mice have worse progression of the ischemic damage. Furthermore, we have tried to elucidate the role of the B and T limphocytes using RAG (-/-) mice that have smaller infarcts than the WT mice; but when they also lack CD69, they turn to have statistically bigger infarcts. We have worked on inflammation in stroke working with two modified strains, the ApoE knock-out (KO) and the IL-10 KO mice. We see that the Apo E (-/-) have bigger infarcts 24 hours after ischemia and the changes remain until day 4. The IL-10KO mice show also bigger infarcts but also a higher expression of proinflamatori cytoquines in the brain. At the moment, we are trying to elucidate the role of the IL-12 in this model, as we see higher levels of IL-12 in astrocyte cultures of IL-10 KO mice after LPS treatment.

2.- Memòria del treball (informe científic sense limitació de paraules). Pot incloure altres fitxers de qualsevol mena, no més grans de 10 MB cadascun d’ells.

IMPLICACIÓ DE LA INFLAMACIÓ I LA RESPOSTA IMMUNITÀRIA EN LA LESIÓ INDUÏDA PER LA ISQUÈMIA

El sistema nerviós central (SNC) i el sistema immunitari (SI) estan estrictament connectats. La lesió cerebral aguda pot induir una resposta sistèmica a través de catecolamines i corticosteroides capaç de provocar alteracions immunològiques (Meisel et al., 2005). Aquestes alteracions immunitàries podrien modificar la resposta inflamatòria que es produeix en el cervell isquèmic. La inflamació es reconeix com a una de les causes de la progressió de la lesió isquèmica (Dirnagl et al., 1999) que podria contribuir al deteriorament neurològic després de l’ictus (Chamorro & Hallenbeck, 2006). Actualment es tenen evidències de que respostes immunitàries innates intervenen en els mecanismes que desencadenen processos inflamatoris en el cervell isquèmic, i que la modulació d’aquestes pot exercir un efecte beneficiós. Un exemple d’aquest tipus de resposta son les mediades per receptors tipus Toll (per exemple el TLR4) que formen part de la immunitat innata i que intervenen de la manera molt activa en la resposta inflamatòria produïda en la resposta a l’ictus isquèmic (Caso et al., 2007). OBJECTIUS:

1. Caracteritzar les alteracions immunològiques perifèriques post-isquèmia estudiant la funcionalitat de monòcits i limfòcits, caracteritzant les diferents subpoblacions i els canvis en les mateixes a diferents temps post-isquèmia fent citometria de flux en sang i òrgans limfoides (ganglis cervicals). Estudiar la lesió cerebral per RM i investigar si podem detectar canvis en els ganglis limfàtics en els animals vius per RM. 2. Identificar les poblacions de leucòcits infiltrants en el cervell post-isquèmic i la seva dinàmica en el temps, així com l’expressió i evolució temporal dels receptors de la família TLR. 3. Estudiar com s’afecten les respostes anteriors interferint amb la via de senyalització de receptors d’immunitat innata de tipus TOLL (TLR).

Per a

desenvolupar aquest objectiu es volien utilitzar animals deficients en MyD88 i Stat-1, però no s’ha pogut disposar d’aquests animals. Per aquest motiu, hem modificat aquest objectiu per estudiar uns ratolins modificats genèticament per ApoE i que pensem que tenen les víes pro-inflamatòries activades. 4. Estudiar com s’afecten les alteracions immunològiques perifèriques en animals deficients en CD69 avaluant l’efecte d’aquest dèficit en la lesió isquèmica, en el dèficit neurològic i en les alteracions immunològiques anteriorment reportades.

5. Modificar les respostes anteriors utilitzant agents antiinflamatoris o potenciant vies antiinflamatòries: ens interessa la hemoxigenasa-1 (HO-1) i la Interleucina-10 (IL-10).

