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UNIVERSITAT DE VALENCIA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS DEPARTAMENTO DE QUIMICA ANALITICA
ESTUDIÓ Y APLICACIONES ANALITICAS DE LAS REACCIONES DE
LA
CISTINA,
CISTEINA
Y
N-ACETIL-L-CISTEINA CON EL O-FTALDEHIDO
MEMORIA que para optar al de Doctor en
Ciencias
grado
Químicas,
presenta la Licenciada
MARIA JOSE MEDINA HERNANDEZ
V a l e n c i a , Diciembre de 1988
UMI Number: U603124
All rights reserved INFO RM ATIO N TO ALL USERS The quality of this reproduction is dependent upon the quality of the copy submitted. In the unlikely event that the author did not send a complete manuscript and there are missing pages, these will be noted. Also, if material had to be removed, a note will indicate the deletion.
Disscrrlation Publishíng
UMI U603124 Published by ProQuest LLC 2014. Copyright in the Dissertation held by the Author. Microform Edition © ProQuest LLC. All rights reserved. This work is protected against unauthorized copying underTitle 17, United States Code.
ProQuest LLC 789 East Eisenhower Parkway P.O. Box 1346 Ann Arbor, MI 48106-1346
ts {l
A Salva A mis padres y hermana
VALENCIA
Una Tesis c o n junto y han
un esfuerzo
colaborado
común,
no sólo
fin , sino
que también
una tarea
agradable.
Doctoral es el fruto de un trabajo son
muchas
las personas que
en que esta Tesis haya llegado a su han contribuido a que ésta haya sido
A
todos
vosotros
quiero
daros
las
gra cias .
A la profesora D ñ a . María Celia García AlvarezCoque por la dirección,
supervisión del trabajo experimental
y colaboración en la redacción de esta Memoria y en especial por crear un ambiente cordial de ayuda y confianza.
Al profesor D. Carlos Mongay Fernández por sus orientaciones y
acertados consejos
este trabajo y por la
para la
consecución de
supervisión de esta Memoria;
así como
por su afabilidad.
A la profesora Dña. por su
amistad,
su
Rosa María Villanueva Camenas
incondicional colaboración y la ilusión
pues ta en que esta Tesis sea una realidad.
Al profesor confianza y apoyo,
por su
Ramis Ramos por su
así como al equipo del Laboratorio 3.
A los Analítica y
D. Guillermo
% % 'miembros del
en especial
a mis
Departamento de
Química
compañeros del Tercer Ciclo
ánimo y alegre compañía que han hecho más grata la a
veces dura tarea de investigar.
Especialmente a mi marido Salvador por su animo y
comprensión
sino
también
Sagrado por
sus
no
solo
consejos
prácticos así como por su contribución a esta Tesis.
A mis padres por el estímulo y aliento que siempre me han
prestado y a mi hermana,
por la eficaz
aportación
en
la
parte Bioquímica.
A D. Luis Medina Castro y D. Salvador por
Sagrado
Soler
su colaboración en la confección, montaje y retoque
de las
figuras y el cariño que han puesto en este Trabajo.
A mi amigo Antonio Sánchez por su colaboración en
la
utilización del programa de cálculo del método de optimización s i m pl e x .
A mis amigos y en especial a José
y
Gemma
por
su
apoyo a lo largo de estos años de trabajo.
Quiero
agradecer
por
ultimo,
a
la
' Generalitat
Valenciana la concesión de una beca de investigación realización de esta Tesis.
para
la
UNIVERSITAT D E VALENCIA ,
| |
FACULTAD DE QUIMICAS Departamento de Química Analítica Doctor Moliner, 50 Teléfono (96) 363 0011 BURJASOT (VALENCIA)
D.FRANCISCO Departamento
BOSCH de
REIG,
Catedrático
Química
Analítica
y
de
Director
la
del
Universidad
de
Va le n c i a ,
CERTIFICA:
Que la Licenciada en Ciencias Químicas Dña. MARIA JOSE MEDINA HERNANDEZ ha realizado el trabajo investigación titulado analíticas
de
cisteína
y
o-ftald ehi do" ,
las
"Estudio
reacciones
y
aplicaciones
de
la
cistina,
N-acetil-L-cisteína conducente
a
la
de
con
el
obtención
Grado de Doctor en Ciencias Químicas,
y
sido dirigido por los profesores D.Carlos
que
del ha
Mongay
Fernandez y Dña María Celia Garcia A l va re z-C oq ue.
Y para que conste a los efectos oportunos,' firmo
la
presente
en
Valencia
a
quince
Diciembre de mil novecientos ochenta y ocho.
de
ÜNIVERSITAT DE VALENCIA FACULTAD DE QUIMICAS Departamento de Química Analítica Doctor Moliner, 50 Teléfono (96) 363 00 11 BURJASOT (VALENCIA)
CARLOS MONGAY FERNANDEZ,
Catedrático
ALVA RE Z-C OQU E, Profesora Titular,
,
MARIA
CELIA
GARCIA
adscritos al Departamento de
Química Analítica de la Universidad de Valencia,
CERTIFICAN:
Que la presente Memoria "Estudio analíticas
de
las
reacciones
y
aplicaciones
de
la
cistina,
cisteína y N-aceti 1-L-cisteína con el o-ftaldehido" constituye la Tesis Doctoral
de
Dña.
MARIA
JOSE
MEDINA HERNANDEZ.
Asimismo certifican haber dirigido
y
supervisado
tanto los diferentes aspectos del trabajo como
la
redacción de la presente Memoria.
Y para que
así
conste,
firman
la
Valencia a quince de Diciembre de mil
presente
en
* novecientos
ochenta y ocho.
f
I N
D
I C
E
Pag.
I.- INTRODUCCION.......................................................
1
1.1.- DERIVATIZACION DE AMINOACIDOS CON O-F TA LD EH ID O ...........
3
1.1.1.- Aspectos generales 1.1.2.- Mecanismo de
................................
3
formación de los isoin dol es .......
6
1.1.3.- Estabilidad de los isoind ole s ...................
11
1.1.4.- Mecanismo de de gr ad ac ió n .........................
15
1.1.5.- Cinética de formación y desc omp osi ci ón .........
25
1.2.- FACTORES ESTRUCTURALES QUE AFECTAN A LA ESTABILIDAD DE LOS ISOINDOLES ............................................
31
1.2.1.- Efecto de la estructura de la amina sobre la est abi li dad .....................................
31
1.2.2.~ Efecto de la estructura del tiol sobre la es tab il i da d ........................................
37
1.2.3.- Utilización de sustitutos de o - f ta ld eh id o ......
42
I .3 .- DETERMINACION DE LISINA, AMINAS SECUNDARIAS, CISTINA Y CISTEINA CON O- FT AL DE H ID O ................................
46
1.3.1.- Determinación de lisina y aminas secundarias....
46
1.3.2.- Determinación de cistina y c i s t e í n a ..............
48
I.4.- D ETECCION ESPECTROFOTOMETRICA DE LOS IS OI NDOLES.........
58
II.- OBJETIVOS
61
Pag^ 111-. - PARTE EX PE RI M E N T AL .............................................
111 .1. - REACTIVOS Y A P A R A T O S ......................................
-
v III-2.- ESTUDIOS SOBRE LA FORMACION DE UN PRODUCTO FLUORESCENTES POR REACCION DE LA CISTEINA CON O-FTALDEHIDO.............
67
69 '
72
III. 2.1.- INTRODUCCION ..................... ...............
74
111.2.2.- ESPECTROS DE EXCITACION Y E M I S I O N . . ...........
74
111.2.3.- OPTIMIZACION DE LAS CONDICIONES EX PE RI MEN TAL ES .................................. 1.- Efecto de la temperatura sobre la formación del d e r i v a d o ..................... 2.- Influencia de la acidez del m e d i o ........ 3.- Influencia de la concentración de o- f t a l d eh id o ................................
77 77 80 82
111.2.4.- DETERMINACION DE LA ESTEQUIOMETRIA DEL PRODUCTO DE REACCION DE LA CISTEINA CON O - FT AL DE HI DO ........
84
111.2.5.- PARAMETROS ANALITICOS SI GN IF ICA TIV OS .......... 1.- Curva de ca l i b r a d o ......................... 2.- R e p et it i vi da d ...............................
89 89 91
111.2.6.- REACCION DE LA CISTINA CON O - FT AL DE HI DO ........
92
II 1.2.7.- REACTIVIDAD DE OTROS AMINOACIDOS CON O - F T A L DE H I DO ..................................... 1.- Ausencia de t i o l ........................... 2.- Presencia de ci st e í n a ......................
95 95 97
III. 3.- DETERMINACION DE CISTINA CON O - FT AL DE HI DO ............
102
III. 3.1.- INTRODUCCION ...................................
104
II1.3.2.- REACCION DE LA CÍSTINA CON O-FTALDEHIDO Y M ER CA PTO ET ANO L .................................
105
Pag. II1.3.3.- REACCION DE LA CISTINA CON O-FTALDEHIDO EN AUSENCIA DE ME RC AP TOE TAN OL ................ 1.- Espectros de a bs or c i ón ................... 2.- Optimización de las condiciones exp er imentales ............................. a) Estabilidad del compuesto formado en medio bór ico -b or ato ................ b) Influencia de la concentración de o- fta l de hi d o ........................... c) Influencia del p H ..................... d) Efecto de la adición de á c i d o ........
