DIAGNOSTIC AUTOMATION, INC. 23961 Craftsman Road, Suite E/F, Calabasas, CA 91302 Tel: (818) 591-3030 Fax: (818) 591-8383 Ver etiqueta externa Σ=96 pruebas

2°C-8°C 8043-1

MYCOPLASMA IgM ELISA Para uso de diagnóstico in vitro Catálogo No. 8043-1

INTRODUCCIÓN El mycoplasma pneumoniae está entre los más pequeños organismos de vida libre. En los humanos, con frecuencia se encuentra en la garganta y pulmones, y es susceptible a agentes antimicrobianos que inhiben la síntesis de proteínas (1). La propagación de infecciones mycoplasmicas, depende del contacto cercano y prolongado entre las personas, ya que se transmite a través de núcleos de pequeñas gotas provenientes del tracto respiratorio (2). La infección mycoplasmica, puede ser asintomática o producir enfermedades del tracto respiratorio superior o neumonía atípica. Es difícil diferenciar la neumonía de las infecciones virales sólo por medios clínicos (1,2). Las pruebas de laboratorio, tales como el aislamiento, la serología por Fijación del Complemento y la serología por ELISA, son útiles para obtener un diagnóstico (1, 2, 3, 4) PRINCIPIO DE LA PRUEBA La prueba inmunoadsorbente ligada a enzima (ELISA), depende de la capacidad de los materiales biológicos, (por ejemplo; los antígenos) absorbida en una superficie de plástico como el polietileno (fase sólida). Cuando los antígenos unidos a la fase sólida son puestos en contacto con el suero de un paciente, de estar presente el anticuerpo específico del antígeno, se unirá al antígeno absorbido en la fase sólida formando complejos antígenoanticuerpo. Se remueve el exceso de anticuerpo por medio del lavado. Luego se agrega globulina de cabra anti-humano IgM conjugada con peroxidasa de rábano picante, la cual luego se une a los complejos antígeno-anticuerpo. Se remueve el exceso de conjugado por medio del lavado, y luego se agregan el sustrato y cromógeno Tetrametilbenzidina (TMB).

Si está presente en el suero del paciente el anticuerpo específico del antígeno, se desarrolla un color azul. Cuando se detiene la reacción enzimática con 1N H2SO4, los contenidos de los pozos se tornan color amarillo. El color es proporcional a la concentración de anticuerpo en el suero y puede leerse en un espectrofotómetro adecuado o con un lector de placa de microtitulación ELISA (5, 6, 7, 8). La sensibilidad, especificidad y reproducibilidad de los inmunoanálisis ligados a enzimas, pueden ser comparados con otras pruebas serológicas de anticuerpos, tales como la inmunofluorescencia, fijación de complemento, hemaglutinación y radioinmunoensayos (9, 10, 11). PRESENTACIÓN DEL KIT Materiales Proporcionados Cada kit contiene los siguientes componentes en cantidades suficientes para llevar a cabo el número de pruebas indicadas en la etiqueta del paquete. 1- Placa de microtitulación recubierta con antígeno (desarrollado en caldo PPLO, lavado y tratado con éter) de mycoplasma (cepa FN): 96 pozos configurados en doce tiras de 1x8, almacenadas en una bolsa de aluminio con una tarjeta indicadora de desecante/humedad. Deje que los pozos se equilibren a temperatura ambiente (21-25°C) en la bolsa para protegerlos de la condensación. Almacenadas a 2-8°C, las tiras recubiertas son estables hasta la fecha de expiración indicada en la etiqueta. (96T: una placa, 480T: cinco placas) 2- Diluyente de suero Plus: Listo para su uso. Contiene anticuerpos IgG de cabra/oveja anti-humano para remover el IgG de competencia por medio de la absorción del suero, con estabilizadores de proteína y proclin (0.1%) como preservativo. (96T: dos botellas de 45 mL cada una: 480T: dos botellas de 225 mL cada una.) 3- Calibrador Cutoff (Calibrador): suero humano o plasma desfibrinada. Azida de sodio (0.1%) y penicilina/estreptomicina (0.01%) agregados como preservativos, con el factor específico del kit impreso en la etiqueta del vial. El calibrador Cutoff se usa para calibrar la prueba y así observar las fluctuaciones en la temperatura diariamente. La fuente del material para el calibrador Cutoff es diferente a los controles. (96T: un vial de 0.4 mL, 480T: un vial de 0.8 mL). 4- Control Positivo Alto: suero humano o plasma desfibrinado. Azida de sodio (0.1%) y penicilina/estreptomicina (0.01%) agregadas como preservativos, con el rango establecido impreso en la etiqueta del vial. El Control Positivo Alto se utiliza para controlar el rango dinámico superior de la prueba. (96T: un vial de 0.4 mL, 480T: un vial de 0.8 mL) 5- Control Positivo Bajo: suero humano o plasma desfibrinado. Azida de sodio (0.1%) y penicilina/estreptomicina (0.01%) agregadas como preservativos, con el rango establecido impreso en la etiqueta del vial. El Control Positivo Bajo se utiliza para

