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Monitorización por PCR del intrón Alu del locus PV92 del cromosoma 16 humano

Módulo: ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS Laboratorio de Biotecnología

UD 2: Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos UD 4: Amplificación de Ácidos Nucleicos por PCR y Separación por Electroforesis Duración: 9 horas (3 sesiones)

Contenido 1.-TITULO: Monitorización por PCR del intrón Alu del locus PV92 del cromosoma 16 humano. ....................... 3 2.-OBJETO ............................................................................................................................................................ 3 3.-ALCANCE.......................................................................................................................................................... 3 4.-REFERENCIAS ................................................................................................................................................... 3 5.-DESCRIPCION ................................................................................................................................................... 4 5.1.- Fundamento ................................................................................................................................................ 4 Planificación de la práctica .................................................................................................................................. 5 5.2- Material necesario....................................................................................................................................... 6 5.3- Procedimiento operativo ........................................................................................................................... 10 Sesión 1A: Previo a la Preparación del Molde de ADN.................................................................................. 10 Sesión 1A: PREPARACIÓN DEL MOLDE DE ADN ............................................................................................ 11 Introducción .................................................................................................................................................. 11 Procedimiento ............................................................................................................................................... 12 Sesión 1B: Previo a la Amplificación por PCR ................................................................................................ 14 Sesión 1B: AMPLIFICACIÓN POR PCR ............................................................................................................ 16 Introducción .................................................................................................................................................. 16 Procedimiento ............................................................................................................................................... 16 Sesión 2A: Previo a la Preparación del gel de agarosa .................................................................................. 18 Sesión 2A: PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA.......................................................................................... 18 Introducción .................................................................................................................................................. 18 Procedimiento ............................................................................................................................................... 18 Sesión 2B: Previo a la Electroforesis de los productos obtenidos en la PCR y Tinción de los geles .............. 19 Sesión 2B: ELECTROFORESIS DE LOS PRODUCTOS OBTENIDOS EN LA PCR Y TINCIÓN DE LOS GELES .......... 20 AURORA CRIADO MONTERO, CARLOS DE PAZ VILLASENÍN, PILAR MACÍA RODRÍGUEZ, MARY SOL OTERO FERNÁNDEZ, MARIANO PAZOS AFONSO

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Introducción .................................................................................................................................................. 20 Procedimiento ............................................................................................................................................... 21 6.- TRATAMIENTO DE DATOS ............................................................................................................................ 25 Registro de los Resultados............................................................................................................................. 25 Análisis ........................................................................................................................................................... 26 7.- NOTAS DE SEGURIDAD Y MEDIOAMBIENTE................................................................................................. 27 8.- ANEXOS ........................................................................................................................................................ 28

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1.-TITULO: Monitorización por PCR del intrón Alu del locus PV92 del cromosoma 16 humano.

2.-OBJETO  Extraer nuestro propio ADN de las células epiteliales bucales.  Realizar la amplificación de un segmento específico del ADN, el locus PV92 del cromosoma 16, mediante el método de la reacción en cadena de la Polimerasa (PCR), que es un método para realizar millones de copias de segmentos específicos de ADN en poco tiempo, imitando algunas de las estrategias utilizadas en la replicación de ADN que ocurre dentro de las células vivas.  Realizar una electroforesis horizontal en geles de agarosa para separar por tamaños los fragmentos de ADN que han sido amplificados.  Comprender la importancia que tiene este método por su aplicación en múltiples campos, uno de ellos la genética de poblaciones, ya que en esta práctica se va a comprobar si somos o no portadores, en ese segmento de ADN del cromosoma 16, del intrón Alu.

3.-ALCANCE Alumnos y profesionales módulo “Ensayos Biotecnológicos” del Ciclo Formativo de grado superior “Laboratorio de Análisis y Control de Calidad” de la familia Química.

4.-REFERENCIAS Manual del kit: Chromosome 16: PV92 PCR Informatics Kit de BIORAD. Catalog #166-2100EDU (explorer.bio-rad.com).

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5.-DESCRIPCION 5.1.- Fundamento Se estima que los 23 pares de cromosomas del genoma humano (46 cromosomas en total) contienen un total de 30.000-50.000 genes. Cada gen contiene el código para una proteína en particular. Curiosamente, estos 30.000-50.000 genes representan sólo alrededor del 5% de ADN cromosómico. El otro 95% es “ADN no codificante”. Este “ADN no codificante” se encuentra no sólo entre los genes, sino también dentro de los genes, dividiéndolos en segmentos. En eucariotas, estas secuencias de dentro de los genes, llamados intrones, son transcritas a ARN, pero al final no forman una proteína. Las secuencias que codifican proteínas se llaman exones. Tanto los intrones como los exones son inicialmente transcritos a ARN (pre-mRNA), luego, el ARN correspondiente a los intrones se corta y el resto del ARN es empalmado, formando los exones empalmados el ARN mensajero (ARNm).

