Siglo XVII

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MICROSCOPIOS MICROSCOPIOS MICROSCOPIOS MICROSCOPIOS Griego: Mikros: pequeño Skopein: mirar

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Zacharias Jansen Holanda (1588

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- 1638)

• Jan Swammerdam observó insectos y sangre con corpúsculos que le dan ese color. 3 y 9 aumentos

• Nehemiah Grew estudió los órganos de reproducción de las plantas y descubrió los granos de polen. • Reigner de Graaf describió en el ovario los folículos. • Marcello Malpighi sus primeros estudios los realizó con pulmones de rana, descubrió que las arterias y las venas se hallaban unidos mediante los capilares.

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Robert Hooke (1665) Observó el corcho constituido por pequeñas celdillas con aire, que llamó “células”

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Microscopio Simple

Antony van Leeuwenhoek (1632 – 1723) Logró aumentos de 270 X sin perjuicio de la nitidez

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Otto Muller (1773) Describió los bacilos y espirilos

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Joseph Jackson Lister (1820) Microscopio acromático

Aberración cromática

La distancia focal es distinta para los diferentes colores

Lente acromático

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RESOLUCIÓN Es la propiedad de un sistema óptico de hacer visibles como independientes dos puntos muy cercanos entre sí

LR= 1/PR Ojo humano = 0,1 mm Microscopio óptico = 0,2 mm Microscopio electrónico = 0,2 nm micrómetro (µm): 10-6 metros nanómetro (nm): 10-9 metros angstrom (Å): 10-10 metros

0,61 . l LR = AN

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RESOLUCIÓN

LR = Índice de refracción

0,61 . l N . AN Sen m

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RESOLUCIÓN

0,61 . l LR = AN Las partículas también se comportan como ondas (De Broglie 1926)

LR = 0,17 µm Microscopio electrónico l electrón = 0,005 nm Magnificación : Objetivo X Ocular

LR = 0,2 - 0,5nm

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l = 550 nm Objetivo 10X Ocular 20 X

AN 0.15

Magnificación: 200 X Objetivo 40X Ocular 5 X

Resolución: L= 2.2 μ

AN 0.65

Magnificación: 200 X

Resolución: L= 0.5 μ

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Aberraciones

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esférica Geométricas astigmatismo en coma curvatura de campo

Cromáticas

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Alteración de la forma

Distorsiones en los colores.

Tipos de objetivos Plan: Corrige aberraciones geométricas. Combinable con otras lentes Achromat: Corrige aberración esférica y cromática para rojo y azul. Fluorite (semi-apochromats): Corrige aberración esférica y cromática para rojo y azul. Permite mayores aperturas numéricas y resultando en imágenes más luminosas.

Apochromatic: Eliminan las aberraciones cromáticas en los tres colores (RGB), y corrigen las esféricas . Tienen aperturas numéricas superiores a los anteriores. Es la mejor elección para foto micrografía.

MICROSCOPIOS Campo Oscuro Luz visible

Contraste de Fase Interferencia Luz polarizada Campo Ultravioleta

Luz ultravioleta

Fluorescencia

Confocal Multifotón

Electrónicos

sonda de Barrido (SPM)

Transmisión (TEM) Barrido (SEM) Efecto túnel (STM)

Contacto Fuerza atómica (AFM) No contacto intermitente

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Campo Oscuro Bloquea los rayos centrales de luz dejando pasar los oblicuos. Luz reflejada y difractada por la muestra.

VENTAJAS *Permite ver partículas dispersas en un medio homogéneo. * Hace posible la observación del movimiento Browniano de las partículas. * Se puede utilizar para la observación de preparaciones sin colorear. * Visualiza los bordes destacados de las muestras. * Técnica valiosa para observar microorganismos de tipo Treponema pallidum, espiroquetas con diámetros superior a 0.2 um •DESVENTAJAS * Inadecuada preparación de la muestra. * Difícil acceso al microscopio que posea el condensador especial por su alto costo. * No deja visualizar estructuras celulares especificas, solo bordes de células partículas.

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Contraste de Fases microscopio basado en cálculos matemáticos

Uso: células vivas, tejidos vivos, cortes no coloreados

= espesores = índice refracción = Fase La fase de un haz de luz es imperceptible a la vista El microscopio lo transforma en diferencias visibles de intensidad

Luz difractada

Fritz Zernike 1934 Premio Nobel de Física 1953

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Ventajas Permiten observar las células en acción y estudiar los movimientos implicados en procesos como la mitosis o la migración celular. Se usa para medir índice de refracción y concentración de sólidos de las estructuras celulares. Es útil para determinar masa seca y espesor de las estructuras celulares.