controlar el rango cerca del cutoff de la prueba. (96T: un vial de 0.4 mL, 480T: un vial de 0.8 mL) 6- Control Negativo: suero humano o plasma desfibrinado. Azida de sodio (0.1%) y penicilina/estreptomicina (0.01%) agregadas como preservativos, con el rango establecido impreso en la etiqueta del vial. El Control Negativo se utiliza para controlar el rango negativo de la prueba. (96T: un vial de 0.4 mL, 480T: un vial de 0.8 mL) 7- Conjugado de peroxidasa de rábano picante (HRP): Listo para usar. Anticuerpos IgM de Cabra anti-humano, con contenido de proclin (0.1%) como preservativo. (96T: una botella de 16 mL, 480T: cinco botellas de 16 mL cada una) 8- Solución Cromógeno/Sustrato Tipo I: Tetrametilbenzidina (TMB), lista para usar. Cuando es almacenada entre 2° y 8°C, la Solución Cromógeno/Sustrato es estable hasta la fecha de expiración indicada en la etiqueta. El reactivo debe mantenerse cerrado cuando no está siendo utilizado. Si se deja evaporar, podría formarse un precipitado en los pozos de reacción. (96T: una botella de 15 mL, 480T: cinco botellas de 16 mL cada una) 9- Tampón de Lavado Tipo I (Concentrado 20X): diluya una parte de concentrado + 19 partes de agua deshionizada o destilada. Contiene TBS, Tween 20 y proclin (0.1%) como preservativo. (96T: una botella de 60 mL, 480T: una botella de 250 mL) 10- Solución Stop: Dos botellas de 15 mL. Contiene una solución H2SO4.

REQUERIMIENTOS ADICIONALES 1. Botella de lavado, sistema de lavado de placa de microtitulación automático o semiautomático. 2. Micropipetas, incluyendo las multicanal capaces de dispensar con precisión volúmenes 10-200 mL (menos de 3% CV) 3. Cilindro graduado de un litro. 4. Toallas de papel. 5. Tubo de ensayo para la dilución del suero. 6. Depósitos de reactivo para pipetas multicanal. 7. Puntas de pipeta. 8. Agua destilada o deshionizada (dH20), CAP (College of American Pathology) tipo 1 o equivalente (16, 17) 9. Temporizador con capacidad para medir con una precisión de +/- 1 segundo (0 - 60 minutos) 10. Cubetas de desechos y 0.5% de hipoclorito sódico (50 mL de blanqueador en 950 mL dH20).