A lo largo de la evolución, las secuencias de intrones han sido el blanco de las inserciones al azar por elementos intercalados repetitivos cortos (SINEs, de “short repetitive interspersed elements”). Los SINEs se han insertado al azar dentro de nuestros intrones durante millones de años. Uno de estos elementos repetitivos es la llamada “secuencia Alu” (Figura 2). Esta es una secuencia de ADN de 300 pares de bases que se repite casi 500.000 veces en el genoma humano. El origen y la función de esta secuencia repetida al azar no se conocen todavía. El nombre “Alu” viene del sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Alu I que se encuentra en esta secuencia.

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Este kit proporciona una simple monitorización basada en PCR para una sola secuencia Alu dentro del locus PV92 del cromosoma 16. Este particular intrón Alu es dimórfico. Es decir, el elemento está presente en algunos individuos pero no en otros (Figura 3). Algunas personas tienen la inserción en el locus PV92 de uno de sus cromosoma 16, otros pueden tener la inserción en los dos cromosomas homólogos (dos alelos), y algunos no tienen la inserción en este cromosoma. La presencia o ausencia de esta inserción puede ser detectada usando la reacción en cadena de la polimerasa seguida de electroforesis en gel de agarosa. En esta actividad, los alumnos aislarán su propio ADN genómico a partir de sus células. Van a utilizar dos “primers” o cebadores (de 300 pb) que flanquean toda la inserción Alu de forma que los 641 pares de bases del locus PV92 se amplifican a un fragmento de 941 pares de bases si el elemento Alu está presente, o permanece un fragmento de 641 pares de bases si el elemento Alu está ausente. La electroforesis en gel de agarosa de los productos de la PCR es suficiente para distinguir entre los homocigotos (+/+) por la presencia de la repetición Alu (sólo hay un producto de 941 pb), homocigotos (-/-) por la ausencia de la repetición Alu (sólo hay un producto de 641 pb), y los heterocigotos (+/-) que tienen tanto los productos de 641pb y los de 941 pb.

Planificación de la práctica Esta práctica consta de 4 unidades o lecciones que se pueden acomodar en 3 sesiones de laboratorio: Lección 1: Preparación del molde de DNA de células epiteliales bucales Aislamiento de células epiteliales bucales Preparación del ADN genómico de células epiteliales bucales Lección 2: Amplificación mediante la PCR Realización de la PCR

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Lección 3: Electroforesis en gel de los productos de la PCR y tinción de los geles de agarosa Preparación del gel de agarosa Actividad de cargar y correr los geles Tinción de los geles Lección 4: Análisis e interpretación de los resultados Registrar los resultados y secar los geles Analizar y discutir los resultados SESIÓN 1

SESIÓN 2

SESIÓN 3

(3 horas)

(3,5 horas)

(2,5 horas)

•Extracción del ADN •Amplificación por PCR

•Preparación del gel de agarosa •Electroforesis •Tinción del gel

•Análisis y Registro de resultados •Secado del gel

Cada lección se divide en dos partes: un trabajo previo a la realización en sí de la propia práctica destinado a la preparación de alícuotas y materiales necesarios, y la realización de la práctica por parte de los alumnos.

5.2- Material necesario Lección 1A: Preparación del Molde de ADN 5.2.1-

Equipamiento:

Equipamiento Microcentrífuga

Cantidad 1

Verificar ☐

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5.2.2-

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Materiales:

Material en cada Puesto de Trabajo Microtubos de 1,5 mL con tapa Tubos de microcentrífuga con tapón de rosca Portamicrotubos de espuma Micropipeta P-20 (2-20 L) y P-200 Puntas de pipeta de 20-200 L Botella de 500 ml

Cantidad 4 4 2 1 4 1

Verificar ☐ ☐ ☐ ☐ ☐ ☐

Material en cada Puesto de Trabajo Vasos de plástico Rotulador permanente Contenedor de residuos Agitador vórtex Baños de agua a 56ºC y 100ºC Protocolo de trabajo

Cantidad 4 1 1 1 4 1

Verificar ☐ ☐ ☐ ☐ ☐ ☐

Cantidad 1 vial

Verificar ☐

Cantidad 10 ml

Verificar ☐

Cantidad 1 1

Verificar ☐ ☐

5.2.3- Reactivos: Reactivos Matriz InstaGene 5.2.4- Disoluciones: Disoluciones Disolución NaCl al 0.9% en cada puesto de trabajo

Lección 1B: Amplificación por PCR 5.2.1-

Equipamiento:

Equipamiento Termociclador Microcentrífuga

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5.2.2- Materiales: Material en cada Puesto de Trabajo Tubos de PCR Microtubos de 1,5 mL sin tapa Microtubo etiquetado como MIX (en hielo) Tubos de microcentrífuga con tapón de rosca Micropipeta P-20 y P-1000 Puntas de pipeta 2-20 L, 100-100 L Portamicrotubos de espuma Material en cada Puesto de Trabajo Recipiente con hielo Rotulador permanente Contenedor de residuos Protocolo de trabajo

Cantidad 12 4 1 4 2 8 2 Cantidad 1 1 1 1

Verificar ☐ ☐ ☐ ☐ ☐ ☐ ☐ Verificar ☐ ☐ ☐ ☐

Cantidad 1

Verificar ☐

1 de cada

☐

1

☐

Cantidad 1

Verificar ☐

5.2.3- Reactivos: Reactivos Mezcla de primers o cebadores del kit Controles PV92 homocigóticos (+/+) y (–/–), y heterocigóticos (+/–). Mezcla-maestra del kit 5.2.4- Disoluciones:

