BOTANICA Acta Científica Venezolana, 51: 90–95, 2000

MULTIPLICACION MASIVA DEL CAFE (Coffea arabica L. cv. Catimor) MEDIANTE CULTIVO DE SUSPENSIONES CELULARES EMBRIOGENICAS Luis Hermoso-Gallardo y Andrea Menéndez-Yuffá Universidad Central de Venezuela, Facultad de Ciencias, Instituto de Biología Experimental, Centro de Botánica Tropical, Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Apartado 47114, Los Chaguaramos, Caracas 1041A.

Recibido: 01/06/99 ; Revisado: 12/01/00 ; Aceptado: 06/06/00 RESUMEN: Las suspensiones celulares ofrecen ventajas como sistema de propagación masiva de plantas por las altas tasas de multiplicación que presentan, una mayor homogeneidad en las condiciones de cultivo y la posibilidad de automatización. En el presente estudio se analizaron distintas condiciones experimentales para el establecimiento de suspensiones celulares embriogénicas de café (Coffea arabica L. cv. Catimor). Las condiciones óptimas para el establecimiento de suspensiones celulares embriogénicas de café consistieron en cultivar secciones de hoja durante 12 semanas (Etapa I) en un medio sólido con las sales de Murashige y Skoog (MS), suplementado con 2 mg/l de cinetina y 0,5 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoacético (medio 1). Bajo estas condiciones de cultivo se formó un tejido de callo que fue transferido a medio líquido con 5 mg/l de 6-bencilaminopurina (medio 2). Después de permanecer 12 días en medio líquido con agitación (Etapa II), los cultivos fueron tamizados y se mantuvieron en el mismo medio, renovándolo cada 8 días (Etapa III). Con el método utilizado se logró la diferenciación de 1884 embriones en 50 ml, los cuales, una vez colocados en las condiciones para su germinación, formaron plántulas de apariencia normal. Palabras clave: Café, embriogénesis somática, propagación clonal, suspensión celular.

MASSIVE MULTIPLICATION OF COFFEE (Coffea arabica L. cv. Catimor) THROUGH EMBRYOGENIC CELL SUSPENSION CULTURE ABSTRACT: Cell suspensions offer several advantages as a system for massive propagation because of the high rates of multiplication, the higher homogeneity in the culture conditions and the possibility of automatization. In this study, different experimental conditions were analyzed to establish embryogenic cell suspension cultures of coffee. The best conditions to establish the embryogenic cell suspension cultures of coffee were as follows: coffee leaf sections were cultivated during 12 weeks (Stage I) in a solid medium with the Murashige and Skoog salts, 2 mg/l kinetin and 0.5 mg/l 2,4-dichlorophenoxiacetic acid (medium 1). Under these conditions the explants formed a callus tissue that was transferred to a liquid medium containing 5 mg/l of 6-benzylamino-purine (medium 2). After 12 days in a shaking liquid medium (Stage II), the cultures were sieved and were maintained in the same media, which was renewed every eight days (Stage III). This method yielded 1884 embryos in 50 ml; placing the embryos under conditions for germination yielded plantlets of normal appearance . Key Words: Cell suspension, clonal propagation, coffee, somatic embryogenesis.

INTRODUCCION El Café (Coffea sp.) es un rubro muy importante en el mercado agrícola internacional y también es un cultivo esencial para la economía y el consumo en Venezuela. Su propagación in vitro se ha realizado por 2 métodos fundamentales: la embriogénesis somática y el cultivo de microesquejes, donde en corto tiempo se logra la propagación masiva de variedades selectas. Existen amplios antecedentes sobre la inducción de embriogénesis somática en café, una revisión reciente puede encontrarse en Menéndez y García7 . El cultivo de suspensiones celulares embriogénicas ofrece varias ventajas en comparación con el cultivo en medio sólido, siendo una de ellas la obtención de altos coeficientes de multiplicación. Asímismo, durante el crecimiento en un medio líquido las células están inmersas en el medio de cultivo y por ende expuestas a los nutrientes, hormonas, etc., lo cual permite una mayor precisión y uniformidad en la aplicación de las diferentes condiciones de cultivo, facilita la manipulación de las células y embriones y permite un mejor seguimiento de su desarrollo. Adicionalmente, en las suspensiones celulares, los agregados pro-embriónicos y embriones están usualmente separa-