11. Lector de microplaca de longitud de onda única o dual con filtro de 450 nm. Si se utiliza la longitud de onda dual, establezca el filtro de referencia en 600-650 nm. Consulte el manual del operador o contacte al fabricante del instrumento para establecer las especificaciones de linealidad del lector. Nota: Utilice sólo material de vidrio limpio y seco.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD 1. Conserve el kit sin abrir a una temperatura entre 2 y 8 °C. El kit de análisis se puede utilizar hasta la fecha de caducidad del mismo. Consulte la fecha de caducidad en la etiqueta del envase. 2. Las placas de microensayo sin abrir se deben conservar a una temperatura entre 2 y 8°C. Las tiras sin utilizar se deben volver a guardar de forma inmediata en una bolsa sellada con desecante y conservar a una temperatura de entre 2 y 8 °C. 3. Conserve la solución del conjugado HRP a una temperatura de entre 2 y 8 °C. 4. Conserve el calibrador cut-off y el control positivo alto, positivo bajo y negativo a una temperatura de entre 2 y 8 °C. 5. Conserve el Diluyente de suero Plus y el tampón de lavado tipo I a una temperatura de entre 2 y 8 °C. 6. Conserve la solución sustrato/cromógeno tipo I a una temperatura entre 2 y 8 °C. El reactivo debe permanecer cerrado cuando no se está utilizando. Si se evapora, podría formarse un precipitado en los pozos de reacción. 7. Almacene el tampón de lavado 1X (diluido) a temperatura ambiente (de 21 a 25 °C) por hasta 5 días, o por una semana a una temperatura entre 2 y 8 °C. Nota: Si se mantiene una temperatura de almacenamiento constante, los reactivos y el sustrato permanecerán estables hasta la fecha de caducidad del kit. Se tomaron precauciones en la fabricación de este producto para proteger los reactivos frente a la contaminación y se han añadido agentes bacteriostáticos a los reactivos líquidos. Deben protegerse los reactivos del kit con especial cuidado de la contaminación. PRECAUCIONES 1. Sólo para exportar. 2. Los componentes del suero humano utilizados en la preparación de los controles y el calibrador cut-off de este kit se han analizado mediante un método aprobado por la FDA para comprobar si existen anticuerpos frente al antígeno del virus de inmunodeficiencia humana 1 & 2 (VIH 1&2), hepatitis C (VHC), así como el antígeno de superficie de la hepatitis B y los resultados fueron negativos. Debido a que ningún método de análisis puede asegurar por completo la ausencia del VIH, el VHC, el virus de la hepatitis B o de cualquier otro agente infeccioso, las muestras y los reactivos de origen humano se deberán manipular como posibles transmisores de agentes infecciosos. 3. Los centros de control y prevención de enfermedades y los institutos nacionales de la salud recomiendan manipular los agentes potencialmente infecciosos de acuerdo con un nivel de bioseguridad 2 (13).

4. Los componentes de este kit se han sometido a una prueba de control de calidad como una unidad de lote principal. No mezcle componentes de distintos lotes a excepción de la solución sustrato/cromógeno, la solución Stop y el tampón de lavado. El diluyente de suero Plus, facilitado con los kits de mycoplasma IgM sólo pueden ser utilizados con otros kits de Mycoplasma IgM. No mezcle con componentes de otros fabricantes. 5. No utilice ningún reactivo después de la fecha de caducidad especificada en la etiqueta del envase. 6. Todos los reactivos deberán estar a temperatura ambiente (de 21 a 25 °C) antes de realizar el análisis. Extraiga sólo la cantidad de reactivo necesaria. No vuelva a introducir los reactivos en los viales, ya que se podría producir una contaminación de los reactivos. 7. Antes de abrir los viales de controles y el calibrador cutoff, dé pequeños golpecitos en el vial para asegurarse de que el líquido se encuentra en el fondo. 8. Utilice sólo agua destilada o deshionizada y material de vidrio limpio. 9. No deje que los pozos se sequen durante el análisis; añada los reactivos inmediatamente después de completar las fases de lavado. 10. Evite la contaminación entre reactivos. Lávese las manos antes y después de manipular reactivos. La contaminación entre reactivos y/o muestras puede dar lugar a resultados erróneos. 11. Si los procesos de lavado se realizan manualmente, los pozos deben lavarse tres veces. Si se utiliza un equipo automatizado de lavado, es posible que sean necesarios hasta cinco ciclos de lavado. 12. La azida sódica inhibe la actividad del conjugado. Utilice puntas de pipeta limpias al añadir el conjugado para que la azida sódica no se transfiera a otros reactivos. 13. Se ha determinado que la azida sódica puede reaccionar con el plomo y el cobre de las tuberías y formar compuestos explosivos. Al desechar estas sustancias, deje que caiga agua por el desagüe para minimizar la formación de compuestos de azida metálicos. 14. Nunca utilice la boca para pipetear ni permita que los reactivos o las muestras del paciente entren en contacto con la piel. Los reactivos que contienen proclin, azida sódica y TMB pueden ser irritantes. Evite el contacto con la piel y los ojos. En caso de contacto, limpie inmediatamente la zona con abundante agua. 15. Si se utiliza una solución de hipoclorito sódico como desinfectante, no se debe exponer al área de trabajo durante el procedimiento de análisis real para evitar que interfiera con la actividad enzimática. 16. Evite que la solución Stop (ácido sulfúrico 1N) entre en contacto con la piel u ojos. En caso de contacto, limpie inmediatamente la zona con abundante agua. 17. Advertencia: Los residuos líquidos con pH ácido se deberán neutralizar antes de añadir la solución de hipoclorito sódico (blanqueador) para evitar la formación de gas venenoso. Se recomienda desechar las placas usadas en bolsas para sustancias de riesgo biológico. Véase Precaución 3. 18. Las concentraciones de anti-Mycoplasma en una determinada muestra determinadas con análisis de distintos fabricantes pueden variar debido a las diferencias entre los métodos de análisis y la especificidad de los reactivos.