Lección 2A: Preparación del gel de agarosa 5.2.1-

Equipamiento:

Equipamiento Horno microondas

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5.2.2- Materiales: Material en cada puesto de trabajo Bandeja de gel y peine Cinta adhesiva de laboratorio Matraz erlenmeyer 1L Probetas (grande y pequeña) Protocolo de trabajo

Cantidad 1 1 1 2 1

Verificar ☐ ☐ ☐ ☐ ☐

Cantidad 5g 20 ml 1L

Verificar ☐ ☐ ☐

5.2.3- Reactivos: Reactivos Agarosa Tampón de electroforesis TAE 50x Tampón de electroforesis TAE 1x 5.2.4- Disoluciones:

Lección 2B: Electroforesis de los productos obtenidos en la PCR y Tinción de los geles 5.2.1-

Equipamiento:

Equipamiento Fuente de electroforesis

Cantidad 1

Verificar ☐

5.2.2- Materiales: Material en cada puesto de trabajo Gel de agarosa Micropipetas P-20 Puntas de pipeta 2-20 L Rotulador permanente Portamicrotubos de espuma Cubeta de electroforesis

Cantidad 1 3 12 1 2 1

Verificar ☐ ☐ ☐ ☐ ☐ ☐

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Material an cada puesto de trabajo Cubeta para la tinción del gel Tubos de microcentrífuga con tapón de rosca Matraz de 500 ml Contenedores grandes para decolorar los geles (protocolo de tinción rápida) Contenedor de residuos Protocolo de trabajo

Cantidad 1 bandeja/2 puestos 1 1 1-3/2 puestos 1 1

Verificar ☐ ☐ ☐ ☐ ☐ ☐

5.2.3- Reactivos: Reactivos Cantidad Verificar Muestras de PCR 1 por alumno (4) ☐ Colorante de carga “PV92 XC DNA loading dye” 1 tubo ☐ Marcador de masas moleculares “EZ Load” 1 tubo ☐ (patrones de DNA) Solución 1x o 100x del tinte de DNA “Fast 120 mL/2 ☐ Blast” puestos Agua del grifo caliente para decolorar los 1,5-2 L/2 ☐ geles (protocolo de tinción rápida) puestos Agua destilada o desionizada 1L ☐ 5.2.4- Disoluciones:

5.3- Procedimiento operativo Sesión 1A: Previo a la Preparación del Molde de ADN Tareas

Preparar las alícuotas de la matriz InstaGene Preparar las alícuotas de la solución salina Colocar los baños de agua a 56 oC y a 100 oC Tiempo requerido 30 minutos

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Preparación de las alícuotas de la matriz InstaGene 1.

Mezclar la matriz InstaGene agitando en un vórtex la botella varias veces para resuspenderla. Asegúrese de que la matriz esté bien mezclada antes de preparar las alícuotas. Para que las micropartículas de intercambio iónico de la matriz se encuentren en la solución, durante el proceso de preparación de las alícuotas, agite cuidadosamente la botella varias veces.

2.

Pipetear 200 L de la matriz InstaGene dentro de cada tubo de microcentrífuga con tapón de rosca. Distribuir 1 tubo por cada estudiante, por lo que en cada puesto de trabajo debería haber un portamicrotubos de espuma con 4 tubos de matriz.

Preparación de la solución salina y las alícuotas 1. Preparar una solución salina al 0,9%. En una botella de 500 mL añadir 4,5 g de sal de mesa (no yodada) y completar con agua potable. Invertir la botella hasta disolver totalmente la sal. 2. Para cada estudiante, colocar 10 mL de solución salina en un vaso. Cada puesto de trabajo debería tener 4 vasos de solución salina. Colocar los baños de agua a 56 oC y a 100 oC

Sesión 1A: PREPARACIÓN DEL MOLDE DE ADN Introducción El ADN que se va a usar como molde en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) lo extraeremos de nuestras propias células vivas: ADN genómico extraído de las células epiteliales bucales. Para ello, se enjuaga la boca con una solución salina, y se recogen las células epiteliales desprendidas mediante centrifugación. Se transfieren a un microtubo que contiene la matriz InstaGene, que se compone de partículas microscópicas cargadas negativamente que quelan o atrapan a los cationes metálicos de la solución, como el Mg2+, que es un cofactor necesario de las DNAsas lisosomales (enzimas que digieren o degradan el ADN). Así, cuando se lisan las células mediante el calor y éstas liberan sus componentes celulares, la presencia de las micropartículas quelantes de la matriz impide la degradación enzimática del ADN extraído. En la preincubación a 56 0 C se suavizan las membranas plasmáticas, soltándose las células agrupadas, y se inactivan las enzimas por el calor; y cuando se hierven las células a 100 0C se rompen las células liberando el ADN de los núcleos.

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Procedimiento 1. Cada alumno debe tener un microtubo con tapón de rosca con 200 L de la matriz InstaGene, un microtubo de ensayo de 1,5 mL y un vaso con 10 mL de solución salina al 0,9%. Etiquetar cada uno de ellos con sus iniciales.