Tabla 1. Composición de los medios de cultivo. Constituyentes M1 Sales Piridoxina Acido Nicotínico Hormonas (mg/l) Agente solidificante (g/l) Agua de Coco (% V/V)

MS 1 mg/l 1 mg/l 2 KIN 0,5 2,4-D 3G -

M2

Nombre del medio M3 C1 D

G

MS/2 MS/2 MS/2 MS/2 MS/2 1 mg/l 1 mg/l 1 mg/l 1 mg/l 5 BAP 1 2,4-D 0,8 8 BAP ANA 7,5 A - 7,5 A -

-

-

-

-

CO 100

* Todos los medios contienen 100 mg/l mio-inositol, 10 mg/l tiamina y 35 mg/l cisteína.

 G = gelrite, A = agar; ANA: ácido naftaleno acético; KIN: cinetina; BAP: 6-bencilamino-purina; 2,4-D: ácido, 2,4-diclorofenoxiacético

dos unos de otros flotando libremente en el medio, por lo que se pueden remover fácilmente y colocar en medio sólido para la regeneración de plantas13 , haciéndose más fácil la automatización. Zamarripa et al.16 , Bieysse et al.1 y Noriega y Söndahl10 han realizado experimentos sobre los

91

Suspensiones celulares de café

Figura 2. Embriones somáticos de café en diferentes estadios. Figura 1. Embrión somático de café en un estadio de pocas células, 40X.

sistemas de cultivos de células en suspensiones embriogénicas de café, encontrando que podría ser un sistema óptimo para la propagación de este cultivo. En la presente investigación se evaluaron diferentes tratamientos para el establecimiento y regeneración de suspensiones embriogénicas de café (Coffea arabica L. cv. Catimor) con el fin de determinar las condiciones óptimas para la multiplicación masiva de esta planta. Los resultados son de potencial importancia para su aplicación en la propagación acelerada en gran escala de variedades de interés o individuos selectos obtenidos en programas de mejoramiento; asímismo, el sistema de suspensiones celulares sirve como material inicial en el aislamiento de protoplastos y para la transformación genética.

Después de la desinfección, se tomaron secciones de hoja de 1 cm2 incluyendo la nervadura central y fueron sembradas con el haz sobre el medio de cultivo M1 o C1 (Tabla 1). Los explantes fueron cultivados en dichos medios durante 12 semanas (Etapa I, inducción de callo), a temperatura ambiente y en oscuridad. Mediante este tratamiento se obtuvo un tejido de callo que fue utilizado para iniciar las suspensiones celulares. Básicamente, los medios de cultivo utilizados estaban constituidos por las sales de Murashige y Skoog9 completas (MS) o diluídas a la mitad (MS/2), 100 mg/l de mioinositol, 35 mg/l de L-cisteína, 10 mg/l de tiamina-HCl y 30 g/l de sacarosa; el pH de los medios se ajustó a 5,6 y fueron esterilizados en autoclave a 120Æ C durante 15 minutos. La composición hormonal y otras variaciones en la composición de los medios utilizados para los distintos tratamientos y etapas se indican en la Tabla 1.

MATERIALES Y METODOS Etapa II. Disgregación de los callos Suspensiones celulares El procedimiento para establecer las suspensiones celulares embriogénicas de café consistió de cuatro etapas. Etapa I. Establecimiento in vitro de los tejidos foliares e inducción de callo Se utilizaron plantas adultas de café (Coffea arabica L. cv. Catimor). Las hojas de estas plantas completamente expandidas pero no senescentes y sin lesiones fueron cosechadas y desinfectadas. El tratamiento de desinfección consistió de un lavado con agua corriente y jabón azul, seguida de una encubación durante 15 minutos en una solución de Betadine al 10%, dos lavados con agua destilada y 15 minutos de agitación en cloro comercial (Hipoclorito de sodio al 5,25%) al 50%. Finalmente, la hojas fueron lavadas dos veces con agua destilada estéril para remover el cloro.

Para iniciar las suspensiones celulares se seleccionaron callos embriogénicos, caracterizados por presentar un color crema claro o blanco y tener consistencia no friable. Un gramo de dichos tejidos fue inoculado en 50 ml de medio M2 (para aquellos callos iniciados en M1) o D (si el callo fue iniciado en C1), donde se incubaron durante 12 días, en oscuridad a temperatura ambiente, bajo agitación orbital de 110 r.p.m. Etapa III. Multiplicación celular y diferenciación de embriones El cultivo obtenido en la Etapa II se filtró a través de una malla de 60 mesh, conservándose sólo las células y agregados que pasaron por el tamiz, los cuales fueron mantenidos en el mismo medio de cultivo en oscuridad, a temperatura ambiente y con agitación de 110 r.p.m. El medio fue renovado cada 8 días.

