Referencia:

2FD97-0916-C02-01

MINISTERIO DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DIRECCION GENERAL DE INVESTIGACION

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO TECNOLÓGICO

INFORME FINAL Investigador Principal:

Marta Gil Farré

Título del Proyecto:

Estudio de la calidad de la carne y de su determinismo genético mediante marcadores moleculares en una población Landrace.

Organismo:

Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries

Centro:

Centro de Tecnologia de la Carne

Departamento:

Calidad de Canal y de Carne

Fecha de Inicio:

01-junio-1999

Fecha de Finalización:

31-diciembre-2001 Fecha: 12 abril 2002

Conforme el Representante Legal del Organismo:

Fdo: Agustí Fonts

El Investigador Principal:

Fdo: Marta Gil

Ilmo. Sr. Subdirector Gral. de Proyectos de Investigación Paseo de la Castellana, 160. 28071 MADRID

A. MEMORIA. Resumen de los resultados del proyecto en relación con los objetivos propuestos (máximo 2000 palabras). Destaque su relevancia científica y/o su interés tecnológico. En el caso de haber obtenido resultados no previstos inicialmente, indique su relevancia para el proyecto. En caso de resultados fallidos, indíquense las causas.

El objetivo final del proyecto es identificar zonas del genoma o genes con efectos relevantes en la calidad de la carne de manera que su conocimiento posibilite la creación de líneas comerciales de alto rendimiento pero cuya calidad de carne sea superior a la de las líneas actuales. Para

alcanzar dicho objetivo se han analizado diversos caracteres que influyen en la calidad de la carne en cerdos de una línea comercial Landrace y se ha estudiado su variabilidad genética mediante marcadores moleculares. El proyecto, por su naturaleza, debía implicar la colaboración de diversos grupos especializados en diversas disciplinas. Por ello, el proyecto se dividió en dos subproyectos: 1.- Gestión, manejo y control del material animal, análisis de caracteres de calidad de carne, desarrollo metodológico y análisis estadístico (grupo IRTA: UdL-IRTA y CTC). La gestión, manejo, y control del material animal, el desarrollo metodológico, y estadístico, han corrido a cargo del grupo UdL-IRTA, mientras que los análisis de las diversas características de calidad de la carne han sido realizados principalmente por el grupo CTCIRTA. 2.- Análisis molecular (grupo UAB). El grupo UAB (subproyecto 2) ha sido el responsable del análisis molecular.

TAREA 1.- Determinación del diseño óptimo para detectar QTLs en una población comercial En primer lugar se abordó la optimización de un diseño experimental en una población comercial abierta seleccionada para múltiples caracteres (crecimiento, % carne), situación en la que se encuentra la población Landrace objeto de estudio. Dicha situación crea dificultades para emplear estrategias como el genotipado selectivo. El principal parámetro que puede manejarse es el número de padres que han de intervenir en la obtención de la generación de animales que contituirán el material animal del proyecto. Basándonos en los resultados de simulaciones y en estudios teóricos, hemos elegido cinco machos con la finalidad de disminuir el riesgo de que todos los machos fueran homocigotos para el QTL, y con el fin de incrementar la potencia estadística. TAREA 2.- Obtención de datos fenotípicos y DNA genómico. Se eligieron 5 machos y 72 hembras Landrace que produjeron 502 descendientes. A todos ellos se les extrajo sangre que fue enviada al grupo UAB responsable del subproyecto 2. El número total de animales sacrificados y la estructura familiar figuran en la tabla siguiente:

1

Tabla 1 Machos 1

2

3

4

5

Nº cerdas Nº camadas Nº hijos *

Total 77

17

19

17

101

104

115

15 95

14

86

87

502

* Matadero La cooperativa Copaga facilitó el matadero para el sacrificio de los animales. Estos se distribuyeron en 6 lotes de engorde y, por lo tanto, de sacrificio. Se dispone de las siguientes medidas de los 502 animales: -

Peso a los 120, 150, y 165 días de edad Espesor de tocino dorsal a los 120, 150, y 165 días de edad Peso vivo al sacrificio (175 días) Peso de la canal Espesor de tocino dorsal sobre canal (dos medidas) FOM pH 45' Semimembranoso (SM) pH 45' Longissimus dorsi (LD) pH 24 h. SM pH 24 h. LD Conductividad Eléctrica (CE) 45' SM CE 45' LD CE 24 h. SM CE 24 h. LD Longitud de la canal Peso jamón izquierdo (izq) y derecho (der) Peso paletillas izq. y der. Peso chuletero izq y der. Peso costilla izq y der. Peso panceta izq y der.

