Unidad Genómica Instituto de Biotecnología - CICVyA Los Reseros y Dr. N. Repetto s/n 1686 – Hurlingham Provincia de Buenos Aires, Argentina
UNIDAD DE GENÓMICA Características, Resultados y Condiciones La Unidad de Genómica es un laboratorio que provee servicios de ensayos en el área de la genómica a profesionales del sector agropecuario y de la biomedicina en diferentes regiones de Argentina y América Latina. Está organizada en base a la Norma IRAM 301 ISO/IEC 17025:2005, según el requerimiento del PEI 2005-2015 de INTA y acredita sus ensayos bajo esta norma. Provee servicios de secuenciación de ADN, genotipificación, desarrollo de proyectos de biología molecular y capacitación de recursos humanos a profesionales del país y del exterior. La unidad de servicio a distancia permite que la organización descentralizada y en red de los laboratorios de investigación y desarrollo de INTA cuente con las últimas tecnologías disponibles en el campo de la genómica para la realización de trabajos científicos de calidad. Especificaciones generales: Usuari@s del servicio: L@s profesionales que requieran el uso del servicio deben enviar el formulario “Autorización para la entrega de informes” por única vez antes de enviar muestras. La autorización debe ser enviada por el/la usuiari@ responsable desde su cuenta de correo electrónico o con copia impresa firmada, autorizando usuari@s a su cargo. Envío de muestras: las muestras deben enviarse por correo 24 hs., encomienda o personalmente a:
Unidad de Genómica Instituto de Biotecnología, C.I.C.V.yA. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) Nicolas Repetto y De los Reseros s/Nº (1686) Hurlingham. Provincia de Buenos Aires IMPORTANTE: no enviar muestra por correo 24hs. los viernes porque no hay recepción de correo en el INTA Castelar durante los fines de semana. Enviar las muestras en tubos de polipropileno o placas de 96 o 384 pocillos, según corresponda. Sellarlas para evitar contaminación cruzada o evaporación de su contenido y protegerlas de la luz, en el caso de ensayos fluorescentes. Si envía las muestras por correo o encomienda, refuerce el acolchado del embalaje para que los mismos no colapsen durante el viaje. Precios: Remitirse a: Aranceles Vigentes UGB-RE-4.4/01 v04. A partir de 2015 el envío de facturas y recibos por correo postal certificado será abonado por el usuario/a y se va a ver reflejado en el total adeudado en cada resumen de cuenta del/la usuario/a responsable. Responsable de la Unidad de Genómica: Dra. Andrea Puebla Correo electrónico:
[email protected] Teléfono: 011 4621 1127/1447 int. 174.
FAX: 011 4621 0199 Página 1 de 9 UGB-DC-4.4 V06
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1.
SECUENCIACIÓN DE ADN POR ELECTROFORESIS CAPILAR:
Este servicio incluye: Aviso de aceptación de la solicitud de ensayo. Cuantificación del ADN templado. Oligonucleótidos universales gratuitos (consultar tabla de disponibles). Ensayo de extensión con terminadores fluorescentes Electroforesis capilar en secuenciadores automáticos de capilares. Revisión de la secuencia obtenida. Envío por correo electrónico de archivos de resultado e informe. Consulta sobre los resultados obtenidos.
oligonucleótidos
Las solicitudes deben enviarse a:
[email protected] Especificaciones:
Templados: ADN plasmídico, BAC, Cósmidos, productos de PCR.
La calidad de la secuencia obtenida depende muy fuertemente de: -
-
Calidad del templado: el ADN que se utilizará como templado deberá estar purificado por métodos de rutina o comerciales. Eluir o diluir hasta la concentración final solicitada usando agua destilada (no TE ni soluciones tampón que contengan EDTA). No se aceptan tubos de muestras rotos o deteriorados ni muestras sin purificar o minipreparaciones crudas. Si la purificación se realiza con PEG o precipitación con sales consultar a la responsable de UGB con anterioridad. Cantidad del templado: se requieren 10 µl de templado por cada reacción de secuenciación solicitada, con las siguientes concentraciones según el tipo y tamaño del ADN: Templado
Concentración
Productos de PCR 100-200 pb (1)
5 ng/μl
200-500 pb
15 ng/μl
500-1000 pb
30 ng/μl
1000-2000 pb
60 ng/μl
mayor a 2000 pb
75 ng/μl
Plásmidos
200 ng/μl
BAC/Cósmidos/ Vectores >7 kb
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200-500 ng/μl
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Para vectores de más de 6 kb es conveniente un ciclado mayor al estándar para obtener mejor señal, esto deberá solicitarse en el campo “Observaciones” de la solicitud del ensayo. (1) Si el fragmentro es menor a 100pb usar templados de 2,5 ng/µl de conc. o 1µl del mismo en conc. mayores para el ensayo, para evitar que la señal fluorescente sea excesiva.