MATERIALS I MÈTODES: Animals. Totes els experiments s’han realitzat seguint els protocols aprovats pel CEEA de la UB. S’han utilitzat rates mascle wistar de 280-320 gr. de pes i ratolins mascle C57bl6j (WT, CD69 KO, ApoE KO), c57bl10j (WT i IL-10KO) i FVB de 12 setmanes d’edat. Lesió isquèmica. Per a dur a terme els experiments s’han realitzat dos protocols diferents per a induir la lesió isquèmica en els animals. -

Oclusió transitòria de l’artèria cerebral mitja (tMCAo) en rata: La oclusió de l’artèria cerebral mitja (ACM) es realitza mitjançant un filament de niló que s’introdueix per la llum de l’artèria caròtida externa i a través de l’artèria caròtida interna, fins a arribar a la bifurcació, en el polígon de Willis, de l’ACM. La oclusió de l’ACM s’observa ja que es mesura el flux sanguini cerebral durant la cirurgia mitjançant la tècnica de laser doppler. La oclusió es manté durant 90 minuts i passat aquest temps es retira el filament i s’observa la reperfusió del teixit.

-

Oclusió distal permanent de l’artèria cerebral mitja (pdMCAo) en ratolí: La oclusió distal permanent de la ACM en aquest model es realitza a través d’una craniotomia en el temporal del crani del ratolí, que es realitza sobre la bifurcació distal de la MCA. En aquest punt, s’oclueix la ACM per cauterització, de manera que el flux s’interromp de manera permanent afectant només al còrtex cerebral.

Avaluació funcional. L’avaluació funcional de les rates s’ha realitzat fent tests neurològics adjudicant una puntuació depenent de l’afectació de l’animal. Pel que fa a l’avaluació funcional dels ratolins amb isquèmia permanent distal, s’ha fet per Test d’adhesió (Tape test), que consisteix en mesurar el temps que tarden els ratolins en ser conscients que tenen una enganxina a la pota i quan tarden a treure-se-la. Amb aquets test s’avaluen deficiències sensori-motores. Citometria de flux. S’ha realitzat la tècnica de citometria de flux en sang total tant de rata com de ratolí. També s’ha realitzat citometria de ganglis limfàtics cervicals de ratolí així com de teixit cerebral. Les mostres s’han avaluat en el citòmetre (CANTO II, Becton Dickinson). Les dades s’han analitzat amb el programa CXP Analysis i el FlowJo 7.6.5. RT-PCR i Western Blot. S’ha utilitzat la tècnica de RT-PCR i Western Blot per a avaluar expressió de mRNA i de proteïna de diferents molècules en cervell i plasma de ratolins amb isquèmia distal focal permanent. Administració de mol·lècules. S’ha realitzat l’administració de molècules d’una forma intraperitoneal o intracerebral de molècules utilitzant tècniques d’estereotàxia.

Neuroimatge. S’han realitzat estudis de RM utilitzant seqüències de difusió (DWI), T2, T2*, T1 i perfusió (PWI) amb contrast (gadolini). En els resultats que es presenten en aquest informe s’han utilitzat principalment les mesures de difusió (ADC) la seqüència T2 per a avaluar el volum de la lesió.

RESULTATS:

Objectiu 1: Caracteritzar les alteracions immunològiques perifèriques post-isquèmia Caracterització de les poblacions leucocitàries en sang perifèrica de rata, a diferents temps post-isquèmia. S’ha extret sang de les rates abans de la isquèmia i a diferents temps (8h, 24h, 7 dies) després d’una isquèmia transitòria de 90 minuts; s’ha fet el mateix en rates sham (rates en les que s’ha practicat el mateix procediment quirúrgic però sense provocar la lesió isquèmica). S’ha estudiat els percentatges de monòcits (CD11b+ amb baixa granulositat), limfòcits T (CD3+), limfòcits B (CD45RA+), cèl·lules T reguladores (CD4+/CD25+) i les molècules coestimuladores (CD80+ i CD86+), i hem validat en els nostres models, canvis que ja s’han descrit anteriorment, com ara la disminució de limfòcits a temps curts (8h) i l’augment de monòcits en aquest mateix temps. Addicionalment, el marcador que hem identificat que presenta canvis significatius en la isquèmia respecte les rates sham, és el CD43, que el vèiem augmentat a 24h postisquèmia. El CD43 és una proteïna transmembrana altament glicosilada que està implicada en

l’adhesió

cel·lular

i

que

s’expressa

àmpliament

en

la

majoria

de

cèl·lules

hematopoiètiques.CD43 s’associa a l’activació de neutròfils (Masanori et al. 2008), regula l’activació de limfòcits T (Cannon et al., 2008), i també s’expressa en monòcits madurs (Yrlid et al., 2006).

