Monitoreo de ensayos de laboratorio Utilización y preparación de controles internos para las pruebas de tamizaje de Infecciones Transmisibles por Transfusión. (ITT)

Controles propios del equipo • Controles negativos (calibradores) • Controles positivos (calibradores) • El valor de corte se obtiene a partir de los calibradores

¿Cómo deben ser los ensayos de laboratorio? • Confiables • Exactos (dentro del rango definido por calibradores) • Deben tener un comportamiento estable día tras día, es decir, deben ser consistentes o precisos • Para ello, las condiciones de los ensayos deben ser estables día tras día

¿Qué condiciones se deben controlar en cada ensayo? • Tiempos de incubación • Temperatura de reacción • Correctas diluciones o preparaciones de cada reactivo • Estabilidad de los reactivos • Cambios entre lotes de reactivos • Funcionamiento de distintos instrumentos y equipos • Variaciones provocadas por distintos operadores

¿Cómo se puede conocer la variabilidad en las condiciones entre ensayos? Utilizando controles internos, independientes de los controles o calibradores provistos por el equipo o kit, como herramienta de monitoreo de los ensayos de tamizaje: Controles internos positivos: positivos débiles

Controles internos: Propiedades • Poseer una composición similar a las muestras verdaderas • Deben ser procesados e interpretados de igual manera que las muestras • Estar disponibles en cantidad suficiente para un período adecuado de trabajo (por ej.: 6 meses o más) • Ser estables en el período de uso • Estar fraccionados de acuerdo a su empleo (deben estar presentes en cada corrida) • Presentar poca variación en su concentración de alícuota a alícuota o vial a vial • Para el caso de los EIAs el valor de absorbancia debe estar en el orden de 2 a 3 veces el valor de corte. • En el caso de técnicas de aglutinación se deben usar controles internos con títulos bajos

Preparación de controles internos (Materia prima) •

Obtención de sueros a partir de unidades de plasma, tanto de sueros negativos como de sueros positivos caracterizados por 2 o más pruebas, siempre que sea posible, por pruebas suplementarias

•

Sueros positivos para anticuerpos anti: Trypanosoma cruzi, HIV, HCV, HBcore, HTLV-I/II, Sífilis, Brucelosis (para Argentina). Antígenos HBs y HIV p24

•

Se pueden preparar controles individuales o de reactividad múltiple

Preparación de controles internos (Obtención de sueros, técnica propuesta) • Seleccionar las bolsas de plasmas y descongelar a 37°C • Agregar con jeringa 1 ml de solución de Cloruro de Calcio 1 M por cada 100 ml de plasma (concentración final 10 mM) • Incubar en baño a 37 °C hasta coagulación • Dejar toda la noche en la heladera para completar la coagulación • Clarificar el suero de las bolsas centrifugándolas 15 minutos a 4600 RPM a 4°C • Dializar contra solución fisiológica en heladera con agitación, durante 20 horas aproximadamente, recambiando la solución fisiológica en ese período

Preparación de controles internos (Precauciones) • En la preparación de un control interno para HBsAg, los sueros no reactivos utilizados para realizar las diluciones deben ser aHBs no reactivos (por posible formación de complejos y disminución del título de HBsAg) • En el caso preparar controles para el Antígeno p24, dada su baja prevalencia, es posible utilizar como materia prima: sobrenadantes de cultivos celulares infectados con HIV o controles positivos provenientes de equipos comerciales • No es conveniente preparar un control interno multi-reactivo mezclando un suero a-HIV reactivo con el material que contenga Ag p24 (formación de complejos)

Preparación de controles internos (Desarrollo) • Hacer diluciones de los sueros positivos en sueros negativos de manera de obtener productos que sean reactivos en dos o tres veces el valor de corte • Definir volumen total a preparar (según frecuencia de trabajo y volumen utilizado para las determinaciones) • Calcular los volúmenes de sueros positivos originales necesarios (utilizando los datos del volumen total a preparar y las diluciones seleccionadas) • Preparar la mezcla llevando a volumen con suero no reactivo, homogeneizar bien y volver a probar la reactividad

Preparación de controles internos: rangos de diluciones probables a-HIV

103 - 105

Chagas

variable (1/5)