RECOLECCIÓN Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS 1. Manipule todas las muestras de sangre y suero como posibles transmisores de agentes infecciosos (13). 2. El óptimo rendimiento del kit, depende de la utilización de muestras de suero frescas (claras, sin hemolisis, no lipémicas y no ictéricas). Se recomienda un volumen mínimo de 50 μL en caso de que sea necesario repetir las pruebas. Las muestras se deben tomar asépticamente mediante venopunción (14). La separación temprana del suero del coágulo, evita la hemólisis del mismo. 3. Conserve el suero entre 2 y 8 °C si el análisis se va a realizar en un período de dos días. Si las muestras se van a conservar durante un período de tiempo más largo, debe mantenerlas a una temperatura de -20 °C o menor. No utilice un congelador sin escarcha, ya que las muestras podrían congelarse y descongelarse de forma cíclica y degradar así el anticuerpo. Las muestras que no se conserven de forma adecuada o que hayan estado sometidas a procesos cíclicos de congelación y descongelación podrían arrojar resultados erróneos. 4. El NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) ofrece recomendaciones para el almacenamiento de muestras de sangre (Approved Standard Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens, H18-A. 1990) (14). MÉTODOS DE USO Preparación para el Análisis 1. Retire los reactivos, controles, suero del paciente y placas del sitio de refrigeración y deje que alcancen la temperatura ambiente antes de utilizarlos (de 21 a 25 °C). Coloque los reactivos en refrigeración tan pronto como haya terminado de utilizarlos. 2. Debe agitar todas las muestras y controles en un vórtex antes de su uso. 3. Diluya 60 mL de los 20X de tampón de lavado tipo I en 1.2 L de H20 destilada y/o deshionizada. Mezcle bien. Tratamiento del suero Los inmunoanálisis en fase sólida para la detección de virus anticuerpos IgM específicos, son conocidos por su sensibilidad a los factores de interferencia. Este kit supera el inconveniente de las interferencias, tratando las muestras antes de la realización del análisis. El IgG de cabra/oveja anti-humano en el Diluyente Plus del Suero, disminuye el IgG virus-específico competitivo, el cual sería responsable de reacciones negativas falsas. Los falsos positivos se disminuyen de forma similar removiendo el IgG, por lo tanto, neutralizan el factor reumatoide unido en las muestras. PROCEDIMIENTO DEL ANÁLISIS 1. Coloque el número de tiras que desee en un soporte de micropozos. Utilice seis (6) determinaciones de calibrador control/cutoff (un control negativo, tres calibradores

cutoff, un control positivo alto y un control positivo bajo) por análisis. En cada análisis se deberá medir un blanco reactivo (BR). Compruebe los requisitos del lector y el software para la configuración correcta del calibrador y los controles. Vuelva a guardar las tiras que no ha utilizado en la bolsa sellada con desecante, cierre la bolsa y refrigere cuanto antes en el congelador. Ejemplo de configuración: Ubicación en placa Descripción de muestra 1A RB 1B NC 1C Cal 1D Cal 1E Cal 1F HPC 1G LPC 1H Paciente #1

Ubicación en placa 2A 2B 2C 2D 2E 2F 2G 2H

Descripción de muestra Paciente #2 Paciente #3 Paciente #4 Paciente #5 Paciente #6 Paciente #7 Paciente #8 Paciente #9

