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Instrucciones de uso «DS-EIA-CA 125»

CH-1832

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INSTRUCCIONES DE USO «DS-EIA-CA 125» INMUNOENSAYO ENZIMATICO “ELISA” PARA LA DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA CONCENTRACION DEL ANTÍGENO CA 125

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INDICE

I. USO INDICADO........................................................................................................…………..........

3

II. INTRODUCCION..........................................................................................................................

3

III. PRINCIPIO DEL PRUEBA ……………………....................................................…………………………………

3

IV. CONTENIDO DEL KIT “DS-EIA-CA 125”........................................................................................

3

V. PRECAUCIONES...........................................................................................................................

4

VI. INSTRUCCIONES DE SALUD Y SEGURIDAD................................................................................

5

VII. MATERIALES Y EQUIPOS REQUERIDOS PERO NO INCLUIDOS EN EL KIT......................................

5

VIII. RECOLECCION Y MANEJO DE MUESTRAS..........................................……………………………………..

6

IX. PREPARACION DE LOS REACTIVOS..................................................................…………………………

6

X. PROCEDIMIENTO DEL PRUEBA.....................................................................................................

6

XI. CALCULO DE RESULTADOS..............................................................................………….................

7

XII. CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO “DS-EIA-CA 125”...............................................................

7

XIII. LIMITES DEL PRUEBA …………………………………………………………...................................................

8

XIV. CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE..............................……………………………….

9

XV. REFERENCIAS............................................................................................................................

9

XVI. EXPLICACION DE LOS SIMBOLOS……………………………………………….………………………………………...

10

ANEXOS…………………………………………………………………………………………..............................................

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Este inserto proporciona información para el uso profesional del kit. El formato contiene suficientes reactivos para 96 pruebas (Placa separable) el ensayo incluye los controles; el uso parcial del kit es posible y puede ser usado con protocolo manual.

I. USO INDICADO el kit “DS-EIA-CA 125” es destinado para la determinación cuantitativa de la concentración del antígeno CA 125 en suero humano por inmunoensayo enzimático “Elisa” en microplacas. Para su uso en diagnostico In Vitro. II. INTRODUCCION El antígeno СА 125 (MUC16) es una glicoproteína tipo mucina de alto peso molecular que se encuentra en la superficie de las células del tumor del ovario con expresión restringida en los tejidos adultos normales, como endocérvix, endometrio, las trompas, pleura, pericardio, peritoneo, la superficie ocular, seno y de vez en cuando tiene expresión en el intestino, pulmones y riñones. Está presente en diversos fluidos biológicos: los suero, quiste, líquidos peritoneal y amniótico, la leche humana, plasma seminal, moco cervical. El CA 125 se definió por primera vez en 1981 por Bast y otros. El antígeno tiene tres dominios antigénicos que clasifica a los anticuerpos como como OC125 (grupo A), como M-11 (grupo B) y como OV197 (grupo C). El CA 125 es una glicoproteína multifuncional con un importante papel en la transducción de señales y la potenciación de tumorigenicidad y la metástasis. Está implicado en la mediación tanto de la anti-adhesión como de la adhesión celular, y la supresión del sistema inmunológico. La propiedad anti-adhesiva de MUC16 se sugiere para proporcionar una barrera de protección en la superficie epitelial contra la adhesión bacteriana y el daño mecánico. Al mismo tiempo, el CA 125 media la adhesión celular al unirse a otra glicoproteínas de la superficie celular. La concentración sérica del CA 125 se eleva en un 80-90% en el cáncer de ovario en estado avanzado. La concentración sérica aumenta con la progresión de la enfermedad, pero el declina después de la intervención terapéutica. El CA 125 ensayo de nivel se utiliza para evaluar el estado terapéutico de los pacientes con enfermedad documentada y la eficacia de la terapia. Un alta concentración del marcador se detectan en otras tipos de cáncer (páncreas, mama, vejiga, hígado y pulmón), en enfermedades benignas (diverticulitis, fibromas uterinos, quistes ováricos benignos, endometriosis, absceso tubo-ovárico, síndrome de hiperestimulación y embarazo ectópico), y en condiciones fisiológicas (embarazo, menstruación). III. PRINCIPIO DE EL TEST La "DS-EIA-CA 125" es un inmunoensayo de un solo paso, basada en el principio del método de "sandwich". El sistema del ensayo utiliza una gran afinidad y especificidad de anticuerpos monoclonales (enzima conjugada e inmovilizada) dirigido contra un determinante antigénico definido en la molécula de CA 125. A la muestra se le permite reaccionar de forma simultánea con los dos anticuerpos, lo que da como resultado que las moléculas del CA 125 sean atrapadas entre la fase sólida y los anticuerpos ligados a enzimas. Después de la incubación, los pocillos se lavan con solución de lavado para eliminar anticuerpos no ligados. Una solución de TMB de sustrato se añade y se incuba, lo que resulta en el desarrollo de un color azul. El desarrollo del color se detiene con la adición de reactivo de parada, cambiando el color a amarillo. La concentración del CA 125 es directamente proporcional a la intensidad del color de la muestra. La absorbancia se mide espectrofotométricamente a 450 nm. IV. CONTENIDO DEL KIT “DS-EIA-GONADOTROPIN-FSH” ETIQUETA

