5

6

7

8

A Mª Lourdes y Ángel A Alfonso

9

Agradecimientos

A mis directores, Pablo Coto Segura y Eliecer Coto García, por su ayuda constante, sus respuestas inmediatas, y su acogida. Gracias por guiarme sin pausa durante el camino recorrido para poder hoy presentar este trabajo, por sugerir mil y una ideas de nuevos proyectos, de nuevos artículos, por convertir en un asunto sencillo cualquier preocupación. A los miembros del servicio de Genética Molecular del HUCA, por la realización de las técnicas de laboratorio, cruciales para este trabajo, y por permitirme comprenderlas de un modo práctico. A Noemí Eirís Salvado y Leire González Lara, por adentrarme y compartir conmigo esta línea de investigación. A Ignacio García Doval, por sentar las bases de la investigación clínica y de la producción científica que hasta el momento he conseguido desarrollar. Gran parte de mi trabajo aquí, es también suyo. A mis compañeros del servicio de Dermatología de Pontevedra, por interesarse en este trabajo, por apoyar todas las ideas para poder establecer estudios de investigación similares en nuestro centro, por sus aportaciones, su colaboración extrema, y su respaldo. A Carlos de la Torre Fraga, mi jefe, por favorecer y confiar en todo momento en este proyecto. Y en último término a mis amigas, Lucía y Ana, por comprender mis ausencias; y a mi familia por su ánimo, su cariño y su ayuda ciega e incondicional.

10

11

Contenidos

Contenidos Contenidos .....................................................................................................................................12 Abreviaturas...................................................................................................................................14 Introducción ...................................................................................................................................18 1

Definición ............................................................................................................ 18

2

Epidemiología...................................................................................................... 18

3

Formas clínicas .................................................................................................... 19

4

Histología ............................................................................................................ 21

5

Comorbilidades.................................................................................................... 22

6

Tratamiento.......................................................................................................... 24

7

Etiopatogenia ....................................................................................................... 25 7.1

Factores ambientales .................................................................................... 25

7.2

Factores inmunológicos................................................................................ 26

7.3

Bases genéticas ............................................................................................. 36

Hipótesis y Objetivos ....................................................................................................................44 1

Hipótesis .............................................................................................................. 44

2

Objetivos.............................................................................................................. 45 2.1

Objetivo principal ......................................................................................... 45

2.2

Objetivos secundarios .................................................................................. 45

Sujetos y Métodos .........................................................................................................................47 1

Descripción del estudio ....................................................................................... 47 1.1

Variables y definición .................................................................................. 48

2

Selección de variantes genéticas ......................................................................... 51

3

Extracción de ADN ............................................................................................. 52

4

Amplificación ...................................................................................................... 52

5

Genotipado .......................................................................................................... 53

6

Secuenciación ...................................................................................................... 54

7

6.1

Secuenciación masiva (NGS) ....................................................................... 54

6.2

Secuenciación Sanger ................................................................................... 55

Análisis estadístico .............................................................................................. 56

Resultados......................................................................................................................................58 1

Características de la población de estudio ........................................................... 58

12

Contenidos

2

Distribución de los polimorfismos de los genes IL17 en pacientes y controles .. 59 2.1

Secuenciación masiva de IL17RA (NGS)..................................................... 61

2.2

Secuenciación de la región promotora de IL17RA y efecto predictivo de la

función de los polimorfismos de esta sección ......................................................... 63 3

Relación entre las variaciones de los genes IL17 y características clínico-

demográficas de los pacientes con psoriasis ............................................................... 64 3.1

IL17A rs7747909 .......................................................................................... 64

3.2

IL17E rs79877597 ........................................................................................ 64

3.3

IL17F rs763780 ............................................................................................ 66

3.4

IL17F rs2397084 .......................................................................................... 66

3.5

IL17RA rs4819554........................................................................................ 66

3.6

IL7RA rs879577............................................................................................ 68

4

Variación en los genes IL17A y HLA-Cw6.......................................................... 68

5

Variación en los genes IL17 y LCE ..................................................................... 69

6

Relación entre las variaciones de los genes IL17 y presencia de comorbilidades

asociadas a riesgo cardiovascular. .............................................................................. 70 7

Relación con la respuesta al tratamiento biológico ............................................. 71 7.1

Variaciones en los genes IL17 y respuesta a tratamiento biológico ............. 73

7.2

Otros hallazgos en relación con respuesta a tratamiento biológico ............. 77

Discusión .......................................................................................................................................81 1

Hallazgos de nuestro estudio ............................................................................... 81

2

Relación con la literatura previa .......................................................................... 82 2.1

Características de la población de estudio.................................................... 82

2.2

Relevancia de los genes IL17 en psoriasis ................................................... 83

2.3

Farmacogenética........................................................................................... 88

Limitaciones ..................................................................................................................................95 Conclusiones..................................................................................................................................98 Bibliografía ..................................................................................................................................100 Anexo I. Aspectos éticos. ...........................................................................................................119 Anexo II. Patologías asociadas a polimorfismos en los genes de la familia de la IL-17. ...........123 Anexo III. Tablas suplementarias. ..............................................................................................131 Anexo IV. Variaciones genéticas que influencian la respuesta a los fármacos biológicos en los pacientes con psoriasis. .....................................................................................................144 Anexo V. Artículos publicados y presentaciones en congresos. .................................................146

13

Abreviaturas

Abreviaturas

ADN: ácido desoxirribonucleico AEMPS: Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios AF: antecedentes familiares ARNm: ácido ribonucleico mensajero ArPs: artritis psoriásica BCG: Bacilo Calmette-Guérin CASP: Collaborative Association Study of Psoriasis: Estudio de Asociación Colaborativa de Psoriasis CASPAR: Classification Criteria for Psoriatic Arthritis: criterios de clasificación para la artritis psoriásica CCL: chemokine ligand: ligando de quimioquina CCR: chemokine receptor: receptor de quimioquina CNV: copy number variation: variación en el número de copias DM: diabetes mellitus dNTP: dinucleótido trifosfato ECV: enfermedad cardiovascular EII: enfermedad inflamatoria intestinal EPA-OD: Estudio Postautorización con Otros Diseños diferentes al de seguimiento prospectivo FRCV: factores de riesgo cardiovascular FDA: Food and Drug Administration FAM: frecuencia alélica menor GM-CSF: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos GWAS: genome wide association studies: estudios de asociación del genoma completo HLA: human leukocyte antigen: antígeno leucocitario humano HTA: hipertensión arterial HUCA: Hospital Universitario Central de Asturias HW: Hardy-Weinberg (equilibrio de) IC: intervalo de confianza Ig: inmunoglobulina

14

Abreviaturas

IK: Ikaros (familia de interleucinas) IL: interleucina IL-R: receptor de la interleucina IMC: índice de masa corporal INF: interferón IRF4: interferon regulatory factor 4: factor 4 regulador del interferón KIR: Killer Ig-like receptor: receptor tipo inmunoglobulina de las células NK LCE: late cornified envelope: envoltura cornificada tardía LCE-DD/ID/II: pacientes homocigotos (DD) o heterocigotos (ID) para la deleción en el gen LCE, u homocigotos para la ausencia de la deleción (II) Lev-Mod: leve-moderada. MAPK: mitogen-activated protein kinases: proteínas cinasas activadas por mitógenos MHC: major histocompatibility complex: complejo mayor de histocompatibilidad MIP3: macrophage inflammatory protein 3: proteína inflamatoria macrofágica 3 MMP: metaloproteinasa NCE ATP-III: National Cholesterol Education Programs' Adult Treatment Panel III: Panel de Tratamiento para Adultos III del Programa Nacional para la Educación sobre el Colesterol n: número de pacientes (o controles) NF: nuclear factor: factor nuclear NGS: Next Generation Sequencing: secuenciación de siguiente (o segunda) generación NK: natural killer: asesinas naturales (células) OR: odds ratio p: valor-p (probabilidad) PAM: péptidos antimicrobianos PASI: Psoriasis Area and Severity Index: Índice de Severidad y Área de la Psoriasis PASI50: mejoría del 50% con respecto al PASI basal PASI75: mejoría del 75% con respecto al PASI basal pb: pares de bases PCR: Polymerase Chain Reaction: reacción en cadena de polimerasa PGM: Personal Genome Machine: máquina del genoma personal PSORS: locus cromosómico asociado a la psoriasis RFLP: restriction fragment lenght polymorphisms: polimorfimos de longitud de fragmentos de restricción

15

Abreviaturas

ROR: retinoid-related orphan receptor: receptor huérfano relacionado con el retinoide SEFIR: similar expression of fibroblast growth factor genes and IL-17Rs: expresión similar a los genes del factor de crecimiento de fibroblastos y de los receptores de IL-17 SNP: single nucleotide polymorphism: polimorfismo de un único nucleótido SOC: suppressor of cytokine signaling: supresor de la señalización por citocinas STAT: signal transducer and activator of transciption: transductor de señales y activador de la transcripción Tc: T citotóxicos (linfocitos) TGF: transforming growth factor: factor de crecimiento transformante Th: T helper (linfocitos) TNF: tumor necrosis factor: factor de necrosis tumoral TNFR: receptor del TNF Treg: T reguladoras (células) Tto: tratamiento VIH: virus de la inmunodeficiencia humana vs.: versus VSG: velocidad de sedimentación globular

16

Introducción

17

Introducción

Introducción

1

Definición

La psoriasis es una enfermedad inflamatoria crónica en cuya etiología participan factores genéticos, inmunológicos y ambientales.1 Inicialmente se consideró una variante de la lepra.2 No fue hasta 1841 cuando Hebra la definió como una entidad independiente.3 Ante la ausencia de un autoantígeno responsable claramente identificado, la psoriasis se incluye

dentro

de

los

denominados

“trastornos

inflamatorios

mediados

inmunológicamente”.3 Clínicamente, se caracteriza por la presencia de placas eritemato-descamativas de predominio en las superficies de extensión de los miembros y en el cuero cabelludo, con posibilidad de afectación mucosa, ungueal y articular. Entre los diferentes individuos que sufren esta patología, existe una gran variabilidad en cuanto a forma de presentación, duración, periodicidad de los brotes y superficie corporal afecta. La psoriasis es además una enfermedad con gran morbilidad, y supone, en términos económicos, un gasto sanitario equiparable a enfermedades cardiovasculares, diabetes mellitus o patología psiquiátrica.1

2

Epidemiología

La incidencia global de la psoriasis se ha estimado entre 60 y 140 individuos por 100000 habitantes-año. En un estudio se ha observado una duplicación de estas cifras entre el año 1970 y el 2000. Este incremento podría deberse no sólo a un cambio franco en la incidencia, si no a modificaciones en los procedimientos o en las clasificaciones diagnósticas.4 La prevalencia global es del 2 al 3% de la población, siendo mayor en Noruega y en el Ártico (5-12%), y menor en africanos, afroamericanos o asiáticos (0,4-0,7%).1, 5, 6 En España, la prevalencia se ha estimado en el 1,2-1,4%, no existiendo diferencias significativas en cuanto al sexo.7 La edad de presentación sigue una distribución bimodal, con un primer pico entre los 15 y los 30 años y un segundo pico entre la quinta y la sexta décadas.1, 8 Suele aparecer más tempranamente en mujeres, y más del 60% de los casos comienzan antes de los 30 años.9

18

Introducción

Atendiendo a la edad de aparición, se han descrito dos tipos de psoriasis:10-12  Tipo I: representa el 85% de los casos. Se caracteriza por edad de comienzo anterior a los 40 años, formas más graves y extensas, mayor prevalencia de psoriasis

guttata

y

faringoamigdalitis

estreptocócica

como

factor

desencadenante; mayor incidencia de fenómeno de Koebner, mayor atenuación con la fotoexposición, mayor porcentaje de antecedentes familiares y de antígeno leucocitario humano (human leukocyte antigen – HLA)-Cw6 positivo.  Tipo II: menos frecuente (15%), con comienzo después de los 40 años, formas más leves, ausencia de historia familiar y HLA-Cw6 negativo. La afectación ungueal y la artritis psoriásica (ArPs) son más frecuentes en este grupo.