2. Introducir la solución salina en la boca y enjuagar vigorosamente durante 30 segundos. Expulsar la disolución bucal en un vaso.

3. Con una micropipeta P-1000 transferir 1 mL de la disolución bucal en el microtubo de ensayo.

4. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos. Cuando la centrífuga se haya detenido completamente, retirar el tubo. Se debería visualizar una especie de pelotita o bolita sólida de células blancas en la parte inferior del tubo (“pellet”). Idealmente, esta bolita debería ser del tamaño de una cabeza de cerilla. Si no ves el sedimento o no es de este tamaño, desechar el sobrenadante salino, llenar el tubo con más enjuague bucal, y volver a centrifugar.

5. Después de sedimentar las células, se vierte el sobrenadante sobre un trocito de papel secamanos, teniendo cuidado de no perder el pellet. Si queda en fondo del tubo una pequeña

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cantidad de disolución salina no pasa nada (aproximadamente del mismo tamaño que el pellet,  50 L).

6. Resuspender el precipitado utilizando un agitador vortex, o dando pequeños golpecitos con el dedo al microtubo, hasta que no queden grupos de células o grumos.

7. Con la micropipeta P-20 transferir todas las células resuspendidas al microtubo de tapón de rosca que contiene el InstaGene. 8. Cerrar el microtubo y agitar para mezclar el contenido. (No pipetear arriba y abajo con la micropipeta para mezclar el contenido porque se puede taponar la punta con las micropartículas del InstaGene). 9. Colocar los tubos del grupo en un portamicrotubos de espuma y dejar flotar el soporte en un baño de agua a 56 0C durante 10 minutos. A la mitad (5 minutos), agitar los tubos varias veces y luego volver a colocarlos en el baño de agua para los restantes 5 minutos.

10. Retirar los tubos del baño de agua y agitarlos varias veces. Colocar ahora el soporte con los tubos en un baño de agua hirviendo (100 °C). Incubar durante 5 minutos.

11. Retirar los tubos del baño de agua de 100 0C y agitar varias veces para resuspender la muestra. Centrifugar los tubos (4 tubos) a 6000 x g durante 5 minutos (o a 2000 x g durante 10 minutos) para sedimentar la matriz.

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12. Depositar los microtubos de rosca en el frigorífico hasta el período siguiente de laboratorio, o bien proceder directamente con la siguiente parte de la sesión 1 (sesión 1B).

Sesión 1B: Previo a la Amplificación por PCR Tareas

Programar el Termociclador Preparar la mezcla-maestra completa o MIX y las alícuotas Preparar las reacciones control de la PCR Tiempo requerido 60 minutos Programar el Termociclador Ciclo Paso 1 Paso 1 Repetir 1 vez 2 Paso 1 Paso 2 Paso 3 Repetir 40 veces 3 Paso 1 Repetir 1 vez

Función Pre-desnaturalización

Temperatura Tiempo 94 ºC 2 minutos

Desnaturalización Anillamiento Extensión

94 ºC 60 ºC 72 ºC

1 minuto 1 minuto 2 minutos

Extensión final

72 ºC

10 minutos

Preparar la mezcla-maestra completa o MIX y las alícuotas Para obtener mejores resultados, los siguientes pasos se deberían realizar 15-30 minutos antes de realizar la reacción de PCR (en sesión 1A, cuando los alumnos están metiendo los portamicrotubos de espuma en los baños de agua). 1. Pipetear 1100 L de la mezcla-maestra en un microtubo. Si se van a amplificar menos de 16 muestras de ADN, dividir la mezcla-maestra en 2 tubos con 550 L cada uno. Uno de estos tubos se usará inmediatamente, mientras que el otro puede volver a congelarse para usar en otro momento.

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2. Etiquetar como “MIX” un número determinado de microtubos, uno por cada puesto de trabajo, y colocarlos en hielo. 3. Añadir 22 μL de la mezcla de “primers” o cebadores a los 1100 L de la mezcla-maestra (o 11 L de primers a 550 L de mezcla-maestra). Mezclar en un agitador vórtex 10 segundos. Es muy importante que la mezcla-maestra se mezcle homogéneamente con los cebadores. La solución debería ser de color amarillo. Los cebadores se suministran como una solución concentrada amarilla en un tampón Tris. Ya que los cebadores son más estables en disoluciones concentradas, añadir los cebadores a la mezcla-maestra justo antes de empezar el trabajo de laboratorio –no más de 15-30 minutos antes de la amplificación con PCR-.