BR = Blanco de reactivo: Pozo sin suero, con todos los reactivos. Se utiliza en el lector de blancos. CN = Control negativo Cal = Calibrador cutoff CPA = Control positivo alto CPB = Control positivo bajo 2. Diluya los sueros de análisis, calibrador cutoff y sueros de Control 1:81 (por ejemplo, 10 μL + 800 μL) en Diluyente de Suero Plus. (Para diluciones manuales, se recomienda introducir en primer lugar el diluyente de suero en el tubo de ensayo, y luego añadir el suero del paciente). 3. En cada pozo, añada 100 μL de los sueros diluidos del paciente, de calibrador cutoff y de los sueros de control. Añada 100 μL de diluyente de suero Plus en el pozo del blanco reactivo. Compruebe los requisitos del lector y el software para la configuración correcta del pozo de blanco de reactivo. 4. Deje incubar cada pozo a temperatura ambiente (de 21 a 25 °C) durante 30 minutos + 2 minutos. 5. Aspire o extraiga el líquido de todos los pozos. Si utiliza un equipo de lavado automático o semiautomático, añada 250-300 μL de tampón de lavado diluido a cada pozo. Aspire o extraiga el líquido, coloque la placa boca abajo y séquela con una toalla de papel para eliminar todo el líquido. Repita el proceso de lavado dos veces (completando un total de tres (3) lavados) si dispone de equipo manual o semiautomático, o cuatro veces (un total de cinco (5) lavados) si dispone de equipo automático. Después del último lavado, seque la placa con una toalla de papel para eliminar todo el líquido de los pozos. **AVISO IMPORTANTE: En relación con los pasos 5 y 8: Un lavado insuficiente o excesivo provocará variaciones en el análisis que afectarán a la validez de los resultados. Por esta razón, para conseguir resultados óptimos con un equipo automático o

semiautomático, se recomienda ajustarlo para que el volumen dispensado llene completamente los pozos (250-300 μL). Con un equipo automático pueden ser necesarios hasta cinco (5) lavados. La completa eliminación del tampón de lavado después del último lavado es crucial para la precisión de los resultados del análisis. Asegúrese también de que no queden burbujas en los pozos. 6. Añada 100 μL de conjugado a cada pozo, incluido el pozo del blanco reactivo. Evite que se formen burbujas al añadir el conjugado, ya que podrían dar lugar a resultados erróneos. 7. Incube cada pozo durante 30 minutos + 2 minutos a temperatura ambiente (de 21 a 25 °C) 8. Repita el procedimiento de lavado como se indica en el paso 5. 9. Añada 100 μL de solución de sustrato/cromógeno (TMB) a cada pozo, incluido el pozo de blanco de reactivo, manteniendo una velocidad constante de adición en toda la placa. 10. Incube cada pozo por 10 minutos + 2 minutos a temperatura ambiente (de 21 a 25 °C) 11. Detenga la reacción añadiendo100 μL de solución Stop (1N H2SO4). Siga el mismo orden que con la solución de sustrato/cromógeno, incluyendo el pozo de blanco de reactivo. Golpee suavemente la placa en los laterales para que se mezcle el contenido de los pozos. Una vez añadida la solución Stop, puede esperar hasta un máximo de 1 hora para leer los resultados de la placa. 12. El color resultante debe leerse en un lector de placas ELISA provisto de un filtro de 450 nm. Si se utiliza la longitud de onda dual, establezca el filtro de referencia en 600-650 nm. Debe hacerse un blanco en el instrumento. El blanco de reactivo debe tener una absorbancia inferior a 0,150 a 450 nm. Si el blanco de reactivo es > 0,150 deberá volver a realizar la operación de medida. Ponga el lector a cero con el pozo de blanco reactivo y, a continuación, realice una lectura de toda la placa. Deseche las placas usadas una vez obtenidas las lecturas. CONTROL DE CALIDAD Para que el análisis se considere válido, se deben cumplir las siguientes condiciones: 1. Con cada análisis se deben medir calibradores cutoff y controles. 2. El blanco de reactivo (comparado con el blanco de aire) debe ser < 0.150 Absorbancia (A) a 450 nm. 3. El Control Negativo debe ser < 0.250 A a 450 nm (comparado con el blanco reactivo) 4. Cada calibrador debe ser > 0.250 A a 450 nm (comparado con el blanco reactivo) 5. El Control Positivo Alto debe ser > 0.500 A a 450 nm (comparado con el blanco reactivo) 6. Los valores índice del control positivo alto, positivo bajo y negativo deben estar dentro de los rangos impresos en las etiquetas de los viales. Si los valores de control no se encuentran dentro de los rangos correspondientes, el análisis se deberá considerar no válido y repetirse.