3

Formas clínicas

La psoriasis tiene un gran espectro de presentaciones clínicas, pero todas ellas con tendencia a la simetría en la disposición lesional. La extensión es también variable, presentando hasta un tercio de los pacientes una afectación mayor del 10% de la superficie corporal.13 La psoriasis vulgar o crónica en placas, cuyas bases genéticas son el objeto de este trabajo, es la forma más frecuente de presentación, afectando a más del 80% de los pacientes. Se caracteriza por placas eritematosas con descamación nacarada adherida (figura 1A), que pueden ser pruriginosas y ocasionalmente acompañarse de dolor.14 Afecta preferentemente a superficies extensoras de codos y rodillas, cuero cabelludo y área lumbosacra. Habitualmente el área facial está respetada.13, 15 Existen otras formas menos frecuentes como la psoriasis en gotas (figura 1B), que aparece más comúnmente en niños, adolescentes y adultos jóvenes, semanas después de un episodio infeccioso de las vías respiratorias superiores; las formas pustulosas (figuras 1C y 1D), caracterizadas por una erupción generalizada o localizada de pústulas estériles; formas confinadas a los pliegues (psoriasis invertida) (figura 1E); o formas graves generalizadas como la psoriasis eritrodérmica. La onicopatía psoriásica (figura 1F) se presenta a lo largo de la vida en el 80-90% de los pacientes con psoriasis. De modo infrecuente, la afectación ungueal puede ser la única forma de presentación.13, 14

19

Introducción

La psoriasis puede afectar al área genital (vulva y glande) y muy rara vez a la mucosa oral. En esta última localización, la lengua geográfica es la forma más frecuente, especialmente en pacientes con psoriasis pustulosa generalizada.13

Figura 1. Formas clínicas de psoriasis. A. Psoriasis en placas. B Psoriasis guttata. C. Psoriasis pustulosa. D. Psoriasis pustulosa palmoplantar. E. Psoriasis invertida. F. Onicopatía psoriásica.

Mención especial por su relevancia merece la ArPs. Clásicamente se definió como una artritis inflamatoria, generalmente seronegativa, asociada a la psoriasis.16 Aunque no existe un sistema de clasificación único, en la actualidad, el diagnóstico de ArPs se rige principalmente por los criterios CASPAR (Classification Criteria for Psoriatic Arthritis) que permiten el diagnóstico en presencia de factor reumatoide e incluso en ausencia de afectación cutánea.17, 18 Su incidencia varía desde el 3,4 al 8 por 100000 habitantes-año.16 Su prevalencia exacta es desconocida, debido fundamentalmente a las controversias en cuanto a los criterios de clasificación, pero se estima que se sitúa entre

20

Introducción

el 0,04% de las Islas Faro y el 0,1% de un estudio de la Clínica Mayo.16 En los pacientes con psoriasis, la artritis aparece entre un 6 y un 42% de los casos de acuerdo con las diferentes series.16, 19 Afecta por igual a ambos sexos,20 y la edad de inicio oscila predominantemente entre los 30 y los 50 años.16 Aunque el escenario más común es que la psoriasis haya comenzado una década antes que la ArPs, la artritis puede preceder a la psoriasis en muchos años.16 La frecuencia exacta de los tipos clínicos de ArPs varía según las publicaciones, posiblemente debido a las diferentes definiciones utilizadas por distintos grupos de investigadores, y a que los patrones van cambiando a lo largo del tiempo, pues a mayor duración de la ArPs, los pacientes tienden a desarrollar un patrón poliarticular.16 En cuanto a la evolución, el 20% de los pacientes desarrollan una forma destructiva e incapacitante de artritis.16 A pesar del correcto tratamiento, hasta el 47% de los pacientes tendrán daño radiológico en una media de tiempo de 2 años.21 Los predictores de progresión hacia formas más deletéreas incluyen 5 o más articulaciones afectas22 y un nivel alto de medicación al inicio de la clínica articular, particularmente el uso de corticoides.23 Una velocidad de sedimentación globular (VSG) baja al inicio, se considera un factor protector.23 Es interesante destacar que hay factores genéticos que han demostrado tener valor pronóstico: el HLA-B22 es protector, mientras que HLAB39, HLA-B27 en presencia de HLA-DR7, y HLA-DQw3 en ausencia de HLA-DR7, son predictivos de un mayor daño.24 La gravedad de la ArPs no sólo se refleja en la acumulación de daño articular, sino también en una disminución de la calidad de vida y de la capacidad funcional en comparación con pacientes psoriásicos sin ArPs. Asimismo se ha documentado una mayor mortalidad en individuos con ArPs con respecto a la población general.25

4

Histología

Los cambios clínicos observados en la placa de psoriasis se correlacionan con los hallazgos histopatológicos. El engrosamiento epidérmico y la descamación plateada son debidos a una maduración prematura e incompleta de los queratinocitos, lo que resulta en retención de núcleos en las células de la capa córnea (paraqueratosis). El turnover de los queratinocitos basales es el responsable del engrosamiento de la epidermis (acantosis), la elongación de las crestas epidérmicas (papilomatosis), y la disminución de la capa granulosa (hipogranulosis).1 Existe una llamativa neoformación vascular

21

Introducción

caracterizada por vasos tortuosos en la dermis papilar.3,

26

Esta vascularización

prominente se manifiesta clínicamente como sangrado cuando se eliminan las escamas (signo de Auspitz). En la dermis papilar se sitúa un infiltrado inflamatorio compuesto por células dendríticas y linfocitos T.1,

3, 27

Un signo histopatológico distintivo es la

transmigración de neutrófilos a la epidermis, para formar los microabscesos de Munro en el estrato córneo.3 (Figura 2.)

Figura 2. A. Psoriasis: acantosis epidérmica, papilomatosis, hipogranulosis y paraqueratosis (hematoxilinaeosina, x10) B. Detalle: se observan los microabscesos de neutrófilos en la capa córnea, una vascularización dérmica prominente y un infiltrado linfocitario en dermis superficial (hematoxilina-eosina, x20).

5

Comorbilidades

En la actualidad, la psoriasis se contempla como una enfermedad sistémica en la que coexisten otras enfermedades de manera más frecuente de lo que se esperaría en la población general (comorbilidades). Determinados factores genéticos en combinación con factores ambientales, el curso crónico de la enfermedad, o los fármacos que reciben estos pacientes, podrían explicar estas asociaciones.28 Dentro de las comorbilidades de la psoriasis, destacamos por su alta prevalencia e implicaciones en salud el síndrome metabólico. Consiste en la asociación de obesidad, resistencia a la insulina, alteración de la tolerancia a la glucosa, hipertensión arterial y dislipemia,29 y constituye un importante factor predictor del riesgo cardiovascular.30 Los criterios de clasificación de dicho síndrome han sido objeto de debate durante años, así la prevalencia varía ligeramente según la definición utilizada.31-33 Globalmente se estima que el síndrome metabólico está presente en el 20-30% de la población general, pero alcanza porcentajes del 40% en pacientes con psoriasis.30, 34-36 De igual modo, se

22

Introducción

ha documentado una mayor prevalencia de síndrome metabólico en pacientes con ArPs en comparación con los que padecen otras artropatías inflamatorias.37 Se ha indicado que la asociación entre síndrome metabólico y psoriasis es mayor en casos de psoriasis de más tiempo de evolución, en pacientes con edad superior a 35-50 años,38, 39 o en el caso de psoriasis grave.40 La relación entre el síndrome metabólico y la psoriasis es compleja. Se explica parcialmente porque ambas entidades comparten vías inflamatorias y bases genéticas comunes.41 Diversos estudios han comunicado la existencia de una mayor prevalencia de hipertensión arterial, diabetes mellitus tipo 2 o dislipemia en los pacientes con psoriasis en comparación con la población general.34 Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son también más frecuentes en pacientes con psoriasis,42 y son varios los estudios que demuestran que la psoriasis constituye un factor de riesgo independiente para el desarrollo de aterosclerosis y ECV.28,

42-44

Este riesgo de padecer ECV podría verse

agravado por la mayor tendencia de este colectivo a desarrollar hábitos tóxicos, muy especialmente el tabaquismo.45 Los adultos jóvenes con psoriasis grave tienen un riesgo tres veces mayor de infarto de miocardio que la población sana,42 las placas de ateroma en las arterias coronarias son dos veces más frecuentes en pacientes con psoriasis que en los sujetos controles,43 y el riesgo de un desenlace fatal ante un infarto de miocardio o cerebral aumenta en aquellos pacientes psoriásicos que han sido hospitalizados.46 Sin embargo, no todos los artículos apuntan en la misma dirección.47 Una reciente revisión sistemática de la literatura, no observó mayor mortalidad de causa cardiovascular en pacientes con psoriasis.44 La enfermedad hepática grasa no alcohólica48 y la enfermedad inflamatoria intestinal (EII)49, 50 son más frecuentes en pacientes con psoriasis que en la población general. La psoriasis moderada-grave también parece constituir un factor de riesgo independiente para padecer enfermedad renal crónica.51 En lo que respecta a la esfera psicosocial, la psoriasis es percibida por algunos pacientes como una enfermedad deformante, suponiendo un riesgo incrementado para padecer depresión, ansiedad e ideación suicida. Este impacto psicológico no está presente sólo en los brotes, sino también durante los periodos de remisión de la enfermedad.52, 53 La repercusión de la psoriasis en la calidad de vida es similar a la de los pacientes con cáncer, artritis, hipertensión arterial, enfermedad cardíaca, diabetes mellitus y depresión.52, 54

23

Introducción

6

Tratamiento

Los objetivos terapéuticos incluyen la mejoría cutánea, ungueal, articular y de la calidad de vida.14 Aproximadamente un 80% de los pacientes con psoriasis presentan enfermedad leve a moderada. La mayoría de estos pacientes pueden controlarse con tratamiento tópico. La terapia tópica también se emplea como adyuvante en casos de psoriasis grave que requieren fármacos sistémicos.55 Los tratamientos sistémicos incluyen fototerapia, ciclosporina, acitretino, metotrexato y terapias biológicas. Las terapias biológicas han revolucionado el panorama de manejo de la psoriasis, y en los últimos años ha existido un uso creciente de estos fármacos en psoriasis moderadagrave y en ArPs. En España contamos, en el momento de la redacción del presente trabajo, y sin considerar ArPs, con adalimumab, etanercept, infliximab y ustekinumab. Los tres primeros pertenecen al grupo de los inhibidores del factor de necrosis tumoral (tumor necrosis factor: TNF) α. Ustekinumab actúa uniéndose a la subunidad p40 de las interleucinas (IL) 12 y 23.14 En la siguiente tabla (tabla 1) se muestran los tratamientos biológicos aprobados por la Food and Drug Administration (FDA) para el tratamiento de la psoriasis, su mecanismo de acción, dosificación y efectos sobre el Índice de Severidad y Área de la Psoriasis (Psoriasis Area and Severity Index: PASI).56 Tabla 1. Fármacos para psoriasis aprobados por la FDA.56-60 Fármaco Adalimumab Anticuerpo monoclonal humanizado Alefacept Proteína de fusión Etanercept Proteína de fusión Infliximab Anticuerpo monoclonal quimérico Ustekinumab Anticuerpo monoclonal humanizado Secukinumab Anticuerpo monoclonal completamente humano

Fármacos para psoriasis aprobados por la FDA Diana Posología Eficacia (% de PASI75) TNFα 80 mg sc en la semana 0; 40mg 59-67‡ sc en la semana 1; después 40mg cada 2 semanas CD2 (LFA- 15mg im/semana, 12 semanas 21-28¥ 3-IgG1) TNFα 50mg sc 1 o 2 veces por semana, 38-60 (dosis de 50mg/sem)‡ 12 semanas; después 50mg 44-58 (dosis inicial de 50mg semanalmente 2v/sem)‡ TNFα 5mg/kg iv semanas 0, 2 y 6. 64-74‡ Después cada 8 semanas Subunidad p40 de las IL-12 y 23 IL-17A

45mg sc las semanas 0 y 4. Posteriormente cada 12 semanas. (Dosis de 90mg si peso > 100kg) 300mg sc/semana, 5 semanas. Posteriormente, cada 4 semanas.