4. Preparar alícuotas de 95 L de la mezcla completa e introducir en los microtubos etiquetados como “MIX”, un tubo para cada puesto de trabajo. Guardar el resto para las reacciones control positivas. Colocar estos tubos en hielo en cada puesto de trabajo hasta que se usen. Preparar las reacciones control de la PCR Esta parte se preparará a la vez que los alumnos preparan sus muestras. 1. Etiquetar los tubos de control de la PCR como: “+/+”, “–/–“, y “+/–“. Si se va a utilizar el kit completo de una sola vez, preparar 4 tubos de cada control, o sea, 12 en total. Si se divide el kit en dos períodos, preparar 2 tubos de cada control, 6 tubos en total. Las soluciones de control sin usar deberán almacenarse en el congelador hasta su uso. ▫ Pipetear 20 μL de la solución de control +/+ en cada tubo de PCR +/+. ▫ Pipetear 20 μL de la solución de control -/- en cada tubo de PCR -/-. ▫ Pipetear 20 μL de la solución de control +/- en cada tubo de PCR +/-. 2. Pipetear 20 μL de la mezcla completa en cada tubo de control de la PCR. Usar una punta de pipeta nueva para cada tubo.

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3. Colocar los tubos en hielo hasta que se carguen en el termociclador. Amplificar las muestras de control de la PCR junto con las muestras de los alumnos.

Sesión 1B: AMPLIFICACIÓN POR PCR Introducción La PCR, Reacción en Cadena de la Polimerasa, es capaz de “apuntar” sobre un fragmento específico de ADN del genoma completo y hacer millones de copias o amplificarla. Nosotros vamos a amplificar una región dentro del cromosoma 16. Para replicar un fragmento de ADN, la mezcla de reacción requiere los siguientes componentes: 1. Molde de ADN. 2. Desoxinucleótidos individuales (A, T, G y C). 3. Taq ADN polimerasa. 4. Iones de magnesio. 5. Dos oligonucleótidos cebadores o “primers”. 6. Tampón Sal. Animación sobre PCR en el siguiente enlace: http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html

Procedimiento 1. Coger del frigorífico o del puesto de trabajo el microtubo con tapón de rosca que contiene el molde de ADN. Centrifugarlo durante 2 minutos a 6000 x g (o 5 minutos a 2000 x g).

2. Etiquetar un tubo de PCR y un microtubo sin tapa con tus iniciales, y colocar el tubo de PCR dentro del microtubo sin tapa tal como se muestra en la figura. Coloque todo en el portamicrotubos de espuma.

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3. Transferir 20 μL del molde de ADN (en el sobrenadante) desde el tubo con tapón de rosca al tubo de PCR. Tener cuidado de no transferir micropartículas de la matriz, que están en el sedimento, al tubo de PCR, ya que se podría inhibir la reacción de la PCR.

4. Localizar el tubo etiquetado como “Mix”, amarillo, que está en hielo, y transferir 20 μL de la mezcla dentro del tubo de PCR. Mezclar succionando con la micropipeta 2-3 veces. Evitar las burbujas, especialmente en la parte inferior de los tubos. Se tapa el tubo de PCR herméticamente y se mantiene en hielo hasta que se proceda al siguiente paso.

5. Saque el tubo de PCR del microtubo sin tapa y colóquelo en el termociclador. 6. Cuando todas las muestras de PCR de los alumnos y las reacciones de control de la PCR preparadas previamente por el profesor estén en el termociclador, este se pondrá en marcha y comenzará la reacción de PCR (40 ciclos de amplificación), lo que lleva unas 3,5 horas.

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Sesión 2A: Previo a la Preparación del gel de agarosa Tareas Preparar el tampón de electroforesis TAE 1x Tiempo requerido 10 minutos Preparar el tampón electroforético TAE 1x El tampón de electroforesis TAE (Tris, acetato, EDTA) se suministra como una solución concentrada 50x, y nosotros usaremos una concentración 1x. Las cantidades calculadas de tampón y de gel dependen de la cubeta de electroforesis y de la bandeja de gel que se use. En esta práctica usamos una cámara Wide Mini-Sub Cell GT System de BioRad, con una bandeja de 10 x 15 cm y un peine de 15 pocillos. Para hacer 2 geles y llenar 2 cámaras de electroforesis un litro de tampón TAE 1x es suficiente. Para hacer 1 L de tampón TAE 1x: (20 ml de TAE 50x + 0,98 L de agua destilada).

Sesión 2A: PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA Introducción Prepararemos una solución de agarosa al 1%, ya que esta concentración proporciona una excelente resolución y minimiza el tiempo requerido para la separación electroforética de los fragmentos de la PCR. Como en esta segunda sesión de laboratorio se utiliza material para cada dos grupos de trabajo (8 alumnos), los dos geles de agarosa que son necesarios también se prepararán de forma conjunta. A continuación cada puesto de trabajo preparará el gel de electroforesis.

Procedimiento Preparación de la solución de agarosa al 1% 1.

Agregar la agarosa en polvo en una botella de vidrio autoclavable. No se debe llenar esta botella más allá de la mitad de su capacidad.

2.

Añadir la cantidad adecuada de tampón de electroforesis TAE 1x y agitar para resuspender la agarosa en el tampón.

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3.

Disolver en un microondas: aflojar el tapón de la botella e introducir en el microondas. Poner a potencia media-baja durante 3 minutos, deteniendo cada 30 segundos para agitar la botella (cuidado al agitar, ya que el movimiento puede desencadenar la ebullición y disparar el gel hirviendo). Hervir y agitar hasta que todas las pequeñas partículas transparentes de agarosa se hayan disuelto y el gel esté totalmente líquido.

4.