110 110 114 114 116 118 120
3.- Parámetros analíticos significativos.... 124 a) Curvas de ca li b r a d o . ................ 125 b) Límitesde detección y determinación.. 130 c) R ep et i tiv id ad .............. ... ........ 132 4.- Estudio de int erferencias ................ 133 5.- Análisis de cistina , en un preparado far ma céutico.................. ............ 140 6.- Estructura del producto der e a c c i ó n 142 a) Reacción de la cisteína con o- ft ald ehi do ........................... 142 b) Determinación de laestequi ome trí a... 146 c) Carácter ácido-base del producto de r e a c c i ó n ............................. 148 d) D is c u s i ó n ................... ♦••• 159
III.4.- UTILIZACION DE N-ACETIL-L-CISTEINA EN LA DETERMINACION DE AMINOACIDOS CON O- FT AL DEH IDO ... 161 III. 4.1.- INTRODUCCION.................................... 111.4.2.- OPTIMIZACION DE LAS CONDICIONES EXPER IM E N T A L E S ................................. 1.- Espectro de absorción y estabilidad de los isoindoles derivados de N-acet il -L-cisteína....................... 2.- Influencia del p H .................. 3.- Influencia de la concentración de o- ft al deh id o ............................... 4.- Influencia de la concentración de N- ace ti 1-L-cisteína....................... 11 1 .4.3.- ABSORTIVIDADES MOLARES DE LOS DERIVADOS DE LOS AMINOACIDOS CON O-FTALDEHIDO Y N-A CE TI L-L-CISTEINA ...........................
163
164
164 166 168 171
173
Pag. 111.4.4.- ESTUDIO CINETICO DE LA FORMACION Y DEGRADACION DE LOS ISOIN DO LE S ................ 1.- Int roducción ,...... 2.- Método de G u g g e n h e i m ...................... 3.- Formación de los is oin dol es .............. 4.- Degradación de los is oin dol es ........... 5.- Factores estructurales que afectan a la estabilidad de los isoind ole s ........ 111.4.5.- INFLUENCIA DE LA CONCENTRACION DE O-FTALDEHIDO Y TIOL SOBRE LA FORMACION Y ESTABILIDAD DE LOS IS OI NDOLES ................
III.5.- DETERMINACION DE CISTINA CON O-FTALDEHIDO N-ACETIL-L-CISTEINA.. . ............
177 177 178 181 190 192
198
Y
III.5.1.- OPTIMIZACION DE LAS CONDICIONES E XP ER IME NT ALE S ................................. 1.- Espectros de a b s o r ci ón ................... 2.- Influencia del p H .......... 3.- Influencia de la concentración del reactivo o-ftaldehido-N-acetil-Lc is t e í n a ...................................
207
209 209 213
215
II 1.5. 2.- ESTRUCTURA DEL PRODUCTO DE R E A C C I O N ......... 1.- Determinación de la es te quiometría ...... 2.- Acidificación del producto de re ac c i ó n .................................... 3.- Fluorescencia del producto de r ea cc ió n ....................................
219 219
II 1.5. 3-
PARAMETROS ANALITICOS SI GN IF ICA TIV OS ........ 1.- Curva de c a l i b r ad o ......... 2.- Límites de detección y determinación.. 3.- R ep et it i vi da d .............................. 4.- D i s c u s i ó n ..................................
228 228 230 231 232
III.6.- DETERMINACION DE PROTEINAS CON O-FTALDEHIDO Y N-A CE TI L-L-CISTEINA .....................................
233
III. 6.1.-
INT RODUCCION .................................. 1.- Análisis de péptidos y proteínas in ta ct a s ................................... 2.- Análisis de péptidos y proteínas hi d r o l iz a da s ...............................
221 225
235 235 237
Pag. II1.6.2.- UTILIZACION DEL REACTIVO O-FTALDEHIDON-ACETI L- L-C IST EI NA ........................... 1 .- Procedimiento de hid ró li si s .............. 2.- Recuperación de algunos aminoácidos sometidos al tratamiento de hidrólisis.. 3.- Cálculo del peso molecular promedio y factores de c or re cc ió n ...................
238 239 240 242
II 1.6. 3.- APLICACION DEL M E T O D O ......................... 245 1.- Análisis de mezclas dea m i n o á c i d o s 245 2.- Determinación de N-amínico en suero y o r i n a ..................................... . 247 3.- Análisis de p r o t e í n a s .................. 255 a) Sensibilidad y recupe rac ión .......... 255 b) Límites de detección y determina c i ó n ..................................... 259 c) R ep ro du cib il id ad ....................... 260 4.- Generalización del m é t o d o ................ 261 5.- Análisis de aminoácidos libres en proteínas parcialmente hi d r o l i z a d a s 264 a) Estimación de la absortividad molar del derivado de una proteína i nt act a ................................. 265 b) Determinación del contenido en aminoácidos libres en caseína 268 parcialmente hid rol iz ad a. ............
III.7.- DETERMINACION DE N-ACETIL-L-CISTEINA EN FARMACOS CON O-FTALDEHIDO E I SOL EUC IN A .........................
273
III. 7.1.- IMPORTANCIA F AR MA CO LO GI CA ......*..............
275
II 1.7. 2.- METODOS DE A N A L I S I S ........................... 1.- Oxidación del grupo t i o l ................. 2.- Formación de mercapturos m e t á l i c o s ...... 3.— Reacciones con compuestos cr om óf or os ....
276 277 280 284
II 1.7. 3.- ENSAYOS P R E V I O S ................................ 1.- Elección de la a m i n a ...................... 2.- Absorbancia del b l a n c o ................... 3.- Estabilidad de las di so luc ion es .........
286 286 291 293
II1.7.4.- OPTIMIZACION DE LAS CONDICIONES EXPERIMEN TALES. 1.- Influencia de la concentración de o -f ta ld ehi do ............................... 2.- Influencia de la concentración de is oleucina .................................
295 295 297
Pag. 111.7.5.- PARAMETROS ANALITICOS SIG NIF IC AT IV OS ........ 299 1.- Curva de ca l i b r a d o ........................ 300 2.- Límites de detección y determinación.... 300 3.- R e p et it i v id ad .............................. 303 111.7.6.- ANALISIS DE N-ACETIL-L-CISTEINA EN DIVERSOS F A R M A C O S .............................. 1.- Descripción y preparación de las disoluciones de los f á r m a c o s ............ 2.- Utilización de métodos com pa ra ti vo s a) Método del tet rationato ............... b) Determinación colorimetrica de N-aceti1-L-cisteína con Fe(III) y 1,10-f en an tro lin a ...................... 3.- Determinación de N-acetil-L-cisteína con o-ftaldehido e is ole uci na ...........
304
304 307 307
310 313
IV. - CO N CL US IO NE S ....................................................
317
V.- BIBLIOGRAFIA
337
INDICE DE ABREVIATURAS
ABA
o-acetilbenzaldehido
ACV
1) ha sido también observada en isoindoles
a
partir
de
o-aminometil
- 11 -
I .1.3.-
Estabilidad de los isoindoles
La detección de aminoácidos mediante HPLC reacción con OPA
Las primeras aplicaciones
análisis de aminoácidos y de otras aminas derivatización
post-columna
de
separación por cromatografía de Sin embargo,
la
su
, constituye uno de los métodos más sensibles
para su determinación.
la
, tras
utilización
requiere la eliminación
los
este
completa
reactivos y de la fase móvil,
primarias
de
que
las
pueden
los
contribuir
de
una
(33). Además,
reactivo
(34-35).
actualmente el interés
dirigido
hacia
límites de detección,
análisis de
mezcla de la fase móvil con el
pre-columna de los isoindoles
(30-32).
de
originan perdidas en la resolución y sensibilidad,
ha
su
impurezas
forma importante a la fluorescencia de fondo
se
al
tras
iónico
esquema
OPA
suponían
mismos
intercambio de
del
(4-5)(33-36),
debido a la Por
la
que
simplifica el sistema
se
ello,
formación mejora
los
cromatográfico
y
reduce el tiempo de análisis.
Desafortunadamente,
como
hemos
isoindoles formados con el reactivo OPA-ME especialmente los derivados ornitina
de
glicina,
indicado, no
son
tiempo de reacción,
estables,
alanina,
(5), por lo que se precisa un cuidadoso siendo generalmente necesario
lisina
control
derivatizadas
pues
se
produce
muestras una
rápida
de
y del
automatizar
el instrumento para obterier una precisión aceptable. lado, no es aconsejable guardar las
los
Por
otro
aminoácidos pérdida
de
- 12 -
fluorescencia,
por lo que es preferible hacer
aminoácidos con OPA inmediatamente separación
antes de
proceder
los
isoindoles
se
obtienen
concentraciones equimolares de todos OPA y tiol)
o
cuando
existe
degradación
un
los
de
disminuye
contrario,
la adición de exceso de OPA
produce su rápida descomposición
Cooper y col.
a
partir
reactantes
exceso
velocidad
de
la
la
al
de
(amina, amina,
la
Por
el
enormemente. isoindol
formado,
(38-39).
(40) realizaron un estudio
utilizando
, en el que examinaron la estabilidad de los derivados en
dos condiciones distintas:
en primer
lugar,
manteniendo
derivados en la cámara de reacción (en presencia de un de
a
(37).
Cuando
HPLC
reaccionar los
OPA,
relación
O P A :aminoácido
90:1)
durante
los
exceso
distintos
intervalos de tiempo antes de la inyección en la columna y
en
segundo lugar,
la
inyectando los derivados inmediatamente
columna y deteniendo el flujo de
disolvente
durante distintos intervalos de tiempo. derivados dieron no solo respuestas
2
min
en
después,
En el primer caso,
fluorescentes
variables,
sino también mostraron distintos grados de estabilidad, especialmente inestables los derivados de OPA-ME ornitina anteriores
y
lisina. (5)(41).
Esta
observación
concuerda
los
de
siendo
glicina, con
otras
- 13 -
Sin embargo, utilizar
HPLC
con
algunos autores han
derivatización
especialmente cuando los
pre-columna
derivados
de
retenidos en la columna por menos de respuestas
fluorescentes
los
30
comparables
inestables y los más estables.
observado
aminoácidos
min
,
para
se
los
Efectivamente,
glicina, ácido
ornitina y lisina.
aspártico
fluorescencia observado
y
Solo
glutámico,
significativa.
dentro
estables,
de
la
los
derivados
Cooper
El
aumento
columna
en la columna,
mayoría
ser
al estar inmovilizados
los
perdida
de
puede
col.
de
diácidos, de
estabilidad debido
eliminación del exceso del reactivo OPA-ME durante el cromatográfico o a que,
y
la
aminoácidos una
son
obtienen
incluyendo
mostraron
al
(6)(42-43),
(40) observaron que una vez dentro de la columna, de los derivados de OPA-ME son
que
los
a
la
proceso derivados
se retarde su descomposición.