Fondo claro

Células en cultivo

Contraste de Fase

Células en cultivo

Desventajas: produce halos y es difícil obtener una alta resolución. La fuente luminosa debe ser muy intensa

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Interferencia Produce imágenes claras y sin halos, con aspecto tridimensional y permite observar estructuras incoloras como si fuesen coloreadas

Es costoso e incómodo.

(7) Imagen intermedia

De luz polarizada Birrefringencia aparece un rayo regular rápido que vibra en una dirección y otro paralelo llamado irregular con velocidad de propagación más lenta y que vibra ortogonalmente con respecto al primero (6)Lente

materiales isótropos índice de refracción constante materiales anisótropos distintos índices de refracción (5) Analizador rotado 90º en relación a (1)

(4) Objetivo

(3) Espécimen iluminado con luz polarizada lineal.

(2) Condensador

(1)

Filtro polarizador

Es útil para examinar estructuras birrefringentes (fibras musculares, fibras proteicas del tejido conectivo, gotas lipídicas y fotorreceptores retinianos).

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Microscopio invertido

Las muestras se pueden colocar en diferentes recipientes con espesores y características ópticas variables. Permite observar organismos o tejidos en cultivo sin una preparación previa disminuyendo las condiciones de estrés. Cámara de video: actividades dinámicas de las células

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Microscopio invertido

Alga

Cultivo celular

Fondo claro

Contraste de fase

Desventajas: costo y limitada magnificación

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Microscopio con procesador de imágenes

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Fluorescencia Fluorescencia primaria (autofluorescencia)

Fluorescencia secundaria (fluorocromo) Isotiacianato de fluoresceína (FITC) 490 – 520 nm Tetrametil Rodamina 540 – 570 nm Naranja de Acridina 480 – 510 nm Diaminofenilindol (DAPI) 372 – 456 nm Ioduro de propidio 493 – 630 nm

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Fluorescencia

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Fluorescencia

Fibroblastos cultivados:Golgi: amarillo (anti-galactosiltransferasa) Microtúbulos: verde (anti-tubulina)

Células de cerebro en cultivo Neuronas: neurofilamentos (amarillo) Astrocitos: PFAG (rojo)

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Microscopio confocal Escaneo de láser (LSCM) TIPOS

Escaneo de platina (SSCM) Escaneo de disco (DSCM)

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Citoqueratina Desmoplaquina

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Fibroblasto Actina: rojo Vimentina: verde

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Microscopio confocal

Cortes ópticos a distinta profundidad Reconstrucción tridimensional

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VENTAJAS Imágenes siempre en foco Secciones ópticas Imágenes 3D Muestras vivas

Colocalización molecular

DESVENTAJAS Intensidades de excitación superiores ( láser). Mayor tiempo de exposición. Anticuerpos menos diluidos.

Tubulina verde Actina roja

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Microscopio electrónico 1924 D`Broglie carácter ondulatorio de los electrones 1926 Busch presenta el diseño de una lente electromagnética

Lente electromagnética

Ernst Ruska y Max Knoll 1933: Diseño y construcción del primer ME. 1986: Premio Nobel de Física

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λ

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Fuente de alto voltaje

Columna vacío

Cátodo

Ánodo Lente condensadora

Objeto

Lente objetivo

Imagen intermedia

Lente proyectora

Imagen final

Pantalla fluorescente

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Microscopio Electrónico de Transmisión (MET) Permite el estudio de la ultraestructura de materiales orgánicos o inorgánicos. APLICACIÓN Determinación de estructura cristalina y tamaño de partícula en minerales, metales, etc. Identificación de bordes de grano e interfaces en metales. Estudio de fases y zonas cristalinas en polímeros. Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos térmicos. Realización de estudios de histoquímica para identificar compuestos específicos. Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales y animales. Reconocimiento de virus. Estudios de citoquímica. Estudios de estructuras moleculares

Platino

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3 mm

Portaespecimen

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1965: primer microscopio electrónico de barrido comercial.