Dejar enfriar esta disolución hasta los 60 ºC (que se pueda tocar el frasco sin quemarse), antes de verterla en la bandeja del gel de electroforesis. Se puede acelerar el proceso enfriándolo debajo del grifo.

Para preparar dos geles de agarosa (2 puestos de trabajo = 8 alumnos) con 0,5 cm de grosor se utilizaron 131 mL de agarosa al 1% = (1,31 g de agarosa + 131 mL TAE 1x). Preparación del gel de electroforesis 5.

Sellar los extremos de la bandeja de gel de forma segura con tiras de cinta adhesiva de laboratorio. Presionar la cinta firmemente a los bordes de la bandeja para formar un precinto hermético. Colocar el peine en la ranura correspondiente de la bandeja de gel. El peine se debe colocar a unos ~ 2 cm del extremo de la bandeja del gel (no en el centro del gel).

6.

Colocar la bandeja de gel en una mesa de trabajo nivelada.

7.

Verter la disolución de agarosa a 60 oC en la bandeja. Apartar o eliminar las burbujas o suciedad con una punta de pipeta o papel de aluminio.

8.

Dejar que el gel se solidifique a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos – será opaco cuando esté listo para su uso. Se puede acelerar el proceso metiéndolo en la nevera.

Sesión 2B: Previo a la Electroforesis de los productos obtenidos en la PCR y Tinción de los geles Tareas

Preparar las alícuotas del colorante de carga “PV92 XC loading dye” Preparar el tinte de ADN “Fast Blast”

Tiempo requerido

30 minutos

Preparar las alícuotas del colorante de carga “PV92 XC loading dye” Etiquete un tubo de microcentrífuga con tapón de rosca como “LD” (Loading Dye) por cada puesto de trabajo, y añada 50 L del colorante de carga dentro de cada tubo. Distribuya los tubos en

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cada puesto de trabajo. Preparación del tinte de ADN “Fast Blast” El tinte se suministra en una concentración de 500x y debe ser diluido antes de usarlo. Se puede usar diluido a 100x en el protocolo de tinción rápida, que permite visualizar el ADN en 1215minutos, o diluido a 1x en la tinción durante toda la noche. a) Para preparar la solución 100x, para la tinción rápida, diluya 100 mL de la solución 500x con 400 mL de agua destilada o desionizada en una botella o matraz de tamaño apropiado y mezcle. Tape el matraz y almacene a temperatura ambiente hasta que esté listo para usar b) Para preparar la solución 1x, para la tinción durante la noche, diluir 1 mL del Fast Blast 500x con 400 mL de agua destilada o desionizada en un matraz de tamaño apropiado y mezclar. Tape el matraz y almacene temperatura ambiente hasta su uso.

Sesión 2B: ELECTROFORESIS DE LOS PRODUCTOS OBTENIDOS EN LA PCR Y TINCIÓN DE LOS GELES Introducción La electroforesis separa fragmentos de ADN según sus tamaños relativos. Los fragmentos de ADN son cargados en un gel de agarosa, que se coloca en una cubeta llena de una solución conductora tampón. Una corriente continua atraviesa la cámara de un electrodo al otro. Los fragmentos de ADN están cargados negativamente, y cuando se colocan en un campo eléctrico migran hacia el polo positivo. La matriz del gel de agarosa actúa como un tamiz molecular a través del cual los fragmentos pequeños de ADN pueden moverse más fácilmente que los más grandes. Pasado un tiempo, los fragmentos pequeños migrarán más lejos que los grandes. Los fragmentos del mismo tamaño permanecen juntos y migran produciendo "una banda" sola de ADN en el gel. Cuando los productos de la PCR son sometidos a electroforesis en gel de agarosa, son posibles 3 resultados distintos: 

Si ambos cromosomas contienen la inserción Alu, cada producto amplificado de PCR será de 941 pb y en el gel migrarán a la misma velocidad, por lo que aparecerá una sola banda que corresponde a una banda de 941 pb.



Si ningún cromosoma contiene la inserción, cada producto amplificado de PCR será de 641 pb y migrarán como una banda de 641 pb.



Si hay una inserción Alu sobre un cromosoma, pero no en el otro, habrá un producto PCR de 641 pb y otro de 941 pb. El gel revelará dos bandas para esta muestra.

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En el gel de la muestra de abajo, las bandas PCR-AMPLIFICADAS de 941 pb y 641 pb se separan en base a sus tamaños.

Procedimiento Preparar las Muestras de Control Amplificadas y el patrón de bandas de ADN En cada gel de electroforesis se deben cargar, además de las muestras de los alumnos, las muestras control amplificadas y el patrón de bandas de ADN (MMR). Este trabajo lo puede hacer el profesor o un grupo de alumnos. La preparación del patrón y los controles se realiza de la siguiente manera: 1. Añadir 10 L del colorante de carga “PV92 XC Loading Dye” a cada muestra control amplificada (+/+, +/–, –/–), se mezcla con cuidado y se sitúan los 3 tubos en una gradilla de espuma. La función de este colorante es la de aumentar la densidad de la muestra y asegurar que se hunda en los pocillos del gel (por el glicerol que contiene), y la de visualizar el desarrollo electroforético, ya que contiene xileno cianol, que es un colorante que migra hacia el ánodo con la misma velocidad que un fragmento de 4000 pb de ADN. 2. Etiquetamos un tubo de PCR como “MMR” y le añadimos 11 L del marcador de masas moleculares “EZ Load”. Los tamaños de las bandas patrón de ADN que contiene son de 1000 pb, 700 pb, 500 pb, 200 pb y 100 pb.