92

Hermoso-Gallardo y Menéndez-Yuffá Tabla 2. Resumen de los tratamientos y rendimiento en producción de embriones somáticos. Nombre del tratamiento

T1

T2

T3

T4

Medio de iniciación M1 M1 C1 M1 Medio de disgregación M2 y M2 D CO y diferenciación M3 Medio de germinación de embriones G G G G NÆ de embriones producidos en 50 ml 828a 1884b 1478c 8d NÆ de embriones por litro| 16560 37680 29560 160 * La suspensión se mantuvo 4 semanas en M2 y luego se transfirió a medio M3

 Los valores indicados corresponden al promedio de producción de embriones después de 6 semanas de cultivo en medio líquido. indican diferencias significativas p

a;b;c;d

Las letras diferentes

< 0,05. | Estos valores se calcularon a partir

de los valores observados (número de embriones en 50 ml), únicamente para homogeneizar las unidades con la de otros trabajos y permitir la comparación con los

Figura 3. Embriones somáticos de café diferenciados en un cultivo de células en suspensión.

Se realizaron observaciones de la morfología de las suspensiones y sus células y se cuantificó la producción de embriones somáticos para cada tratamiento; para ello, todos los embriones somáticos producidos en cada tratamiento fueron contados visualmente. Etapa IV. Germinación de embriones somáticos Cuando los embriones somáticos se encontraban en estado de torpedo, fueron transferidos a condiciones de germinación, previamente descritas por García y Menéndez3 . Con el fin de determinar las condiciones óptimas para el establecimiento de las suspensiones celulares y su posterior regeneración por embriogénesis somática se ensayaron los 4 tratamientos que se resumen en la Tabla 2. ANALISIS ESTADISTICO La producción de embriones para cada tratamiento fue analizada mediante un test no paramétrico ANOVA unifactorial por rangos de Kruskal-Wallis y luego se aplicó una prueba de Duncan. Las diferencias fueron consideradas significativas cuando p < 0,05. DETERMINACION DE LA DENSIDAD DE INOCULO INICIAL La densidad de inóculo inicial se determinó en ensayos preliminares, mediante el procedimiento siguiente: 1, 5 ó 10 g de callo de 12 semanas en medio M1 fueron colocados en 50 ml de medio líquido M2 con agitación, en el cual se mantuvieron durante 12 días para lograr su disgregación. Posteriormente, se tamizó la suspensión a través de una malla de 60 mesh con el fin de eliminar aquellos fragmentos de callo que no se disgregaron. Para establecer la densidad de inóculo óptima, se cuantificó la produc-

mismos.

ción de embriones. En dicho ensayo se estableció que la densidad de inóculo óptima fue de 1 g de callo en 50 ml de medio (20 g/l). Es importante resaltar, que aunque la suspensión se iniciaba con 1 g en 50 ml de medio (20 g/l), después de tamizarla quedaban aproximadamente 10 g/l, debido a que se eliminaban los fragmentos grandes sin disgregar, es por ello, que en la curva de crecimiento de peso fresco la medida inicial fue de 10 g/l. CURVA DE CRECIMIENTO DE LAS SUSPENSIONES CELULARES El crecimiento de las suspensiones celulares de café fue evaluado determinando el Peso Fresco (PF), el peso seco (PS) y mediante contaje celular. Para estimar el crecimiento, después de mantener los tejidos creciendo durante 12 semanas en medio M1, se transfirió 1 g de callo a 50 ml de medio líquido M2, los cuales se mantuvieron con agitación de 110 r.p.m durante 12 días. Luego, este callo fue tamizado por una malla de 60 mesh. La curva de crecimiento se elaboró tomando muestras diarias de 1 ml de suspensión, las cuales fueron centrifugadas a 14000 r.p.m durante 5 minutos, posteriormente se eliminó el sobrenadante y se determinó el peso del tejido. Estas mediciones se realizaron por triplicado, determinando los pesos diariamente durante 12 días, en la suspensión cultivada en medio M2 (Tabla 1). Las mismas muestras secadas durante 48 horas a 60Æ C, se utilizaron para determinar el peso seco. El contaje celular se realizó en un hematocitómetro tipo Neubauer. RESULTADOS Y DISCUSION La etapa inicial para el establecimiento de las suspensiones celulares, consistió en la inducción de callo en medio sólido. Los tratamientos T1, T2 y T4 coincidieron en que la etapa de inducción de calló se llevó a cabo en el medio