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MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO - SEM

Los convierte en una señal electrónica que es proyectada en un tubo de rayos catódicos (CRT)

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Microscopio electrónico de barrido

APLICACIONES DE MEB (SEM) Sus análisis proporcionan datos como textura, tamaño y forma de la muestra. Estudio de materiales Caracterización micro estructural de materiales. Composición de superficies y tamaño de grano. Valoración del deterioro de materiales, fatiga, corrosión, fragilización etc. Estudio químico y estructural de obras de arte, alteración de monumentos, identificación de pigmentos (restauración, autentificación)

Otros campos: Geología Odontología Paleontología y Arqueología: Peritajes Medicina Forense Botánica, Biomedicina y Medicina Electrónica

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OPTICO

Long. de onda) Aumentos Lím.resolución Espesor muestra

400-700 nm 20-1500 X 0,2um 5-7um

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TEM

SEM

0,005 nm 2000-600.000X 0,2-0,5nm 50-70nm

0,005nm 50-50.000X 10 nm 1 cm

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La microscopia SPM (microscopia de proximidad) sonda de barrido Una sonda puntiaguda barre la superficie de una muestra, monitorizándose la interacciones que ocurren entre la punta y la muestra. - Una punta. - Un sistema de nanodesplazamiento. - Una muestra. - Un dispositivo de acercamiento punta/muestra. - Una electrónica y/o informática de control. Las características generales : - Desplazamientos de hasta 150 μm en el plano, y 10 15 μm en altura. - Resolución de hasta 0.01 Å, resolución teórica de las cerámicas piezoeléctricas. - Permiten trabajar en medios muy variables: al aire, en atmósfera controlada, en vacío y ultra-alto vacío, altas/bajas temperaturas, líquidos

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MICROSCOPIO DE FUERZA ATÓMICA (AFM)

De contacto La fuerza origina la flexión del brazo adaptándose a la superficie de la muestra. Un láser incide sobre el dorso del brazo y se refleja sobre un fotodetector obteniendo una imagen gráfica de la superficie

De no contacto Se excita cerca de su frecuencia de resonancia de modo que vibre cerca de la superficie de la muestra a frecuencias de 100 a 400 kHz y conforme se acerca la punta a la superficie se detectan cambios en la frecuencia de resonancia La sensibilidad de la técnica proviene de la frecuencia de resonancia del cantilever.

De contacto intermitente La punta está en intermitente contacto con la superficie a la vez que la barre. La variación de la amplitud de oscilación de la punta, debida a la amortiguación sobre la superficie es lo que se utiliza como señal de control. Evita las fuerzas de laterales y de fricción que ocurren en la AFM.

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De contacto -Ventajas: amplia gama de muestras a analizar; (medidas in situ en una celda líquida o en la celda electroquímica) Alta resolución - Desventajas: la punta está en contacto con la superficie; problemas de destrucción de la punta o modificación de la superficie, arrastre de partículas.

De no contacto Ventajas: no existe modificación ni contaminación de la muestra; se pueden medir diferentes gradientes de fuerza (magnética, electrostática, etc.). Desventajas: resoluciones altas requieren que la punta se sitúe muy cerca de la superficie

De contacto intermitente Ventajas: medida muy estable; fuerza de presión muy débil; resolución elevada Desventajas: no puede trabajar en medio líquido; no se llega a resolución atómica; barridos más lentos.

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MICROSCOPIO DE EFECTO TUNEL (STM) Heinrich Rohrer y Gerd Binnig (1981)

Premio Nobel de Física 1986 (junto con Ruska)

(Scanning Tunneling Microscope )

No utiliza luz, ni haz de electrones, ni ópticas Fuente: Nube de electrones de la superficie de la muestra Sonda: punta que se desplaza de manera constante sobre sup De W (pulidas electroquímicamente), Pd, Pt-Ir .

Ventaja : resolución a escala atómica. Para conseguir este tipo de resolución se ha de trabajar sobre muy buenos conductores (Pt, Au, Cu, Ag). Limitaciónes: imposibilidad de trabajar con muestras aislantes. Trabajar in-situ, al vacío o a baja temperatura. punta de wolframio

Es un instrumento fundamental en el campo de la nanotecnología y la nanociencia.

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Microscopio de Efecto Túnel

Microscopio de Fuerza Atómica

Cromosomas

Fibras colágenas

ADN

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Toda interacción que se pueda medir entre la punta y la muestra puede dar lugar a una forma de microscopia SPM.

Otros tipos de microscopia SPM son: Lateral Force Microscopy (LFM), Force Modulation Microscopy,

Magnetic Force Microscopy (MFM), Electric Force Microscopy (EFM), Surface Potential Force Microscopy, Phase Imaging, Force Volume, Electrochemical STM & AFM (ECM), Scanning Thermal Microscopy (SThM), etc

PENSEMOS ¿Con qué microscopio se obtuvieron las siguientes fotografías?

A

B

C

D

E

F

1- Confocal 2- Luz polarizada 3- Interferencia 4-TEM 5-SEM 6- Fluorescencia