Anàlisi de les poblacions de monòcits CD43+ en sang per FACS, en ratolins amb isquèmia permanent. Hem volgut validar en ratolí els resultats obtinguts en rata; per a fer-ho hem analitzat la sang de ratolins C57bl6j als que hem realitzat una isquèmia distal permanent (pdMCAo) i hem estudiat a 24h, 48h o 4 dies per analitzar el percentatge de CD11b+ i CD43+ en la població total de leucòcits. Observem també un augment significatiu tant de la proporció de cèl.lules CD11b com de CD43 a les 48h després de la isquèmia, de manera que corroborem l’augment que s’observa en la rata. A més a més, també hem observat un augment significatiu a les 48h de la població de cèl·lules que presenta alta intensitat de fluorescència tant per CD11b com per CD43 (CD11b+high/CD43+high). El més interessant però, és que l’augment d’aquesta població correlaciona significativament amb el volum d’infart dels ratolins.

Estudi de la població CD11b+high/CD43+high Degut a l’interés en aquesta subpoblació leucocitària en la isquèmia, hem realitzat estudis de citometria de flux per a caracteritzar aquesta població. Per a realitzar aquest estudi, ens hem centrat en mirar l’expressió de TLR2 i CD11c en els monòcits CD11b high+, diferenciant-los en dues subpoblacions: la CD11b h/CD43h i la CD11bh/CD43dim. En aquest sentit, hem comprovat que les dues subpoblacions expressen el receptor TLR2, mentre que el patró d’expressió de CD11c, que és un dels marcadors de cèl·lules dendrítiques, s’expressa de manera diferent. La població CD11bh/CD43h és CD11c+, mentre que la població CD11bh/CD43dim no l’expressa. En estudis recents, s’ha proposat una classificació de les subpblacions de monòcits basant-se en l’expressió de CD43 i de Ly6C, que és un antígen hematopoiétic de diferenciació cel·lular. En aquesta classificació es proposa una subdivisió en tres tipus de monòcits: els clàssics (Ly6C++/CD43+) els intermedis (Ly6C++/CD43++) i els no clàssics (Ly6C+/CD43++) (Ziegler-Heltbrock et al., 2010). Partint d’aquesta classificació, hem volgut comprovar a quines subpoblacions de monòcits es corresponen les nostres poblacions d’interés. Fent un triple marcatge (CD11b A647/CD43 PE/Ly6C FITC), hem vist que la població CD11bh/CD43dim

correspon

a

la

població

anomenada

de

monòcits

clàssics

(Ly6C++/CD43+), mentre que la població CD11bh/CD43h forma part en gran mesura de la població de monòcits no clàssics (Ly6C/CD43++) tot i que un percentatge important de la població té un patró de monòcits intermedis (Ly6C++/CD43++). El patró d’expressió dels diferents tipus de monòcits ens fa pensar en una possible transició de monòcits clàssics a no clàssics durant els procés isquèmic, donant lloc a l’augment en la població CD11bhihg/CD43high que observem a les 48h. En aquest sentit, hem aconseguit separar aquestes dues subpoblacions per a poder caracteritzar el seu patró d’expressió de citocines en resposta a diferents estímuls. La població de monòcits no clàssics (CD43high/Ly6C-) corresponen a un percentatge molt alt de la població CD43high/CD11bhigh i presenten un perfil més antiiflamatori i fagocític.