TAREA 3.- Análisis calidad de carne En el Centro de Tecnología de la Carne (CTC-IRTA) se han llevado a cabo las siguientes medidas de calidad de carne y determinaciones químicas y bioquímicas en el músculo Longissimus dorsi:

2

-

pH, CE y color (L, a, b) a 24h. Porcentaje de miosina lenta o tipo I (MHC I), relacionado con las fibras de tipo I (de contracción lenta y oxidativas. Actividades enzimáticas: Lactato deshidrogenasa (LDH), característica del metabolismo glicolítico, e isocitrato deshidrogenasa (ICDH), del metabolismo oxidativo.. Determinación de la cantidad de pigmentos musculares (mioglobina). Medidas de textura (test de Warner-Bratzler). Determinación de los componentes responsables del olor sexual (en la grasa subcutánea): escatol, indol y androstenona.

Dado que se recogían las muestras de longissimus en el matadero el mismo día del sacrificio y se transportaban al Centro, al día siguiente se medían los valores de pH y CE en el lomo para observar si había algun efecto del transporte. Paralelamente, en el matadero se medían (grupo UdL-IRTA) también estos dos parámetros a 24 h en las canales, aunque en otro punto del músculo. Por lo tanto, se tienen dos medidas de estas variables en el LD. Las medidas de pèrdidas a la cocción que se plantearon en el diseño inicial del proyecto se descartaron posteriormente debido a la baja repetitividad del método detectada en otros estudios realizados en el Centro. Además, las medidas, por imposibilidad pràctica, se hubieran hecho en muestras congeladas en lugar de frescas, con lo que el error hubiera sido mayor. La información que se obtiene puede suplirse con las medidas de pH, color y CE. En la tabla 2 se muestran los valores medios, desviaciones estándar y valores mínimos y máximos obtenidos para las variables de calidad de carne analizadas en el músculo longissimus dorsi, excepto las correspondientes al olor sexual: Tabla 2 Variable

n

Media

Desviación. estándar

Valor Mínimo

Valor Máximo

pH 24h CE 24 h(µs) L* a* b* % MHC I1 Act. LDH 2 Act. ICDH 3 Pigmentos (µg/g) F.ruptura (kg/cm2)4 F máx.(kg/cm2)4 Pendiente (kg/s)4

491 490 465 487 487 502 502 502 502 377 377 376

5.48 11.22 51.96 6.81 1.75 7.9 3262.28 1.29 34.95 6.63 6.74 0.34

0.15 4.13 3.63 2.01 1.35 4.1 610.92 0.45 6.99 1.82 1.81 0.14

5.17 1.70 39.6 -2.74 -1.01 1.1 1049.88 0.25 19.76 3.19 3.32 0.16

6.75 19.90 64.92 11.17 7.9 27.5 4703.84 3.10 64.33 15.58 15.58 2.23

*Según CIE (1976) ; 1porcentage de cadena pesada de miosina lenta o miosina tipo I; 2Unidades de actividad lactato deshidrogenasa: µmol NADH/min.g ; 3Unidades de actividad isocitrato deshidrogenasa: nmol NADPH/min.g; 4Variables de textura obtenidas mediante el test de WarnerBratzler: Fuerza de ruptura, fuerza máxima y pendiente.