Por otro lado,
en presencia de un exceso de
OPA, se
ha observado una disminución de la velocidad de degradación al aumentar la concentración de diversos
tioles
(39)(44).
Esta
observación contradice otras anteriores que indicaban que
los
excesos de ME no tenían efecto sobre
los
derivados.
Sin embargo,
en uno
de
la estos
estabilidad estudios
variar la concentración de tiol no existía exceso de
de (45),
al
OPA,
de
modo que se eliminaba la principal causa desestabi1izad ora . En el segundo
(38),
de 1.5x10"*
M
aproximadamente
la máxima concentración de tiol examinada fue y
la un
utilizadas en (39).
de orden
OPA, de
1.5xl0~4 magnitud
M, por
concentraciones debajo
de
las
- 14 -
Se puede actuar de diversas formas para obtener máxima
estabilidad
de
concentración de tiol, del tiol. De ellas,
los
isoindoles:
controlar
la
la concentración de OPA o la estructura
la
influencia
relevante a altas concentraciones.
de
la
primera
Por otro lado,
una mínima cantidad de OPA parece la vía más se ha visto anteriormente, este reactivo,
una
la
necesidad
rápida y cuantitativa de los derivados
de
impone
estructura del tiol parece lograr la estabilización.
Así,, finalmente, ser
la
forma
uso
de
adecuada.
especialmente en muestras que contienen aminas rango de concentraciones.
es
el
deben evitarse grandes
sin embargo,
solo
Según
excesos
una
formación
unos en
de
límites, un
amplio
la alteración de la más
viable
para
- 15 -
I .1 .4 .- M e c a n i s mo d e d e e r r a d a c i o n
Simons y Johnson degradación
de
los
N-alqui1ftalimidina su formación: degradación
(11) caracterizaron el producto
isoindoles
formados
ME
como
una
(XX), y propusieron dos posibles vías para
la hidrólisis acida del se
con
de
ve
acelerada
a
pH
isoindol ácidos)
(12)(15) y . el
nucleofílico intramolecular del grupo hidroxilo (Esquema 4).
:N-R
i
OH
0¿N R*A XVIII
0
¿
N'R
+
'ICH2CV
XX
Esquema 4
XIX -J
S>n
del
(la
ataque ME
(13)
- 16 -
La intervención del grupo hidroxilo en
la
reacción
hecho
de
que ,
apoyada
de descomposición viene
por
el
velocidad de degradación de los derivados del ME es
debido probabl emente a
medio borato que en medio fosfato, el borató
compleja
grupo
al
menor
hidroxilo
(15) .
Además,
derivados de ET son más estables que los de ME.
El producto de degradación propuesto col.
fue también identificado por Stobaugh y
embargo,
según estos últimos autores,
el
por
Simons
col.
(38).
mecanismo
al aumentar la concentración
de
OPA,
ninguna razón obvia por la cual
el
es
OPA
que
Sin
propuesto
no explica la aceleración de la degradación de los derivados de ME a productos no fluorescentes,
y
isoindoles se
produce
decir,
no
existe
catalice
el
ataque
nucleofílico intramolecular mostrado en el Esquema 4.
Nakamura y
col.
desestabilizante del
OPA
(45)
propusieron
que
el
efecto
explicarse
por
un
ataque
podría
directo del OPA al anillo del
isoindol,
actuara como dienófilo
como
conduciría
a
[3]
productos
o de
en
nucleófilo
degradación
identificado por Simons y Johnson (11).
(dieno)
y
el
derivado no fluorescente Diels-Alder sobre
el
(XXI).
anillo
producen con dienófilos, la N-fenilmaleimida
OPA
que
el
OPA
[4],
lo
que
distintos
En el primer caso
se produciría una reacción de Diels-Alder fluoróforo
el
entre
(dienófilo) Este
tipo
pirrol
de
el
para
[3]
isoindol formar
un
de
reacciones
de
los
isoindoles
se
como el anhidrido maleico
(47-49).
del
(29)(46)
y
- 17 -
S-R [3]
CÓ"
\
hc-
0
XXI
El segundo mecanismo propuesto por Nakamura
y
col.
[4] consiste en un ataque nucleofxlico de un grupo aldehido de la molécula de
OPA
sobre
el
isoindol,
lo
que
también productos de condensación no fluorescentes
originaria (XXII).
CHO CHO
[4] \
S-R
H
V
S-R
CHO
CHO
N-R
XXII
Stobaugh y col.
(38)
criticaron
ambos
mecanismos,
indicando que el OPA no puede actuar ni como dienófilo ni como nucleófilo. isoindol
Si
[3],
actuara se
como
formaría
dienófilo un
producto
respecto en
el
al
anillo
cual
la
- 18 -
aromaticidad
del
OPA
se
perdería,
energéticamente poco favorable.
Por
aldehido del OPA poseen mas bien
lo
que
otro
un
es
lado,
carácter
indicó
deshidrata
en
gran
anteriormente extensión
1,3-ftalandioles cíclicos cis y
grupos
nucleofílico
, la constante
de
aldehidos
(Esquema
para trans
log K de protonación medio de 11.6 40°C en DaO
los
[4].
A diferencia de muchos otros tal como se
proceso
electrofílico,
por lo que no es probable que efectúen un ataque sobre el anillo isoindol
un
formar
2), una
(VI), que
(I = 0.1,
hidratación
25°C)
aromáticos, el
OPA
se
mezcla
de
exhiben
un
(25)
[5]. A
es de 3.99 ± 0.16
(25), así, aproximadamente el 80% del OPA existe en
su
forma
hidratada en disolución acuosa.
OH CHO CHO
‘
+
H -0
2
O
v
[5] OH VI
OH
conocida
habilidad
de
asistencia aquimérica (50),
]os en
t ioéteres
las
para
reacciones
de
junto con observaciones derivadas de
cinéticos,
llevaron a Stobaugh
mecanismo
de
catalizador
degradación
en
que
el
OPA
OH OPA :N-R vía 2 XXIV
" H 2O :N-R
V7 OH N-R OH XXIII
H 20
Y7
H-0 N-R XXV
N-R
XX
X IX
Esquema 5
estudios
proponer
(Esquema 5).
via
desplazamiento
diversos 38
el
proporcionar
actúa
un como
- 20 -
En ausencia de exceso de OPA
(vía
(I) forma el ion 1-ciclopropilsulfonio ataque por el agua y/o ocurrir en las
hidróxido
posiciones
el
isoindol
sobre
metileno
1),
esta
del
ion
isoindol
(XXIII). especie
El
puede
sulfonio
para
regenerar I o en el C-l del anillo isoindol para formar XX. En presencia de exceso de OPA
(vía
2),
originar rápidamente el hemiacetal
el
isoindol
(XXIV)„
grupo ftalandiol para abandonar el anillo
La
(XXIV)
(I)
puede
capacidad
del
es mayor
que
la del hidroxilo en I, por lo que se facilita la formación del ion sulfonio
(XXIII),
siendo así
mayor
ésta especie en el estado estacionario, tanto,
la y
concentración aumentando
la velocidad de degradación del isoindol
La utilización lugar de ME
de
de
por
lo
(MP),
en
(I).
3-mercapto-l-propanol
, aumenta la estabilidad de los derivados,
lo
que
se supone es debido a que la formación de un derivado sulfonio de 4 miembros Estas
(XXVI)
observaciones
Nakamura y col. anillo isoindol,
(45),
es menos descartan
favorable el
cinéticamente
mecanismo
(38).
propuesto
en el cual el OPA ataca directamente
ya que si fuera así,
sería
la gran estabilización conseguida cuando se por el MP.
O .
XXVI
difícil sustituye
por el
explicar el
ME
- 21 -
Sin embargo, col.
el
esquema de degradación de Stobaugh y
(38), del mismo modo
que el de Simons
solo es aplicable a los derivados de ME). para
Jacobs y col. acelerar
y
Johnson
hidroxitioles
(como
(39) comprobaron que la capacidad
la
degradación
isoindoles
formados
con
hidroxilo,
por lo que
también
tioles
que
supusieron
se
no
que
(13),
del
presenta contienen
todos
los
de
sugirieron, dominada
un
exceso
de
OPA.
Estos
grupos
isoindoles
autores
que puesto que la química de los
por
las
sustituciones
OPA con
deben descomponerse por medio del mismo proceso limitante, presencia
el
además
isoindoles
electrofilicas
en
(51),
está la
inestabilidad de los mismos se debe a una adición nucleofílica del isoindol al OPA libre.
Sin
embargo,
no
propusieron
un
mecanismo definitivo.
Sternson y col.
(24)
indicaron que la
inestabilidad
de los isoindoles proviene principalmente de sus reacciones de condensación y reacciones
de
sólo
autooxidación puede
tener
sustituidos en el nitrógeno. su parte,
es
observada en
acelerada diversos
en
(51). lugar
El con
primer
tipo
isoindoles
de no
La degradación au to o x i d a t i v a , por presencia
isoindoles
de
(51-56),
aire
y
ha
sido
siendo
un
caso
excepcional el de los isoindoles derivados de ME, en el que el proceso de degradación no es oxidativo y tiene lugar, se ha visto,
por un ataque hidrolítico en el C-l
(38).
como
ya
22
-
Stobaugh y col. los
1
-(alq ui 1
degradación
1
(57-58)
-
observaron que
i o )- 2 -alqui 1 i soíndoles
autooxidativa,
de
productos de degradación siendo
XXX,
una
(XXVII, XXVIII,
ftalimidina
mostrado en el Esquema
2
6
similar
otros
el de
[6 ] (57), componente
degradación
.