Oligonucleótidos: se requieren 10 µl de una solución 5 µM por cada reacción de secuenciación solicitada con cada oligonucleótido específico. Para l@s usuari@s que rutinariamente utilicen oligonucleótidos específicos particulares el laboratorio posee capacidad para guardar una alícuota, lo que se indicará en la solicitud de análisis en “Observaciones”. Enviar la/s muestra/s y los oligonucleótidos en tubos de polipropileno de 1,5 ml rotulados en los laterales, dejando la tapa libre. Para envíos mayores a 30 muestras utilizar placas de 96 pocillos para los ADN y los oligonucleótidos en tubo. La Unidad de Genómica cuenta con una colección de oligonucleótidos universales que están a disposición de los clientes sin cargo: T3 Promotor:
5´ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3´
T7 Promotor:
5'TAATACGACTCACTATAGGG3´
T7 Reverse:
5'CTAGTTATTGCTCAGCGGTGG3'
T7 Terminator:
5'GCTAGTTATTGCTCAGCGG3'
T7 EEV:
5'AAGGCTAGAGTACTTAATACGA3'
SP6:
5'ATTTAGGTGACACTATAGAA3'
M13 (-21) Forward:
5'TGTAAAACGACGGCCAGT3'
M13 (-40) Forward:
5'GTTTTCCCAGTCACGAC3'
M13/pUC Reverse (-29):
5'CAGGAAACAGCTATGACC3'
pET Upstream Primer:
5'ATGCGTCCGGCGTAGA3'
PGEX5:
5'GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG3'
PGEX3:
5'CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG3'
27f:
5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3'
1492r:
5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT3'
ITS-1:
5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG3'
ITS-4:
5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3'
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A falta de especificación clara, consideramos los pedidos de secuenciación con T7 como T7 Promotor y M13 Forward como M13 Forward (-21).
Resultados:
Como resultado del análisis se obtienen y envían por correo electrónico 3 archivos: - Uno con extensión .abi que contiene la secuencia de ADN y un electroferograma que puede ser interpretado por el cliente. - Un archivo con extensión .phd que contiene los índices de Phred de cada una de las bases obtenidas. - Un tercer archivo con extensión .seq que contiene la secuencia de nucleótidos de ADN en un formato requerido por varios programas de uso para el análisis posterior de los resultados.
Plazo de entrega de resultados: cinco días hábiles a partir de la recepción de la muestra en nuestro laboratorio (recibidas antes de las 15 horas). En el caso de solicitar más de 100 reacciones en un solo envío o muestras que necesiten un tratamiento especial, el plazo de entrega de resultados se acordará con la responsable según la disponibilidad del laboratorio. Las muestras para análisis diagnósticos humanos serán priorizadas por sobre el habitual orden de recepción.
Acreditación: Laboratorio de ensayo acreditado por el Organismo Argentino de Acreditación con acreditación Nº LE 113. Consultar alcance de la acreditación en http://www.oaa.org.ar/docs/113%20LE%20BIOTECNOLOGIA.pdf
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GENOTIPIFICACIÓN POR ELECTROFORESIS CALIPAR MEDIANTE MARCADORES MOLECULARES
2.