3

Es importante tener en cuenta la variabilidad de la línea Landrace con respecto a cada característica estudiada. Una variabilidad elevada facilitará, en principio, la búsqueda de genes o grupos de genes asociados a dicha característica (será más probable que existan). La concentración de escatol y androstenona puede clasificarse en baja, media y alta, según la tabla 3: Tabla 3 (ppm)

Escatol

Baja 0.00-0.10 Media 0.11-0.21 Alta 0.22-

Androstenona 0.00-0.50 0.51-1.00 1.01-

La tabla 4 muestra la distribución del número de muestras en las concentraciones de escatol, indol y androstenona en los animales estudiados, según la clasificación anterior. Puede observarse que más del 90% de los animales presentaron concentraciones bajas de los tres compuestos. Tabla 4 Escatol Indol Androstenona N Baja Media Alta

480 447 19 14

480 474 3 3

< 0,01 < 0,03

236

374

480 459 18 3 245

Los valores obtenidos para las variables bioquímicas, porcentaje de MHC I, actividades LDH e ICDH y pigmentos, han sido parecidos a los publicados por diversos autores. Ruusunen and Puolanne (1997) hallaron diferentes porcentajes de fibras de tipo I al estudiar las propiedades histoquímicas del músculo Longissimus de cerdos de tres líneas genéticas distintas: 15.2% para la línea Hampshire, 13.2 % para la Landrace Finlandesa y 9.9% para la Yorkshire. En el estudio de Henckel et al. (1997), la línea Landrace presentaba un 12.8% de fibras de tipo I y una actividad LDH de 2811 µmol/min.g, mientras que la línea Large White tenía un 13.0% de fibras tipo I y una actividad LDH de 2976 µmol/min.g. Los músculos Longissimus de animales procedentes del cruzamiento (Landrace Danés x Large White x Duroc) presentaban valores del 12% de fibras tipo I (Petersen et al., 1998). Al estudiar las características de las fibras de cerdos Landrace y cerdos Ibéricos, Serra et al., (1998) hallaron diferentes proporciones tanto de fibras tipo I como de pigmentos hemo: 9.09% y 39.5 µg hematina /g, respectivamente para los Landrace y 12.09% y 47.9 µg hematina /g, para los Ibéricos. Hay que tener en cuenta que el método utilizado para la determinación de las fibras de tipo I en este proyecto es un método inmunoquímico (ELISA), basado en la detección de un anticuerpo monoclonal específico para la isoforma lenta de la miosina (MHC I) (Picard et al., 1994). Este método permite obtener el % de

4

este tipo de miosina en el músculo, pero los resultados pueden no coincidir exactamente con los obtenidos mediante los métodos histoquímicos, que se basan en actividades enzimáticas relacionadas con la contracción y con el metabolismo de las fibras. Bibliografía Commission Internationale de l’Eclairage (1976). CIE Publication 36. Henckel, P. Oksbjerg, N., Erlandsen, E., Barton-Gade, P., Bejerholn, C.(1997). Meat Sci. 47, 311-321. Picard, B., Leger, J., Robelin, J. (1994). Meat Sci. 36, 333-343. Ruusunen, M. and Puolanne, E. (1997). Meat Sci. 45, 119-125. Serra, X., Gil, F., Pérez-Enciso, M., Oliver, M.A., Vázquez, J.M., Gispert, M., Díaz, I., Moreno, F., Latorre, R., Noguera, J.L. (1998) Livestock Prod. Sci. 56, 215-223. TAREA 4.- Desarrollos metodológicos y análisis estadísticos Se han desarrollado una serie de herramientas estadísticas para analizar los datos de este proyecto, y otros de similar diseño, utilizando aproximaciones clásicas y bayesianas. La investigación se ha focalizado principalmente en tres aspectos. 1. Computación de relaciones genéticas con marcadores de ADN. La precisión en la estimación de la probabilidad de identidad por descendencia (IBD) en un loci o posición genómica de interés es de capital importancia en el estudio de caracteres cuantitativos y resistencia a enfermedades. En el marco del proyecto hemos desarrollado un método basado en Cadenas de Markov de Monte Carlo (MCMC) para computar las probabilidades IBD entre individuos condicionadas a los marcadores de ADN y a la información de pedigrí. Los IBDs pueden obtenerse en un pedigrí general completo en cualquier posición de interés, y todos los marcadores e información de pedigrí disponible se utiliza. 2.