7. Se pueden analizar controles adicionales de acuerdo con los requisitos o directrices de las normativas locales, estatales y/o federales o de las organizaciones autorizadas. 8. Consulte el documento C24A del NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) para obtener información sobre las prácticas de control de calidad adecuadas (15). 9. Si al repetir el análisis no se cumplen los criterios anteriormente descritos, contacte el Servicio Técnico de Diagnostic Automation. INTERPRETACIÓN Cálculos 1. Densidad óptica media del calibrador cut-off: Calcule el valor medio del calibrador cutoff a partir de tres determinaciones de calibrador. Si cualquiera de los tres valores de calibrador difiere en más de un 15% de la media, descarte ese valor y calcule la media de los dos valores restantes. 2. Factor de corrección: Para reflejar las variaciones diarias que se producen en el ensayo debido a la temperatura ambiente y al cronometraje, Diagnostic Automation ha establecido un factor de corrección para cada lote de kits. El factor de corrección aparece impreso en el vial del calibrador. 3. Valor de corte del calibrador: El valor de corte del calibrador cut-off de cada ensayo se determina multiplicando el factor de corrección por la densidad óptica media del calibrador cut-off determinada en el paso 1. 4. Valor índice: El valor índice de cada muestra se calcula dividiendo el valor de densidad óptica de la muestra entre el valor de corte del calibrador cut-off determinado en el paso 3. Ejemplo:

Densidades ópticas obtenidas para el calibrador = 0.38; 0.40; 0.42 Densidad óptica media del calibrador = 0.40 Factor de corrección = 0.50 Valor de calibrador cut-off = 0.50 x 0.40 = 0.20 Densidad óptica obtenida para los sueros del paciente = 0.60 Valor índice = 0.60/0.20 = 3.00

ANÁLISIS 1. Los valores índice de los pacientes están interpretados a continuación: Valor Índice ≤. 0.90

Resultado Negativo

Interpretación No se detectó anticuerpo IgM contra el Mycoplasma con la prueba ELISA. Sugiere que no hay exposición inmunológica actual al Mycoplasma pneumoniae; Este resultado no descarta la reciente exposición y la recolección de muestras de prueba antes del desarrollo del IgM.

0.91-1.09

Equívoco

≥ 1.10

Positivo

Las muestras deben analizarse nuevamente. La exposición inmunológica no puede evaluarse. Las muestras que sigan siendo equívocas después de repetir la prueba, deben ser analizadas con un método alternativo, por ejemplo, por medio de la prueba de inmunofluorescencia (IFA). Si los resultados continúan siendo equívocos después de análisis más exhaustivos, deberá tomarse una nueva muestra. Nivel significativo de anticuerpo IgM de Mycoplasma detectable. Indicativo de infección actual o reciente.