CH.CN/HjO
Según este mecanismo, al oxígeno o a otro
radical
la
el
peroxi-isoindoil
O2
transferencia
(XXXIII).
da
para
(54),
formar que
electrónica
lugar
proceso
(XXXII),
continuación de diversas formas de un endoperóxido
XXX
presente
(52), que inicia un
radical reacciona con
[6
x x v i i i
XXIX
radical
a
XXIX y XXX)
mecanismo
XXVII
catiónico XXXI
una
e identificaron cuatro
tiosustituída,
m a y o r i t a r i o . Además propusieron el
general,
experimentan
manera
isoindoles no sustituidos en el azufre,
en
en
al
radical
cadena.
Este
un intermedio,
puede
reaccionar
incluyendo la
el a
formación
-
23
-
S-R :N-R
+
02
•N-R
+
o 2-
XXXI
S-R +6
R
N-R -R -S XXXII
XXXIII
XXVII
N-R
+
XXX
XXVIII
Esquema
El producto
de
6
degradación
no
(Esquema 7) puede obtenerse a partir de radicales
-RS•
descrito en el
(producidos Esquema
6
)
durante con
mediante un proceso de sustitución intermedio XXXIV. pirróles
el
la el
isoindol homolitico
Este tipo de reacción
debido
a
la
reacción proceso
se
(59-60) y cabe esperar que también
isoindoles,
oxidativo
contribución
del
los
degradado, través
observa tenga
de
oxidativo
no a
(XXIX),
del
con
los
lugar
con
intermedio
- 24 -
estabilizado reacción.
por
resonancia
que
se
produce
El efecto desestabilizador del OPA puede ser
a un ataque electrofílico en las posiciones 1 y 3 isoindol
durante
del
(61).
S-R* + R’- S
-H
H S-R’ XXXIV
Esquema 7
XXIX
la
debido anillo
- 25 -
I .1.5.-
Cinética de formación y descomposición
Svedas
y
col.
espectrofotométrico
de
aminoácidos con el OPA, consideraron
dos
(41) la
realizaron
cinética
en presencia de
esquemas
de
A + B
> P
A + B
> D
B
reacción absorbentes
un
aminoácido,
ki la
Estos
basados
de
de
estudio de
los
autores en
los
(13):
[7]
> P
y
D
[8]
productos
de
(isoindoles l-alquil-2-tiosustituído y 1-
velocidad
de segundo orden,
descomposición,
.
P el producto final de
(una N-alquilftalimidina) (XX), no
constante
intermedio,
ME
C
hidroxi-2-sustit uí do , respectivamente), descomposición
reacción
reacción
mecanismos propuestos por Simons y col.
donde A es el OPA,
de
un
primer
ka
de
formación
la
orden,
constante y
ka
la
absorbente,
del
compuesto
velocidad constante
de de
velocidad de primer orden correspondiente a la conversión de C a D.
- 26 -
Asimismo, ecuaciones [7] y [8]
se propusieron los siguientes sistemas
diferenciales, (41)
correspondientes
a
los
de
esquemas
:
dx = ki(a.-x)(b.-x) dx
dt = ki(a.-x)(b«-x)
dt
x = c + p + d [9 ]
x = c + p
de --dt
dp
[10] = ki(a.-x)(b.-x)
- ksc
= ka(x-p) dt
dp
= kad dt
donde x es la fracción de OPA o de aminoácido implicada en reacción,
ao y b. las concentraciones iniciales de
aminoácido y
t
el
tiempo.
Las
letras
OPA
minúsculas
la
y del indican
concentraciones instantáneas de cada compuesto.
Los
autores
encontraron
correspondiente al esquema sistema de ecuaciones experimentales.
[8],
Se observo
las
1
del
que y
D
que la era
absortividades
compuestos es comprensible, posición
curva
obtenida por
además
absortividades molares de C entre
la
teórica
integración
del
[10] concordaba mejor con los resultados
obtenía cuando se consideraba
similitud
que
anillo
el
mejor
ajuste
diferencia
entre
menor
10%
del
molares
de
las .
estos
se
La dos
puesto que las sustituciones en la
isoindol
afectan
propiedades espectrales de los compuestos
muy
(62).
poco
a
las
- 27 -
Posteriormente, cinéticos
sobre
presencia
de
proponiendo
la ME
el
Wong y col.
reacción y
del
ácido
siguiente
(63) realizaron estudios OPA
con
la
alanina
3-mercaptopropiónico
esquema
cinético,
mecanismo propuesto por Sternson y col.
en
(MPA),
basado
en
el
(24):
ki
ka
P ----------- > I
OPA + Alanina "sssrrsíSk-i
[11]
tiol
K OPA + tiol
El reactivo OPA
=^
reacciona
con
C
la
[12]
alanina
compuesto intermedio P, que reacciona a tiol
para
producir
Simultáneamente,
el
isoindol
formar
continuación
fluorescente
disociación es K . Cuando deducida
[OPA]
aplicando
, cuya <
constante
[tiol]
la
,
la
aproximación
el
con
(I)
el
[11].
el OPA reacciona reversiblemente con el
para formar el derivado C [12]
velocidad
para
tiol
aparente
de
ecuación
de
del
estado
estacionario a la especie P es:
k^[OPA]
[tiol]
[Ala]
d[P]/dt =
[13] k ^ / kg + [tiol]
K + [tiol]
- 28 -
Mientras que en las condiciones normalmente utilizadas, que
en las
la concentración de alanina es mucho menor que la de
OPA
y tiol se tiene:
d[P]/dt - k o£g [Ala]
[I4 ]
donde
_
k-[OPA]
k*
[tiol]
K
^-------------
[15]
k_l/ k2 + [tiol]
Al ajustar a la ecuación k*ot»> obtenidos para
K + [tiol]
[15]
los
distintas
datos
experimentales
concentraciones
de
tiol
de se
obtuvieron las constantes de la Tabla 2:
Tabla 2. - Constantes de formación de los isoindoles derivados de la alanina con el reactivo OPA-tiol (63).
Tiol
ME MPA
ki
(m M ~ 1s ~ 1 )
113 ± 4 121 ± 13
k-i/ka
0.053 ± 0.100 ±
(mM)
0.005 0.021
K
(mM)
4.64 ± 0.55 1.58 ± 0.40
- 29 -
Se observa que los valores de ki son similares ME y MPA,
lo que está de acuerdo con el
mecanismo
propuesto,
en el que la primera etapa es independiente del tiol. contrario, doble
la relación k-i/ka para MPA es
que
para
ME.
Puesto
que
k-i
reactantes,
Por
el
aproximadamente
el
corresponde
descomposición del producto intermedio,
P, para
esta constante debe ser también
la concentración de tiol y por lo tanto,
para
a
la
producir
los
independiente
kz (ME) /ka (MPA)
de 2
,
lo que implica que el ME es más efectivo al reaccionar con
P.
La razón de este comportamiento se puede explicar en base a la mayor basicidad del MPA (log K = 10.2-10.3) la del ME
(loe K = 9.4-9.5)
condiciones utilizadas
(65-66)
(pH = 9.3),
,
(64-65)
por
lo
existe una
respecto a
que
mayor
en
las
fracción
del anión mercapto del ME que del MPA.
Diversos estudios sobre la cinética de los isoindoles indican
que
menos dos procesos paralelos; lineal entre la constante k 4 ob.
de
ésta
donde ko es la constante catalizado
de
transcurre
degradación (39)
de
una primer
al
relación orden,
:
[OPA]
[16]
proceso
no
(en ausencia de exceso de OPA) y ki corresponde
al
proceso catalizado por OPA.
velocidad
degradación mediante
además se observa
, y la concentración de OPA
k d «b.= k* + ki
de
para
el
La constante ko es despreciable en
presencia de un exceso moderado de OPA.
- 30 -
La actividad del OPA depende en gran estructura del tiol
(38-39) . En la Tabla
3
medida
se
muestran
valores de ko y ki correspondientes a derivados de con diversos tioles
(39). Se observa
que
la
de
solo
los
metilamina
constante ko es
menos variable que la k i , lo que parece indicar que el de la estructura sobre la estabilidad,
la
es
efecto
debido
a
la
inhibición del proceso catalizado por el OPA
Tabl a 3. - Constantes de velocidad de degradacion derivados de la metilamina con diversos tioles (39).
de
los
SR
N-CH
Isoindol a b c d e
r3
ki (M ~ 1 m in ~ ')
k« (rain*1)
—CH 3 -CHzCHaOH -CHzCHa -CH(CH 3 ) 3 -C(CH3)a
34.0 17 . 8 13.4 5 .6 0 .1
0 . 0 0 1
.0 0 2 0 .0 0 2 0. 007 0. 003 0
El efecto estabilizador de la presencia de un exceso de tiol es probablemente debido a la formación de derivados OPA-tiol, libre.
que
disminuye
la
concentración
o
mas
de
OPA
La reacción de adición de agua o tiol a un aldehido con
formación del hidrato o hemitioacetal es (66-69) y en este caso, el hemitioacetal cíclico
bien
el derivado formado, (VII,
también puede ser debida a la (70).
uno
Esquema 2). acción
conocida
C [12], La
(25)
puede ser
estabilización
antioxidante
del
tiol
- 31 -
I.2.-
FACTORES ESTRUCTURALES QUE AFECTAN A LA ESTABILIDAD DE LOS ISOINDOLES
I .2.1.-
Efecto
de
la
estructura
de
la
amina
sobre
la
estabi1 i dad
Nakamura
y
col.
cualitativo sobre el efecto
(45) de
la
realizaron
un
estructura
de
primaria sobre la estabilidad de los isoindoles, reacción con el reactivo OPA-ME.
la
con
sean atacados por el OPA. Además se
impedimento
que
observó
los el
estabilizador del grupo carboxilo al comparar los
aminoácidos
L-tirosina
con
aromáticos los
menor
que en
esterico
la sustitución en el carbono ex
adyacente al grupo amino parece impedir
de
por
Estos autores observaron,
primarias
alrededor del grupo a m i n o . Así,
amina
formados
la velocidad de disminución de la fluorescencia era los derivados de aminas
estudio
fluoróforos gran
la
L-trip tó fan o,
correspondientes
estabilidad L-dopa
y
compuestos
de sca rboxilados. En el Esquema 8 se ordenan en función estabilidad diversos aminoácidos y aminas primarias
efecto
(45)
de :
su
- 32 -
H a N - C H ( CH 3 ) -COOH > H a N - C H a - C H a - O H
> H a N - C H a - C H 2 -CHa-COOH >
H aN -C H a- C Ha -C OO H > HaN-CHa-COOH
H a N-CH(CH a ) a > H a N-C(CH 3)3
> HaN-CHa-CHa-CHa-CH3
>
XXXV > H a N-CH a - C H a -C H a > H a N- C H a - C H a
a
NHa
>
O
NHa
>
O
> HaN-CHa
NHa
NH;
>
XXXVI Esquema 8
Más
tarde,
cuantitativamente isoindoles. revelo
Stobaugh
la
y
estabilidad
col.