72-79 (dosis de 45mg) ‡ 69-81 (dosis de 90mg) ‡ 65-82# 93†

FDA: Food and Drug Administration; IL: interleucina; im: intramuscular; iv: intravenoso; PASI: Psoriasis Area and Severity Index; PASI75: mejoría del 75% con respecto al PASI basal; sc: subcutáneo; sem: semana; TNF: tumor necrosis factor: factor de necrosis tumoral; v: veces. ‡ Evaluación a la semana 24; rango correspondiente al intervalo de confianza al 95% del porcentaje medio obtenido en un metaanálisis. 60 ¥Evaluación en la semana 12-14.15, 59 #Evaluación en la semana 12. Rango de respuesta en función de ensayos clínicos en fase III.58 †Evaluación en la semana 16. Datos correspondientes a un ensayo clínico en fase III. 61

24

Introducción

7

Etiopatogenia

En la etiopatogenia de la psoriasis intervienen múltiples factores ambientales, inmunológicos y genéticos.

7.1 Factores ambientales Diversos factores ambientales se han relacionado con el desarrollo de psoriasis. Como sucede en otras dermatosis, la psoriasis es una de las enfermedades en las que los traumatismos pueden inducir la aparición de lesiones en la piel previamente no afecta. La aparición de psoriasis sobre áreas de traumatismos se conoce como fenómeno de Koebner.62 Afecta al 38-76% de los pacientes, y ocurre generalmente 7-14 días tras el traumatismo. El fenómeno de Koebner inverso se refiere al blanqueamiento de la psoriasis en una zona de traumatismo.63, 64 La aparición de psoriasis guttata aguda se ha asociado a una infección estreptocócica precedente, predominantemente faríngea.65 Se ha descrito también la aparición de psoriasis guttata como exacerbación de una psoriasis previa o como forma de inicio en pacientes con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).3 Diferentes fármacos se han relacionado con el inicio o la exacerbación de la psoriasis, entre los que destacan las sales de litio, los antipalúdicos, los agentes beta-bloqueantes, los antiinflamatorios no esteroideos, los inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina, algunos antibióticos (tetraciclinas, penicilinas), la suspensión de corticoides sistémicos, o las terapias anticitocina.1 Aunque la fotoexposición es generalmente beneficiosa, en una minoría de pacientes la psoriasis puede exacerbarse tras la exposición solar. La fotosensibilidad en la psoriasis es más frecuente en el sexo femenino, y suele asociarse a la presencia de ciertos factores genéticos como el HLA-Cw6, a la presencia de historia familiar y a la edad de inicio precoz.66 La edad de presentación más temprana en mujeres, los cambios de la enfermedad durante el embarazo y las exacerbaciones o el inicio de la psoriasis durante la administración de estrógenos a altas dosis, son indicativos de un papel hormonal.67 La hipocalcemia se ha relacionado con formas graves de psoriasis.68 También se ha atribuido a los eventos estresantes un papel en la exacerbación de la psoriasis.69 Aunque los datos de los estudios epidemiológicos no son del todo concluyentes, parece que el alcohol y el tabaco pueden influir en su desarrollo.70 Conviene destacar la existencia de una marcada relación entre hábito tabáquico y

25

Introducción

formas pustulosas de psoriasis, en las que un porcentaje mayor del 95% de los pacientes son fumadores al inicio de la enfermedad, y un 90% de ellos son mujeres. También se ha observado que el cese del hábito tabáquico puede dar lugar a una mejoría considerable en estas formas de psoriasis.71

7.2 Factores inmunológicos Con el avance en el conocimiento sobre las bases genéticas de la enfermedad, la psoriasis ha dejado de considerarse un trastorno primario de la proliferación y diferenciación de los queratinocitos, para considerarse una enfermedad mediada inmunológicamente, donde tanto la respuesta inmune innata (células dendríticas, neutrófilos, macrófagos, células natural killer - NK -

y queratinocitos) como la

adaptativa (linfocitos T CD4+ y CD8+) son fundamentales. Los eventos inmunológicos consisten en una regulación alterada de las células que desencadenan la respuesta inmunitaria frente a una barrera cutánea distorsionada. Las células presentes en las placas de psoriasis son las mismas que intervienen en la reparación de las heridas (queratinocitos, células dendríticas, monocitos, macrófagos y linfocitos T y B). Es por ello que debido a las grandes similitudes entre reepitelización y psoriasis, muchos investigadores consideran que las lesiones de psoriasis representan un proceso de curación de la herida prolongado en el tiempo, ya que en presencia de un epitelio alterado, estas células continúan con la respuesta inmunitaria aberrante frente a un antígeno desconocido.1, 72-75 Debemos considerar a la psoriasis como una enfermedad dinámica, siendo probable que en diferentes estadios de la enfermedad (iniciación, progresión, mantenimiento y remisión) ocurra un cambio en el tipo de respuesta inmunitaria y en los tipos celulares predominantes.76 Son varios los ejes moleculares implicados en la psoriasis, con relaciones de regulación cruzada e interdependientes. Para su estudio los clasificaremos en tres tipos de respuestas paradigmáticas: respuesta tipo T helper (Th) 1 (vía del interferón - INF - ƴ), respuesta tipo Th22 (vía de la IL-22) y respuesta tipo Th17 (eje IL-23/IL-17). 7.2.1 Vía del

-

INFƴ / TNF-Th1

INFƴ

El INFγ es una citocina central en la patogenia de la psoriasis. Tras la diferenciación desde los linfocitos T naïve a células Th1 por medio de la acción de la IL-12, las células Th1 activadas se definen por la expresión de INFγ, IL-18, TNF e IL-1. El INFγ

26

Introducción

pertenece a la familia de los INF tipo II, que son producidos mayoritariamente por células NK, células T-NK, linfocitos de memoria activados Th CD4+ y células T citotóxicas (Tc) CD8+. El INFγ regula positivamente las quimiocinas y las moléculas de adhesión, permite reclutar linfocitos a las zonas de inflamación y estimula a las células dendríticas para producir IL-1 e IL-23, que participa en el desarrollo de las vías de respuesta Th22 y Th17. El INFγ tiene también un efecto aparentemente contradictorio, al actuar como un factor antiproliferativo sobre los queratinocitos. Esto se explica porque en condiciones normales, la actividad de las citocinas Th1 en los queratinocitos es regulada negativamente por citocinas Th2 (IL-4 e IL-13), a través del transductor de señales y activador de la transcripción (signal transducer and activator of transciption: STAT) 6, del supresor de la señalización de citocinas (suppressor of cytokine signaling: SOCS) 1 y del SOCS3. Se ha sugerido que los queratinocitos psoriásicos regulan positivamente SOCS1 en respuesta a un nivel elevado de INFγ. Sin embargo este intento de prevenir la expresión de genes proinflamatorios es incompleto, pues la producción de SOCS no es suficiente para inhibirla.77, 78 -

TNF

Sin duda, el TNF es una molécula clave en el proceso inflamatorio de la psoriasis. Los principales productores de TNF en la piel son los mastocitos, pero en los pacientes con psoriasis existen también otros tipos celulares implicados en su secreción que incluyen a las células Th1 y Th17.1, 79 El TNF es secretado como una citocina soluble a través de un precursor transmembrana tras la actuación de una enzima convertidora de TNFα. Tanto el TNF soluble como su precursor, son biológicamente activos y pueden unirse a dos receptores diferentes: el receptor 1 del TNF (TNFR1, p55) o el receptor 2 del TNF (TNFR2, p75). TNFR1 se expresa en todas las células nucleadas, mientras que TNFR2 se expresa preferentemente en células endoteliales y hematopoyéticas. La unión del TNF a sus receptores inicia una cascada de eventos que lleva a tres modos de regulación inmunitaria: i.

Inflamación: a través de la activación del factor nuclear (nuclear factor: NF) Kβ.

ii.

Activación de la vía que comprende las cinasas activadas por mitógenos (mitogen-activated protein kinases: MAPK) y la cinasa c-Jun N-terminal.

iii.

Proliferación, diferenciación, y apoptosis celular.80

La regulación del crecimiento celular, supervivencia y apoptosis se logra gracias a la activación simultánea de vías apoptóticas y antiapoptóticas por parte de la misma citocina y en la misma célula. Estas complejas vías explican el éxito de las terapias que

27

Introducción

actúan inhibiendo la acción del TNF en enfermedades inflamatorias como la psoriasis. Sin embargo, el dirigirse sobre esta diana terapéutica plantea posibles efectos secundarios asociados, al tratarse de una citocina de tan amplio espectro de actuación.1

7.2.2 Vía de la

-

IL-22-Th22/Tc22

IL-22

La IL-22 es una citocina clave que permite la interacción entre el epitelio y el sistema inmunitario adaptativo. Pertenece a la familia de la IL-10, y es principalmente producida por células T y NK. Su receptor (IL-22R) forma un complejo de dos cadenas, IL-10R e IL-22RA1. El IL-22R sólo se encuentra en células no inmunitarias, como los queratinocitos y las células epiteliales de los tractos digestivo y respiratorio.81, 82 La IL22 parece tener una función dual: tiene un papel proinflamatorio y otro homeostático, que depende del tipo de tejido y del entorno de citocinas.83-85 Está también implicada en la curación de las heridas, la reparación tisular, y la infección.86-88 La IL-22 estimula la expresión de genes de metaloproteinasa (MMP) 1 y MMP3 en los queratinocitos, los cuales actúan como proteínas reguladoras de la movilidad y migración celular.89-91 Se han encontrado niveles elevados de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de IL-22 en las lesiones y en el suero de pacientes con psoriasis. Los niveles séricos de IL22 se correlacionan con la actividad de la enfermedad y disminuyen tras el tratamiento antipsoriásico.82,

92

De manera interesante, la IL-22 actúa también sobre los

queratinocitos induciendo acantosis, ya que aumenta su proliferación e inhibe su diferenciación.93 A nivel óseo se ha relacionado con la osteoclastogénesis y la remodelación/neoformación ósea, fenómenos presentes en la ArPs. De hecho, se ha observado que las células mononucleares de sangre periférica de pacientes con ArPs producen mayor cantidad de IL-22 que en pacientes con psoriasis sin afectación articular.94-96 Aunque la IL-22 no actúa directamente sobre células inmunitarias, sí puede participar en la promoción de la inmunidad innata. Así, en las lesiones de psoriasis abundan péptidos antimicrobianos (PAM) como β-defensinas 2 y 3, proteína S100, y LL-37, y todos ellos pueden ser inducidos por IL-22.86 Para conseguir la inducción de PAM por parte de los queratinocitos, la IL-22 actúa sinérgicamente con la IL-17A.91 -