Estudi de l’expressió de CD43 en el cervell de ratolins isquèmics. A partir d’aquests resultats ens vàrem plantejat l’estudi per western blot (WB) del CD43 en el cervell dels ratolins isquèmics. A partir de l’anàlisi a diferents temps, hem observat expressió basal de CD43 en el cervell i també hem observat la degradació del CD43 en el còrtex ipsilateral dels ratolins afectats a 4 dies post-isquèmia. L’aparició de la fracció soluble d’aquesta proteïna, que s’ha descrit com el resultat de la proteolisi del dímer de membrana (Mambole et al. 2008) i que es troba en altes concentracions en circulació. La relació directa que hem observat entre la quantitat de fracció soluble i d’albúmina plasmàtica en el teixit, suggereix trencament de barrera hematoencefàlica, per esbrinar-ho hem fet un experiment injectant arabinosa intracarotídia per a produir un trencament de barrera hematoencefàlica focal, i així comprovar que la fracció soluble que observem per WB correspon a la fracció present en circulació i que, després del trencament de barrera produït per la lesió isquèmica, accedeix al parènquima cerebral. Pel que fa a la degradació de la proteïna de membrana del cervell, s’ha descrit que la Catepsina G proteolitza el CD43 donant lloc al fragment soluble (Mambole et al. 2008). En aquest sentit vàrem realitzar un experiment ex vivo amb Catepsina G i el seu inhibidor, i vàrem observar com la Catepsina G és capaç de proteolitzar el CD43 del cervell i que el seu inhibidor evita aquesta degradació. A partir dels resultats obtinguts en relació al CD43, podem pensar que la població de monòcits CD11b high/CD43high pot tenir un efecte directe sobre la lesió isquèmica, ja que augmenta d’una manera proporcional al volum d’infart a les 48h. Aquest efecte pot donar-se per la infiltració a la regió de l’infart, ja sigui produint un efecte local per l’alliberació de determinades citocines o per la seva diferenciació que, partint de la base que aquesta població expressa CD11c, podria estar determinada a cèl·lula dendrítica i no a macròfag. Pel que fa a la proteïna al cervell, la principal pregunta a respondre és el tipus cel·lular que expressa la proteïna, per a poder determinar la implicació de la degradació d’aquesta a 4 dies post isquèmia. Aquesta degradació pot tenir com a objectiu principal d’activació de vies de senyalització d’aquetes cèl·lules, però també pot estar directament relacionada amb la mort cel·lular en la zona de l’infart.

Objectiu 2: Identificar les poblacions de leucòcits infiltrants En aquest sentit, s’estudien les poblacions monocítiques que infiltren al cervell després de la isquèmia; comparant l’hemisferi ipsilateral amb el contralateral. Fins al moment no hem pogut identificar monòcits CD43+ al cervell, pel que proposem que el CD43 s’ha de proteolitzar per permetre la transmigració a través de l’endoteli vascular.

Objectiu 3: Estudiar com s’afecten les respostes anteriors interferint amb la via de senyalització de receptors d’immunitat innata de tipus TOLL (TLR) Apolipoproteïna E (ApoE): L’ApoE s’ha vist que és rellevant en un gran nombre de desordres del sistema nerviós central (SNC). A part del ja conegut paper en el metabolisme del colesterol, el paper de l’ApoE en la modulació de la inflamació i la oxidació és crucial per a avaluar els factors de risc de moltes malalties, ja que les funcions d’aquesta lipoproteïna estan estretament connectades amb citocines pro i antiinflamatòries (Zhang et al. Rev 2011). En el nostre laboratori disposem de ratolins knock-out per ApoE, i ens va semblar molt interessant pel nostre treball estudiar l’evolució de la lesió permanent (pdMCAo) en absència d’aquesta proteïna així com avaluar les possibles diferències en les cèl·lules del sistema immunitari, fent estudis per citometria de flux en sang total i ganglis cervicals i d’histologia del cervell en el punt final de l’experiment. L’estudi es va realitzar a 7 dies, fent mesures del volum d’infart a 24h, 4 i 7 dies i avaluació funcional (Tape test) a 4 i 7 dies. Pel que fa al volum d’infart, els animals ApoE KO mostren un augment del dany després de la isquèmia que ja es veu en les primeres 24h i es manté als 4 dies. Pel que fa al dèficit neurològic, observem deficiències motores significativament més importants en els animals KO tant a 4 dies com a 7 dies. Per altra banda, també s’han realitzat estudis en cultiu primari d’astròcit d’aquests mateixos ratolins per a avaluar la seva resposta a LPS (lipopolosacàrid que s’utilitza com a model de reacció inflamatòria tant in vivo com in vitro) després de 8h de tractament. Hem observat que els cultius d’astrocits procedents de ratolins KO per ApoE mostren una resposta alterada a l’activació de TLR4, amb més producció d’mRNA de TNFα i Cox-2 i menys producció de MMP-9 i IP-10. En anteriors publicacions del grup, s’ha mostrat que la inducció de l’expressió dels gens de TNFα (Gorina et al 2010) i Cox2 (Font-Nieves et al. 2012) és depenent de la via de MyD88 i del factor de transcripció NFκB, cosa que suggereix que aquesta via està sobreactivada en les cèl·lules ApoE KO exposades a LPS. En aquest sentit, proposem que la inhibició de NFκB en aquests animals revertiria aquest efecte potenciador del dany isquèmic.