2. Para determinar el cut-off del análisis, se evaluaron 175 sueros normales con la prueba de Mycoplasma IgM de Diagnostic Automation (ocho de los sueros no se utilizaron en los cálculos ya que eran obviamente positivos.) La media y desviación estándar de las lecturas de densidad óptica para los sueros, fueron de 0.16 y 0.145 respectivamente. El umbral positivo del análisis se determinó agregando la media y tres desviaciones estándar (0.16 + 3(0.145)= 0.595). Se analizo un suero positivo para dar una relación constante del valor medio obtenido del suero calibrador. En todos los ensayos subsecuentes este suero fue corrido y el ensayo fue calibrado multiplicando el valor de la D.O por el radio del cut-off obtenido de la D.O del cutoff. Este valor fue dividido entre la D.O de cada suero paciente para obtener una relación del estado inmune (ISR). Por definición del cut-off ISR es igual a 1.00. En cuanto a la variación inherente en los valores del inmunoanálisis de 0.91-1.09 fueron considerados equívocos. Por lo tanto, los valores de < 0.90 son considerados negativos, y los valores de > 1.10 son considerados positivos. 3. El siguiente método es el recomendado para reportar los resultados obtenidos; “Los siguientes resultados se obtuvieron con el Mycoplasma IgM ELISA de Diagnostic Automation. Los valores obtenidos con métodos diferentes no deben utilizarse alternativamente. La magnitud del nivel de IgM reportado, no puede correlacionarse a una valoración final.” 4. Las muestras que sigan resultando equívocas después de repetir el análisis, deben analizarse nuevamente con un método alternativo, por ejemplo, el análisis de inmunofluorescencia (IFA). VALORES ESPERADOS En la actualidad, el cultivo del Mycoplasma pneumoniae y un aumento cuádruple en los niveles de anticuerpos son las pruebas de laboratorio utilizadas como ayuda en el diagnóstico de la infección de Mycoplasma pneumoniae. El cultivo no es un método sensible, ya que sólo el ~58% de los pacientes con un aumento cuádruple en los niveles de anticuerpos por Fijación de Complementos (FC) serán positivos. Por el contrario, los aumentos cuádruples por FC en los niveles de anticuerpos son vistos en ~53% en pacientes de cultivo positivo (12). Muchas infecciones por Mycoplasma pneumoniae son asintomáticas y puede ocurrir una reinfección. La incidencia de los anticuerpos del Mycoplasma pneumoniae en la población en general, es alta (3). El Mycoplasma IgM ELISA de Diagnostic Automation mostró una tasa de prevalencia de 4.6% con 175 sueros

normales de varias regiones geográficas y edades. Vea la tabla 1. Esta prevalencia puede variar de acuerdo a la edad y área geográfica de la población de análisis. Los datos en el Cuadro 1 ilustran la prevalencia de los índices en la población normal. Edad 2-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 ≥ 81 Total

Tabla 1 Total de # de Muestras 21 25 12 24 28 17 17 10 21 175

Prevalencia 14.3% 8.0% 8.3% 0.0% 0.0% 5.9% 0.0% 10.0% 0.0% 4.6%

Cuadro 1

Prevalencia de Mycoplasma IgM en una Población Normal

Frecuencia

Valores Índice

LIMITACIONES 1. En el presente, la tecnología no proporciona un estándar de referencia recomendado. Debido a las inconsistencias que actualmente presenta un determinado número de pruebas, médicos y laboratorios deben apoyarse en una combinación de métodos de