HBsAg

103 - 105

Sífilis

variable (1/5)

a-HCV

más de 1/50

Brucelosis

variable (1/5)

a-HBcore

102 – 103

Ag p24

1/10

a-HTLV

variable (1/5)

(controles positivos)

Ag p24 (sobrenadantes de cultivo)

102 – 103

Preparación de controles internos •

Hacer ajustes agregando suero reactivo o suero no reactivo según sea necesario que la reactividad sea aumentada o disminuída

•

Volver a probar la reactividad si hubo ajustes

•

Homogeneizar y, si es posible, filtrar para lograr sueros estériles (más estables)

•

Se pueden agregar conservantes. Por ejemplo: Bronidox al 0.05% o Thimerosal 0.01%. No utilizar azida sódica

•

Fraccionarlo de manera tal que cada vial alcance para no más de 3 días.

•

Congelar a –20 o –80°C

Alternativas de preparación

• Utilización de albúmina al 6% como diluyente de los sueros positivos • Utilización de sueros positivos débiles confirmados (no obtenidos por dilución) • Utilización de plasma (posibles inconvenientes debido a la fibrina)

Adquisición de controles comerciales

Utilización diaria del control interno • Incluir en cada corrida un control interno. Cuando se utiliza micro-ELISA se debe colocar un control interno por placa. Cuando se utilizan sistemas automatizados abiertos se debe incluir un control interno cada 24 hs de trabajo. • Se debe calcular la relación de positividad para cada valor e incluir el valor en el gráfico de control.

Validación del control interno • Evaluar el control interno durante 20 corridas y registrar los valores obtenidos para obtener un promedio (x) • Calcular el desvío estándar (s) • Tomar ese valor promedio para construir el gráfico de Levey Jennings • Eje de las x: días de corrida o ensayos • Eje de las y: densidad óptica / valor de corte en cada punto

Gráfico de Levey-Jennings DO/CO 6 5 4 3 2 1 0 01- 02- 03- 04- 05- 06- 07- 08- 09- 10- 11- 12- 13- 14- 15- 16Jun Jun Jun Jun Jun Jun Jun Jun Jun Jun Jun Jun Jun Jun Jun Jun

Fecha

Cálculos estadísticos • Promedio (X)= Σxi / n xi= RP (Densidad Optica/CutOff

(valor de corte))

RP= Relación de Positividad

• Desvío estándar (s)=

Σ (xi – X)2 / n-1

• Coeficiente de variación (CV%)= s/X *100 Un CV % mayor al 20% es inadecuado

• Unidades Desvío estándar (UDS)= (xi – X) / s

Monitoreo diario: ejemplo de tablas Fecha Abs CI+ Cut off RP CI+ USD CI+ LOTE N* Venc 07-Mar 0,719 0,196 3,67 0,7 A43LH Oct-03 08-Mar 0,753 0,202 3,73 0,84 10-Mar 0,565 0,187 3,02 -0,82 11-Mar 0,711 0,212 3,35 -0,04 12-Mar 0,705 0,205 3,44 0,16 13-Mar 0,721 0,206 3,5 0,3 14-Mar 0,678 0,193 3,51 0,33 15-Mar 0,798 0,203 3,93 1,32 17-Mar 0,747 0,2 3,74 0,86 18-Mar 0,606 0,192 3,16 -0,51 19-Mar 0,641 0,216 2,97 -0,95 20-Mar 0,715 0,202 3,54 0,4 21-Mar 0,691 0,194 3,56 0,45 22-Mar 0,609 0,202 3,01 -0,23 22-Mar 0,786 0,203 3,87 2,36 24-Mar 0,663 0,208 3,19 0,29 25-Mar 0,623 0,197 3,16 0,22 26-Mar 0,575 0,201 2,86 -0,69 27-Mar 0,557 0,188 2,96 -0,38 28-Mar 0,546 0,197 2,77 -0,96

Abs CI+: Absorbancia del control interno positivo RP: Densidad óptica / cut off USD: Unidades de desvío estándar USD = (RPi - RP promedio)/s