(38)
cinética
evaluaron
de
diversos
El examen de las constantes de velocidad, que
se
producían
estabilidad al
aumentar
(Tabla 4, b>a)
y
al
ligeros
el
tamaño
contener
sustitución adicional en el
adicional de la estabilidad lo grupo carboxilo en la
amina,
aproximarse este grupo al C - 1 0
incrementos de
los
estos
C -10
(f>d
produce aumentando
de
sustituyentes y
é>c).
la
Un
presencia la
(a— > d ) . Así,
, la
N-sustituyentes una aumento de
un
estabilidad
al
los o^-aminoácidos
tienden a formar isoindoles más estables que las otras es tu di ad as .
k dot>«
aminas
- 33 -
Anteriormente,
Lindroth y Mopper
(5) sugirieron,
que
el efecto estabilizador del grupo carboxilo de los aminoácidos se debe a un efecto electrodonante en la embargo,
posición
los resultados de Stobaugh y col.
de otros
autores
(36)(71),
indican
que
(38), el
cr , para
un
aumento
grupo
Sin
junto con los
estabilidad es debido predominantemente a factores Además el valor de Hammett,
C-10.
en
la
estericos.
carboxilo
es
casi nulo.
Tabla 4. - Constantes de velocidad de primer orden y tiempos de vida media para la degradación de los isoindoles derivados de OPA-ME y aminas primarias (R» = -C H 2 C H 2 OH) (38).
SR H N -
Isoindol
Ri
R2
k dob> (m i n ” 1)
a b c d e f
-H -H -H -H —CH 3 -CH3
- C H 2 CH* -CH2CH2C02H -CH2C02H -CO2 H -CH2CO2H -CO2H
38 .0 32 .9 27 .8 22 .5 12 .0 •7.0
ti/2 (m i n )
18.2 21 .1 24 .9 30 .8 57 .8 98. 9
- 34 -
Jacobs y col.
(39),
una serie de derivados
al examinar
variando
la
estabilidad
sistemáticamente
de
la
amina,
observaron que la introducción de ramificaciones en la
cadena
lateral de la amina produce un gran
estabilizante,
y
que la magnitud de la estabilización aumenta al aproximarse
la
ramificación al anillo isoindol.
de
la extensión de la cadena, una disminución en degradación
por
Finalmente,
el
aminoácidos
un
sin
factor
grupo
Además,
un aumento lineal
ramificación de
metileno
comportamiento
(Tabla 5,
efecto
dos
en
(Tabla de
alguna, la
5,
los
velocidad a,
derivados
disminución
en
la
degradación con la ramificación en la posición ex
adicional
en
un
factor
estericos
de
h). los
de
dos
por
velocidad
de
(j ->k ->1), cada
carbono
las constantes de velocidad obtenidas
'etilaminas-2-sustituíclas
inhibición
e,
(jm).
Por otro lado, con
b,
de
j-m) es paralelo al de las a l q u i l a m i n a s ,
produciéndose una drástica
y una disminución
origina
de
la
degradación
( Tabla 6 ).
muestran es
también
producida
por
que
la
efectos
- 35 -
Tabla 5. - Constantes de velocidad de primer orden y tiempos de vida media para la degradación de los isoindoles derivados de OPA-ET y aminas primarias (R* = -CH2CH3) (39).
SR N-C-R
Isoindol
Rx
r
2
Ra
k d • b •xl 0 2 (min ' 1 ) 31 .6 ± 0 .6 12 .0 ± 0 .4 0 .33 ± 0 .03
t
2 .2 5 .8 210 -
-H -H -H
5 .69 ± 0 .04 2 .3 ± 0 .2 0 .33 ± 0.06
12 .2 30 210
-CHaCHaCHa -H -C Ha CH (C H a )2 -H
3 .15 ± 0.08 ± 0 .1 1.7
22.0 41
5 .4 ± 0.02 0.14 ± 0.02
12 .8 480 20. 3
a b c d
-H -H -CHa -CHa
-H -CHa -CHa -CHa
-H -H -H -CHa
e f g
-H -H -H
— CH 2 CHa -CH (CH a ) 2 —C (CH s ) a
h i
-H
j k 1 m
-H -H -CHa -CHa
-H
1 1 /2 (m i n )
' -C 0 2 H -C 0 2 H -C 0 2 H —CH 2CO 2H
-H -H -CHa -H
* No se observan cambios a las tres horas.
* 3 .41 ± 0.02
- 36 -
Tabla 6. - Constantes de velocidad de primer orden y tiempos de vida media para la degradación de los isoindoles derivados de OPA-ET y e t ilaminas-2-sustituídas (39).
Isoindol
R
a b c d e f
k d *b. x 1 0 a (m i n " 1 )
12.0 5.88 5.69 4.40 3.41 3.30 1.07 0.33
-H -OH -CHs = CHa —CO 2 H -OCHs -C.Hí - C (CH 3 ) 3
S h
Sin
embargo,
en
± ± ± ± ± ± ± ±
t 1/ 2 (m i n )
5 .8 11 .8 12.2 16 20. 3
0.4 0.08 0.04 0.02 0.02 0.2 0.05 0.06
ocasiones
21 64. 7 210
la
obtención
de
un
isoindol más estable viene ac-ompañada de una disminución de la velocidad -tirosina)
de y
formación de
una
(t-but il am in a, intensidad
de
(t-buti lamina y ciclooc ti la mi na , XXXVI) de la fluorescencia también ha sido Haré
(14)
con
el
ácido
XXXV
y
cx'-metil-L-
fluorescencia (45).
La
observada
c^-aminoisobutírico,
menor
disminución
por
Cronin
isovalina
t-b ut ilamina, que carecen de hidrógeno en la posición oí.
y y
- 37 -
I .2.2.-
Efecto de la estructura del tiol sobre la estabilidad
El
tiol
más
utilizado
en
la
derivatización
aminoácidos es el ME. Sin em b a r g o , en múltiples
de
ocasiones
se
ha sugerido su sustitución por otros tioles,
con
el
aumentar la estabilidad de
Son
muchos
los
fluorescentes,
aunque
en
tioles
que
producen
los
isoindoles.
isoindoles
algunos casos la fluorescencia obtenida es menor (ditiotreitol y ET) fluorescentes
y
en
otros,
se
forman
fin
que
de
con
ME
compuestos
no
(metilmercaptoacetato y ácido me rc aptosuccínico)
(10)(15).
Aunque el 2-meti1-2-propanotiol mucho más
estables
que
ME
o
ET,
los
produce
isoindoles
derivados
presentan un rendimiento cuántico de fluorescencia por lo que se
recomienda
su
detección
isoindoles sufren oxidación anódica a un
formados muy
bajo,
electroquímica potencial
(los
moderado)
(72) . Jacobs y col. ácido ^-aminobutfrico
(39) observaron que los derivados
(GABA)
son más estables al
ramificación en la posición ex
del
tiol
aumentar
(Tabla
7),
parece confirmar que el factor determinante de la es el volumen del tiol
(cd).
Por otro lado,
lo
del la que
estabilidad
en la Tabla
7
se observa que el aumento de estabilidad conseguido con ET (b) respecto a ME (e) no es importante.
- 38 -
Tabla 7. - Constantes de velocidad de primer orden y tiempos de vida media para la degradación de los isoindoles derivados del acido T-aminobutirico (Ri = H ; Ra ~ -C H 2 C H 2 C O 2 H) (39).
SR N-C-R
Isoindol
R3
k dob. x 1 0 2 (m i n " 1 )
-en 3 -CH2 C H 3 -C H(C H3 )2 —C (CH a )3 -CHaCH20H
a b c d e
Sin embargo,
7.7 5.96 2.7 0.17 8.7
1 1 /2 (m i n )
± 0.2 ± 0.08 ±0.6 ± 0.02 ±0.2
9.0 11 .6 25 410 8 .0
Simons y Johnson (12) sugirieron el uso
de ET como sustituto de
ME,
debido
a
que
i soindo1es der ivados de ET son mas estables
en
general
(12)(15)(73).
aumento de estabilidad de dichos derivados ha sido recientemente aminoácidos.
por
Stobaugh
aminoácidos que forman (GABA,
col.
(58)
desagradable olor, mayor volatilidad.
en
derivados
^B-alanina,
a l a n i n a ) . Sin embargo,
veces
glicina,
la
para
diversos
estabilidad
particularmente ácido
se ve aumentado con
el
ofrece de
los
inestables
^-a minobutírico
uno de los inconvenientes ET,
El
comprobado
Estos autores observaron que el uso de ET
un incremento de más de 5
con ME
y
los
del debido
y
ME,
su
a
su
- 39 -
Se ha propuesto el uso de otros tioles como el ácido 3-mercaptopropionico
(74-75) y el tioglicerol
(76),
pero no se
ha extendido su uso. También se ha estudiado la posibilidad de usar ariltioles
(77)
(bencilmercaptano,
tiofenol
metanotiol),
menos volátiles que ME, en la
isoindoles.