Suspensiones celulares de café

93

Figura 6. Incremento en el número de células de la suspensión celular Figura 4. Embriones somáticos en distintos estadios de diferenciación: globular (g), corazón (c) y torpedo (t).

Figura 5. Incremento en el peso fresco y seco de la suspensión celular

M1, que contenía 0,5 mg/l de 2,4-D y 2 mg/l de cinetina, en cambio, en el tratamiento T3 se inició el callo en un medio que contenía 1 mg/l de 2,4-D y 8 mg/l de BAP (6-bencilamino-purina); con ambos medios (M1 y C1) se logró una abundante formación de callo, no observándose diferencias cualitativas ni cuantitativas en los efectos de estos dos tipos de medio. Cuando los callos fueron colocados en el medio de cultivo líquido, los mismos se disgregaron con gran facilidad, originando una suspensión de alta densidad formada por agregados de callo de color blanco-beige. El crecimiento de las suspensiones celulares de café fue evaluado mediante tres parámetros: peso seco, peso fresco y contaje celular; los tres métodos dieron resultados similares (Figuras 5 y 6). La suspensión celular mostró un crecimiento lineal hasta los días 9 y 10, en los cuales alcanzó la fase estacionaria; un comportamiento similar observaron Grézes et al.4 , al medir el crecimiento en suspensiones celulares

de Coffea arabica por volumen de células empaquetadas y por Haldimann y Brodelius5 midiendo el peso seco en suspensiones celulares de la misma especie. La misma tendencia se ha observado en la curva de crecimiento de suspensiones celulares de otras especies, tales como Platycerium coronarium6 , Solanum chnysotrichum15 , en Carya illinoiensis2 y en Ipomoea y Daucus12 . De acuerdo a la cinética de crecimiento observada se seleccionó el tiempo de ocho días para la renovación del medio de cultivo, ya que al llegar a los días 9-10, el crecimiento alcanzaba la fase estacionaria. El crecimiento observado es relativamente lento si se lo compara con los resultados de Van Boxtel y Berthouly14 , en cuyo trabajo se observó un incremento en el peso fresco desde 20 g/l hasta 75 g/l en suspensiones celulares de Coffea canephora, en cambio, con el tratamiento aplicado en el presente trabajo se obtuvo un incremento del peso fresco desde 10 g/l (que fue el inóculo inicial después de filtrada la suspensión y el momento en el que se empezó a medir) hasta 12,9 g/l, esta diferencia puede deberse a las condiciones de cultivo, ya que ellos utilizaron un medio con 1-2 mg/l de 2,4-D y 1 mg/l de cinetina, en cambio en la presente investigación el medio contenía 0,5 mg/l de 2,4-D y 2 mg/l de cinetina; otra diferencia importante es que los datos de crecimiento reportados por Van Boxtel y Berthouly14 fueron obtenidos con Coffea canephora y esta investigación se llevó a cabo con la variedad Catimor que es un híbrido cuyas características en su mayoría corresponden a la especie Coffea arabica. Esta forma de crecimiento lento en la suspensión no fue considerada como un inconveniente del método, ya que como se verá más adelante, el rendimiento en producción de embriones fue bastante elevado. El método para la medición del crecimiento merece especial atención, tal como señalan Rose y Martin12 , los investigadores que trabajan con célula vegetales se han confiado principalmente en cuatro medidas de crecimiento para evaluar el desarrollo de los cultivos, como son: peso celular fresco, volumen de células empaquetadas, número de células y peso de células secas. En algunos casos se