Computación del factor de Bayes en análisis de QTL. Un aspecto fundamental en mapeo de QTL es determinar la verosimilitud de un QTL en una posición del genoma. El análisis Bayesiano ofrece una via muy atractiva de probar modelos alternativos (QTL versus no QTL) via el factor de Bayes. Hay distintas alternativas numéricas para computar el Factor de Bayes, en general basadas en MCMC, pero estas estrategias están sujetas a problemas numéricos o de estabilidad. En el marco del proyecto, proponemos un procedimiento simple y estable para calcular el Factor de Bayes entre modelos jerarquizados. El procedimiento se basa en la reparametrización de una componente de varianza del modelo en términos de correlación intraclase. Se han codificado los programas informáticos que permiten su implemención.

3.

Desarrollo y utilización de metodología de máxima verosimilitud para probar los efectos de los alelos del QTL en la varianza en poblaciones abiertas. La interacción entre alelos del QTL y otros genes que afectan al carácter, puede conducir a varianzas diferentes en individuos que heredan alelos alternativos de un progenitor. Dicha metodología se aplicará a caracteres distribuidos normalmente y también para caracteres longitudinales en poblaciones abiertas, como es el caso de la población Landrace analizada en este proyecto, y con marcadores genéticos aleatorios. Se han codificado los programas informáticos que permiten su implementación.

5

B. RESULTADOS MÁS RELEVANTES ALCANZADOS EN EL PROYECTO

En el momento en el que se redacta este informe final, se está en plena fase de análisis del conjunto de los datos y de preparación de dos artículos científicos para sendas revistas internacionales (Journal of Animal Science y Genetics, Selection, Evolution.). Cuando se publiquen se enviará copia al Ministerio. 1. En el marco del proyecto hemos desarrollado un método basado en Cadenas de Markov de Monte Carlo (MCMC) para computar las probabilidades IBD entre individuos condicionadas a los marcadores de ADN y a la información de pedigrí. Los IBDs pueden obtenerse en un pedigrí general completo en cualquier posición de interés, y todos los marcadores e información de pedigrí disponible se utiliza. 2. El desarrollo de un procedimiento simple y estable para calcular el Factor de Bayes entre modelos jerarquizados. 3. Desarrollo y utilización de metodología de máxima verosimilitud para probar los efectos de los alelos del QTL en la varianza en poblaciones abiertas. 4. El análisis de porcentaje de magro en la canal utilizando 23 microsatélites revela: 1) Los marcadores SW2443 e IGF2 fueron significativos al 5 y 1% cuando se testan para diferencias en la media obtenida por hijos que heredan alelos alternativos de sus padres; 2) Los marcadores SW2618 y S0070 fueron significativos al 1% cuando se testan el efecto de los alelos del QTL en la varianza poligénica. Los resultados de los hijos que heredan ambos alelos del verraco 2 se representa en la Figure 1, dónde se ilustra la distinta varianza en los dos subgrupos de progenie.

6 5 4 3 2 1 0

frecuencia

frecuencia

Figura 1. Distribución del porcentaje de tejido magro en dos grupos de descendientes heredando alelos alternativos del verraco 2. El marcador es el SW2618.

40

50

60 % magro

-

70

80

6 5 4 3 2 1 0 40

50

60

70

80

% magro

Se han enviado dos comunicaciones a Congresos Internacionales a celebrar durante el año 2002: 1) L. Gomez-Raya, Varona, L., Rauw, W.M., Vidal O., and J.L. Noguera. Maximun likelihood allows testing the effect of QTL alleles on variance. 7th World Cong. Genet. Appl. Livest. Prod., Montpellier, Francia. Agosto 2002. 2) L. Gomez-Raya, L. Varona , W.M. Rauw, J.L. Noguera. Maximun likelihood testing of the effect of QTL alleles on variance for normal and longitudinal traits. 53rd Annual Meeting of the EAAP, Cairo, Egypt September 1- 4, 2002.