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Electroforesis en gel de las muestras amplificadas por PCR 1. Añadir 10 L del colorante de carga (PV92 XC Loading Dye) a cada tubo de PCR y mezclar cuidadosamente. Situar los tubos en la gradilla de electroforesis. 2. Retirar con cuidado la cinta adhesiva de la bandeja del gel. Colocar la bandeja con el gel solidificado apoyada sobre la base central de la cubeta de electroforesis de forma que los pocillos estén cerca del cátodo (negro). Las muestras de ADN, durante la electroforesis, migrarán hacia el extremo donde se encuentra el ánodo (rojo). 3. Agregar el tampón de electroforesis TAE 1x necesario hasta cubrir bien el gel ( 650 mL; que el gel se encuentre de 2 a 6 mm por debajo del tampón), y retirar con cuidado, tirando hacia arriba lentamente, el peine del gel solidificado. 4. Situar la cubeta de electroforesis sobre un fondo oscuro, para que se vean mejor los pocillos, y usando una punta limpia para cada muestra, cargar las muestras en los pocillos del gel de la siguiente manera:

5. Poner la tapa del aparato. La tapa se ajusta a la base en una sola orientación: rojo con rojo y negro con negro. Conectar los electrodos a la fuente de alimentación, el cable rojo con el terminal rojo y el negro con el negro. 6. Realizar la electroforesis de las muestras a 100 V durante 30 minutos. Si usamos la fuente de alimentación PowerPac Basic de BioRad:

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Se nota que comienza el proceso porque aparecen burbujas en las cámaras de la cubeta. 7. Cuando acabe la electroforesis, apagar la fuente de alimentación y retirar la tapa de la cubeta. Con cuidado, sacar la bandeja y el gel del aparato. Hay que tener cuidado porque el gel es muy resbaladizo. Da un golpecito en el gel con el pulgar y con cuidado deslízalo dentro de la bandeja plástica de tinción proporcionada en el kit.

Tinción del gel Ya que el ADN es incoloro, no es visible inmediatamente en el gel. El examen visual de gel después de la electroforesis indica sólo las posiciones de los tintes que se cargan pero no las posiciones de los fragmentos de ADN. Los fragmentos de ADN son visualizados por tinción del gel con un colorante azul llamado tinción de ADN Fast Blast.  PROTOCOLO 1: Tinción rápida de los geles de agarosa con la solución Fast Blast 100x 1. Marcar la bandeja de tinción con las iniciales y la fecha. En cada bandeja de tinción sólo cabe un gel de 15 x 10 cm. 2. Tinción del gel (2-3 minutos): Verter  125 ml de la solución de tinción FB 100x en la bandeja de tinción sobre el gel. Si fuera necesario, añadir más solución 100x hasta sumergir completamente el gel. Teñir los geles durante 2-3 minutos, pero no más de 3 minutos.

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3. Aclarado del gel: transferir el gel a un contenedor grande que contenga 500-700 ml de agua del grifo limpia y caliente (40-55°C). Como el gel es frágil, hay que tener especial cuidado manejándolo (usar una espátula grande u otra superficie de apoyo para transferir el gel de un contenedor al otro). Con cuidado sacudir el gel en el agua durante ~10 segundos para aclarar.

4. Lavado del gel: Transferir el gel a un contenedor grande con 500-700 ml de agua del grifo limpia y caliente. Con cuidado sacudir el gel sobre una plataforma oscilante durante 5 minutos. Si no tienes, mueve los geles con cuidado en el agua una vez cada minuto.

5. Lavado del gel: Realizar un segundo lavado como en el paso anterior.

6. Las bandas comienzan a aparecer pero se marcarán más en 5-15 minutos. Si es necesario se pueden realizar lavados adicionales con agua caliente, pero nunca dejar el gel a remojo toda la noche. Cuando se de por terminado el proceso de tinción, depositar el gel en la bandeja de electroforesis para trasladarlo de forma más segura.

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 PROTOCOLO 2: Tinción durante toda la noche de los geles con la solución Fast Blast 1x 1. Marcar la bandeja de tinción con las iniciales y la fecha. En cada bandeja de tinción sólo cabe un gel de 15 x 10 cm. 2. Tinción del gel (toda la noche): Verter la solución de tinción 1x dentro de la bandeja de tinción sobre el gel. Si es necesario, añadir más solución 1x para sumergir completamente el gel. Situar la cubeta de tinción en una plataforma oscilante para agitar durante toda la noche. Si no se dispone de la plataforma, agitar los geles con cuidado e intermitentemente, ya que los fragmentos pequeños de ADN tienden a difundir si no se agitan. Se deberían empezar a ver las bandas de ADN después de 2 horas, pero se recomiendan al menos 8 horas de tinción para una completa visibilidad de las bandas teñidas.