prueba y resultados, así como en los síntomas clínicos al diagnosticar una infección de Mycoplasma pneumoniae. La prueba ELISA para Mycoplasma IgM de Diagnostic Automation no pretende reemplazar el cultivo y no debe utilizarse como única base de diagnóstico. 2. Los procedimientos del kit o prácticas además de las descritas en el presente inserto, podrían arrojar resultados cuestionables. 3. Los sueros ictéricos, lipémicos, hemolizados o de calor inactivado deben evitarse, ya que podrían arrojar resultados erróneos. 4. Pueden darse falsos resultados positivos con sueros de pacientes con Ureaplasma, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitaluim, Pancreatitis, Meningitis bacterial y otras enfermedades inflamatorias agudas. La reactividad cruzada de este análisis con el estado de los anticuerpos a las enfermedades arriba mencionadas, no ha sido determinada. La epidemiología de caso, síntomas y otras pruebas de laboratorio, pueden ayudar a diferenciar estas condiciones de una infección de Mycoplasma pneumoniae. 5. Un resultado negativo de anticuerpo, no descarta la infección de Mycoplasma pneumoniae. Podrían darse resultados negativos falsos cuando las muestras se tomas mucho tiempo antes de comenzar el análisis. Debe retrasarse la producción de anticuerpos detectables. Puede que algunos pacientes nunca generen niveles detectables de anticuerpos. Los pacientes con síntomas que sugieran la presencia de una infección por Mycoplasma pneumoniae con resultados de análisis negativos, deben analizarse nuevamente en un período de 4 a 6 semanas utilizando un análisis de sueros pares. 6. La infección por Mycoplasma pneumoniae puede tener un largo período de incubación, por lo tanto, los valores elevados de anticuerpos en la muestra aguda, son comunes y podría ocurrir una reinfección, por este motivo son inusuales las conversiones de negativo a positivo. 7. Un resultado positivo sólo indica la exposición previa al Mycoplasma pneumoniae. El nivel de anticuerpo en una muestra individual no determina la severidad de la enfermedad. La presencia o ausencia de anticuerpos no se puede utilizar para determinar el éxito o fracaso de la terapia con antibióticos. 8. No debe realizarse una detección de la población general. Los análisis sólo deben realizarse cuando se presenten síntomas o cuando se sospeche la exposición a la enfermedad. 9. Los resultados de los inmunoanálisis ELISA realizados en suero proveniente de pacientes inmunosuprimidos deben interpretarse con cautela. 10. Las características de ejecución del análisis no han sido establecidas con muestras de pacientes con infección de Mycoplasma documentada, ni con otras matrices además del suero. 11. El IgG específico podría competir por sitios con el IgM y esto podría arrojar un resultado negativo falso. Por el contrario, el factor reumatoide en presencia de IgG específico podría resultar en una falsa reacción positiva. La Solución Absorbente en el Diluyente de Suero Plus disminuye el IgG específico competitivo y minimiza la interferencia del factor reumatoide en las muestras. La solución absorbente en el Diluyente de Suero Plus ha sido formulada para remover el IgG del suero del paciente, expresando diferentes concentraciones de IgG. En una dilución final de muestra de 1.81, se demostró que la solución absorbente remueve > 99% del IgG a

concentraciones de 340 mg/dL, y 2250 mg/dL. Esto corresponde a un valor en exceso de los límites alto y bajo del rango normal aceptable de IgG (~700-1500 mg/dL). Las muestras < 340 mg/dL y > 2250 mg/dL deben interpretarse con cautela. 12. Se ha descubierto que algunos anticuerpos nucleares causan una reacción positiva falsa en algunas pruebas ELISA. 13. La prevalencia del analito afectará el valor predictivo del análisis. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO El kit ELISA de Diagnostic Automation para Mycoplasma IgM se ha evaluado en comparación con otros kit ELISA disponibles en el mercado para anticuerpos de Mycoplasma IgM en un laboratorio de salud del estado. Los resultados obtenidos se muestran a continuación: 88 prospectivos sueros frescos y normales se analizaron en el kit ELISA para Mycoplasma IgM de Diagnostic Automation y en un ELISA alternativo. 80 (90.9%) de los sueros, fueron negativos, 6 (6.8%) fueron positivos y 2 (2.3%) fueron equívocos en la prueba ELISA para Mycoplasma IgM de Diagnostic Automation. En la prueba ELISA alternativa, 62 (70.4%) de los sueros fueron negativos, 19 (21.6%) fueron positivos y 7 (8.0%), fueron equívocos. 41 sueros congelados, pareados en retrospectiva provenientes de pacientes con sospecha de infección de Mycoplasma pneumoniae fueron analizados con la prueba ELISA para Mycoplasma IgM de Diagnostic Automation y con un ELISA alternativo. 35 pares demostraron un aumento cuádruple o mayor en una prueba de fijación complementaria. La prueba ELISA para Mycoplasma IgM de Diagnostic Automation fue positiva en al menos una de las muestras para 23 de los conjuntos de sueros pareados (56.1%). En 18 de los pares, ambas muestras fueron negativas (43.9%). La prueba ELISA alternativa fue positiva en al menos una de las muestras para 35 de los conjuntos de sueros pareados (85.4%). En seis de los pares, ambas muestras fueron negativas (13.6%). El acuerdo general de la prueba ELISA para Mycoplasma IgM de Diagnostic Automation comparado con un ELISA alternativo, fue de 74.4% Precisión Se analizaron diez sueros, diez veces cada uno en tres análisis diferentes y en tres sitios distintos. Dos sitios se asociaron con el fabricante del kit y uno fue un laboratorio de salud del estado. La precisión intra e inter análisis en cada sitio se muestra en las tablas 2, 3 y 4. Con la técnica apropiada, el usuario debería obtener una precisión de