Este servicio incluye: Aviso de aceptación de la solicitud de ensayo. Puesta a punto de diluciones de la reacción de PCR. Estándar de peso molecular (consultar tabla de estándares disponibles). Electroforesis capilar de la muestra. Revisión de la electroforesis obtenida. Envío por correo electrónico de archivos de resultado e informe. Consulta sobre los resultados obtenidos. Las solicitudes deben enviarse a:
[email protected] Especificaciones: Marcadores moleculares ensayados:
SSR (simple Single Repeat) AFLP (Amplified Fragment Length Polimorfism) VNTR (Variable Number Tandem Repeat) SNP ( Single Nucleotide Polimorfism) ARISA (Automated Approach for Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polimorfism) SHAPE (Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extensión) MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) Preparación de los fragmentos de PCR fluorescentes: la electroforesis para genotipificación pueden realizarse con:
-
-
Fragmentos provenientes de una única reacción de PCR. Fragmentos provenientes de diferentes PCR mezcladas en la proporción adecuada para que cada fragmento esté representado en señales fluorescentes similares (normalización de la señal de cada PCR): CO-ELECTROFORESIS. Fragmentos de PCR provenientes de la amplificación con diferentes pares de oligonucleótidos ensayados en una única reacción: MULTIPLEX.
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Fluoróforos compatibles con las químicas disponibles:
Dye Set
Estándar Fluoróforo Fluoróforo Fluoróforo Fluoróforo Fluoróforo de Azul Verde Amarillo Rojo Naranja tamaño
Aplicaciones
DS02
LIZ 120
dR110
dR6G
dTAMRA
dROX
LIZ
SNaPShot
DS30
ROX o LIZ
6-FAM
HEX
NED
ROX
/
MM varios
DS33
ROX o LIZ
6-FAM
VIC
NED
PET
LIZ
MM varios
Otros posibles a pedido: DS31
ROX
6-FAM
VIC
NED
ROX
/
MM varios
DS32
LIZ
6-FAM
JOE
NED
ROX
/
MM varios
Estándares de tamaño disponibles:
Estándar de tamaño
Dye Set
Color del fluoróforo
Tamaño de la serie de fragmentos
Aplicaciones
GeneScan LIZ 120
DS02
Naranja
15, 20, 25, 35, 50, 62, 80, 110, y 120
SNaPShot
GeneScan LIZ 500
DS33
Naranja
35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 300, 340, 350, 400, 450, 490 y 500
MM varios
GeneScan LIZ 600
DS33
Naranja
20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 314, 320, 340, 360, 380, 400, 414, 420, 440, 460, 480, 500, 514, 520, 540, 560, 580 y 600
MM varios
MM varios
GeneScan LIZ 1200
DS33
Naranja
20, 30, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 314, 320, 340, 360, 380, 400, 414, 420, 440, 460, 480, 500, 514, 520, 540, 560, 580, 600, 614, 620, 640, 660, 680, 700, 714, 720, 740, 760, 780, 800, 820, 840, 850, 860, 880, 900, 920, 940, 960, 980, 1000, 1020, 1040, 1060, 1080, 1100, 1120, 1160 y 1200
GeneScan ROX 500
DS30
Rojo
35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 300, 340, 350, 400, 450, 490 y 500
MM varios
GeneScan ROX 2500
DS30
Rojo
55, 112, 127, 134, 190, 204, 251, 256, 287, 304, 379, 488, 508, 554, 845, 1133, 1199, 1740, 2026, 2180, 2483 y 2499
MM varios
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Consultar por otros estándares de tamaño necesarios para aplicaciones especiales. Figura 1: Patrón electroforético del estándar de tamaño GeneScan 500 (-250) Rox.
Para explotar al máximo las posibilidades del sistema y hacerlo más procesivo y económico, se deben tener en cuenta dos aspectos importantes al preparar las muestras para la electroforesis: Usar la mayor cantidad de fluoróforos de diferentes colores para el diseño de los oligonucleótidos a ensayar. Combinar los colores con los diferentes pesos moleculares de los fragmentos, evitando la superposición fragmentos del mismo tamaño y del mismo color. Es muy recomendable evaluar el ensayo en geles de agarosa antes de preparar las diluciones y realizar una optimización de la corrida. Cuando se realiza el envío de un nuevo marcador, se realiza en el laboratorio una optimización de la corrida electroforética, para asegurarse que: Todos los fragmentos estén dentro del rango de fluorescencia adecuado (entre 100 y 6500 RFU). No haya superposiciones de tamaños de fragmentos marcados con el mismo fluoróforo, en el caso de co-electroforesis o electroforesis de multiplex. La calidad del análisis depende muy fuertemente de: Calidad de los oligonucleótidos fluorescentes: Tenga en cuenta cuando adquiera reactivos que existen diferencias entre oligonucleótidos sintetizados en distintos servicios y compañías. Ajustar las condiciones de la PCR para utilizar la mínima cantidad de oligonucleótidos necesaria, a fin de que estos no compitan en la electroinyección durante la electroforesis capilar con los fragmentos de PCR producidos. Diluir los fragmentos fluorescentes de PCR para que se encuentren dentro de la fluorescencia óptima para las corridas en el secuenciador automático (entre 100 y 4000 RFU). Proteger las muestras de la exposición a la luz desde la preparación de los reactivos y ensayos hasta el envío de las muestras al servicio. No se ensayarán muestras con evidente deterioro de la placa que las contiene o Página 7 de 9 UGB-DC-4.4 V06
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contaminación microbiana.