NATURALEZA DE LOS REACTIVOS

Pocillos Microtitulados recubiertos AntiCA 125

Placa de 96 pocillos (separables) recubiertos con anticuerpos monoclonales anti-CA 125. Una vez abiertos los pozos micro-titulados deben ser almacenados a 28°C y utilizados dentro del periodo de caducidad del kit.

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PRESENTACION

1 placa

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Calibradores

Suero de Control

Conjugado

Solución de lavado (Concentrada 25 veces) TMB- Substrato

Reactivo de parada.

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Seis frascos de LH en un buffer de base proteica aproximadamente* concentraciones de: 0 (0), 12.5 (1), 50 (2), 100 (3), 250 (4), 500 (5) U/ml. * Niveles exactos son dados en las etiquetas en una base específica a cada lote y en los certificados de análisis. Liquido transparente o ligeramente opaco de color amarillo pálido. Agente conservante: 0.1% ProClin 300, 0.004% Sulfato de gentamicina, 0.1% fenol. Una vez abiertos, los calibradores deben ser usados en dos meses. Almacenar a 2-8°C en el frasco bien cerrado. Control basado en suero humano. Leer la etiqueta del frasco para el rango de referencia. Liquido transparente o ligeramente opaco de color amarillo pálido. Agente conservante: 0.1% ProClin 300, 0.004% Sulfato de gentamicina, 0.1% fenol. Una vez abierto el suero de control debe ser usado en dos meses. Almacenar a 28°C en el frasco bien cerrado. Anticuerpos monoclonales anti-CA 125 conjugados con peroxidasa de remolacha. Liquido transparente u opaco de color rosado. Conservante: 0.1% ProClin 300. Una vez abierto el conjugado debe ser usado en dos meses. Almacenar a 2-8°C en el frasco bien cerrado. Liquido transparente o ligeramente opaco, incoloro o amarillo pálido. Almacenar a 2-8 °C hasta su fecha de caducidad en el frasco bien cerrado. Tetrametilbenzidina (TMB) en una solución buffer cítrica, que contiene H2O2. Liquido transparente incoloro. Una vez abierto, el TMB-sustrato debe ser usado en 2 meses. Almacenar a 2-8°C en el frasco bien cerrado. 0.2 M Solución de ácido Sulfúrico. Liquido de color transparente. Almacenar a 2-8 °C hasta su fecha de caducidad en el frasco bien cerrado.

6 frascos 0.5 ml (Calibrador 0 U/ml – 2.0 ml)

1 frasco 0.5 ml

1 frasco 12.0 ml 1 frasco 50.0 ml 1 frasco 12.0 ml 1 frasco 15.0 ml

Adicionalmente el siguiente material puede estar incluido en el kit: -Una tapa para una placa de poliestireno de 96 pozos o una película de protección para las placas EIA; -Puntas desechables; -Un plato de plástico para reactivos líquidos; -Una bolsa de plástico con auto-cierre. V. PRECAUCIONES La confiabilidad de los resultados depende de la correcta aplicación de las siguientes Buenas Prácticas de Laboratorio: ● La temperatura del laboratorio debe estar entre 18-24 °C. ● No utilice reactivos caducados ● No mezclar reactivos de diferentes lotes dentro de una serie de ensayos. ● Con cuidado reconstituir los reactivos evitando cualquier tipo de contaminación. ● No realizar la prueba en presencia de vapores de reactivos (ácido, alcalino, aldehído) o polvo que podría alterar la actividad enzimática de los conjugados. ● Utilizar material de vidrio bien lavado y enjuagado con agua desionizada o de preferencia, material desechable.