Sin
fluorescencia
alguna
fluorescencia, indicar que isoindoles
embargo,
productos
obtenidos
formación de derivados
tiofenol, excitación
formados
trifenil-
formación
bencilmercaptano
y el
sus máximos de
los
incrementándose
el
y
de
no
origina
aunque y
son
produce
emisión
parecen
distintos
con alquiltioles.
Por
con trifenilmetanotiol
de
ultimo, es
los
los la
muy lenta,
la intensidad de fluorescencia en un factor de
cinco a lo largo de un período de tres horas.
La
N-acetil-L-cisteína
(NAC)
empleada en la derivatización pre- y
(XXXVII)
post-columna
ha de
primarias y aminoácidos y, por ser un tiol ópticamente permite la separación de isoindoles derivados
compuestos
diastereoisómeros de
la
cisteína
(Esquema se
9)
encuentran
mercaptanos quirales de que se puede ópticamente pura.
enantiómeros
sido aminas activo,
al
(78-83). entre
disponer
en
formar Los
los
pocos
una
forma
40
-
1 ^
L
-
+
ru r CIIO
HS-CH2 CHCOOH
xxxvii
AlICOCH: R -fH -C O O H NH2 \/
Co o h
CH*COHN^C-*H ■CÜ2
co
CH3COHNI
COOH
y
Í-+ H
COOH
ft
R
Esquema 9
Los espectros de excitación y emisión, intensidad de fluorescencia de los casi
derivados
idéntica a la de los derivados de
la reacción antes de dos
minutos.
1a
OPA-NAC
es
de
OPA-ME,
La
así" como
completándose
fluorescencia
isoindoles formados es estable al menos durante
10-30
incluyendo
es
el
derivado
de
susceptible de autooxidación
Por intensidad
otra
de
parte,
la
glicina,
que
que
puede
e1
fluorescencia
ser
debido
reactivo
mayor
NAC
que
la
d eterminación
»
el
más
origina
una
ME
el
a
la
alta
s imultánea
de
iminoácidos con sensibilidades del mismo orden
en
con
estab ilidad
isoindoles cis teínicos frente a la oxidación. posible
min
los
(41).
determinacion de iminoácidos p reviamente oxidad os lo
de
la
NaClO, de
los
D e este m o d o , e s aminoácidos (82)(84).
e
- 41 -
El NAC
es
un
relativamente económico,
reactivo
sólido,
comercializado
y
presentando un olor apenas apreciable
en contraposición a los tioles normalmente usados. Ademas,
el
reactivo OPA-NAC y los derivados formados son mas estables que los correspondientes al ME y E T . Otros derivados que han sido utilizados son la Boc-L-cisteína -carbonil-L-cisteína) (XXXVIII) (XXXIX)
de
cisteína
(N-terbutiloxi-
(83) y N-acetil-D-penicilamina
(85). La resolución obtenida con NAC es peor
Boc-L-cisteína,
sin
embargo,
este
desventaja de no estar comercializado
ultimo
con
presenta
la
(83).
HS NH-CO-CH (CH ) -Ó-CH-COOH J d ¿
CH -CO-f-NH-fH-COOH 0 c h 2- s h
XXXVIII
que
,
XXXIX
Recientemente se han publicado un par de trabajos en los que los derivados de aminoácidos separan mediante cromatografía
en
como fase móvil L-prolina y Cu(II). separan
como
C u (I I )-L-prolina
complejos (86-87).
mixtos
DL fase Los
con
OPA
inversa, isómeros
y
NAC
se
utilizando ópticos
diastereoisómeros
se de
- 42 -
I .2 .3.- Utilización de sustitutos de o-ftaldehido
El mínimo requisito estructural para que un reactivo condense con una amina primaria y un tiol es la la agrupación o-diacil ben ce no, en la cual al carbonilo sea aldehídico. pueden
resultar
Así,
los
adecuados.
producirían isoindoles
presencia
menos
un
grupo
o-cetobenzaldehidos
Ademas,
estos
1,2,3-t ris ustituídos,
(XL)
compuestos
(XLI)
(Esquema
1 0 ), que presumiblemente ofrecerían una mayor protección la
oxidación
que
o-acetilbenzaldehido (XLb)
la
que
(ABA)
proporciona
OPA
(XLa) y o-benzoilbenzaldehido
fueron seleccionados para comprobar
los derivados formados
el
la
(24).
S-R1 R' - 5 H , R"-NH2
0
R
XLI
XL
a.-
ABA
R = CH3
b .-
OBB
R = Ph ’
c.-
OPA
R = H
t
Esquema 10
'ante .
El
(OBB)
estabilidad
\
GÓ
de
de
- 43 -
Se realizaron estudios cinéticos utilizando G A B A . La formación del isoindol a partir de OBB mostró una cinética
de
pseudo-primer orden en presencia de un exceso de OBB y E T . Sin embargo, primer
la degradación del isoindol no siguió una cinética de orden
degradación
en es
radical libre,
estas
condiciones.
característica en la
que
de
existe
Esta
la un
cinética
autooxidación período
de
de
de
un
inducción,
seguido de la aceleración de la descomposición.
El isoindol derivado de OBB es
apreciablemente
mas
estable que el derivado de ABA (y éste a su vez es mas estable que el de O P A ) , aparentemente efectos estéricos,
debido
a
una
combinación
electrónicos y de resonancia,
el sustituyente fenilo en la posición 3.
Por
ejercidos por
otro
lado,
velocidad de formación del isoindol a partir de OBB menor
que
con
impedimento
OPA
o
estérico
ABA, del
lo
que
grupo
puede
fenilo,
de
es
ser que
la
mucho
debido reduce
al la
posibilidad de ataque nucleofílico intramolecular por la amina secundaria del cx'-alquilbencilsulfuro (Esquema 2, estabilización por resonancia del
reactivo.
X)
Así,
o
a
la
aunque
el
isoindol derivado de OBB es considerablemente mas estable el de ABA,
que
la lenta velocidad de formación del primero lo hace
menos recomendable como reactivo analítico.
Basándose en el hecho de que la estabilidad isoindoles
frente
a
la
autooxidación
electrofí1 ico én las posiciones cuando
el
isoindol
posee
1
y
3
(88)
y
(58)
se
sustituyentes
al
de
los
ataque
incrementa fuertemente
- 44
-
electroatrayentes, se ha propuesto la sustitución del otros nucleofilos tales como embargo, HSO a”
Na",
SCN-,
HSO 3
y
CN~.
Sin
al utilizar alanina como amina primaria solo el CN" y
formaron
derivados
flúor es c ent es .
Se
observo
aumento de estabilidad en el deri vado de CN" con derivado
de
ME,
sin
embargo,
intensidad fluorescente menor
La sustitución aldehido
tiol por
(N D A ) (XLII)
CN" origina derivados
de
el
primero
un
respecto presento
una
(89).
OPA
por
2
,3-naftalendicarboxi-
en la deriva tización de aminoácidos 1-cianobenz (f )isoindolol
OPA
la útil ización de NDA y ME
derivados inestables y muy poco fl uo rescentes. El
con
(XLIII),
presentan mayor fluorescencia que los derivados de (89-93). Por el contrario,
al
que y
ME
produce
Esquema
11
muestra el posible me.canismo de fo rmación de los derivados
de
NDA y CN".
RNMj
XLII
NHR
Esquema
11
- 45 -
También se ha estudiado el 5-(N ,N-dimeti lam in o)-2,3naftaléndicarboxaldehido y a la posibilidad de derivados con C N " . Sin isoindoles isoméricos
(XLIV),
debido a su mayor solubilidad
incrementar embargo, (91)
la la
fluorescencia reacción
(Esquema 12).
CN ,CHO CHO N M «2 X L IV
Esquema 12
origina
de
los dos
- 46 -
I .3.- DETERMINACION DE LISINA.
AMINAS SECUNDARIAS..
CISTINA Y
CISTEINA CON O-FTALDEHIDO
1.3.1 - Determinación de U s i n a y aminas secundarias
En presencia de un exceso del
reactivo
OPA-ME,
la
lisina forma un derivado que posee dos grupos isoindol,
debido
a la existencia en la molécula del aminoácido
de
grupos
amino terminales.
lisina
Chen y col.
(10)
valoraron
dos
reactivo OPA-ME.
Cuando el grado de sustitución era
encontró que la
intensidad
fluorescente
fluorescencia disminuyó,
el
^ < 1.
se
a
la
1.
la
llegando a ser la decima parte de
la
obtenida con otros aminoácidos,
era
con
similar
& >
sin embargo cuando
de otros aminoácidos en la lisina di su st i tu id a.
Sin
embargo,
la
fluorescencia
disustituida aumenta en presencia de
un
anionico
sádico
como
el
dodecil
sulfato
observándose el mismo efecto con (95). Asi,
un
de
la
agente
tensioactivo
(DSS)
tensioactivo
es probable que la extinción
de
la
lisina
(10)(94), no
ionico
fluorescencia
sea debida a la interacción de los dos grupos isoindol
de
la
las aminas secundarias tales como
la
lisina y que el tensioactivo facilite su separación.
Por otro lado,
prolina e hidroxiprolina no pueden con el reactivo OPA-ME, aminas primarias.
determinarse
directamente
sino que previamente deben oxidarse
Para ello se han empleado reactivos como
cloramina T y especialmente el hipoclorito sádico
a la
(2)(11)(30).
- 47 -
Sin embargo, sensibilidad, con
las
la mayor desventaja del procedimiento es su
baja
aproximadamente diez veces menor que la obtenida
aminas
primarias.
conversión incompleta
a
Esto
amina
puede
ser
primaria
o
debido a
una
incompleta entre la amina primaria formada y el por la interferencia del exceso de oxidante
la
reacción
OPA,
causada
(96).
El exceso de hipoclorito es capaz de aminas primarias formando cloraminas
a
[17-18] y
clorar de
a
las
oxidar
al
OPA y al ME.