Monitoreo diario: ejemplo de gráficos

UDS CI+ UDS

3 2 1 0 -1 -2 -3

01Jul

02Jul

03Jul

04Jul

05Jul

06Jul

07Jul

08Jul

09Jul

10Jul

11Jul

12Jul

13Jul

14Jul

15Jul

16Jul

17Jul

18Jul

19Jul

20Jul

21Jul

22Jul

23Jul

24Jul

fecha

Documentando paso a paso Ficha con los datos de cada lote de control interno donde consten: • Fecha de elaboración • Número de lote de control interno • Volumen preparado • Diluciones finales para cada marcador • Datos de las unidades de plasma utilizadas para su preparación • Volumen de fraccionamiento • Operador • Tipo, marca y lotes de reactivos utilizados para la caracterización del control interno • Planilla con los valores de D.O. de los controles y valores de corte en sucesivas corridas para el cálculo de parámetros

Ficha de preparación del control interno Preparación Control Interno Lote N° Reactividad: Fecha inicio preparación: Preparado por: Volumen preparado: Reactividad Marca (Método) reactivo

Material utilizado

Identific.

Filtrado: SI Conservantes: SI Volumen de utilización diaria total: Lote N° aceptado SI Fecha término de preparación: Observaciones: Revisado por:

NO NO

Volumen utilizado

Diluyente Dilución

ELISAs Resultado validación (RP)

Cuál ? Volumen de fraccionamiento:

NO Fecha inicio utilización:

Rango de aceptación

Téc. Aglut. semicuantitativas Título Rango de Dilución título diaria

Fraccionado en:

Planilla para el cálculo de parámetros Control interno Lote N° 10 Reactividad: HCV Motivo:Cambio de control interno (Lote N°10) Fecha Abs Cut off RP LOTE N* VENC Fecha inicio utilización: 29-Ene 0,589 0,364 1,618 J-2002 19/07/2003 Reactivo: 30-Ene 0,677 0,379 1,786 RP Control interno 31-Ene 0,601 0,367 1,638 Promedio 1,834 01-Feb 0,562 0,356 1,579 DS 0,295 04-Feb 0,599 0,377 1,589 n 20 05-Feb 0,768 0,386 1,990 06-Feb 0,724 0,373 1,941 Cut off 07-Feb 0,776 0,376 2,064 Promedio 0,373 08-Feb 0,475 0,356 1,334 DS 0,013 10-Feb 0,767 0,37 2,073 n 20 12-Feb 0,534 0,354 1,508 11-Mar 0,725 0,377 1,923 12-Mar 0,628 0,383 1,640 13-Mar 0,752 0,38 1,979 14-Mar 0,766 0,388 1,974 17-Mar 0,586 0,392 1,495 19-Mar 0,934 0,394 2,371 20-Mar 0,611 0,368 1,660 21-Mar 0,852 0,351 2,427 22-Mar 0,758 0,361 2,100

Revisado por:

¿Qué criterios se utilizan para validar los resultados de un ensayo? Los calibradores y controles de los equipos o kits deben cumplir con los criterios de validación del ensayo establecidos por el fabricante Los controles internos positivos deben ser reactivos, y deben encontrarse dentro de límites de desviación Para la toma de decisión frente al desvío pueden aplicarse las reglas o criterios de decisión aplicados a la química clínica: Reglas de Shewhart

Reglas o Criterios de decisión (Shewhart) • 12s Un control excede el límite x ± 2s (advertencia o alarma: Observar las otras reglas) • 13s Un control excede x ± 3s, corrida inválida • 22s Dos controles- consecutivos exceden el mismo límite, ya sea x+2s ó x–2s, corrida inválida • 41s Cuatro controles consecutivos exceden el mismo límite, x+1s ó x–1s corrida inválida • 10x Diez controles consecutivos caen del mismo lado de la media, corrida inválida

Reglas o Criterios de decisión (Shewart) • La regla 13s (puntos fuera del límite de control) indica errores aleatorios: de registro, de medición, defecto del equipo, error del operador. • Las reglas 22s , 41s y 10x se relacionan con errores sistemáticos: cambio de operadores, nuevo lote de reactivos, cambio de materia prima, deterioro del reactivo, error gradual en instrumentos.