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No permita que se seque la microplaca entre el final de la operación de lavado y la distribución de los reactivos. La reacción de las enzimas es muy sensible a los iones metálicos. En consecuencia, no permita que ningún elemento de metal entre en contacto con las diferentes soluciones de conjugado o sustrato. Use una punta de distribución nueva para cada muestra. El buen lavado es un paso crítico en este procedimiento: respete el número recomendado de ciclos de lavado y asegúrese de que todos los pozos se llenan por completo y luego se vacíen totalmente. El lavado incorrecto puede conducir a resultados inexactos. No utilice el mismo recipiente para distribuir solución de conjugado el desarrollador de color. Compruebe el correcto funcionamiento de las pipetas y otros equipos de precisión. No cambiar el procedimiento del ensayo. Utilice agua de alta calidad. Evite la exposición de los reactivos al calor excesivo o la luz solar durante el almacenamiento y la incubación.

VI. INSTRUCCIONES DE SALUD Y SEGURIDAD ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●

●

Todos los reactivos contenidos en el kit son destinados para su “uso para diagnostico in vitro”. El material de origen humano usado en la preparación del Suero de control ha sido testado y encontrado negativo a HBsAg, anticuerpos del virus de la hepatitis C y a anticuerpos del virus de inmunodeficiencia humana (HIV-1 and HIV-2), antígeno p24 HIV-1. Debido a que ningún método de prueba puede ofrecer una completa seguridad que agentes infecciosos estén ausentes, manipule los reactivos y las muestras de los pacientes como si fueran capaces de trasmitir una enfermedad infecciosa. No coma, beba, fume, o aplique cosméticos donde materiales inmunodiagnósticos están siendo manipulados. No pipetee con la boca. Cualquier equipo en contacto directo con las muestras o los reactivos así como las soluciones de lavado deben considerarse como productos contaminados y manejados como tales. Vista bata de laboratorio y guantes desechables cuando manipule reactivos y muestras y lave muy bien sus manos después de manejarlos. Evite salpicar muestras o soluciones que contengan muestras. Evite cualquier contacto con el sustrato TMB y la solución de parada con la piel o la mucosa. Provea adecuada ventilación. No olvide neutralizar y/o usar la autoclave con los residuos de lavado o cualquier fluido que contenga muestras biológicas antes de versarlas en el contenedor. Muestras y reactivos de origen humano, así como, material contaminado y productos deben ser desechados después de ser descontaminados: ya sea por emersión en hipoclorito a una concentración final del 5% de hipoclorito de sodio (1 parte de hipoclorito por cada 10 partes de fluido contaminado o agua) por 30 minutos. También los residuos sólidos deben ser desinfectados con autoclave por una hora a una temperatura de 124-128 ºС y a una presión de 1.5 kHz/sm2 (0.15 MPa). También los residuos líquidos pueden ser desinfectados mediante un tratamiento de ebullición por 30 minutos o con uso del autoclave por una hora a una temperatura de 124-128 ºС y una presión de 1.5 kHz/sm2 (0.15 MPa). Instrumentos y equipos deben ser limpiados 2 veces con etanol al 70% antes y después de su uso. Algunos reactivos contienen ProClin 300 (0.1 %). Irritante. Puede causar sensibilización de la piel por contacto. Después del contacto con la piel, lavar inmediatamente con abundante agua y jabón.

VII. MATERIALES Y EQUIPOS REQUERIDOS NO INCLUIDOS EN EL KIT:    

Agua purificada Pipetas, de un canal y multicanal, volumétricas o graduadas para medir y dispensar 25µl, 100µl, 150µl. Puntas de pipeta desechables Lavador automático de microplacas.

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Lector de microplacas equipado con un filtro de 450 y 405-415 nm. Guantes desechables.