NaOCl + RNHa
> NaOH + RNHC1
[17]
NaOCl + R N H C 1 --------- > NaOH + RNCla
[18]
Sin embargo,
la sensibilidad de la reacción
por adición de 2,2 *-tiodie tan ol, con
el
exceso
de
hipoclorito
monocloraminas en aminas primarias
que
aumenta
probablemente reacciona
[19] [20]
NaOCl + (HOCH 2 C H 2 )aS ------ > NaCl +
y
convierte
las
.
(H 0 C H 2 C H 2 ) 2 SO [19]
RNHC1 + (H0CH2CH2)2S + H 2 O ------ > R N H 2 + (HOCH 2 CH a ) 2 SO + HC1 [20]
- 48 -
1.3.2.- Determinación de cistina y cisteína
El derivado que forman la cistina y cisteína con reactivo OPA-ME es mucho menos fluorescente que el que la mayoría de los aminoácidos
forman
(en proporciones equimolares
alrededor de 40 veces menos fluorescente reactivo no es en principio adecuado cistina y cisteína en proteínas,
), por
lo
el
que
es este
para la determinación de
considerando además
su
bajo
contenido en las mismas.
El hecho de que la aminas
primarias,
fluorescente,
de
aunque
cisteína,
lugar no
a
ha
en
un
sido
oposición producto
a
otras
débilmente
completamente
explicado,
parece ser debido a la presencia del grupo tiol en la molécula de cisteína,
el cual compite intramolecularmente con el ME por
la posición 1 en el isoindol
(I)
(97-98).
reacciona con el reactivo OPA-ME, reductores del medio,
Sin
debido
Cuando
la
a
condiciones
las
cistina
se forma el derivado de la cisteína.
embargo,
algunos
derivados
cisteicos,
al
reaccionar con OPA-ME originan una fluorescencia superior a la producida por la cistina y cisteína S-carboximetilcisteína
}
el
(Tabla ácido
S-3-sulfopropilcisteína dan lugar a veces superior a la
que
cistina y
pueden
cisteína
origina
8)
una la
(2).
cisteico
transforman en estos derivados cisteicos.
si
por
la y la
fluorescencia
cisteína,
determinarse
Así,
40-80 lo
previamente
que se
- 49 -
Tabla 8. Formación d e r i v a d o s c i s t e i c o s (2).
Reactivo
de
derivatizante
isoindoles
Derivados
fluorescentes
con
cisteicos
If -
-
Cisteína
0 .5
-
Cistina*
1 .0
4-Vinilpiridina
S ~ p ~ ( 4 - p i r i d i l e t i l )c i s t e í n a
2 .5
Ditiotreitol tetrationato
S-sulfocisteína
2 .9
y sódico
Et i l a m i n a
S - 2 - a m i n o e t i l c i s te ína
19 .9
Acido
iodoacético
S-carboximet ilcisteína
22. 9
Acido
performico
Acido
34 .8
Tri-n-butilfosfina 1,3-propanosulfona
■ b
cisteico
S-3-sulfopropilcisteína
y
43 .G
Se c o m p a r a n c o n c e n t r a c i o n e s e q u i m o l a r e s L a c o n c e n t r a c i ó n de c i s t i n a es la mitad que la o t r o s c o m p u e s t o s , d e b i d o a su e s t r u c t u r a d i m é r i c a .
En los análisis de en los
que
cisteico,
cistina
aminoácidos totales en proteínas,
cisteína
dos horas y media,
con
ácido
Desafortunadamente, performico, cistina,
se
determinan
como
previamente
a
ácido
metanosulfonico durante
el
que
también
tirosina, valina
se
(42)(97)(99-100).
tratamiento
origina
e histidina
esto ultimo se minimiza por adición de la
liofilizacion
mezcla (102).
de
reacción
con
a
la hidrólisis
con
no solo se destruyen los puentes disulfuro
sino
triptófano,
diluyendo
los
la oxi-dacion con ácido performico se lleva a cabo
0*C durante acida
y
de
la
de
la
destrucción
de
(99)(101);
agentes agua,
acido
aunque
reductores seguida
o de
- 50 -
Bermudez y col.
(103) propusieron un método para
determinación fluorimetrica de mezclas de glicina con OPA-ME, propuesto,
utilizando un montaje
FIA.
En
el
y
cisteína
procedimiento
la cisteína es oxidada a ácido cisteico
con lo que su fluorescencia aumenta en gran
con
medida,
que la glicina no es afectada por el oxidante.
la
KIO*,
mientras
Se consigue
resolución de la mezcla de aminoácidos a partir de la
la
señales
obtenidas en presencia y en ausencia de oxidante.
Sin embargo, con el reactivo OPA-ME
la derivatizacion de cistina y cisteína tras
.su
oxidación,
no
general una buena reproducibilidad, dado el
carácter
de las reacciones de formación de ácido cisteico obtención de los isoindoles
(reducción).
presenta
de
opuesto
(oxidación) y
Además,
total de aminoácidos requiere la obtención
el al
análisis menos
hi dro liz ado s, uno en presencia de ácido performico y su ausencia
(100). Obviamente,
es deseable
la
en
dos
otro
en
existencia
de
unas condiciones experimentales para el análisis de todos
los
aminoácidos a partir de un solo hidrolizado.
Lee y Drescher que, tiol
(97) propusieron un método
previamente a la adición del reactivo de
la
cisteína
es
bloqueado
1,3-propanosulfona para formar determinar
cistina,
tri-n-butilfosfina.
OPA-ME,
el
el
grupo
reacción
con
S-3-sulfop ro p i lc is te ín a.
Para
reduce
por
en
esta
se
a
La
1,3-propanosulfona
cisteína
con
reacciona
- 51 -
específicamente con la cisteína bajo
condiciones
modo que otros aminoácidos no resultan afectados
suaves,
de
(la mezcla de
reacción se mantiene bajo atmosfera de Na a 25°C durante 2 h ) . La sulfop rop ila cio n, seguida de hidrólisis con H C 1 , condujo buenos
resultados
para
todos
los
aminoácidos,
triptofano que se destruyo completamente, a la acción del H C 1 . Por el contrario, metanosulfonico origino unos triptofano
excepto
probablemente debido
la hidrólisis con ácido
resultados
aceptables
para
(recuperación del 80%) y excelentes para los
aminoácidos.
Además,
el
método
alquilacion e hidrólisis se hidrólisis.
Sin
cancerígeno
de
embargo,
es
a
directo:
realizan
en
debido
al
el
la
el
demás
reducción,
mismo
tubo
posible
de
carácter \
la
1,3-propanosulfona,
se
deben
tomar
precauciones especiales de aislamiento durante el tratamiento.
El bloqueo del grupo tiol con el
ácido
para formar S-carboximetilcisteína, produce un una intensidad fluorescente similar a la de los otros aminoácidos con OPA-ME
iodoacetico
compuesto derivados
(98). El procedimiento es
la separación de su derivado con OPA-ME mediante H P L C . El
el grupo tiol también permite la formación de otros con OPA-ME, y cisteína
de
rápido
y permite la determinación de cisteína en suero y orina,
de reactivos como iodoacetamida y acrilonitrilo para
con
tras uso
bloquear derivados
que son adecuados para la determinación de cistina (98).
- 52 -
El bloqueo del grupo amino de que esta actué puramente como tiol.
la
cisteína
El NAC
(XXXVII)
permite ha
sido
utilizado como estándar interno en la determinación de
tioles
con
en
OPA
y
taurina
(104).
La
utilización
derivatización de aminoácidos ha
de
NAC
la
sido comentada en el apartado
1 . 2.2 .
Un estudio interesante en el que -D-valina
hacen
reaccionar
es el de Usher y col.
cT- (L-ot'-aminoadipi 1) -L-cisteini 1-
(ACV) con OPA en ausencia de un
tiol;
por HPLC mostró un solo pico a los 26 min
.
el
Por
se obtuvo un pico principal a los
segundo pico a los 28 min
. Así,
a un compuesto fluorescente, grupos amino y tiol,
mismas
min
y
que
el
pico
a
un
corresponde
en el que el ACV proporciona
mientras
corresponde a un isoindol,
lado,
las
26
el pico a 26 min
análisis
otro
cuando se cromatografio el derivado de OPA-NAC en condiciones,
(81),
los
los
28
min
donde el ACV reacciona tan solo por
el grupo amino. Utilizando NAC más diluido,
el grupo tiol
del
ACV compitió más favorablemente con el tiol externo y el
pico
a los 28 min disminuyó.
La cisteína puede también comportarse como su reacción con OPA y una (104)
amina
primaria.
eligieron arbitrariamente taurina
para la reacción flu orogenica, y determinación de cisteína y
otros
Nakamura
como
aplicaron tioles
líquida con derivatización po st -c ol um na . La
tiol
amina el
por
y
en col.
primaria
método
a
la
cromatografía
presencia
de
un
- 53 -
gran exceso de
taurina
impide
que
el
grupo
amino
cisteína reaccione con el OPA. La mezcla de OPA y
de
la
taurina
da
lugar a un color rojo que aumenta con el tiempo y disminuye la capacidad de inducir fluorescencia en los tioles,
por
lo
que
el eluato se debe mezclar en primer lugar con la disolución de OPA y luego con la taurina.
La
reacción
se
completa
pocos segundos de añadir la taurina. Más tarde, desarrollaron otro
procedimiento
para
estos
determinar
donde la taurina fue sustituida por L-triptofano
Una modificación de este determinación simultánea
de
y
7
tioles con taurina y OPA a pH 9-10
y
permite
la
cisteína se eluye conjuntamente-con la cistina,
la
tras
su
reducción
de
derivatización
(105). En
autores cisteína,
disulfuros,
separación en una columna de intercambio iónico, los disulfuros con sulfito a pH
los
(45).
procedimiento
tioles
a
de
columna,
los la
sin embargo es
posible la determinación diferencial omitiendo el
sulfito
en
la post- co lu mn a. Un inconveniente del procedimiento es que una concentración de sulfito excesiva produce una. disminución la fluorescencia,
debido probablemente al consumo de
OPA
de por
el bisulfito.