Objectiu 4: Estudiar com s’afecten les alteracions immunològiques perifèriques en animals deficients en CD69. CD69: La proteïna CD69 és un dels primers marcadors d’activació leucocitària i s’expressa principalment en limfòcits B i T activats així com en Natural Killer (NK). Hem pogut disposar d’animals deficients en aquesta proteïna per a poder estudiar l’efecte d’aquesta en la isquèmia permanent. Com a primera aproximació, hem realitzat el mateix protocol i seqüències d’anàlisi per RM que amb els ratolins ApoE KO, i hem observat que malgrat que a les 24h, 4 dies, 7 dies i 10 dies no hi havia diferències significatives en el volum d’infart, la progressió de la lesió era significativament pitjor en els CD69KO que en els WT

•

RAG-/-: Per esbrinar el paper dels limfòcits hem treballat amb ratolins RAG-/-, que són ratolins deficients en la proteïna RAG, crucial per a la recombinació de TCR i IgGs; per tant, aquests ratolins només tenen cèl·lules de la línia mieloide i limfòcits Natural Killer, però no tenen cèl·lules T ni B. Els RAG(-/-) tenen infarts més petits que els WT, en canvi els RAG (-/-) que careixen de CD69, tenen infarts significativament més grans que els RAG (-/-), fet que suggereix un paper clau del CD69 en cèl·lules que no són limfòcits B o T

Objectiu 5: Modificar les respostes anteriors utilitzant agents antiinflamatoris o potenciant vies antiinflamatòries Hemoxigenasa-1 (HO-1): Respecte a aquest apartat, hem volgut modificar l’expressió de la HO-1 (isoforma induïble de la hemoxigenasa que s’indueix al cervell després de la isquèmia i que podria tenir funcions beneficioses). Hem utilitzat un inhibidor de la HO-1, la protoporfirina de zinc i hem trobat un empitjorament del volum d’infart dels animals que en un principi ens va fer pensar en un possible efecte beneficiós de la HO-1 en la isquèmia. Malgrat això, després hem vist que l’inhibidor era capaç d’induir l’expressió del mRNA i de la proteïna HO1 i que possiblement els efectes deleteris d’aquest fàrmac es deguin a que també augmenta l’expressió de citocines pro-inflamatòries com la IL-1β i el TNFα. Per tant, hem considerat que aquest fàrmac no és apropiat pels estudis que volíem portar a terme. No obstant, el que sí ens sembla rellevant per la isquèmia és esbrinar per quin mecanisme s’indueix la HO-1. Donat que la IL-10 és un factor que es relaciona amb la inducció de HO-1 (Lee et al. 2002), hem estudiat l’expressió de HO-1 després de la isquèmia en ratolins IL-1O KO, i hem trobat que la HO-1 s’indueix però en menor grau en aquests animals que en les WT. La qual cosa mostra que la IL-10 participa en la inducció de HO-1 post-isquèmica però no és l’únic factor . L’expressió de HO-1 està regulada per factors de transcripció que l’indueixen, com Nrf2, i per repressors, com Bach-1. Hem identificat que el factor Bach-1es degrada després de la isquèmia, la qual cosa podria ser responsable de la inducció de HO-1 en aquestes condicions. Interleucina-10 (IL-10): La IL-10 és una citocina de caràcter anti-inflamatori que augmenta la seva expressió en models d’isquèmia (Strle et al, 2001). S’ha descrit que tant l’administració de la citoquina (Spera et al., 1998), com la sobreexpressió gènica (Ooboshi et al., 2005) mostren efectes beneficiosos en models animals. Per aquests motius hem volgut estudiar l’evolució de la lesió isquèmica cortical permanent (pdMCAo) en ratolins IL-10 KO, realitzant el protocol amb mesures per RM a 24h, 4 i 7 dies del volum d’infart i test neurològic. Pel que fa al volum d’infart, observem a la figura que es mostra, com els animals IL-10 KO presenten un major volum d’infart en tots els temps analitzats però que a 4 dies és on trobem les diferencies més importants.