VIII. RECOLECCION DE MUESTRAS Y MANEJO DE MUESTRAS La toma de muestras de sangre debe ser implementada de acuerdo a las prácticas actuales. Se debe usar únicamente suero. Separar el suero de las células sanguíneas lo más pronto posible para evitar cualquier hemolisis. Una hemolisis extensa puede afectar la eficiencia del test. Muestras con sustancias particuladas visibles deben ser clarificadas por centrifugación antes de ser testadas. Partículas suspendidas de fibrina o agregados pueden conducir a la obtención de falsos resultados. No caliente la muestra. Para una adecuada comparación y establecer los valores normales, la muestra debe tomarse en la mañana y en ayunas. La sangre debe ser recolectada en tubo de venopuntura de tapa roja sin aditivos o gel de barrera. Las muestras pueden ser almacenadas a 2-8 ºC por no más de 72 horas; pueden ser congeladas a -20 ºC. Evite los ciclos repetidos de congelación/descongelación. Muestras que han sido congeladas y descongeladas por más de una vez no deben ser usadas. Muestras con hemolisis manifiesta, hiperlipidemia no deben ser analizadas. IX. PREPARACION DE LOS REACTIVOS 1. Reactivos listos para su uso:  Pozos micro-titulados cubiertos con anti-CA 124  Calibradores  Suero de Control  Conjugado  Sustrato-TMB  Solución de parada 2. Reactivos para preparar: Solución de lavado de trabajo: Agitar bien la solución de lavado concentrada. Para obtener la solución de lavado concentrada de trabajo tome la cantidad requerida del concentrado y mézclelo con agua purificada (1:25) en un frasco aparte. La solución de lavado de trabajo es estable por al menos 14 días a temperatura ambiente cuando se aplican las buenas prácticas de laboratorio (GLP). X. PROCEDIMIENTO DEL TEST Nota: Antes de usar, permita a los reactivos alcanzar la temperatura ambiente por 30 minutos. 1. Porte todos los componentes y muestras clínicas a testar a temperatura ambiente. 2. Ajuste los pozos de la microplaca a cada calibrador, el suero de control y las muestras de pacientes para ser testadas por duplicado. Añada uno o 2 pozos para el TMB de control (blanco). Deje los pozos microtitulados no utilizados en el empaque de aluminio y no retire el gel de Silicio. Introduzca el empaque en una bolsa plástica de cierre hermético y almacene a 2- 8 °C hasta la fecha de caducidad del kit. 3. Pipetee 25 µl de cada calibrador, suero de control y muestras con una punta desechable dentro del pozo asignado. El proceso de pipeteo de las muestras no debe tomar más de 10 minutos para evitar la deriva del análisis. 4. Añadir 100 µl de conjugado en los pozos, excepto en el blanco. 5. Agite suavemente la microplaca por 30 segundos para mezclar, después de añadir la muestra y el Conjugado, cubra las tiras con una tapa o un film protector por 90 minutos a temperatura ambiente (20-25 ºC). 6. lave los pozos 5 veces con 300 µl con la solución de lavado de trabajo por pozo y golpee la placa firmemente contra papel absorbente para asegurar que este seca- el volumen residuo debe ser menor de 10 µl (El uso de un lavador es recomendado). No permita que la microplaca se seque durante el final de la operación de lavado y la distribución del reactivo. 7. Pipetee 100 µl de sustrato-TMB a intervalos de tiempo controlados. 8. Encubar por 25±5 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. 9. Añadir 150µl de la Solución de Parada en cada una de los pozos con los mismos intervalos de tiempo empleados en el paso 7. Suavemente mezclar por 5-10 segundos.

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10. Lea las absorbancias en el lector de microplacas a 450 nm. En caso de valores excesivos de absorbancia lea a 405-415nm. La lectura se debe hacer dentro los 20 minutos siguientes a la adición del reactivo de parada. El esquema del ensayo está representado en el anexo. Verifica espectrofotométrica del pipeteado del reactivo La presencia de Conjugado + muestra en el pozo puede ser verificada por la lectura automática a 540 nm. Cada pozo que contenga muestra y conjugado debe tener una OD mayor a 0.500. XI. CALCULO DE RESULTADOS 1. Calcule el valor de la absorbancia media de cada calibrador por duplicado con las dos longitudes de onda (450 y 405-415 nm). 2. Calcular la media de la densidad óptica de cada valor desconocido por duplicado. 3. Reste la media del valor de absorbancia del “blanco”, de los valores de la media de absorbancia de los calibradores, control y muestras de suero. 4. Dibuje una curva de calibración en papel milimetrado con la absorbancia media sobre el eje Y y la concentración del calibrador sobre el eje X para las dos longitudes de onda (450 y 405-415 nm). 5. Lea los valores desconocidos directamente de la curva de calibración – si la OD de la muestra es menor de 2.5 a 450 nm use la curva calibración obtenida a 450 nm. Si la OD de la muestra es mayor a 2.5 a 450 nm use la curva de calibración obtenida a 405-415. Si se usa un software para el inmunoensayo, se recomienda una curva a 4 parámetros. 6. Si las muestras en un análisis inicial dan un valor de lectura para la CA 125 mayor al control 5 dilúyala con el calibrador 0. El resultado obtenido debe ser multiplicado por el factor de dilución. Calibrador

