PRACTICAS DE ENSAYOS BIOTECNOLOGICOS (CFGS LABORATORIO DE ANALISIS Y DE CONTROL DE CALIDAD) Introducción Se presentan 4 prácticas de laboratorio para ser desarrolladas dentro del segundo curso del nuevo título de técnico superior en laboratorio de análisis y de control de calidad que sustituye al anterior de técnico superior en análisis y control y que ha entrado en vigor en este curso 2009-10. Concretamente este nuevo titulo incluye la existencia de un nuevo módulo denominado “Ensayos Biotecnológicos” para el que puede resultar un tanto difícil para el profesorado que lo imparte encontrar documentación para su desarrollo. Se presentan aquí un bloque de 4 practicas que por su sencillez y por no requerir de un instrumental excesivamente específico pueden realizarse en este nivel en cualquier centro educativo: Aislamiento de la proteína de la leche y determinación de su punto isoeléctrico (pI), Separación de las fracciones proteicas del huevo por precipitación, Cuantificación de proteína total (Biuret) y Medida de la actividad enzimática. No se incluyen otro tipo de prácticas como pueden ser la Electroforesis en geles de poliacrilamida SDS-PAGE o la Inmunodetección mediante “western blot” o “ELISA” porque estas requieren de un instrumental mas especifico que no esta disponible en todos los centros educativos.

Practica 1. Aislamiento de la proteina de la leche (caseína) Esta práctica consta a su vez de 3 partes: aislamiento de la caseína, preparación de una disolución de caseína y, por ultimo, determinación del punto isoeléctrico (pI) de la caseína. A. Aislamiento de la caseína: - Caliente en un vaso de precipitado 150ml de agua destilada a 38ºC, añada 50ml de leche y luego gota a gota y con agitación, adicione ácido acético 1M hasta que observe que se forma un precipitado (la leche se corta). - Deje sedimentar y filtre sobre papel de filtro usando un embudo de cristal. - Lave el precipitado con 20ml de etanol en el mismo filtro. - Seque el precipitado colocando varios pliegues de papel de filtro. - Coloque el precipitado en un vaso de precipitado pequeño previamente pesado, vuelva a pesar el vaso con el precipitado y luego adicione 5ml/g de éter etílico. - Filtre nuevamente. - Deseche el líquido quedando un precipitado blanco de fácil manipulación que es la caseína.

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B. Preparación de la solución de caseína: - Coloque aproximadamente 250 mg de caseína en un vaso de 50ml. - Agregue 20ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N; agite hasta lograr una solución total de la caseína. - Una vez disuelta la caseína, se vierte en un matraz aforado de 50 ml, adicione 5 ml de ácido acético 1N y diluya con agua destilada hasta 50ml y mezcle bien (pH=8,9) - La solución debe ser clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar. C. Determinación del pI de la caseína: En diez vasos de 25 ml limpios y secos adicione exactamente los volúmenes de los reactivos según la siguiente tabla: TABLA DE DISOLUCIONES

- Medir experimentalmente el pH de todos los vasos, que debe cubrir un rango aproximado semejante al teórico (3 a 6,5). Anotar los valores reales en la Tabla, que deben ser semejantes a los expresados y en todo caso crecientes. - Añadir 1 ml de disolución de caseína a cada tubo. - Agitar suavemente cada uno y esperar aproximadamente 3 minutos. - Medir la absorbancia de cada muestra a 640 nm con las cubetas de colorimetría de 1 cm de paso óptico, teniendo la precaución de agitar bien el contenido de cada tubo para obtener una solución/suspensión homogénea antes de verter una porción en la cubeta. - Anotar resultados, representar la absorbancia frente al pH, y determinar el pI aproximado de la caseína, que corresponderá al pH cuya absorbancia sea máxima.