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C. RESUMEN DE LOS RESULTADOS DEL PROYECTO 1. Formación del personal Personal Formado

Nº ( )

Personal formado o en formación que se ha transferido al sector industrial: Doctores ( )

Titulados Superiores

( )

Técnicos

( )

2. Tesis doctorales

( )

3. Artículos científicos en revistas

( )

nacionales

( X)

internacionales En preparación

4. Artículos de divulgación en revistas

(X )

nacionales

( )

internacionales En preparación

5. Artículos de revisión en revistas

( )

nacionales

( )

internacionales

6. Libros, capítulos de libros y monografías

( )

nacionales

( )

internacionales

7. Conferencias en congresos (por invitación)

( )

nacionales

( )

internacionales

8. Patentes y otros títulos de propiedad industrial

( ) ( )

registrados España

( ) ( )

en explotación extranjero

1. FORMACIÓN DE PERSONAL EN RELACIÓN AL PROYECTO, describir brevemente.

2. TESIS DOCTORALES REALIZADAS TOTAL O PARCIALMENTE EN EL PROYECTO. Indicar: Título, nombre del doctorado, Universidad, Facultad o Escuela, fecha de comienzo, fecha de lectura, calificación y director.

7

3. ARTICULOS CIENTÍFICOS EN REVISTAS. Indicar: Autor(es), título, referencia de la publicación.

Están, en estos momentos, en fase de preparación dos artículos científicos para publicar en revistas internacionales. Uno de ellos se enviará al Journal of Animal Science y el otro a Genetics, Selection Evolution.

4. ARTÍCULOS DE DIVULGACIÓN EN REVISTAS. Indicar: Autor(es), título, referencia de la publicación.

5. ARTÍCULOS DE REVISIÓN. Indicar: Autor(es),título, referencia de la publicación.

6. LIBROS, CAPÍTULOS DE LIBROS Y MONOGRAFÍAS. Indicar: Autor(es), título, referencia de la publicación

8

7. CONFERENCIAS EN CONGRESOS, SIMPOSIOS Y REUNIONES (POR INVITACIÓN) Indicar: Autor(es), nombre del congreso, lugar de celebración, año.

1) L. Gomez-Raya, Varona, L., Rauw, W.M., Vidal O., and J.L. Noguera. Maximun likelihood allows testing the effect of QTL alleles on variance. 7th World Cong. Genet. Appl. Livest. Prod., Montpellier, Francia. Agosto 2002. 3) L. Gomez-Raya, L. Varona , W.M. Rauw, J.L. Noguera. Maximun likelihood testing of the effect of QTL alleles on variance for normal and longitudinal traits. 53rd Annual Meeting of the EAAP, Cairo, Egypt September 1- 4, 2002.

8. PATENTES Y OTROS TÍTULOS DE PROPIEDAD INDUSTRIAL. Indicar: Autor(es),título , registro, entidad titular de la patente, año, países, clase.

D. CARÁCTER DE LOS RESULTADOS DEL PROYECTO (señalar hasta dos opciones) ( ) Teóricos

( X) Teórico-prácticos

( ) Prácticos

( X ) De inmediata aplicación industrial

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E. COLABORACIONES Y PARTICIPACIÓN EN PROGRAMAS INTERNACIONALES. 1. Si el proyecto ha dado lugar a colaboraciones con otros grupos de investigación, coméntelas brevemente. En caso contrario, indicar qué dificultades ha encontrado.

2. Si ha participado en proyectos del Programa Marco de I+D de la UE y/o en otros programas internacionales en temáticas relacionadas con las de este proyecto, indique programa, tipo de participación y beneficios para el proyecto. Mencione las solicitudes presentadas al Programa Marco de la UE durante la ejecución del proyecto, aunque no hayan sido aprobadas.

Se ha participado en el proyecto "Transferring QTL technology to the pig breeding industry (PigQTech) - a demonstration project". (Contract no. BIO4-CT97-2243) del Programa Marco de I + D de la U.E. Los socios del proyecto han sido: Universidad de Uppsala (Suecia), Roslin Institute (UK), Universidad Autónoma de Barcelona, COPAGA (España), Scan Avel HB (Suecia), Pig Improvement Company (UK), e IRTA. Nuestra participación ha sido como Associated contractor.

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F. PROYECTOS COORDINADOS 1 1. Describa el desarrollo de la coordinación entre Subproyectos, y los resultados de dicha coordinación en relación a los objetivos globales del Proyecto.