OD1

DATOS TIPICOS DE TABULACION OD2 media OD-Blanco

Valor (U/ml ) 0 0.051 0.052 0 0 1 0.117 0.114 0.064 12.5 2 0.352 0.340 0.295 50 3 0.613 0.610 0.560 100 4 1.374 1.365 1.318 250 5 2.448 2.470 2.408 500 Desconocido 0.295 0.278 0.235 40.7 Estos datos tienen como único propósito ilustrar, y no deben ser usados para calcular los valores desconocidos. Cada usuario debe obtener sus propios datos y una curva estándar. Validación del test Para considerar los resultados del test como válidos se deben cumplir los siguientes criterios. Si estos criterios no se cumplen el test debe considerarse no valido y debe ser repetido. 1. Blanco OD: El valor de absorbancia no debe ser mayor de 0.1 a 450 nm. 1. La absorbancia (OD) del calibrador 5 debe ser menor de 1.3. 2. Calculado el valor del Control debe estar dentro el rango establecido. XII. CARACTERISTICAS DE EFICIENCIA “DS-EIA-CA 125” 1. Rango dinámico del ensayo El rango del ensayo debe estar entre 0-500 U/ml. 2. Sensibilidad El limite menor de detección se calcula desde una curva de calibración determinando el resultado de concentración de la OD media del calibrador 0 (basada en 10 análisis por duplicado) mas 2 SD. De esta manera, la sensibilidad del kit “DS-EIA-CA 125” es 1 U/ml.

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3. Especificidad (Reactividad cruzada) No existe reacción cruzada con los antígenos CEA, CA 15-3, CA 19-9. 4. Precisión Precisión Intra-ensayo La variabilidad del ensayo se ilustra en la siguiente tabla: Muestra n Media, U/ml SD 1 2

30 30

101.8 29.9

CV,%

4.76 1.66

4.7 5.5

Precisión Inter-ensayo La variabilidad del ensayo se ilustra en la siguiente tabla: Muestra Media, U/ml Media, U/ml 1 26.3 1.76 2

126.0

SD 6.7 6.6

8.95

5. Recupero Las muestras claveteadas fueron preparadas añadiendo cantidades definidas de CA 125 a el suero muestra. Los resultados en (U/ml) se ilustran en la siguiente tabla: Concentración añadida, Concentración medida, Concentración esperada, Recupero, U/ml

U/ml

U/ml

%

50

42.2 44.3

42.2 46.1

96

6. Linealidad Tres muestras fueron diluidas con el calibrador 0. Los resultados en (U/ml) se ilustran en la siguiente tabla: Concentración Recupero, Sin diluir Dilución Concentración esperada, U/ml medida, U/ml % 500 250 100

500:2 250:2.5 100:2

243.3 100.9 50.7

250 100 50

97 101 101

7. Volumen normal esperado El CA 125 se midió en 115 mujeres sanas. El valor medio obtenido fue de 7.4 U/ml con una derivación estándar de 6.4. el valor medio fue 6.5 U/ml, el rango de 1.1 – 29.6 U/ml. El 100% de las mujeres sanas obtuvieron en el ensayo valores menores a 35 U/ml. 8. Exactitud El sistema de la prueba “DS-EIA-CA 125” fue comparado con el test de referencia “Roche ELEXIS CA 125”. El número total de muestras fue 228. Los valores se encontraron en un rango de 1.4 hasta 1001.4 U/ml. La mínima ecuación de regresión del cuadrado y el coeficiente de correlación fueron computados para “DS-EIACA 125” en comparación con el método de referencia. Los valores mínimos de la ecuación de regresión del cuadrado fue de y = 1.07 (x) + 16.36 con un coeficiente de correlación 0.98. XIII. LIMITES DE LA PRUEBA 1. Todos los reactivos del kit han sido calibrados para la determinación de CA 125 en suero humano. El kit no está calibrado para la determinación de CA 125 en saliva, plasma u otro tipo de muestras de origen humano o animal. 2. Cualquier uso impropio de las muestras o modificaciones de la prueba pueden influenciar los resultados. 3. El pipeteo de las muestras no debe prolongarse por más de 10 minutos para evitar la deriva del análisis. 4. Solo el calibrador 0 puede ser usado para diluir cualquier muestra alta de suero. El uso de cualquier otro reactivo puede llevar a falsos resultados.