Practica 2. Separación de las fracciones proteicas del huevo por precipitación La precipitación de proteínas usando sulfato de amonio se consigue por deshidratación en el microambiente de la molécula de proteína. En disolución, un gran numero de moléculas de agua están unidas al ion sulfato, reduciendo la cantidad de agua disponible para interaccionar con las moléculas de proteína. A una concentración particular de (NH4)2SO4, la cantidad de agua libre será insuficiente para mantener en disolución una proteína dada, resultando la precipitación de esa proteína.

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Las mejores condiciones para enriquecer una proteína específica de una mezcla compleja son determinadas empíricamente. Como una primera aproximación los siguientes porcentajes deberían ser de ayuda: 0-25%, 25-40%, 40-60%, 60-80%, y el 80% sobrenadante. De esta forma se pueden obtener cortes de distintas proteínas, lo que se conoce como precipitación fraccionada. El procedimiento es el siguiente: 1. Rompa un huevo y separe la yema de la clara. Descarte la yema y vacíe la clara en un vaso de precipitados de 250 ml. 2. Agite suavemente la clara. No agite vigorosamente pues provocaría la producción de espuma, cosa que no es recomendable. (Toda solución proteica si se agita produce espuma. Si la proteína es una enzima además se desnaturaliza). 3. Filtre a través de papel de filtro de tamaño de poro no muy cerrado. Puede filtrar directamente a una probeta para calcular la cantidad de filtrado que se obtuvo. 4. Mida el volumen de filtrado obtenido y vacíelo a otro vaso de precipitados de 250 ml. Añada un volumen igual de una solución al 100% de saturación de sulfato de amonio (la mezcla de ambas queda al 50% de saturación de (NH4)2SO4. Agite suavemente y deje reposar por unos 10 minutos. 5. Filtre a través de papel de filtro ordinario. El precipitado contiene la ovoglobulina y el filtrado contiene la ovoalbúmina todavía en disolución. 6. Pese el precipitado hasta pesada constante y disuelva este precipitado en un vaso de precipitados de 100 ml añadiendo 50 ml de cloruro de sodio al 1%. 7. Al filtrado, que ya está en solución al 50% de sulfato de amonio, agréguele sulfato de amonio sólido para llevarlo al 100% de saturación. Se mide la cantidad de filtrado y se calculan los gramos de sulfato de amonio que hay que añadir sabiendo que por cada 100 ml de filtrado habrá de añadir 39.2 gramos de (NH4)2SO4. Agite suavemente para que se disuelva bien el sulfato de amonio. Deje reposar unos 10 minutos. Se precipita la ovoalbúmina. 8. Filtre a través de papel filtro ordinario rápido. 9. Pese el precipitado hasta pesada constante y disuelva este nuevo precipitado en otro vaso de precipitados de 100 ml añadiendo 50 ml de cloruro de sodio al 1%. 10. Lo que se acaba de hacer es la separación por precipitación de la Ovoalbúmina y la Ovoglobulina. 11. A partir de los datos de las pesadas puede determinarse el contenido en ovoalbúmina y ovoglobulina de la clara de huevo. También puede determinarse este contenido mediante otros métodos (Biuret, Folin, etc.) a partir de las dos disoluciones creadas. Práctica 3. Cuantificación de proteína total (metodo de Biuret) La reacción de Biuret implica un reactivo de cobre fuertemente alcalino que produce un color púrpura con las proteínas. La reacción de Biuret esta basada en la formación de un complejo azul-púrpura entre los enlaces peptídicos y el ion Cu2+ en medio alcalino (este medio asegura que la cadena polipeptídica este totalmente desplegada y sea plenamente accesible). Este complejo absorbe luz en el espectro visible =540 nm. Este método tiene la ventaja de que se ve poco influenciado por la composición aminoacídica de las proteínas presentes en la muestra, ya que es una reacción en la que el que interviene directamente es el enlace peptídico. El procedimiento es el siguiente: 1. Coloque en una gradilla 10 tubos de ensayo de 15 mL e identifíquelos de alguna manera, y rellénelos con suero, disolución estándar de proteínas convenientemente diluida (10 mg/mL) y reactivo de Biuret de la siguiente manera: Tubo

suero (mL)