Tal cómo se indicaba en la memoria del proyecto, se trataba de un estudio multidisciplinar y que sólo podía llevarse a cabo aunando la experiencia de cada uno de los grupos en su especialidad. Cada grupo posee un conocimiento y especialización en un tipo de disciplina distinto y complementario, de forma que han sido necesarios ambos para el planteamiento del estudio, consecución de sus objetivos y explotación de resultados. Aunque las tareas de cada grupo se han realizado con independencia uno de otro, el sentido final del proyecto y su principal objetivo – la identificación de las principales regiones del genoma que afectan a la variabilidad de la calidad de la carne en una población Landrace – implicaban la conjunción de conocimientos y especialización del grupo IRTA y del grupo UAB. Así pues, la realización de este proyecto no hubiera sido posible sin el concurso de los dos grupos participantes. Durante todo el proyecto los dos grupos han realizado reuniones periódicas, y se han mantenido en contacto para el seguimiento de tareas a fin de asegurar el cumplimiento del plan de trabajo definido, y también para la eventual discusión de incidencias.

1

A rellenar sólo por el coordinador del proyecto. 11

G. RELACIONES O COLABORACIONES CON DIVERSOS SECTORES G1. Si en el proyecto ha habido colaboración con Entes Promotores Observadores (EPO) participantes: 1. Describa en detalle la relación mantenida con los EPO’s, y la participación concreta de éstos en el proyecto, especificando, si procede, su aportación al mismo en todos sus aspectos. (Si se ha modificado la relación y/o el apoyo del EPO, en relación con lo previsto a la aprobación del proyecto, descríbalo brevemente).

La empresa NOVA GENETICA S.A. ha facilitado las instalaciones y suministrado el material animal de acuerdo con el diseño experimental. También ha colaborado en la obtención de muestras biológicas y en la realización de los controles en granja. La empresa COPAGA ha facilitado las instalaciones de su matadero para el control individual de las canales y de su despiece. Así mismo, ha posibilitado la obtención de muestras de carne de la canal para el análisis laboratorial. La colaboración de ambas empresas ha sido altamente satisfactorias.

2. Describa, si procede, las transferencias realizadas al (los) EPO (s) de los resultados obtenidos, indicando el carácter de la transferencia y el alcance de su aplicación.

3. Indique si esta colaboración ha dado lugar a la presentación de nuevos proyectos o si se tiene intención de continuarla en el futuro. En caso afirmativo, describa brevemente cómo va a concretarse.

La colaboración con NOVA GENETICA S.A. ha dado lugar a otros dos proyectos: a. Arquitectura genética de caracteres relacionados con el crecimiento y la composición corporal (CICYT AGF99-0284-C02-01) b. Detección de QTL's y genes candidatos que afectan a caracteres reproductivos de interés económico en el porcino (CICYT AGL2000-1229-C03-01).

G2. Si el proyecto ha dado lugar a otras colaboraciones con el entorno socioeconómico (industrial, administrativo, de servicios, etc.), no previstas inicialmente en el proyecto, descríbalas brevemente.

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H. RESUMEN DE GASTO DEL PROYECTO Miles de pta. 1. Gastos de personal (indicar datos personales, situación laboral y función desempeñada)

Total _______________________________________________________________________________________________ 2. Material inventariable (describir brevemente el material adquirido)

Total _________________________________________________________________________________________________ 3. Material fungible (describir brevemente el tipo de material)

Total _________________________________________________________________________________________________ 4. Viajes y dietas (describir brevemente)

Total _________________________________________________________________________________________________

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5. Otros gastos (describir brevemente)

Total _________________________________________________________________________________________________ 6. Costes indirectos.

Total _________________________________________________________________________________________________ 7. En caso de que exista algún remanente de consideración en alguno de los capítulos, indique su cuantía y las previsiones de gasto.

_________________________________________________________________________________________________ TOTAL GASTOS DEL PROYECTO :

CONFORME con el resumen de gastos realizados en el Proyecto, el Responsable de los Servicios de Gestión del Organismo o Centro beneficiario. D./Dª. :

Fecha :

Cargo :

Firma y Sello :

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