Th22

Durante años se consideraba que las células Th1 y Th17 eran las principales productoras de IL-22. Sin embargo, numerosos estudios han observado que menos del 50% de la IL-

28

Introducción

22 en la piel psoriásica está producida por células Th17. La mayoría de las productoras de IL-22 son células Th CD4+ secretoras únicas de esta citocina y no coexpresan ni IL17A ni INFγ. Una mejor caracterización posterior demostró que es posible la coexpresión de IL-22 con TNFα. A estas células se las ha denominado Th22.79 Las células Th22 coexpresan los marcadores epiteliales receptor de quimiocina (chemokine receptor: CCR) 6, CCR4 y CCR10 y se cree que responden a niveles elevados del ligando de quimiocina (chemokine ligand: CCL) 20 (también llamado proteína inflamatoria macrofágica 3 - macrophage inflammatory protein 3: MIP3α -) que se encuentran en la piel psoriásica lesional. Se ha evidenciado que los clones de células Th22 derivados de los pacientes con psoriasis, regulan positivamente la expresión de genes asociados con remodelación tisular y las quimiocinas implicadas en angiogénesis y fibrosis. En la actualidad todavía es tema de debate si las células Th22 representan un linaje diferente de células Th.1, 79 -

Linfocitos Tc22

La IL-22 puede también proceder de células Tc CD8+. Los análisis con citometría de flujo de células T CD4+ y CD8+ derivadas de piel normal, mostraban su habilidad para producir IL-17A sola o en combinación con IL-22 (Th17 y Tc17, respectivamente), o IL-22 en ausencia de IL-17A e INFγ (Th22 y Tc22). En la piel con psoriasis, se observó que la proporción de células Tc17 y Tc22 era mucho mayor en comparación con las células Th17 y Th22. Se puso también de manifiesto que los clones de células T CD4+ y CD8+ IL-17+ podían evolucionar a productores exclusivos de IL-22. Estos hallazgos apuntan a una relación entre Th17 y Th22 y Tc17 y Tc22, subrayando la plasticidad inherente a las subpoblaciones linfocitarias.97

7.2.3 Eje

-

de la IL-23/IL-17A-Th17

IL-23

La IL-23 es un mediador proinflamatorio crucial en enfermedades inflamatorias mediadas inmunológicamente, entre ellas, la psoriasis.1 La IL-23 es una citocina heterodimérica secretada principalmente por macrófagos y células dendríticas, compuesta por una subunidad única, IL-23p19, emparejada con una subunidad común, IL-12p40, que es compartida con la IL-12. Señaliza a través de su receptor heterodimérico IL-23R, que consiste en la subunidad IL-23R emparejada con la subunidad IL-12Rβ1 (compartida con el complejo IL-12R). IL-23R se expresa en células T de memoria, células NK, monocitos y células dendríticas. Este receptor carece

29

Introducción

de actividad cinasa inherente, pero contiene siete residuos tirosina que pueden fosforilarse para iniciar la cascada de señalización (figura 3).82, 98, 99.

Figura 3. Receptor de la IL-23 y su vía de señalización (modificada de Di Cesare et al.82). Tras la unión de IL-23 a IL-23R, las cinasas Janus Jak2 y Tyk2, se unen directamente a IL-23R e IL-12Rβ1, respectivamente, provocando la fosforilación de los dominios receptores y de proteínas STAT. La proteína STAT3 puede unirse al ácido desoxirribonucleico (ADN) y permitir la expresión de genes diana, como el gen RORC, que codifica para el receptor huérfano relacionado con el retinoide (retinoid-related orphan receptor: ROR) γ y RORα, implicados en la diferenciación de las células Th17. A través de la diferenciación de este linaje celular, se incrementarán las citocinas derivadas de esta vía como IL-22, IL-17A/F o INFƴ. La unión de la IL-23 a su receptor, estimula también la degradación de la subunidad inhibitoria del factor nuclear кβα (Iкβα), induciendo la producción de NF-кβ.

Esta vía de señalización IL-23/IL-23R parece tener un papel fundamental en la diferenciación terminal, mantenimiento y patogenicidad de las células efectoras Th17 y en la producción de su citocina definitoria de linaje, IL-17.100-103 La IL-23 y su receptor están aumentados en la piel psoriásica, así como en el líquido sinovial en caso de psoriasis articular.99, 104 Las células dendríticas mieloides y los queratinocitos expresan niveles elevados de IL-23 en piel patológica, mientras que la IL-23 disminuye tras tratamientos sistémicos.105-109 También el número de células T y células dendríticas que expresan IL-23R está incrementado en las lesiones psoriásicas con respecto a la piel normal, y las células T circulantes en psoriasis expresan niveles más altos de IL-23R.106 El hallazgo de que los polimorfismos del gen IL23R se relacionen con susceptibilidad a psoriasis y ArPs (así como a otras enfermedades como la EII, la artritis reumatoide, la espondilitis anquilosante o la enfermedad de Graves), enfatiza la importancia de la vía IL-23/IL-17-Th17 en éstas y otras enfermedades inmunomediadas.82, 110, 111

30

Introducción

-

Familia de la IL-17 y sus receptores

La familia de la IL-17 consiste en un grupo de citocinas que participa en la respuesta inmunitaria aguda y crónica.112 Existen seis familias de ligandos de la IL-17 (de la A a la F) y cinco receptores, IL-17R (del A al E) (tabla 2).113

Tabla 2. Expresión y funciones de los miembros de la familia de la IL-17 (modificada de Gaffen et al.114). Miembro IL-17A (o IL-17, o CTLA8) IL-17B IL-17C IL-17D IL-17E (o IL-25)

IL-17F

IL-17A-IL17F (heterodímero)

Expresión y funciones de los miembros de la familia de la IL-17 Receptores Funciones principales Expresión IL-17RA e Autoinmunidad, reclutamiento Céls. Th17, T CD8+, Tγδ, Tαβ, NK, iNKT y LTi, IL-17RC de neutrófilos, inmunidad neutrófilos, eosinófilos, mastocitos, macrófagos, frente a patógenos céls. de Langherhans, céls. epiteliales, astrocitos, extracelulares. algunas poblaciones de céls. B. IL-17RB ¿Proinflamatoria? Céls. del tracto GI, páncreas, condrocitos y neuronas. IL-17RA e ¿Proinflamatoria? Céls. epiteliales (próstata y riñón fetal). IL-17RE Desconocido ¿Proinflamatoria? Céls. de músculo, cerebro, corazón, pulmón, páncreas, tejido adiposo. IL-17RA e Inductora de respuestas por Linfocitos T CD4+ y CD8+, NKT, macrófagos, IL-17RB parte de células Th2 y céls. dendríticas, mastocitos, eosinófilos, supresora de respuestas Th17. basófilos, céls. epiteliales (pulmón), céls. endoteliales, céls. del tracto GI y útero. IL-17RA e Reclutamiento de neutrófilos, Céls. Th17, T CD8+, Tγδ, NK, NKT y LTi, IL-17RC inmunidad frente a patógenos monocitos, basófilos, mastocitos. extracelulares. IL-17RA e Autoinmunidad, reclutamiento Céls. Th17, T CD8+, Tγδ, NK, NKT y LTi. IL-17RC de neutrófilos, inmunidad frente a patógenos extracelulares.

Céls: células; GI: gastrointestinal; IL-R: receptor de interleucinas, iNTK: invariant natural-killer T: células T asesinas naturales invariantes; LTi: linfocitos T inmaduros; NK: natural-killer; NTK: natural-killer T; Th: T helper

La primera de estas citocinas en identificarse fue la IL-17A (también llamada IL-17 o CTLA8). Posteriormente, basándose en la homología de la secuencia de aminoácidos, se identificaron la IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E e IL-17F.112, 115 Los miembros de esta familia mejor caracterizados son IL-17A, IL-17E (también denominada IL-25) e IL-17F.116 Los genes que codifican a IL-17A e IL-17F se encuentran en el mismo cromosoma (6p12.3-q13) y ambas comparten un 50% de homología en su secuencia.117 Pueden formar homodímeros IL-17A/A e IL-17F/F, pero también heterodímeros IL17A/F que actúan sobre el mismo complejo receptor, por lo que desencadenan la misma cascada de señalización.118 En cuanto a los aspectos diferenciadores, destaca el hecho de que IL-17A tiene un mayor papel que IL-17F en la autoinmunidad. Esto podría explicarse porque las respuestas inducidas por IL-17F son más débiles que las inducidas

31

Introducción

por IL-17A. Los heterodímeros IL-17A/F se sitúan en un nivel de potencia intermedia.114 Todas las subunidades de los receptores de esta familia son proteínas individuales con un dominio transmembrana, que contienen entre 499 y 866 aminoácidos, de los cuales existen secuencias compartidas entre los diferentes miembros. Todavía no está claro cómo se unen estas subunidades para formar complejos receptores.112, 114 A diferencia de las citocinas implicadas en las respuestas por parte de Th1 y Th2, que desencadenan la vía de señalización JAK-STAT, la señalización de la familia de receptores de la IL-17 depende de Act1, una proteína citosólica también denominada activador 1 del NF-кβ, CIKS o TRAF3IP2.114 En la región C-terminal de los IL-17R se sitúa el dominio SEFIR (similar expression of fibroblast growth factor genes and IL-17Rs: expresión similar a los genes del factor de crecimiento de fibroblastos y de los receptores de IL-17). Este dominio característico permite la agrupación de estos receptores dentro de una familia.119 El dominio SEFIR está también presente en Act1. Una vez activado IL-17R tras la unión a su ligando, Act1 es reclutada por el complejo receptor, uniéndose a través de los dominios SEFIR. Act1 activa IKK, permitiendo la liberación de NF-кβ del complejo IKK-NF-кβ (figura 4).120, 121

Figura 4. Familia de la IL-17, receptores y vías de señalización (modificada de Gu et al.112).