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5. Los resultados obtenidos con este kit no deben ser usados como única base para el diagnóstico clínico. Cualquier resultado de laboratorio es solo parte del cuadro total del paciente. 6. Algunos individuos pueden tener anticuerpos heterófilos de ratón u otras proteínas animales que podrían interferir con el ensayo. De cualquier manera, los resultados de pacientes que han recibido preparaciones de anticuerpos de ratón par diagnostico o terapia deben ser interpretados con precaución. 7. No se observó efecto gancho en este ensayo. XIV. CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE Su vida útil es de 15 meses. Mantener en un lugar oscuro y a 2-8 C. El transporte debe ser efectuado mediante toda clase de medios que garanticen una temperatura de 9-20 C con una duración de no más de diez (10) días. La congelación es prohibida. El Nombre y la dirección del fabricante son: DSI S.r.l Saronno (VA), Vía A.Volonterio, 36а, 21047, Italia Tel:+39 02 967 09111, Fax: +39 02 962 0185 E-mail: [email protected], www.dsitaly.com

XV. REFERENCES 1. Singh A.P., Senapati Sh., Ponnusamy M.P., Jain M., lele S.M., Davis J.S., Remmenda S., Batra S.K. “Clinical potential of mucins in diagnosis, prognosis, and therapy of ovarian cancer”, Lancet Oncol, 9: 1076-1085 (2008). 2. Warren D.J., Nustad K., Beard J.B., O’Brien T. “Expression and epitope characterization of recombinant CA 125 repeat: fourth report from the ISOBM TD-1 Workshop”. Tumor Biol., 30: 51-60 (2009). 3. Bast R.C., Feeney M., Lazarus H.,Nadler L.M., Colvin R., Knapp R.C. “Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma”, J. Clin. Invest, Vol. 68, 1331-1337 (1981). 4. Davelaar E.M., Kamp G.J., verstraeten R.A., Kenemans P. “Comparison of seven immunoassays for the quantification of CA 125 antigen in serum”, Clin. Chem, 44:7 1417-1422 (1998). 5. Medeiros L.R., Rosa D.D., Rosa M.I., Bozetti M.C. «Accuracy of CA 125 in the diagnosis of ovarian tumors: A quantitative systematic review», Eur. J. of Obstetrics & Gynecol. and Reprod. Biol, 142: 99-105 (2009). 6. Markmann S, Gerber B., Briese V. «Prognostic value of CA 125 levels during primary therapy», Anticancer Res., 27: 1837-1839 (2007).

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XVI. EXPLICACION DE LOS SIMBOLOS Marcado CE (Directiva Europea 98/79/CE para los dispositivos médicos para diagnostico in vitro)

Para uso diagnostico in vitro

Fabricante

Código de Catalogo

Suficiente Para # de pruebas

Código del Lote

Limitación de la temperatura para el almacenamiento

Fecha de caducidad Año Mes- Día

Consultar Instrucciones de uso

Contiene un agente irritante

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Instrucciones de uso «DS-EIA-PSA-TOTAL»

Esquema del ensayo

Anexo

25 µl de los Calibradores, Sueros de control por duplicado; 1

Añadir

25 µl de las muestras a probar por duplicado; Uno o dos pozos para el TMB de control (blanco)

2

Añadir

100 µl de Conjugado dentro de los pozos, excepto el blanco

3

Mezclar

10 segundos

4

Incubar

90 min, a 20-25 ºС

5

Lavar la placa

Solución de Lavado de trabajo, 300 µl, 5 veces

6

Añadir

100 µl de Sustrato-TMB-Substrato dentro los pozos

7

Incubar

25±5 min, a temperatura ambiente en un lugar oscuro

8

Añadir

150 µl de Solución de Parada dentro los pozos

9

Mezclar

5-10 segundos

Leer la densidad óptica

450 nm, 405-415 nm.

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