94 ha indicado que las curvas de crecimiento basados en datos de una de estas medidas pueden ser interpretadas en la misma forma que las curvas de los cultivos bacterianos, ya que son superficialmente similares12 . El peso de células frescas y el volumen de células empaquetadas son útiles para una evaluación rápida del desarrollo del cultivo, pero son limitadas para estudios precisos. Consideramos que hay dificultades en la medición del crecimiento que son inherentes a los cultivos de células vegetales, debidas posiblemente a su heterogeneidad, ya que están presentes distintos tipos celulares que difieren en forma, tamaño, comportamiento de crecimiento y diferenciación. También se encuentra heterogeneidad en la agregación de las células, ya que algunas se presentan en grupos y otras están en forma individual. Por los motivos anteriores, en el presente estudio se trabajó con varias medidas de crecimiento, las cuales generaron curvas que en su aspecto general fueron similares. Al ser observada en el microscopio la suspensión presentó una composición celular heterogenea, estando formada por células aisladas o agrupadas. Las células no embriogénicas eran relativamente grandes, con las paredes celulares delgadas y el citoplasma menos denso. Las células embriogénicas eran más pequeñas, redondeadas, con paredes celulares gruesas y citoplasma denso, características éstas que ya habían observado Menéndez-Yuffá y García8 en las células no embriogénicas y embriogénicas de café creciendo en medio sólido. En la Figura 1 se observa un embrión de pocas células constituido por células que presentan características similares a las células embriogénicas de la suspensión. Respecto al rendimiento evaluado según la producción de embriones, en los distintos tratamientos utilizados (Tabla 2), la mayor producción de embriones (1884 embriones/50 ml) se obtuvo con el tratamiento T2, que consistió en utilizar medio M1 para la inducción de callo y medio M2 para la diferenciación de embriones somáticos; el tratamiento que siguó cercanamente en rendimiento (1478 embriones/50 ml) fue el T3, en el cual, el callo fue iniciado en medio C1 y la diferenciación de embriones se indujo en medio D; este último medio es similar al reportado por Peña11 ; el análisis estadístico de Kruskall-Wallis indicó que las diferencias en producción de embriones entre los cuatro tratamientos fueron estadísticamente significativas y la prueba a posteriori para comparar las medias mostró que la producción de embriones con el tratamiento T2 fue significativamente mayor que con el tratamiento T3. A continuación, le siguió en rendimiento el tratamiento T1 (828 embriones/50 ml), el cual se diferenció del tratamiento T2 en que incluía un paso intermedio en el cual, después de tamizar la suspensión, ésta fue cultivada durante 4 semanas en medio M2 líquido y luego fue cambiada al medio M3, el cual no contenía hormonas. Esta variación redujo notablemente la producción de embriones. Por último, el tratamiento T4 originó una producción de embrio-

Hermoso-Gallardo y Menéndez-Yuffá

nes muy baja, indicando que la utilización de agua de coco como sustituto de la adición de hormonas en el medio de diferenciación no es apropiada, sin embargo, en este medio se logró una muy buena disgregación del callo al pasar el tejido de medio sólido a medio líquido. En todos los tratamientos estudiados, los embriones somáticos diferenciados comenzaron a observarse después de 6 semanas después de haber tamizado las suspensiones (Etapa III). Los embriones se diferenciaron en forma asincrónica, de modo que en las suspensiones celulares se encontraron siempre embriones en todos los estados de desarrollo (Figuras 2, 3 y 4). Una vez colocados en medio para su germinación (medio G), los embriones dieron origen a plántulas de apariencia normal, que se adaptaron exitosamente al ser transplantadas a tierra. Comparando los resultados presentados con los obtenidos en otros trabajos, Zamarripa16 obtuvo 460000 embriones por litro a partir de suspensiones celulares de Coffea canephora y Arabusta; Noriega y Söndhal10 lograron 9000 embriones por litro utilizando bioreactores para el cultivo de suspensiones celulares de Coffea arabica, Van Voxtel y Berthouly14 obtuvieron 120000 embriones/g de inóculo para Coffea canephora, 92300 para Arabusta y 12300 para Coffea arabica; evidentemente, los rendimientos reportados son sumamente variables, en algunos casos mayores y en otros menores que los de la presente investigación, lo cual se puede atribuir a la diferencia en las condiciones de cultivo y a los genotipos utilizados. Bieysse et al.1 ensayaron distintos tratamientos sobre 8 genotipos de Coffea arabica, encontrando que las condiciones experimentales y la variabilidad genotípica afectan la capacidad embriogénica de dichos tejidos. Es notorio que en los trabajos realizados hasta la fecha se ha obtenido un rendimiento mayor de embriones para la especie Coffea canephora que para Coffea arabica. En conclusión, la presente investigación aportó un método para la obtención de suspensiones celulares embriogénicas de café del cultivar Catimor, lo cual no había sido reportado previamente. Estas suspensiones presentaron altos rendimientos en producción de embriones (Figuras 3 y 4), comparables a los obtenidos en investigaciones con otras variedades de esta planta. Por lo tanto se dispone de un sistema para la propagación clonal masiva de este cultivar, el cual ha mostrado un buen comportamiento agronómico en Venezuela. AGRADECIMIENTOS Al Dr. Carlos Ascanio Evanhoff de la Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela y al personal de la Estación Experimental "Jaime Henao Jaramillo" de la misma institución, por suministrarnos las plantas de café ’Catimor’. Al CDCH por aportar los recursos para realizar la investigación (Proyecto NÆ 03.33.4049-97).