Sin embargo, originan
otros aminoácidos
productos
fluorescentes,
débilmente
cuando el
(10)(45). Mopper y Delmas
ME
se
y
aminas
fluorescentes reemplaza
por
la
primarias o
no
cisteína
(106) propusieron un método para
la
determinación de trazas de tioles biológicos por cromatografía
- 54 -
líquida y derivatización pre-columna con OPA, taurina es sustituida por 2-aminoetanol. A alta de 2-aminoetanol
(>
12
mM)
se
una
que
con
otros
tioles),
cisteína con OPA se mejoro
drásticamente,
una
(unas
mientras
concentración de amina inferior a 1 mM la
el
que
la
concentración
observo
fluorescente más bien baja para la cisteína menor
en
respuesta 100
que
veces
con
reactividad pero
el
una de
la
derivado
eluyo junto con el volumen muerto.
La
razón
de
este
comportamiento
puede
ser
la
participación del grupo amino de la cisteína en la reacción, una concentración baja de la amina. cisteína
pueda
funcionales
reaccionar
( amino y tiol
tipo de los isoindoles
a
La posibilidad de
través
de
sus
) para producir un
(XLV),
que
dos
la
grupos
fluoroforo
del
tal como ocurre con el glutation
(XLVI), ha sido también sugerida por otros autores.
(COOH)
XLV
a
COOH
XLVI
- 55 -
Por otro lado, Nakamura y Tamura fluorescencia al
hacer
temperatura ambiente,
reaccionar
en
ausencia
la
(104) no observaron
cisteína
de
otra
amina
Estos autores pensaron que ello era debido a la reacciones
laterales,
fluorescentes, formado,
con
formación
en
comparación
miembros que origina el glutatión
(XLVII)
cisteína)
forman con
segundos
a
50°C
(incluyendo OPA
(en
derivados
ausencia
OPA
por
post-columna.
cromatografía
Además,
de
isoindol en
el
el
de
10
anillo
(107) encontraron que cisteína
y
un
tiol
las
en
pocos
externo),
estos y
los
,^-dimetil-
fluorescentes
líquida
determinaron
derivados fluorescentes formados,
del
no
resultante
propusieron un método para la separación de con
de
.
Recientemente Metz y col. ^3-aminot ioles
con
a
primaria.
productos
o a la ausencia de fluorescencia
anillo de 5 miembros
OPA
aparición
de
debido probablemente a la tensión
con
y
compuestos
derivatización
estructuras
de
los
analizando sus extractos
en
cloruro de metileno mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
(GC-MS).
el OPA reacciona selectivamente producir
Los análisis demostraron con
los
^0-aminotioles
2,3-dihidrotiazo(2,3 a )isoindoles
(XLVIII)
similares a los obtenidos con las aminas primarias presencia de un tiol externo
(I)
que
(11-12)(21).
y
para [21],
OPA
en
- 56 -
XLVI I
XLVIII
La cisteína formo un derivado fluorescente 356 nm
, A e m = 438 nm
), sin embargo,
aislarlo fueron infructuosos, descomposición,
como
se
( Aex
=
reiterados intentos para
debido aparentemente a su rápida
comprobo
por
la
perdida
fluorescencia y cambios de color en los tres primeros después de la salida de la columna.
No obstante,
de
minutos
por similitud
con los otros ^5-aminotioles se propuso la estructura XLV.
También se ha observado que las proteínas en general producen
productos
fluorescentes
con
OPA
en
presencia
y
ausencia de ME. El rendimiento de la fluorescencia en ausencia de ME puede incrementarse por reducción previa de los disulfuro a grupos tiol libres,
y
anularse
por
previo de las proteínas con N-e til ma le im id a, que grupos tiol
la
cisteína
5-hidroxiindoles
en
la
separación
acción y
con
OPA
en
medio
determinación se hace
uso
de
diversos
halla
la
cisteína,
entre
los
tratamiento bloquea
los
(108-109).
Resulta interesante señalar la de
puentes
que
se
HC1
interferente
determinación 8
M
agentes para
.
En
de esta
reductores, prevenir
la
- 57 -
autooxidación de los 5-hidroxiindoles
(110-113). Sin
la cisteína puede reaccionar con OPA para formar fluorescente, (111)(113).
por
En un
lo
que
estudio
se
recomienda
realizado
un
evitar
por
producto su
Tachiki
muestra cómo la cisteína presenta su máxima
embargo,
uso
(111)
se
fluorescencia
al
calentarse con OPA en HC1 8 M durante 50 min a 82 °C.
Por ultimo, NDA
(XLII)
como
recientemente se ha propuesto el uso del
reactivo
alternativo
al
determinación fluorimetrica específica de débilmente alcalino a 20°C ( A e x = tiempo de reacción 25 min) la adición de tiol,
462
OPA
arginina nm,
Aem
(114). La reacción no
e incluso su presencia
aminoácidos no presentan interferencia
en =
excepto
la medio
520
nm,
requiere
interfiere.
debido a la presencia del grupo tiol, que debe por tratamiento con N-etilmaleimida.
para
de
Otros
la
cisteína,
ser
bloqueado
- 58 -
I.4.-
DETECCION ESPECTRQFOTOMETRICA DE LOS ISOINDOLES
La gran mayoría de los métodos existentes basados en la reacción del o-ftaldehido fluorimétricos,
aminas
su
análisis
de
aminoácidos con OPA se debe a que esta técnica es al menos
un
sobre
340
fuerte
nm
,
absorción
son
también
OPA
la
primarias
los
de
embargo,
las
de
derivados
sin
con
permite
determinación espectrofotométrica El mayor uso de la fluorimetria en
el
orden de magnitud más sensible que la espectrofotometría y sin embargo,
en
la
reacción
con
OPA,
esta
ultima
puede
ser
deseable en algunas ocasiones por diversas causas:
1.- Las
absortividades
distintos aminoácidos
molares
muestran
de
menor
los
isoindoles
variabilidad
que
de los
respectivos rendimientos cuánticos fluorescentes.
2.- En algunos casos pueden existir efectos de de
la
fluorescencia,
péptidos,
que
presentan una intensidad de fluorescencia menor que la de
los
aminoácidos
como
(10)(115-116),
molares son similares
3.- El método
ocurre
mientras
con
que
los
extinción
sus
absortividades
(117)'.
espectrofotométrico
puede
ser
alternativa cuando no se dispone de un fluorímetro.
la
única
- 59 -
El método espectrofotométrico presenta un limite detección para los aminoácidos de 7x10“ • M, ligeramente que el obtenido con
ninhidrina
comparación con la ninhidrina, absorbencia muy bajas cromoforo
son
(2x10“ • el
OPA
a
frente
tampoco
unas
necesarias
calentamiento y enfriamiento,
La sustitución en la modifica la forma del espectro la
cadena
lateral
del
el
al
en
lecturas
de
como
el
ambiente,
oxigeno
etapas
mayor
embargo,
reactivo
temperatura
requiriendose su protección son
presenta
(-3 M
C o i i t i m (M) : (1) 3 .6x10 "6 ; (2) 5.4x10-* ; (4) 9.1x10-* ; (5) 1.09x10-“ ;(6) 1.27x10-“ ; (8) 1.63x10-“ ; (9) 1.81x10-“
(3) 7.3x10-* ; (7) 1.45x10-“ ;
- 126
-
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0 0
2 CISTINA x
10*
(M)
gura 2 2 . - Gráfica de calibrado en medio borico-borato. Copa
= 8.75xl0~3 M
- 127 -
Medio ácido
Las disoluciones anteriores con HC1 hasta pH
cierta
proviene
440
nm
y
de de
concentración.
aunque
llegan
a
algunos otros Así,
que el
procedimiento no es lo suficientemente selectivo para permitir la determinación de cistina en
fluidos
útil tras una separación cromatográfica.
biológicos,
pero
es
- 324 -
Aunque en origina con ausencia,
presencia
o-ftaldehido
un
de
mercaptoetanol
derivado
de
la
cistina
cisteína,
en
los productos de reacción de cistina y cisteína
muy distintos,
apareciendo un precipitado verde a
su son
violeta
al
acidificar las disoluciones que contienen cisteína.
El método de Asmus indico que el derivado de se forma por reacción de un mol de cistina con o-ftaldehido
(constante de formación,
l o g J3Z -
dos 7.7).
se confirmo la existencia de dos grupos ácidos con
cistina moles
de
Asimismo, log
Ki
=
5.88 y log Ka-= 3.71 a I = O.l.y 20°C,que pueden
corresponder
a la protonacion de
dos
grupos
reacción es probable que sea
una
carboxilo.
El
producto
de
ftalimida
en
la
el
puente disulfuro de la cistina permanece intacto.
cual
- 325 -
UTILIZACION DE N-ACETIL-L-CISTEINA EN LA
DETERMINACION
DE
AMINOACIDOS CON O-FTALDEHIDO
El bloqueo del grupo amino
de
la
tioles que pueden ser utilizados en las o-ftaldehido.
cisteína
origina
derivatizaciones
Con N-acetil-L-cisteína se forman isoindoles
gran estabilidad,
con de
con un máximo de absorción a 335 nm.
El derivado de isoleucina-N-aceti1-L-cisteína presenta la máxima absorción en el intervalo de pH 7.5-11 la
absorbancia
es
constante
para
Asimismo,
relaciones
o-ftaldehido
/isoleucina y N-acetil-L-cisteína/isoleucina mayores de 5 y 3, respectivamente.
En estas condiciones,
la reacción
rápidamente a temperatura ambiente y el
derivado
transcurre formado
es
estable durante al menos una hora.
La absortividad molar media de los isoindoles de aminoácidos proteicos primarios formados N-acetil-L-cisteína es ,
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UNIVERSIDAD DE VALENCIA
FA&UITAD OE CIENCIAS QUIMICAS
R eu nid o el Tribunal q u e suscribe, en el día d e la fe c h a , a c o r d ó otorgar, por unanim idad, a esta Tesis doctoral d e
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