Procedimiento de control aplicando las Reglas de Shewhart Dato del Control

No Bajo Control – Corrida válida

12S

No

Si No 13S

No 22S

Si

No R4S

Si

No 41S

Si

Fuera de Control – Corrida inválida

10x Si

Acciones a tomar al invalidar una corrida: 1. Investigar las causas que pudieron provocar el desvío observado: Incumplimiento del procedimiento operativo estándar, inadecuado funcionamiento del equipamiento, cambio de lote de reactivos, etc. 2. Implementar las medidas correctivas correspondientes. 3. Si la corrida fue inválida por el desvío del control interno, los resultados reactivos de esa corrida no se pueden invalidar y deben ser considerados como resultados inicialmente reactivos (repetirlos por duplicado en la siguiente corrida) 4. Repetir el ensayo.

Situaciones en las cuales es posible evaluar el informe de los resultados de corridas con un resultado del control interno fuera de rango: 1. Puede ser demostrado que el problema se debe al mismo material usado como control interno. 2. Puede ser demostrado que el problema es un hecho aislado que no afectaría el resto de la corrida (intercambio de muestras sembradas o error de transcripción) 3. Toda decisión que genera una acción que no cumple con lo establecido en los procedimientos operativos estándar debe ser registrada como una excepción.

Utilización de Controles para Tamizaje de Acidos Nucleicos (NAT) • Cada muestra posee un control interno (verificación de correcta preparación, amplificación y detección = validación del resultado individual) • En cada corrida deben analizarse controles negativos y positivos (validación de la corrida por los controles del equipo) • Si los controles se usan para determinar el cut off, se deben utilizar controles independientes para validar la corrida. Si los controles no se usan para calcular el cut off el uso de controles independientes es opcional. • Debe evaluarse el desempeño del laboratorio participando de un Programa de Evaluación Externa del Desempeño

Ejemplo de situaciones (tendencia) UDS

3 2 1 0 -1 -2

Señal de advertencia -3 1-

2-

3-

4-

5-

6-

7-

8-

9-

10-

11-

12-

13-

14-

15-

16-

17-

18-

19-

20-

21-

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

fecha

• Falla en la calibración de pipetas o equipamiento • Deterioro gradual de reactivos • Desgaste de algún componente del equipo • Identificar posibles causas y corregir según corresponda

Ejemplo de situaciones (corrimiento) UDS

3 2

Corrimiento del promedio 1 0 -1 -2 -3 1-

2-

3-

4-

5-

6-

7-

8-

9-

10-

11-

12-

13-

14-

15-

16-

17-

18-

19-

20-

21-

22-

23-

24-

Jul

Jul

Jul

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Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

Jul

fecha

• Cambio de lote de reactivo • Introducción de un nuevo equipo • Cambio de operador • Identificar posibles causas y corregir según corresponda

Ejemplo de situaciones (acercamiento a la media) UDS

3

2

1

0

-1

-2

-3 1-

2-

3-

4-

5-

6-

7-

8-

9-

1 0-

11-

1 2-

1 3-

1 4-

1 5-

1 6-

1 7-

1 8-

1 9-

20-

21 -

22-

23-

24-

Nov

Nov

Nov

Nov

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Nov

Nov

Nov

Nov

Nov

Nov

Nov

Nov

Nov

• Mejoramiento del proceso (ej. introducción de un equipo automatizado) • Cálculo inadecuado del desvío estándar (incorporación de datos con gran dispersión en el cálculo del desvío estándar) • Identificar posibles causas y corregir si es necesario.

fecha

Ejemplo de situaciones (periodicidad) UDS

3

2

1

0

-1

-2

-3 1-

2-

3-

4-

5-

6-

7-

8-

9-

1 0-

11-

1 2-

1 3-

1 4-

1 5-

1 6-

1 7-

1 8-

1 9-

20-

21 -

22-

23-

24-

Nov

Nov

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Nov

Nov

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Nov

Nov

Nov

Nov

Nov

Nov

Nov

• Alteraciones debidas al suero control interno. • Rotación regular de operadores o equipos. • Cambios sistemáticos en las condiciones ambientales. • Fluctuaciones en el voltaje eléctrico. • Identificar posibles causas y corregir según corresponda.