32

Introducción

Figura 4 (continuación).Tras la activación del receptor por la IL-17A, Act1 se une al complejo receptor y recluta a TRAF6, lo que desencadena la activación de IKK con la consiguiente liberación de NF-кβ del complejo IKK-NF-кβ y la producción de citocinas inflamatorias. 112, 120-122 El complejo IL-17R-Act1 activado también recluta IKK, que fosforila a Act1. Esta fosforilación permite reclutar a TRAF2 y TRAF5, formando el complejo Act1/TRAF2/TRAF5/arginine-and-serine-rich splicing SRSF1, que favorece la estabilidad de los ARNm. Otro complejo formado por Act1/TRAF2/TRAF5/HuR puede también mediar la estabilización del ARNm dependiente de IL-17A.5, 14 Act1 también se une directamente a TRAF6, lo que permite la activación de la cascada de NF-кβ, MAPK y C/EBP (CAAT enhancer binding protein).99 TRAF4, TRAF3, C/EBPβ, dos enzimas de desubiquitinización (USP25, A20) y un micro-ARN (miR-23b), actúan como reguladores negativos de esta cascada.112, 114, 123-128 El receptor IL-17RD se colocaliza con IL-17RA y participa en la regulación de la señalización por parte de IL17A. Por un lado, IL-17RD inhibe la función de Act1 en células inactivas, mientras que esta inhibición se pierde cuando las células se activan, permitiendo en ese caso que IL-17A dé lugar a la cascada de señalización vía NF-кβ.112, 129, 130

Para interactuar con IL-17A, IL-17RA conforma un complejo receptor junto con IL17RC.131 IL-17A e IL-17F comparten este mismo receptor, aunque la IL-17A se une a IL-17RA con una afinidad de 100 a 1000 veces mayor que IL-17F. Ambas IL se unen con afinidad similar a la subunidad IL-17RC.112, 118, 131 La fuerza de señalización de IL17A parece correlacionarse con los niveles de IL-17RA en la superficie celular, siendo requeridos niveles elevados de este receptor para que las respuestas inducidas por IL17A sean efectivas. IL-17RA puede limitar la señalización internalizando su ligando. Así, los niveles de IL-17RA en la superficie celular disminuyen rápidamente tras la unión a su ligando. Las IL-15 y 21 regulan positivamente la expresión de IL-17RA, mientras que PIK3 limita su expresión.114 En los pacientes con psoriasis se han evidenciado niveles más altos de células circulantes productoras de IL-17A en comparación con controles sanos. Estas células productoras de IL-17 se han encontrado asimismo en las lesiones psoriásicas, siendo los niveles de citocinas proinflamatorias Th17 más elevados en piel psoriásica con respecto a la piel sana. La IL-17 está elevada en la sangre de los pacientes con psoriasis, o en el líquido sinovial de los pacientes con psoriasis articular, y sus niveles se han correlacionado con la gravedad de la enfermedad (niveles más elevados a mayor gravedad). Sin embargo, esta presencia de niveles incrementados de IL-17A en suero no ha sido documentada en todos los estudios.99, 104, 107, 132 En la psoriasis, IL-17A e IL-17F ejercen un efecto proinflamatorio sobre los queratinocitos y neutrófilos. Los queratinocitos expresan IL-17RA y responden a IL17A e IL-17F produciendo IL-6, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF), y PAM, junto con gran cantidad de quimiocinas (CXCL1, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL8,

33

Introducción

CCL20), que están reguladas positivamente en la psoriasis. La producción del ligando del CCR6, CCL20, sugiere posibles mecanismos por los cuales las células Th17 mantienen una presencia continua en la piel con psoriasis, a través de una retroalimentación positiva en la que están implicados CCL20 derivado de queratinocitos, y CCR6 expresado en la superficie de las células Th17 (figura 5).1, 93, 133

Figura 5. Células y mediadores celulares que conectan la inmunidad innata y adaptativa en la psoriasis (modificada de Nestle et al.).5 Células participantes en la inmunidad innata (queratinocitos, células T-NK, células dendríticas plasmocitoides y macrófagos), producen mediadores inflamatorios (TNFα, INFα, INFү, IL-1β o IL-6) que llevan a la activación de las células dendríticas mieloides. Una vez activadas, éstas producen citocinas como IL-12 e IL23. La primera, induce la diferenciación de las células Th1, y la segunda, de las Th17. La producción de TNFα e INFү por las células Th1 y de IL-17A/F e IL-22 por las células Th17, activa a los queratinocitos e induce su producción de PAM y citocinas proinflamatorias (IL-1β, IL-6, TNFα, CXCL8/9/10/11 o CCL20), moléculas que retroalimentan el estado inflamatorio. CCL: chemokine ligand: ligando de quimiocina; CXCL: chemokine CXC motif ligand: ligando de quimiocina con motivo CXC; INF: interferón; PAM: péptidos antimicrobianos.

El hallazgo de la presencia incrementada de IL-17 en la psoriasis, pone de manifiesto el papel central de esta molécula y de otros miembros de su familia como dianas terapéuticas en esta enfermedad.134 En la actualidad existe un tratamiento de bloqueo de la IL-17A, secukinumab (inmunoglobulina (Ig) Gк1 neutralizante de IL-17A), cuyos estudios pivotales presentan las mejores y más rápidas tasas de respuesta en comparación con los tratamientos disponibles hasta la fecha para el tratamiento de la psoriasis.135

34

Introducción

-

Células Th17

Tradicionalmente las células Th se habían diferenciado en células Th1 (productoras de INFγ) o células Th2 (productoras de IL-4 e IL-13). En la actualidad se ha visto que hay subgrupos de células Th cuya diferenciación y función no se basa en la transcripción de uno de estos dos grupos de citocinas (figura 6).56, 116 Entre estos subgrupos adicionales se encuentran las células Th17, que se caracterizan por una producción mayoritaria de IL-17, pero también de IL-6, IL-21, IL-22, IL-26, INFγ, TNFα, GM-CSF, y CCL20.56, 82, 114, 118, 136-139

En lo que respecta a la familia de la IL-17, sólo la IL-17A y la IL-17F

son secretadas por células Th17.118, 140

Figura 6. Fenotipos de células T. Elementos necesarios para su diferenciación y retroalimentación (modificada de Schmidt-Weber et al.141). Fenotipos de células T. Durante la diferenciación de los linfocitos T naïve, INFγ, IL-6, TGFβ e IL-4 secretadas por Th1, Th17, células T reguladoras (Treg) y Th2, respectivamente, inducen la síntesis de los factores de transcripción que favorecen la diferenciación de cada una de estas líneas celulares: T-BET, RORγt, FOXP3 y GATA-3, respectivamente. Se observa también en esta figura cómo la IL-17 no participa en la retroalimentación positiva de la producción de células Th17, correspondiendo principalmente este papel a la IL-6.118 Epit: célula epitelial; Fib: fibroblasto: Mast: mastocito.

Los factores implicados en la diferenciación de las células Th17 han sido una fuente de debate. Parecen ser especie-específicos. En humanos comprenden factores de diferenciación (factor de crecimiento transformante - transforming growth factor: TGF - β, junto con IL-6, IL-21 o IL-1β), factores de transcripción (STAT3, factor regulador del interferón 4 - interferon regulatory factor 4: IRF4 -, receptor huérfano relacionado

35

Introducción

con el retinoide - retinoid-related orphan receptor: ROR - γt, RORα y el receptor del aril hidrocarburo), y la IL-23 (factor de crecimiento y estabilización). Estas células Th17 expresan IL-23R.56,

82, 112, 114, 118, 137, 142

Aunque la IL-23 no es un factor de

diferenciación en sentido estricto, las respuestas Th17 sólo pueden desarrollarse en su presencia. De esta forma, IL-23 actúa más bien como un factor limitante.118 Los inhibidores del desarrollo de Th17 incluyen las citocinas Th1 y Th2 (INFγ e IL-4, respectivamente), IL-17E (a través de la inhibición de la expresión de IL-1β e IL23 por parte de las células dendríticas) e IL-27.82, 107, 118 En cuanto a los marcadores de superficie celular, en humanos la coexpresión de CCR4 y CCR6 o la expresión de CCR2 en ausencia de CCR5 parecen definir a las células Th17.118, 133, 139 Las células Th17 están implicadas en la respuesta inmunitaria frente a hongos y bacterias extracelulares, y juegan un papel importante en la autoinmunidad y la inflamación.56, 118 Además de las células Th17, existe otro nuevo subtipo de células T denominadas Treg (T reguladoras) (CD4+, CD25+). El papel del TGFβ en la diferenciación de Treg y Th17, parece indicar una próxima relación entre ambos tipos celulares.118, 141 Tanto las células Th17 como las Treg presentan niveles más altos en sangre y en tejido de pacientes psoriásicos que en controles sanos y dichos niveles se correlacionan positivamente con la gravedad de la psoriasis.143

7.3 Bases genéticas Los factores genéticos constituyen un aspecto fundamental en la patogenia de la psoriasis. En las últimas décadas ha habido un avance espectacular en el conocimiento de las bases genéticas que intervienen en la susceptibilidad para padecer esta enfermedad. Estos conocimientos han ayudado a comprender mejor las vías moleculares implicadas en la psoriasis, permitiendo incluso el desarrollo de nuevas aproximaciones terapéuticas.

7.3.1 Estudios

de ligamiento

Estos estudios comenzaron hace décadas, analizando la cosegregación de marcadores genéticos tipo microsatélite en familias con diferentes individuos con psoriasis. Este tipo de estudios trata de identificar un marcador que segrega con la enfermedad de

36

Introducción

modo más frecuente de lo que cabría esperar debido al azar. Mediante esta metodología, se han mapeado loci de susceptibilidad para la psoriasis, denominados PSORS.12 El principal determinante genético de la psoriasis, el PSORS1 se ha localizado en la región cromosómica 6p21, habiéndose determinado que contribuye al 30-50% de la susceptibilidad genética de la enfermedad. Posteriormente se ha confirmado la presencia del alelo HLA-Cw6 en PSORS1, como el principal responsable de la asociación con psoriasis.12 Se ha postulado que este alelo permitiría la presentación de un epitopo putativo presente en las queratinas de tipo 1, en concreto en aquellas cuya expresión está aumentada en la psoriasis.12 Este epitopo actuaría como un autoantígeno, al presentar reactividad cruzada con la proteína M estreptocócica. De este modo se perpetuaría una respuesta autoinmune mediada por linfocitos CD8+ (y tal vez por linfocitos CD4+ con receptores NK-T), capaces de reconocer al complejo mayor de histocompatibilidad (Major Histocompatibility Complex: MHC) de tipo I, dando lugar a la cronificación de las lesiones.12 En estudios de ligamiento realizados en familias de diversa procedencia geográfica se han identificado otros loci de susceptibilidad para esta enfermedad (tabla 3). La identificación de genes de predisposición a psoriasis mediante estos estudios es difícil, ya que se trata de genes de baja penetrancia que son además objeto de múltiples interacciones entre sí, con el HLA-Cw6, y con los factores ambientales.144 Tabla 3. Loci asociados a psoriasis.5, 12 Locus PSORS1*

Región 6p21.3

Loci asociados a psoriasis OMIM Genes candidatos/función 612410 HLA-Cw6, CCHCR CDSN

PSORS2* PSORS3 PSORS4 PSORS5* PSORS6 PSORS7* PSORS8/PSORSA1* PSORS9 PSORS10 PSORS11* PSORS12 PSORS13*

17q25 4q34 1q21 3q21 19p13 1p 16q 4q31-q34 18p11.23 5q31.1-q33.1 20q13 6p21

607211 6601454 603935 604316 605364 605606 610707 607575 612410 612599 612950 614970

CARD14, RUNX1, RAPTOR, SLC9A3r1, NAT9, TBCD IRF-2 LOR, FLG, PGLYRP3,4; genes S100 y LCE SLC12A8, CSTA, ZNF148 JUNB PTPN22 (1p13), IL23R (1p32.1-31.2) CX3CL1, CX3R1, NOD2/CARD15 IL15 IL12B ZNF313/RNF114, ligasa de ubicuitina TRAF3IP2

OMIM: online mendelian inheritance in man: registro online de herencia mendeliana en humanos. El papel de estos dos genes como componentes de PSORS1 implicados en el riesgo de psoriasis arroja resultados controvertidos en diferentes estudios.145-147 *Locus asociados a ArPs al menos en alguna población (identificados por estudios de ligamiento, los menos, y en su mayoría, mediante estudios de asociación).148-153

37

Introducción

7.3.2 Estudios

de asociación

Son estudios caso-control de individuos no relacionados. En ellos se identifica un set de casos diagnosticados según unos criterios especificados, y una muestra independiente de individuos no afectados (controles) de la misma población. Se comparan las frecuencias genotípicas y/o alélicas en ambos grupos para identificar variantes asociadas con la enfermedad objeto de estudio, pues se considera que si una variación genética se presenta en los individuos con una enfermedad de modo más frecuente que en la población control, dicha variación interviene en el riesgo de padecerla.154 Las variaciones genéticas que estudian son fundamentalmente variaciones de un único nucleótido (single nucleotide polymorphisms: SNP – localizados a una frecuencia de 1 de cada 1000 nucleótidos -), y en menor medida variaciones en el número de copias (copy number variation: CNV - deleciones o duplicaciones de un segmento mayor de 1000 pares de bases (pb), que constituyen el 10% del genoma -).155 Inicialmente, los estudios de asociación evaluaban un número pequeño de variaciones genéticas.156, 157 Son múltiples los trabajos de estas características llevados a cabo en pacientes con psoriasis. En concreto, en población española, han permitido determinar asociación entre susceptibilidad a psoriasis o ArPs y los genes MICA,158 OTF3,159 LCE3B_LCE3C,160 APOE,161 NOS3,156 IL12B, IL23R, IL23A,111,

162

TNF,163,

164

CARD14,165 ADAMTS9-MAGI1,166 PTPN22, CD226, TYK2, IL1A, TNFAIP3, SLC22A4, HLA-C o IKBKB.167 La máxima expresión de este tipo de estudios son los estudios de asociación de todo el genoma (Genome Wide Association Studies: GWAS), dotados de una gran potencia para el

conocimiento

de

la

genética

de

enfermedades

complejas.168

Analizan

fundamentalmente la presencia de SNP mediante microarrays que permiten determinar cientos de miles de SNP a la vez en un mismo experimento. Estos estudios han posibilitado la identificación de nuevos polimorfismos en la psoriasis, cuyo número ha presentado un crecimiento exponencial en las últimas décadas (figura 7).