L’anàlisi per RT-PCR a 4 dies de l’expressió de diferents molècules implicades en el procés inflamatori ens va permetre veure un augment significatiu de TNF-α, MMP-9, IL1beta, IL-27 en l’hemisferi ipsilateral dels ratolins IL10-KO. Per altra banda vàrem veure com, en l’hemisferi contralateral, els ratolins IL-10 KO tenen més IL-12, que és una molècula clarament proinflamatòria. Aquest resultat aniria en concordança amb resultats obtinguts in vitro en el nostre laboratori on, en cultius primaris d’astròcits estimulats amb LPS, aquests alliberen IL-12. Si tenim en compte que a 4 dies en la zona de l’infart ja casi no queden astròcits, això ens indicaria que els astròcits podrien respondre a IL-10, donat que expressen el seu receptor i que aquesta atenuaria l’expressió de IL-12 que, en canvi, es troba augmentada en els KO. A més a més els ratolins IL10 KO alliberen més IL-12 d’una manera basal, donat que no tenen l’efecte inhibidor de la IL-10 sobre aquesta via.

A partir dels estudis realitzats amb els ratolins IL-10 KO, hem pogut observar la implicació d’aquesta citocina antiinflamatòria en el procés isquèmic cerebral. Tant en el fet que aquests animals tinguin un volum d’infart més gran com en el fet que expressin més marcadors d’inflamació com el TNFα o la MMP9 entre d’altres.

REFERÈNCIES Caso JR, Pradillo JM, Hurtado O, Lorenzo P, Moro MA, Lizasoain I. Toll-like receptor 4 is involved in brain damage and inflamation after experimental stroke. Circulation. 2007 Mar 27;115(12):1599-608. Cannon J. L., Collins A., Purvi D. Mody, Balachandran D., Kammi J. Henriksen, Cassandra E. Smith, Jiankun Tong, Bryan S. Clay, Stephen D. Miller, and Anne I. SperlingCD43 Regulates Th2 Differentiation and Inflammation. The Journal of Immunology. 2008,180: 7385–7393. Chamorro A, Urra X, Planas AM. Infection after acute ischemic stroke: a manifestation of brain-induced immunodepression. Stroke. 2007a Mar;38(3):1097-103. Chamorro A, Amaro S, Vargas M, Obach V, Cervera A, Gomez-Choco M, Torres F, Planas AM. Catecholamines, infection, and death in acute ischemic stroke. J Neurol Sci. 2007b Jan 15;252(1):29-35. Chamorro A, Amaro S, Vargas M, Obach V, Cervera A, Torres F, Planas AM. Interleukin10, monocytes and increased risk of early infection in ischaemic stroke. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2006 Nov;77(11):1279-81. Chamorro A, Hallenbeck J. The harms and benefits of inflamatory and immune responses in vascular disease. Stroke. 2006 Feb;37(2):291-3. Chamorro A, Horcajada JP, Obach V, Vargas M, Revilla M, Torres F, Cervera A, Planas AM, Mensa J. The Early Systemic Prophylaxis of Infection After Stroke study: a randomized clinical trial. Stroke. 2005 Jul;36(7):1495-500. Dirnagl U, Iadecola C, Moskowitz MA. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 1999 Sep;22(9):391-7. Dirnagl U, Klehmet J, Braun JS, Harms H, Meisel C, Ziemssen T, Prass K, Meisel A. Strokeinduced immunodepression: experimental evidence and clinical relevance. Stroke. 2007 Feb;38(2 Suppl):770-3. Font-Nieves M, Sans-Fons MG, Gorina R, Bonfill-Teixidor E, Salas-Perdomo A, MarquezKisinousky L, Santalucia T, Planas AM. Induction of Cox-2 and down-regulation of Cox-1 expression by LPS control prostaglandin E2 production in astrocytes. J Biol Chem. 2012 Jan 4. [Epub ahead of print] Justicia C, Martin A, Rojas S, Gironella M, Cervera A, Planes J, Chamorro A, Planas AM. Anti-VCAM-1 antibodies did not protect against ischemic damage either in rats or in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 2006 Mar;26(3):421-32. Lee Tzong-Shyuan & Lee-Young Chau Heme oxygenase-1 mediates the anti-inflammatory effect of interleukin-10 in mice. Nature Medicine. 2002; 8 (3):240-246 Loboda A., Jazwa A., Grochot-Przeczek A., Rutkowski A. J., Cisowski J., Agarwal A., Jozkowicz A., and Dulak J. Heme Oxygenase-1 and the Vascular Bed: From Molecular Mechanisms to Therapeutic Opportunities. Antioxidants & Redox Signaling. 2008; 10(10). Mambole A., Baruch D., NusbaumP., Bigot S., Suzuki M., Lesavre P., Fukuda M., and Halbwachs-Mecarelli L. The Cleavage of Neutrophil Leukosialin (CD43) by Cathepsin G Releases Its Extracellular Domain and Triggers Its Intramembrane Proteolysis by Presenilin/g-Secretase. The Journal of Biologycal Chemistry. 2008 Aug; 283(35): 2362723635 Masanori Matsumoto, Akiko Shigeta, Masayuki Miyasaka, and Takako Hirata. CD43 Plays Both Antiadhesive and Proadhesive Roles in Neutrophil Rolling in a Context-Dependent Manner. The Journal of Immunology. 2008, 181: 3628–3635 Meisel C, Schwab JM, Prass K, Meisel A, Dirnagl U. Central nervous system injury-induced immune deficiency syndrome. Nat Rev Neurosci. 2005 Oct;6(10):775-86. Ooboshi H, Ibayashi S, Shichita T, Kumai Y, Takada J, Ago T, Arakawa S, Sugimori H, Kamouchi M, Kitazono T, Iida M (2005) Postischemic gene transfer of interleukin-10 protects against both focal and global brain ischemia. Circulation 111: 913–919. Planas AM, Gorina R, Chamorro A. Signalling pathways mediating inflammatory responses in brain ischaemia. Biochem Soc Trans. 2006 Dec;34(Pt 6):1267-70. Prass K, Braun JS, Dirnagl U, Meisel C, Meisel A. Stroke propagates bacterial aspiration to pneumonia in a model of cerebral ischaemia. Stroke. 2006 Oct;37(10):2607-12.