fecha

PROBLEMA N°1 En la siguiente tabla se muestran los valores del monitoreo diario del tamizaje de a-HIV utilizando un ELISA: Fecha Promedio de DO Control DO Control RP del Control UDS Control 10/04/2008 11/04/2008 12/04/2008 13/04/2008

DO Controles Negativos 0.005 0.007 0.004 0.005

positivo

interno

interno

interno

1.205 1.542 1.304 0.798

0.653 0.540 0.701 0.462

2.56 2.10 2.76 1.81

+0.04 -1.95 +0.91 -3.21

DO: Densidad óptica; RP: Relación de positividad (DO/Cut off); UDS: Unidades de Desvío Estándar Valores de validación del control interno: Promedio de RP = 2.55 Desvío estándar = 0.23 Características del ELISA: ELISA de 3ra generación. Sembrado de 100µ de muestra. Tres controles negativos y un control positivo (100µ) Primera incubación de 60 minutos a 37°C. Seis lavados con buffer. Segunda incubación de 30 minutos a 37°C sembrando 100µ de conjugado. Seis lavados con buffer. Tercera incubación de 30 minutos a temperatura ambiente sembrando 100µ de sustrato. Detención de generación de color con 100µ de ácido sulfúrico 1N. Lectura a 450nm con filtro de referencia de 630nm. Cálculo de cut off: Promedio de DO Controles Negativos + 0.250. Zona gris de ±10%. Resultados : Todo valor en zona gris o superior es considerado inicialmente reactivo. Criterios de validación: DO de cada control negativo menor a 0.200. DO del control positivo entre 0.800 y 1.600 1. ¿Son válidos los resultados del 13/04/2008? 2. ¿Por qué?

PROBLEMA N°2 En la siguiente tabla se muestran los valores de Unidades de desviación estándar (UDS) del monitoreo del control interno para un ELISA para detectar anticuerpos a-Trypanosoma cruzi:

4/2/2008

UDS del Control interno -1.51

5/2/2008

+0.62

6/2/2008

-0.83

7/2/2008

-1.29

8/2/2008

+1.90

11/2/2008

-2.78

12/2/2008

-3.57

13/2/2008

-3.21

14/2/2008

-1.95

15/2/2008

-2.52

18/2/2008

-3.05

19/2/2008

-2.56

20/2/2008

-3.16

21/2/2008

-1.98

22/2/2008

-3.40

Fecha

Observaciones

Cambio de lote del reactivo

1. ¿Deberíamos invalidar la corrida del 11/2/2008? 2. ¿Qué acción debemos realizar?

PROBLEMA N°3 Observar la siguiente tabla, donde se detallan las Unidades de desviación estándar (UDS) del monitoreo del tamizaje de HBsAg utilizando un método inmunofluorométrico:

1. ¿En qué fechas nos encontraríamos con valores de alarma del control interno según las Reglas de Shewhart? 2. ¿En qué fechas los resultados del tamizaje serían inválidos?

3/3/2008

UDS del Control interno +0.52

4/3/2008

-1.93

5/3/2008

+1.51

6/3/2008

-2.44

7/3/2008

+0.33

10/3/2008

-1.02

11/3/2008

-3.02

12/3/2008

+0.48

13/3/2008

+2.71

14/3/2008

+2.01

17/3/2008

-1.37

18/3/2008

+0.53

19/3/2008

-1.57

25/3/2008

-1.02

26/3/2008

-1.99

27/3/2008

-2.06

28/3/2008

-0.03

1/4/2008

-0.58

3/4/2008

-1.11

4/4/2008

-0.98

7/4/2008

-0.04

8/4/2008

-2.20

Fecha

Observaciones

PROBLEMA N°4 ¿Qué factores pueden causar los siguientes perfiles en los gráficos de Levey – Jennings en el monitoreo de un marcador de tamizaje de ITT?

A)

B)

C)

Bibliografía • Westgard, J.O., Barry P.L., Hunt M.R. A multi-rule Shewart chart for quality control in clinical chemistry. Clin. Chem., 27: 493-501, 1981 • Organización Panamericana de la Salud. Manual de procedimientos de control de calidad para los laboratorios de serología de los bancos de sangre. PAHO/HPC/HCT/94.21 Washington DC. Febrero 1994.