38

Introducción

Figura 7. Número de genes asociados a psoriasis identificados mediante estudios de asociación de todo el genoma (Genome Wide Association Studies: GWAS). La primera columna, correspondiente a la década de los 70, representa al HLA-Cw6, inicialmente identificado mediante estudios de ligamiento (posteriormente confirmado por estudios GWAS).169 En la columna correspondiente al año 2014 se incluye un trabajo con metodología diferente (secuenciación del exoma completo).170 Las columnas indican el número acumulado de loci asociados a riesgo de psoriasis a lo largo de los años.

Los primeros GWAS realizados en psoriasis identificaron loci de riesgo en los genes IL12B e IL23R.171, 172 En el gen IL12B, que codifica para IL-12p40, subunidad común de IL-12 e IL-23, se identificó el primer locus de riesgo asociado a psoriasis independiente del MHC.171 El gen IL23R codifica una subunidad del receptor IL-23R. Ambos genes, IL12B e IL23R, junto con HLA-Cw6 suponen el mayor peso en la carga genética de la psoriasis.173 Cargill et al. analizaron “en lo que no fue un GWAS en sentido estricto” 25215 SNP en 467 pacientes norteamericanos con psoriasis y 500 controles, e identificaron que el alelo A del SNP IL12B rs3212227 confería una odds ratio (OR) de 1,59-1,81 para padecer la enfermedad. También el alelo G del SNP IL12B rs6887695 se relacionó con mayor riesgo de psoriasis.171 Posteriormente, otros 3 estudios confirmaron dichas asociaciones en individuos británicos y alemanes, e identificaron otro SNP de susceptibilidad en el gen IL12B (rs1004531).174-176 Los mismos grupos de trabajo identificaron SNP de riesgo para psoriasis en el gen IL23R (rs7530511 y rs11209026).171, 174-176 Liu et al. publicaron el segundo GWAS en psoriasis, en donde evaluaron 311398 SNP en 223 pacientes con psoriasis y 519 controles (norte-europeos), que posteriormente replicaron en 577 casos y 737 controles estadounidenses y en 576 pacientes con ArPs y

39

Introducción

480 controles británicos. Confirmaron la relación de los genes IL12B e IL23R con psoriasis y ArPs, y observaron nuevos loci candidatos: COG6, LHFP, TNFAIP8L3, IL2, IL21 y LCE1C.172 La relación entre psoriasis y el gen ZNF313/RNF114 ha sido también identificada mediante estudios GWAS.177 El gen IL23A, que codifica la subunidad p19 de la IL-23, se ha asociado también con susceptibilidad para padecer psoriasis y ArPs.169 La identificación de este gen partió de un GWAS llevado a cabo por el Estudio de Asociación Colaborativa de Psoriasis (Collaborative Association Study of Psoriasis: CASP), en el que estudiaron 438670 SNP en 1409 casos y 1436 controles americanos. Tras una primera aproximación, identificaron 21 SNP candidatos que evaluaron en 5048 casos y 5041 controles, determinando una fuerte evidencia de asociación entre psoriasis y HLA-Cw6, IL13/IL4, IL12B, IL23R, y dos genes de la vía del NF-κβ, TNFAIP3 y TNIP1.169 Se confirma así mediante GWAS la relación entre el MHC y la psoriasis, identificada previamente en estudios ligados a familias. Los GWAS observan también que el SNP rs12191877 presenta el mayor desequilibrio de ligamiento con HLA-Cw*0602.169, 178 Zhang et al. realizaron un GWAS en población china incluyendo el análisis de SNP y de CNV. Estudiaron a 1139 casos y 1132 controles de etnia Han en una primera fase, lo que se siguió de una segunda fase con 5182 casos y 6516 controles de población china Uygur. En este estudio de asociación concluyeron que el gen LCE (late cornified envelope: envoltura cornificada tardía), previamente identificado en estudios de ligamiento como el PSORS4, confería riesgo para psoriasis, y que la deleción en este gen presentaba desequilibrio de ligamiento casi completo (o alta correlación) con el SNP rs4112788. En este mismo trabajo confirmaron la citada asociación entre psoriasis e IL12B y MHC.179 Otro GWAS realizado en población china por Sheng et al. determinó 3 nuevos loci de susceptibilidad, situados en 4q24 (NFKB1), 12p13.3 (CD27LAG3) y 17q12 (IKZF3).180 Con respecto al gen LCE, es relevante el estudio realizado por De Cid et al., al incluir población española, junto con individuos holandeses, italianos y estadounidenses. En este GWAS, basado en el análisis de CNV, se observó que la deleción de fragmentos en LCE (LCE3C_LCE3B-del) se asociaba a riesgo de psoriasis.181 El gen TRAF3IP2, que codifica una proteína que interviene en las señales inducidas por IL-17 e interacciona con miembros de la familia de factores de transcripción Rel/NF-κβ (Act1), se ha relacionado con psoriasis y ArPs mediante estudios GWAS.182 El Genetic Analysis of Psoriasis Consortium y el Wellcome Trust Case Control Consortium 2,

40

Introducción

analizaron 594224 SNP en 2622 pacientes con psoriasis y 5667 controles, confirmando la asociación entre TRAF3IP2 y psoriasis. Asimismo, en este trabajo, identificaron otros 6 nuevos loci: IL28RA, REL, IFIH1, ERAP1, NFKBIA, TYK2.183 En un GWAS de replicación, que incluyó pacientes y controles chinos, alemanes y estadounidenses, identificaron 6 nuevos loci en los genes ERAP1 (este gen ha sido citado previamente, sin embargo, ambos artículos que lo describen datan de la misma fecha de publicación), PTTG1, CSMD1, GJB2, SERPINB8 y ZNF816A.184 El GWAS con mayor número de pacientes se ha llevado a cabo en población china. Zuo et al. estudiaron 17614 casos y 25216 controles, definiendo 16 SNP en 15 nuevos loci asociados a psoriasis: C1orf141, ZNF683, TMC6, AIM2, IL1RL1, CASR, SON, ZFYVE16, MTHFR, CCDC129, ZNF143, AP5B1, SYNE2, IFNGR2 y 3q26.2-q27. Replicaron también la asociación previamente conocida con TNIP1, NFKBIA, IL12B y LCE3D_LCE3E, y determinaron que la conjunción de todas estas variaciones genéticas era responsable del 1,9% de la variabilidad de la psoriasis.185 La recopilación de estudios previos mediante metaanálisis ha permitido reconocer nuevos loci. Así Stuart et al., documentaron que los genes NOS2, FBXL19 y un locus próximo a PSMA6-NFKBIA, se relacionaban con la susceptibilidad de padecer psoriasis.186 Tsoi et al. identificaron 15 loci de susceptibilidad: RERE, SLC45A1, ERRFI1, TNFRSF9 (1p36.23), RUNX3 (1p36.11), B3GNT2 (2p15), EXOC2, IRF4 (6p25.3), TAGAP (6q25.3), ELMO1 (7p14.2-7p14.1), DDX58 (9p21.1), KLF4 (9p31.2), ZC3H12C (11q22.3), ETS1 (11q24.3), SOCS1 (16p13.13), STAT3 , STAT5A/5B (17q21.2), CARD14 (17q25.3), MBD2, POLI, STARD6 (18q21.2), ILF3, CARM1 (19p13.2).187 Recientemente, en otro trabajo llevado a cabo por un grupo de este mismo investigador, encontraron nuevos marcadores de riesgo en dos regiones intergénicas, 1q31.1 y 5p13.1, y otros tres SNP cerca de PLCL2 (3p24.3), NFKBIZ (3q12.3), y CAMK2G (10q22.2).188 Es de interés un trabajo publicado por Tang et al. realizado sobre población china, en el que secuenciaron el exoma en 781 pacientes con psoriasis y 676 controles. Los posibles genes candidatos obtenidos mediante esta primera aproximación, los combinaron con genes de susceptibilidad identificados a través de GWAS previos. Analizaron consiguientemente 1326 genes candidatos en 9946 pacientes y 9906 controles. Los análisis de este estudio identificaron a CARD14 como gen de susceptibilidad para psoriasis, confirmaron la asociación entre psoriasis e IL23R, GJB2, LCE3D, ERAP1 y

41

Introducción

ZNF816A, e identificaron variables raras en FTU2 y TARBP1 sugestivas de asociación con psoriasis.170 En varios trabajos se ha evaluado la influencia de variaciones genéticas en individuos con ArPs. Tanto HLA-C, IL12B, TRAF3IP2, IL23R, IL23A, IL2/IL21, FBXL19, PSMA6, NFKBIA o REL se han asociado con susceptibilidad para ArPs a través de estudios GWAS.169, 172, 182, 186, 189, 190 En un trabajo en población española que evaluó a 955 pacientes con ArPs y realizado mediante tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction: PCR) en tiempo real, identificaron que las variaciones genéticas en HLA-C, TRAF3IP2, TNIP1, IL12B, IFIH1 y NOS2 se asociaban a riesgo de padecer ArPs.148 Es de interés comentar que algunos SNP no sólo se asocian a riesgo de psoriasis, si no que están también implicados en variaciones fenotípicas de la enfermedad.12 Ejemplos de ello son la asociación de HLA-Cw6 con psoriasis guttata,191 de ERAP1 y ZNF816A con psoriasis tipo I,184 de IL1RN con onicopatía en casos de psoriasis puramente cutánea, o de IL36RH con psoriasis pustulosa.192 Asimismo, determinados polimorfismos en genes asociados a riesgo de psoriasis, o en genes que codifican elementos clave en las vías moleculares de esta enfermedad, como HLA-Cw6,164,

193, 194

TNFα,164,

195

IL23R,164 o TNFAIP3196, se han

relacionado con una mejor o peor respuesta al tratamiento. La mayoría de los trabajos en este ámbito se centran en los fármacos biológicos,173,

197

y añaden a los genes de

estudio aquellos que codifican elementos implicados en la unión a su diana terapéutica (TNFRSF1B,195, 198 FcƴR199.173, 197).