Dln. proteina (mL)

3

1 2 3 4 5

10 7.5 5 2.5 0

0 2.5 5 7.5 10

2. Tome 2 mL de cada tubo anterior (patrones) y de la disolución problema y transfiéralo a otro tubo y añada 6 mL de agua dest., 3 mL de reactivo de Biuret y 2,5 mL de NaOH 10% (p/v). 3. Agite bien y deje reposar por unos 15 minutos. 4. Observe el color desarrollado en los tubos de los patrones debe ser cada vez mas intenso conforme aumenta el nº del tubo, debido a que también aumenta la cantidad de proteína en cada tubo. 5. Mida la absorbancia a 540 nm y registre los datos en hoja de cálculo. Obtenga la recta (curva) de calibrado y a partir de esta obtenga el contenido en proteina de la muestra problema.

Práctica 4. Medida de la actividad enzimática Para esta práctica se va a utilizar como ejemplo la fosfatasa alcalina. Dicha enzima cataliza la hidrólisis del enlace éster fosfórico entre un grupo orgánico y un grupo fosforilo a pH alcalino, lo que libera fosfato al medio. Se van a estudiar algunos aspectos cinéticos de la fosfatasa alcalina comercial de mucosa intestinal bovina. Para ello se va a emplear un método de ensayo de la actividad de esta enzima que emplea como sustrato un éster de fosfato artificial, el p-nitrofenilfosfato, cuya hidrólisis da lugar a fosfato y a p-nitrofenol. Éste último adquiere color amarillo a pH alcalino por lo que se puede cuantificar colorimétricamente a 405 nm. Se obtendrá la curva de progreso de la reacción catalizada y se determinará la velocidad inicial y la concentración de enzima. Se comprobará la dependencia de la velocidad de reacción con la concentración de enzima y se calculará gráficamente la Km (constante de Michaelis) de la enzima. El estudio consta de 3 partes. Parte A. Efecto del tiempo de reacción en la aparición de producto. 1. A 5 tubos de ensayo se añaden los reactivos que se detallan en la Tabla 1. Se agitan suavemente e incuban en baño termostatizado a 30ºC los tiempos indicados.

2. A medida que se cumplen estos tiempos, se retira el tubo correspondiente del baño a 30 ºC y se le añade inmediatamente 1 ml de fosfato mezclando las soluciones para detener la reacción. 3. A continuación se mide la absorbancia a los distintos tubos a 405 nm usando el nº 1 como blanco. Parte B. Efecto de la concentración de enzima sobre la velocidad de reacción 1. A una serie de 5 tubos de ensayo se les añade los distintos reactivos según se indica en la Tabla 2, obteniéndose así concentraciones crecientes de enzima en los

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mismos. Tras agitar suavemente se incuban en baño termostatizado el tiempo indicado:

2. Cuando se cumplan los 10 minutos de reacción, se retiran los tubos del baño y se les añade inmediatamente 0,5 ml de fosfato a cada uno de ellos mezclando las soluciones para detener la reacción. 3.Se mide la absorbancia a los distintos tubos a 405 nm usando el nº 1 como blanco. Parte C. Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de la reacción. Determinación de Km Y Vm 1. A una serie de tubos de ensayo se les añade los reactivos que se detallan en la Tabla 3 y se agitan suavemente, obteniéndose de esta manera concentraciones crecientes de sustrato en los mismos. Se introducen los tubos en el baño termostatizado a 30 ºC el tiempo indicado para que se desarrolle la reacción.

2. Al finalizar los 10 minutos de reacción, retirar los tubos del baño y añadir inmediatamente 0,5 ml de la solución de fosfato mezclando para detener la reacción. 3. Medir la absorbancia a los distintos tubos a 405 nm; usando como blanco el nº 1. Resultados: A partir de los datos obtenidos y mediante la técnica de linealización de LineweaverBurk o de Eadie-Hofstee pueden obtenerse los parámetros cinéticos Vm y Km.

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