Prass K, Meisel C, Hoflich C, Braun J, Halle E, Wolf T, Ruscher K, Victorov IV, Priller J, Dirnagl U, Volk HD, Meisel A. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. J Exp Med. 2003 Sep 1;198(5):725-36 Rojas S, Martin A, Arraz MJ, Purroy J, Verdaquer E, Llop J, Gomez V, Gispert JD, Millan O, Chamorro A, Planas AM. Imaging brain inflammation with [(11)C]PK11195 by PET and induction of the peripheral-type benzodiazepine receptor after transient focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 2007 Apr 25; Strle K, Zhou JH, Shen WH, Broussard SR, Johnson RW, Freund GG, Dantzer R, Kelley KW. Crit Rev Immunol. 2001;21(5):427-49. Review Urra X, Villamor N, Amaro S, Gómez-Choco M, Obach V, Oleaga L, Planas AM, Chamorro A. Monocyte subtypes predict clinical course and prognosis in human stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 2009 Mar 18; 29, 994–1002 Vargas M, Horcajada JP, Obach V, Revilla M, Cervera A, Torres F, Planas AM, Mensa J, Chamorro A. Clinical consequenses of infection in pacients with acute stroke: is it prime time for further antibiotic trials? Stroke. 2006 Feb;37(2):461-5. Yrlid U, Jenkins CD, MacPherson GG. Relationships between distinct blood monocyte subsets and migrating intestinal lymph dendritic cells in vivo under steady-state conditions. J Immunol 2006, 176:4155-62. Zhang H, Li-Min Wu, Jiang Wu. Cross-talk between ApoE and Cytokines. Mediators of inflammation. Rev. 2011 Ziegler-Heltbrock L, Ancuta P, Crowe S, Dalod M, Grau V, Hart D.N, Leenen P. J. M., YongJun Liu, MacPherson G, Randolph G. J., Scherberich J, Schmitz J, Shortman K, Sozzani S, Strobl H, Zembala M, Austyn J.M, Lutz M. B. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 2010