95

Suspensiones celulares de café

REFERENCIAS 1. Bieysse, D., Gofflot, A. and Michaux-Ferrière, N. Effect of experimental conditions and genotypic variability on somatic embryogenesis in Coffea arabica. Can. J. Bot. 71: 1496-1502, 1993. 2. Burns, J. A. and Wetzstein, H. Y. Development and characterization of embryogenic suspension cultures of pecan. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 48: 93-102, 1997.

9. Murashige, T. and Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497, 1962. 10. Noriega, C. and Söndhal, M. R. Arabica coffee micropropagation through somatic embryogenesis via bioreactors. En: 15ème Colloq. Sci. Int. Café, Montpellier, 6-11 Junio, 1993, pp. 73-81.

3. García, E. de y Menéndez, A. Embriogénesis somática a partir de explantes foliares del cafeto Catimor. Café Cacao Thé XXXI(1): 15-22, 1987.

11. Peña, M. Somatic embryo induction and plant regeneration from Coffea canephora and Coffea arabica. Simpósio Sobre Ferrugens do Cafeeiro, Oeiras (Portugal), 17-20 de Octubre, 1983, pp. 493-512.

4. Grèzez, J., Thomas, D. y Thomasset, B. Factors influencing protoplast isolation from Coffea arabica cells. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 36: 91-97, 1994.

12. Rose, D. and Martin, S. M. Parameters for growth measurement in suspension cultures of plant cells. Can. J. Bot. 52: 903-912, 1974.

5. Haldiman, D. and Brodelius, P. Redirecting cellular metabolism by immobilization of cultured plant cells: a model study with Coffea arabica. Phytochemistry 25(5): 14311434, 1987.

13. Söndhal, M., Nakamura, T., Medina-Filho, H. P., Carvalho, A., Fazuoli, L. C. and Costa, W. M. Coffee. Handbook of Plant Cell Culture, V.3, Ammirato, P.V., Evans, D.A., Sharp, W.R. y Yamada, Y. (Eds.), Ed. Macmillan Publishing Company, New York, 1984, pp. 564-590.

6. Kwa, S.-H., Wee, Y.-C-, Lim, T.-M. and Kumar, P. Morphogenetic plasticity of callus reinitiated from cell suspension cultures of the fern Platycerium coronarium. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 48: 37-44, 1997.

14. Van Boxtel, J. and Berthouly, M. High frequency somatic embryogenesis from coffee leaves. Plant Cell Tissue and Organ Culture 44: 7-17, 1996.

7. Menéndez-Yuffá, A. y García de García, E. Trees IV, Vol. 35, Serie Biotechnology in Agriculture and Forestry, Y.P.S. Bajaj (Ed.), Ed. Springer-Verlag, Berlín-New York, 1996, pp. 95-119. 8. Menéndez-Yuffá, A. and García de García, E. Morphogenic events during indirect somatic embryogenesis in coffee "Catimor". Protoplasma 199(3/4): 208-214, 1997.

15. Villarreal, M. L., Arias, C., Feria-Velasco, A., Ramírez, O. y Quintero, R. Cell Suspension Culture of Solanum chrysotrichum (Schldl.) - A Plant producing an Antifungal Saponin. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 50: 39-44, 1997. 16. Zamarripa, A., Ducos, J. P., Tessereau, H., Bollon, H. et Pétiard, V. Production d’embryons somatiques de caféier en milieu liquide: effets densité d’inoculation et renouvellement du milieu. Café Cacao Thé XXXV (4): 233-243, 1991.