3. Depositar el gel en la bandeja de electroforesis para trasladarlo de forma más segura. Los geles teñidos se guardan en la nevera para realizar el registro y análisis de resultados al día siguiente.

6.- TRATAMIENTO DE DATOS Registro de los Resultados a.

Examen visual de los geles teñidos: Analizar las bandas visibles de ADN que aparecen en el gel y determina si eres homocigoto o heterocigoto para la inserción Alu.

b. Sitúa el gel en el transiluminador con luz visible (blanca)

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y realiza una fotografía con el Documentador de Geles Doc-Print VX2, que permite imprimir y grabar imágenes en un puerto USB sin necesidad de estar conectado a un ordenador. Se puede editar la imagen y deducir más información (identificación automática de bandas, cálculos de pesos moleculares, área e intensidad de las bandas, etc.) utilizando el software Photo-Capt. c. Seca el gel de agarosa para tener un registro permanente del experimento en el Secador de Geles.

Análisis Recuerda que la interpretación de este gel te permite determinar tu composición genética sólo en el locus que se está estudiando. Para la clase, determinar el número de individuos de cada genotipo: homocigotos + / +, homocigoto - / -, y heterocigotos + / -. Tabla 1. Frecuencias genotípicas observadas para la clase Categoría

Número

Frecuencia (Frecuencia del genotipo/Total)

Homocigoto (+/+) Heterocigoto (+/-) Homocigoto (-/-) Total =

1,00

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p = frecuencia del alelo (+) = =

número de alelos (+) número total de alelos (+ y -)

2(nº alumnos + /+) +1(nº alumnos + /-) número total de alelos (+ y -)

= frecuencia alumnos (+ / +) + 1 .frecuencia alumnos (+ / -) 2 número de alelos (-) q = frecuencia del alelo (-) = número total de alelos (+ y -) =

2(nº alumnos - /-) +1(nº alumnos + /-) número total de alelos (+ y -)

= frecuencia alumnos (- / -) + 1 .frecuencia alumnos (+ / -) 2

Tabla 2. Frecuencias alélicas calculadas para la clase Categoría

Frecuencia

Número

Alelos (+)

p=

Alelos (-)

q= Total alelos=

1,00

La inserción Alu, amplificada en este ejercicio, se ha usado a lo largo del tiempo para estudiar los patrones de migración de las poblaciones humanas. Los datos de estos estudios han sido publicados, y las muestras de clase se pueden comparar con los datos recogidos de poblaciones más grandes. Puedes entonces comparar las frecuencias alélicas y genotípicas de tu población de clase con los informes publicados de poblaciones de tamaños mayores. En la siguiente dirección se pueden encontrar artículos y enlaces a páginas web relacionados con el intrón Alu PV92: http://www.babec.org/node/44

7.- NOTAS DE SEGURIDAD Y MEDIOAMBIENTE -

No proceden.

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8.- ANEXOS Explicaciones sobre Líneas Vacías o Muestras sin amplificar Hay muchas explicaciones para el hecho de que algunas muestras no hayan sido amplificadas en la PCR:  Recolección inadecuada de las células epiteliales bucales.  Excesivo número de células.  Matriz del InstaGene no transferida.  Restos de InstaGene en la reacción de PCR. Observaciones a considerar 

Se puede realizar una electroforesis del ADN extraído de las células epiteliales bucales para comprobar si el ADN está muy degradado. Lo ideal sería obtener una única banda que apenas se moviera, lo que indicaría que el ADN está intacto. Si aparecen muchas bandas muy juntas significa que el ADN está muy degradado, lo que se traduciría en que se podrían haber perdido los sitios que son el blanco de los cebadores y en una mala PCR. Para ello necesitaremos 10-20 L de la disolución de ADN (sobrenadante en el tubo con tapón de rosca). Por tanto, guardaremos el microtubo con tapón de rosca en el frigorífico hasta la próxima sesión en la que se realizará la electroforesis.



La disolución TAE 1x sólo es válida 1 día. Se puede almacenar en nevera, y cuando se vaya a utilizar, si tiene precipitación en el fondo se debe calentar antes de utilizar.



La disolución de agarosa se puede preparar 1-2 días antes para montar el gel el día de la práctica



El gel de electroforesis se puede preparar 1-2 días antes por el profesor y guardarse en el frigorífico hasta que se use.



El tampón electroforético se puede guardar para otra electroforesis (sirve para 2 electroforesis)



Si se usa otra bandeja de tinción diferente a la del kit, añadir suficiente volumen de la solución de tinción como para sumergir completamente los geles.



La solución de tinción Fast Blast 100x puede reutilizarse hasta 7 veces.

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

La tinción durante toda la noche es más cómoda y se obtienen mejores resultados.



Como las bandas se decoloran ligeramente al secar el gel, lo mejor es analizar los geles teñidos antes de que se sequen.



Evite la exposición de los geles secados a la luz directa para prevenir la decoloración de las bandas. Sin embargo, las bandas de ADN reaparecerán si los geles secados se almacenan en la oscuridad durante 2-3 semanas después de la decoloración.

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