42

Hipótesis y Objetivos

43

Hipótesis y Objetivos

Hipótesis y Objetivos

1

Hipótesis

La variación en genes que codifican citocinas implicadas en la patogenia de las enfermedades, ha demostrado ser un factor de riesgo para desarrollar dichas patologías, pudiendo influir en su pronóstico e incluso determinar la respuesta a los tratamientos. La vía de la IL-17 ejerce un papel clave en la unión de la inmunidad innata y adaptativa y constituye un pilar importante en la patogenia de la psoriasis. Se han descrito variaciones genéticas que afectan a la expresión y función de las IL-17 o de sus receptores, que se asocian con la susceptibilidad para padecer una serie de enfermedades inflamatorias, determinadas infecciones o incluso neoplasias. Sin embargo, la relación entre las variaciones en la secuencia de los genes de la familia de la IL-17 y la psoriasis no ha sido suficientemente evaluada. Creemos que las variaciones genéticas que afectan a la expresión o actividad de las IL17 o de sus receptores pueden influenciar la susceptibilidad para padecer psoriasis, la gravedad de la misma o la respuesta al tratamiento.

44

Hipótesis y Objetivos

2

Objetivos 2.1 Objetivo principal

Determinar la influencia de las variaciones genéticas de la IL17A (rs7747909), IL17E (rs79877597), IL17F (rs763780, rs2397084), e IL17RA (rs4819554, rs879577) en el riesgo de padecer psoriasis.

2.2 Objetivos secundarios -

Determinar si existe relación entre estas variaciones genéticas y las características clínicas y demográficas de los pacientes con psoriasis.

-

Determinar si existe relación entre estas variaciones genéticas y la presencia o ausencia de HLA-Cw6.

-

Determinar si existe relación entre estas variaciones genéticas y la presencia o ausencia de la deleción en el gen LCE.

-

Determinar si existe relación entre estas variaciones genéticas y la presencia de los principales factores de riesgo cardiovascular: hipertensión arterial, diabetes mellitus tipo 2, dislipemia, cardiopatía isquémica, síndrome metabólico y obesidad.

-

Determinar si existe relación entre estas variaciones genéticas y la respuesta a tratamiento biológico (anti-TNF y anti-IL-12/IL-23).

45

Sujetos y Métodos

46

Sujetos y Métodos

Sujetos y Métodos

1

Descripción del estudio

Se diseñó un estudio observacional de casos y controles desde los servicios de Dermatología y de Genética Molecular del Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA) (Oviedo). Asimismo, y sólo en el grupo de pacientes (casos), se realizó un estudio descriptivo transversal (incluyendo un estudio farmacogenético). El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del HUCA y todos los participantes firmaron el consentimiento informado previamente a su inclusión (anexo I). Debido a que el trabajo incluye la observación de respuesta a tratamientos, se envió a la Asociación Española de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS) para su clasificación, siendo catalogado como “Estudio Postautorización con Otros Diseños diferentes al de seguimiento prospectivo (EPA-OD)” (anexo I). El periodo de recogida de datos de los pacientes incluidos en el estudio tuvo lugar entre octubre de 2013 y abril de 2015. Se incluyeron pacientes mayores de edad, caucásicos, con psoriasis crónica en placas. Se excluyeron pacientes no caucásicos, con fenotipos de psoriasis distintos de la forma crónica en placas, y los que tuvieran familiares de primer o segundo grado incluidos en el estudio. De cada paciente se recopilaron en una base de datos Excel las siguientes variables: edad, sexo, peso, altura, antecedentes familiares de psoriasis, edad de inicio, duración y gravedad de la psoriasis (según el PASI), afectación ungueal, presencia de ArPs, y genotipos HLA-Cw6 y LCE. Se recogió también la existencia de comorbilidades de riesgo cardiovascular (hipertensión arterial, diabetes mellitus tipo 2, dislipemia, cardiopatía isquémica, síndrome metabólico, obesidad) y de hábitos tóxicos (alcohol/tabaco). Finalmente, se incluyó información referente al tratamiento sistémico clásico recibido y al tratamiento con fármacos biológicos previos y actuales, así como la respuesta a los tratamientos biológicos en referencia a la mejoría en el PASI. De todos los pacientes se obtuvieron muestras de sangre para la obtención de ácido desoxirribonucleico (ADN) y subsiguiente determinación de las variaciones genéticas (polimorfismos) seleccionadas. Para conocer si existían asociaciones entre el riesgo de psoriasis y las variaciones genéticas, se analizaron éstas en un grupo de 567 controles sanos, con distribución

47

Sujetos y Métodos

similar a los casos en cuanto a edad y sexo, reclutados a través del Servicio de Dermatología y del Banco de Sangre del HUCA. Los genotipos y alelos de los polimorfismos estudiados en relación con la respuesta a los tratamientos biológicos, fueron las variables analizadas en el estudio farmacogenético.

1.1 Variables y definición -

Pacientes con psoriasis

Pacientes que cumpliendo los criterios de inclusión, hubiesen sido diagnosticados de psoriasis según criterios clínicos y uniformes por al menos un dermatólogo. -

Peso (kg), altura (cm), y cálculo del índice de masa corporal (IMC)

(peso/altura(m)2). -

Antecedentes familiares

Familiares de primer o segundo grado con psoriasis. -

Edad de inicio de la psoriasis

Inicio precoz si la edad de aparición fue menor de 40 años (tardío, si la edad de inicio fue mayor o igual a 40 años). -

Duración de la enfermedad

Edad actual menos la edad de inicio. -

Gravedad (PASI)200

Se consideró el PASI máximo histórico de los pacientes. Se definió psoriasis grave si el PASI era mayor o igual a 10. En el subgrupo de pacientes a tratamiento con fármacos biológicos se tuvo en cuenta el PASI previo al inicio del tratamiento. -

Onicopatía

Presencia o ausencia de las alteraciones ungueales características de la psoriasis: hoyuelos (pits), mancha de aceite, hiperqueratosis subungueal, onicólisis y onicodistrofia total. -

Presencia de ArPs

El diagnóstico de ArPs fue realizado por un reumatólogo, de acuerdo con los criterios CASPAR.17 -

HLA-Cw6

Presencia o ausencia del alelo HLA-Cw6 determinado en el análisis de ADN. -

Deleción en LCE

48

Sujetos y Métodos

Presencia de la deleción en este gen en homocigosis (DD) o heterocigosis (ID), o ausencia de la deleción (II). -

Hipertensión arterial

Diagnóstico emitido por un médico de atención primaria o por un especialista, constar en la historia los mmHg correspondientes a dos mediciones, cuya media se encontrase en rangos de hipertensión arterial (tensión arterial sistólica ≥130mmHg o tensión arterial diastólica ≥85mmHg), o estar a tratamiento con fármacos antihipertensivos. -

Diabetes mellitus tipo 2

Diagnóstico emitido por un médico de atención primaria o por un especialista, o estar a tratamiento con fármacos antidiabéticos orales o subcutáneos. -

Dislipemia

Diagnóstico emitido por un médico de atención primaria o por un especialista, o estar a tratamiento con fármacos hipolipemiantes. -

Cardiopatía Isquémica

Diagnóstico emitido por un cardiólogo, estar a tratamiento con fármacos para tal fin, o haber requerido procedimientos de revascularización. -

Síndrome metabólico

Diagnóstico establecido en función de los criterios del Panel de Tratamiento para Adultos III del Programa Nacional para la Educación sobre el Colesterol (National Cholesterol Education Programs’ – Adult Treatment Panel III - NCE-ATPIII), por ser los criterios más ampliamente utilizados en Europa.201 -

Obesidad

Se definió obesidad según el IMC de los pacientes (IMC ≥ 30: obesos; IMC < 30, no obesos). -

Consumo de alcohol

-

Consumo de tabaco

-

Tratamiento sistémico

Incluye los tratamientos sistémicos clásicos y biológicos.  Tratamiento sistémico clásico Haber requerido en algún momento de la enfermedad alguno de los siguientes tratamientos: fototerapia, ciclosporina, acitretino o metotrexato.  Tratamiento biológico

49

Sujetos y Métodos

Se recogieron los diferentes tratamientos biológicos que los pacientes psoriásicos hubiesen recibido o estuviesen recibiendo en la actualidad, con un seguimiento mayor de 6 meses. Se incluyeron aquellos fármacos biológicos aprobados para el tratamiento de la psoriasis el momento de la realización de este estudio (anti-TNF: adalimumab, etanercept e infliximab; y anti-IL12/23: ustekinumab). En todos los casos, la indicación del tratamiento en los pacientes siguió las recomendaciones de la ficha técnica y de las guías actuales de tratamiento de la psoriasis. La dosificación inicial fue la indicada en la ficha técnica de cada uno de los fármacos. -

Respuesta al tratamiento biológico

El tratamiento sistémico biológico en la psoriasis consta de dos fases:202 

Fase de inducción: período hasta la semana 16 o 24, según el fármaco y la dosis. En la semana 24, todos los fármacos alcanzan la fase de meseta terapéutica.



Fase de mantenimiento: a partir de entonces (semana 24 en adelante).

Para unificar criterios y poder incluir a todos los fármacos biológicos cuando éstos hubiesen alcanzado la fase de meseta, en este trabajo se consideró la fase de inducción hasta la semana 24. Así, para la evaluación de la respuesta al tratamiento biológico, se tuvo en cuenta el PASI previo al inicio del tratamiento y en las semanas 12 (punto intermedio entre el inicio y la fase de meseta) y 24. Se recogió si se alcanzaba o no el PASI50 (mejoría del 50% con respecto al PASI basal) y el PASI75 (mejoría del 75%) en dichos puntos de evaluación. Se eligió esta escala de valoración de la respuesta, ya que el porcentaje de pacientes que alcanza un PASI75 constituye uno de los parámetros de efectividad más relevante.202 Teniendo en cuenta lo anteriormente descrito, así como las guías acerca de los tratamientos biológicos, se clasificó a los pacientes en respondedores y no respondedores según se alcanzase un PASI75 o mayor al final de la fase de inducción (semana 24).198, 202-204 En la evaluación de la respuesta a los fármacos biológicos, se tuvieron en cuenta únicamente los datos correspondientes a la administración de dichos tratamientos por primera vez (pacientes naïve para tratamiento biológico).

50

Sujetos y Métodos

2

Selección de variantes genéticas

Los SNP analizados se seleccionaron según datos de estudios previamente publicados acerca de su relación con otras enfermedades, lo que sugería un papel funcional de estas variantes (anexo II, tabla 1). Para ello se realizó una revisión no sistemática de la literatura en la base de datos de Medline con los siguientes términos de búsqueda libre: ("Interleukin-17" OR IL-17 OR "interleukin 17" OR "IL 17") AND (polymorphisms OR polymorphism OR SNP), en combinación con ("Interleukin-17" OR "IL-17" OR "interleukin 17" OR "IL 17") AND psoriasis. Aunque hasta la fecha no se había estudiado el papel del SNP rs79877597 (IL17E), nosotros lo hemos incluido debido al efecto inhibitorio que la IL-17E ejerce sobre el eje IL-23/IL-17-Th17.114 También debemos mencionar que IL-17RA es la subunidad común del complejo receptor de las tres IL-17 cuyos genes hemos estudiado en este trabajo (IL-17A, IL-17E, IL-17F). En la siguiente tabla (tabla 4) se indican las localizaciones en el genoma y los efectos predictivos de los SNP de estudio (www.ensembl.org).