Resultados:
Como resultado del análisis se obtiene y envía por correo electrónico un archivo con extensión .fsa que contiene el gráfico de fluorescencia producto de la electroforesis. Este archivo sólo puede ser analizado con el programa GeneMapper (Applied Biosystems). También existe un programa libre para la visualización de los gráficos y un análisis acotado de los datos, que puede bajarse de la página web de la compañía Life Technologies: Peak Scanner. El servicio cuenta con computadoras que poseen el programa GeneMapper a disposición de l@s usuari@s, l@s cuales deberán previamente solicitar un turno.
Plazo de entrega de resultados: el plazo depende de la cantidad de muestras recibidas diariamente en el laboratorio, en el aviso de aceptación del análisis se detallan los plazos aproximados.
Acreditación: Laboratorio de ensayo acreditado por el Organismo Argentino de Acreditación con acreditación Nº LE 113. Consultar alcance de la acreditación en http://www.oaa.org.ar/docs/113%20LE%20BIOTECNOLOGIA.pdf
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NUEVAS TECNOLOGÍAS DE SECUENCIACIÓN Y GENOTIPIFICACIÓN DE ALTO RENDIMIENTO Estos ensayos requieren de un asesoramiento previo a la solicitud, por favor contactarse con la responsable del laboratorio. Las solicitudes deben enviarse a:
[email protected] GENOTIPIFICACIÓN MEDIANTE MARCADORES SNP EN MICROARREGLOS: ensayos GoldenGate-Vera Code en lectores BeadXpress (Illumina) 3.
Este servicio incluye: Asesoramiento sobre la tecnología y el diseño del microarreglo. Aviso de aceptación de la solicitud de ensayo. Ensayo Golden Gate (Illunima) con microarreglos de/de la usuari@. Análisis del microarreglo en lector BeadXpress (Illumina). Revisión de los datos obtenidos utilizando el programa Genome Studio v1.0 (Illumina). Envío por correo electrónico de archivos de resultado e informe. Consulta sobre los resultados obtenidos. 4. SECUENCIACIÓN DE ALTO secuenciador Miseq (Illumina)
RENDIMIENTO:
Secuenciación
por
síntesis
en
Este servicio incluye: Asesoramiento sobre la tecnología y el diseño del ensayo. Pre evaluación cuali/cuantitativa de las muestras de ADN/ARN recibidas. Aviso de aceptación de la solicitud de ensayo. Preparación de bibliotecas (si correspondiera). Evaluación cuali/cuantitativa de las bibliotecas construidas. Secuenciación de alto rendimiento (SAR) en secuenciador Miseq (Illumina). Análisis bioinformático de la calidad de los datos obtenidos. Envío por correo electrónico de archivos de resultado e informe. Consulta sobre los resultados obtenidos. 5. ANÀLISIS DE ÀCIDOS NUCLEICOS POR ELECTROFORESIS CAPILAR: Electroforesis de ác. nucleicos no marcados en Fragment Analyzer (Advanced Analytical) Este servicio incluye: Asesoramiento sobre la tecnología y los kits disponibles según la aplicación. Aviso de aceptación de la solicitud de ensayo. Preparación de las muestras para la electroforesis. Electroforesis capilar en equipo Fragment Analyzer (Advanced Analytical). Análisis de resultado con el programa PROSize v2.0(Advanced Analytical). Envío por correo electrónico de archivos de resultado e informe. Consulta sobre los resultados obtenidos.
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