Tabla 4. Localización en el genoma y efecto predictivo de los SNP de los genes IL17 estudiados. Gen IL17A Cr. 6 IL17F Cr. 6

IL17E Cr. 14

IL17RA Cr. 22

Localización en el genoma y efecto predictivo de los SNP de los genes IL17 estudiados SNP Tránscrito SNP ADNc Efecto Programa Programa SIFT* PolyPhen* rs7747909 n.672G>A c.159G>A 3’ UTR (ENST00000340057) rs763780 n.590A>G c.482A>G p.H161R 0,09 0,003 (ENST00000336123) (Tolerable) (Benigno) rs2397084 n.485A>G c.377A>G p.E126G 0 0,992 (ENST00000336123) (Deletéreo) (Posiblemente perjudicial) rs79877597 n.682C>T c.424C>T p.R142W 0 0,999 (ENST00000329715) (Deletéreo) (Posiblemente perjudicial) rs4819554 5’ (promotor) rs879577 n.1233C>T c.110C>T p.A367V 0,44 0,004 (ENST00000319363) (Tolerable) (Benigno)

FAM Europa 0,25 0,06 0,08

0,22

0,21 0,26

ADNc: ADN complementario; FAM: frecuencia alélica menor; SNP: single nucleotide polymorphism: polimorfismo de un único nucleótido. *SIFT y PolyPhen son programas que predicen el efecto funcional de un cambio de aminoácido.

Los genes IL17A (también denominado IL17 o CTLA8) e IL17F (también denominado CANDF6 o ML1) se localizan en el brazo corto del cromosoma 6 (6p12, NC_000006.12). IL17A contiene 3 exones, e IL17F, 4. El gen IL17E (o IL25), se

51

Sujetos y Métodos

localiza en el brazo largo del cromosoma 14 (14q11.12, NC_000014.9), y consta de 2 exones. El gen IL17RA (denominado también CANDF5, CD217, CDW217, IL17R o hIL-17R), localizado en el cromosoma 22 (22q11.1, NC_000022.11) tiene mayor tamaño, contando con 13 exones. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=IL17A)

Teniendo en cuenta el peor de los escenarios, considerando la mayor frecuencia alélica menor (FAM) de los SNP seleccionados (IL17RA rs879577), serían necesarios 355 pacientes y 355 controles para detectar diferencias del 10%, con un poder estadístico del 80%.

3

Extracción de ADN

Para la obtención del ADN se extrajeron 5mL de sangre en un tubo de hemograma, con EDTA como anticoagulante. La purificación del ADN se realizó con un sistema automático y empleando los reactivos proporcionados por el fabricante (Promega Biotech). La concentración y calidad del ADN obtenido se determinó midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro de ultravioleta. Todos los ADN se ajustaron a una concentración final de 50 ng/µl.

4

Amplificación

La PCR convencional se empleó para amplificar fragmentos de ADN en el genotipado del HLA-Cw6 y del gen LCE, así como en la generación de fragmentos destinados a secuenciación capilar automática mediante el método de Sanger. En todas las muestras la amplificación se realizó en un volumen final de 30 µl, conteniendo 2 µl de ADN, 10 pM de cada cebador (primer) y 1 Unidad de Taq polimerasa (EurX). El resto de los reactivos (MgCl2, dNTP) estaban incluidos en el tampón de PCR suministrado por el proveedor. La amplificación se realizó con un programa que incluía las siguientes etapas: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguido de 32 ciclos en los que se repitieron los procesos de desnaturalización (95 °C, 30 segundos), cebamiento (unión de los primers a sus secuencias complementarias según la temperatura, 1 minuto), y elongación (72 °C, 2 minutos), y una fase final de 5 minutos a 72 °C. Para comprobar la amplificación se cargaron 3 µl de la reacción en geles de agarosa, seguido de electroforesis y visualización de las bandas en un transiluminador ultravioleta.

52

Sujetos y Métodos

5

Genotipado

Los polimorfismos de los genes de la familia de la IL-17 se determinaron mediante PCR

en

tiempo

real

con

sondas

Taqman

en

un

equipo

ABI7500

(www.appliedbiosystem.com). Estas sondas están comercializadas por la compañía Life Technologies. El genotipado se realizó en placas de 96 pocillos y en un volumen final de 12 µl por muestra, conteniendo cada reacción 20 ng de ADN y una solución 1x del reactivo de genotipado (Taqman genotyping master Mix, Applied Biosystems). El programa de PCR era el estándar para sondas Taqman (42 ciclos con cebamiento y extensión a 60 °C). En la figura 8 se muestran los resultados de una placa para uno de los polimorfismos estudiados.

Figura 8. Genotipos para uno de los polimorfismos de estudio (IL17RA rs4819554) mediante análisis con PCR en tiempo real. Cada genotipo se representa de un color según la composición alélica. Así los círculos azules indican los individuos homocigotos para el alelo 1, los círculos rojos, los homocigotos para el alelo 2, y los verdes, los individuos heterocigotos (portadores de ambos alelos). La cruz indica el control negativo (no se añade ADN a la muestra).

La determinación de la presencia o ausencia del alelo HLA-Cw6 (positivo/negativo) se realizó mediante PCR de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (restriction fragment lenght polymorphisms: RFLP), según el protocolo descrito en trabajos previamente publicados.205 Todos los pacientes se genotiparon por duplicado sin que hubiese discrepancias entre los dos ensayos. También se genotipó un SNP en desequilibrio de ligamiento casi completo con el HLA-Cw6 (rs4406273), a través del

53

Sujetos y Métodos

método Taqman en tiempo real (ensayo id. C_2451986_10; Applied Biosystems-Life Technologies).

La detección de la deleción en el gen LCE (LCE3C_LCE3B-del) se realizó mediante PCR de tres primers (figura 9).181

Figura 9. Genotipos de LCE tras electroforesis en gel de agarosa al 3%. Para determinar este polimorfismo, el ADN genómico (100ng) se amplificó (32 ciclos) en un volumen final de 20 µL, con los siguientes primers: LCE3CF: TCACCCTGGAACTAGACCTCA, LCE3CR: CTCCAACCACTTGTTCTTCTCA, LCE3CR2D: CATCCCAGGGATGCTGCAT. DD: homocigoto para la deleción en LCE; ID: heterocigoto para la deleción en LCE; II: homocigoto para la ausencia de deleción. LD: marcador de tamaño. NEG: ausencia de ADN en la PCR.

6

Secuenciación 6.1 Secuenciación masiva (NGS)

Dado que el SNP IL17RA rs4819554 proporcionaba susceptibilidad para psoriasis, se procedió a secuenciar este gen para identificar otras variantes que pudiesen conferir riesgo de desarrollar la enfermedad. La secuenciación masiva de genes completos se realizó sobre mezclas de ADN de varios individuos con chips semiconductores en un equipo Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) (Life Technologies). Previamente habíamos demostrado que este método era válido para identificar variantes raras diluidas por el alelo común en una mezcla (pool) de ADN.206 Para este procedimiento se ajustó el ADN de cada paciente a una concentración de 10 ng/μl mediante cuantificación con una sonda Taqman en tiempo real (Life Technologies). Realizamos un diseño online de amplificación múltiple (multiplex Ion AmpliSeq™ Designer), que permitiría amplificar toda la secuencia diana de cada gen

54

Sujetos y Métodos

en sólo dos tubos. El fabricante (Life Technologies) nos suministró parejas de primers para un total de 20 amplicones que cubrían más del 99% de la secuencia diana en dos tubos (tabla 5). Tabla 5. Secuencias cubiertas (región codificadora – exones - y al menos 5 regiones intrónicas flanqueantes) en el NGS para el gen IL17RA. Secuencias cubiertas en el NGS para el gen IL17RA Gen

Exón de inicio

Exón de terminación

Diana (pb)

Amplicones

IL17RA

17565976

17566124

149

2

IL17RA

17577946

17577981

36

1

IL17RA

17578681

17578838

158

1

IL17RA

17579659

17579782

124

1

IL17RA

17581239

17581376

138

1

IL17RA

17582880

17582938

59

2

IL17RA

17583023

17583197

175

3

IL17RA

17584378

17584472

95

1

IL17RA

17585610

17585705

96

1

IL17RA

17586475

17586497

23

1

IL17RA

17586737

17586849

113

1

IL17RA

17588611

17588663

53

1

IL17RA

17589191

17590715

1525

8

NGS: Next Generation Sequencing: secuenciación de segunda generación; pb: pares de bases.

El ADN de los pacientes seleccionados se dividió en mezclas (pools) y se realizó una amplificación múltiple utilizando el Ion Ampliseq™ Library Kit (Life Technologies). Dado que la NGS requiere equipos y conocimientos técnicos especiales, esta fase del estudio se contrató con un centro especializado (Servicios de Apoyo Científico-técnicos de la Universidad de Oviedo), que nos proporcionó una lista de todas las variantes nucleotídicas identificadas en cada mezcla de ADN. Las variantes que consideramos de posible interés clínico (fundamentalmente los cambios de aminoácidos) se asignaron a pacientes concretos dentro de cada mezcla de ADN mediante secuenciación de un fragmento de PCR por el método de Sanger.

6.2 Secuenciación Sanger Dado que el SNP rs4819554 se localizaba en la región promotora del gen IL17RA, se analizó dicha región mediante secuenciación de un fragmento de 300 bases generado por PCR con los primers 5'GGCAGGAGCGTGTGGATGCAC (forward: hacia delante) y

55

Sujetos y Métodos

5'GCCTCCTGGCTCGGACTCG (reverso) (cebamiento a 65 °C). Los amplificados se purificaron mediante columnas y se secuenciaron con reactivo BigDye (Applied Biosystems) en un equipo ABI3130xl (Life Technologies). Las secuencias se leyeron con el programa SeqScape (Applied Biosystems) y se compararon con la secuencia de referencia del gen IL17RA (base de datos www.ensembl.org).

7

Análisis estadístico

Los datos fueron analizados mediante el programa SPSS versión 22 (Chicago, IL). Para establecer diferencias cualitativas entre grupos se empleó el test de Chi-Cuadrado (o el test exacto de Fisher cuando estaba indicado por tamaños muestrales pequeños), con corrección según el test de comparaciones múltiples de Bonferroni. En el caso de las frecuencias genotípicas y alélicas, también se aplicó el test de Chi-Cuadrado para observar la existencia de desviaciones con respecto al equilibrio de Hardy-Weinberg (HW). Se determinaron las OR y los intervalos de confianza (IC) al 95%. Para calcular las diferencias entre variables cuantitativas, se utilizó el test t de Student. Se aplicaron modelos de regresión logística para identificar posibles factores de confusión. El nivel de significación estadística se consideró en el caso de un valor-p (p) < 0,05.

56

Resultados

57

Resultados

Resultados

1

Características de la población de estudio

Se incluyeron 580 pacientes con psoriasis cuyas principales características se resumen en la tabla 6. En los pacientes estudiados, predominó ligeramente en el sexo masculino (54% versus (vs.) 46%). La edad media de los pacientes en el momento del estudio se situó en 47 años. En un 74% de los pacientes, la psoriasis se había iniciado antes de los 40 años. La media de edad de inicio fue de 28 años, siendo algo menor en el caso del sexo femenino (30 vs. 26, p=0,011). Un 52% tenía al menos un familiar de primer o segundo grado afecto de psoriasis. Los antecedentes familiares fueron más frecuentes en el grupo de la psoriasis de inicio precoz (59%), con respecto al grupo de psoriasis de inicio tardío (32%) (p