Nuevo Influenza A H1N1 Contardi , Lorena Gabriela Reverendo, Marí María Amelia CEMIC 2009

Influenza






Los virus influenza son virus pertenecientes a la familia Orthomyxoviridae 3 tipos de influenza, A, B y C Los virus B y C causan enfermedad solo en el hombre mientras que influenza A además infecta aves y otros animales

Reseña sobre vigilancia y prevención de la influenza aviar y rol zoonótico. Linzitto et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana v.39 n.4 485-492, Diciembre 2005.

Síndrome Gripal









Fiebre,escalofríos,malestar general Mialgias Dolor de garganta Tos no productiva, rinitis Cefalea Fatiga extrema Convalecencia: 1-2 semanas Complicaciones: Neumonía, exacerbación de problemas cardíacos ó pulmonares, encefalopatías, mielitis, síndrome de Reye, miositis, miocarditis y pericarditis Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.

Transmisión por aerosoles







Periodo Incubación: 1-4 días Adultos eliminan virus: 1 día antes de los síntomas hasta 5 días Niños: > a 10 días Inmunocomprometidos: semanas a meses

Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.

Influenza A








Genoma de ARN segmentado y de polaridad negativa. La replicación es nuclear. Los viriones son envueltos por una cubierta lipídica proveniente de la célula huésped. En la envoltura poseen distintas proyecciones con forma de espícula. Reseña sobre vigilancia y prevención de la influenza aviar y rol zoonótico. Linzitto et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana v.39 n.4 485-492, Diciembre 2005.

Influenza A

Influenza A





La HA y la NA son los antígenos claves contra los que la respuesta inmune es dirigida. Utilizados para tipificar los virus de influenza A en 16 HA y 9 NA subtipos.

Emergence of a novel swine-origin influenza A virus (S-OIV) H1N1 virus in humans. J.S.Malik Peiris, Leo L.M.Poon, Yi Guan. Journal of Clinical Virology 45 (2009) 169-173

Hemaglutinina











Adsorción del virus a la célula. HA se une a los residuos de ácido siálico que se encuentran en el receptor de las células Fusión de la envoltura viral con la membrana del endosoma. Clivaje en dos péptidos HA1 y HA2 Responsable de la hemoaglutinación mediante la HA1 Induce la aparición de Acs. neutralizantes

Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.

El rol de la Hemaglutinina viral Hemaglutinina se une al ácido siálico

Virus es incorporado dentro de la célula

RNA del virus se replica en el núcleo

Neuraminidasa


Integrada por 4 subunidades




Enzima destructora de receptores




Permite transportar al virus a través de las mucinas y destruir los receptores de la HA sobre la célula huésped




Estimula la producción de anticuerpos inhibidores de la NA

Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.

El rol de la Neuraminidasa viral

La neuraminidasa corta la unión entre la hemaglutinina y el ácido siálico, lo que libera el virus de la célula

Ciclo de vida del virus de la Influenza

Subtipos de Hemaglutinina Subtype

Human

Swine

Horse

H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13 H14 H15 H16 Adapted from Levine AJ. Viruses. 1992;165, with permission

Bird

Subtipos de Neuraminidasa Subtype N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9

Human

Swine

Horse

Adapted from Levine AJ. Viruses. 1992;165, with permission

Bird

Variación antigénica en Influenza A


Drift antigénico o cambios menores: mutación puntual en el gen de HA y/o NA. No reconocida por su Ac correspondiente. epidemia




Shift antigénico o cambios mayores: involucra grandes cambios HA y/o NA por el reemplazo de los genes de estas proteínas. pandemia Reseña sobre vigilancia y prevención de la influenza aviar y rol zoonótico. Linzitto et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana v.39 n.4 485-492, Diciembre 2005.

“Shift” antigénico: origen de las cepas pandémicas


Reasociación genética entre cepas animales y cepas humanas en circulación. (1957/1968)




Cepas aviarias o de mamíferos adquieren la capacidad de infectar al hombre. (1918)




Cepas que desaparecieron, se mantuvieron escondidas y reaparecen luego de un período. (1977)

Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.

Variación antigénica


Se cree que las pandemias se generan cuando una HA y/o NA novel de la influenza aviar es adquirida a través de re-arreglos por virus humanos preexistentes o por un virus puramente aviar adaptándose eficientemente a la transmisión humana.

Emergence of a novel swine-origin influenza A virus (S-OIV) H1N1 virus in humans. J.S.Malik Peiris, Leo L.M.Poon, Yi Guan. Journal of Clinical Virology 45 (2009) 169-173

Orígenes de las pandemias de influenza

The Origins of Pandemic Influenza – Lessons from the 1918 Virus. Robert B. Belshe, MD. NEJM 353;21 November 24, 2005.

Nuevo Influenza A H1N1

Geographic Dependance, Surveillance and Origins of the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. Vladimir Trifonov, Hossein Khiabanian and Raul Rabadan. NEJM 10.1056, May 27, 2009.

Proteínas de superficie del virus porcino

5 genes de origen porcino

2 genes de origen aviar

1 gen de origen humano

¿Por qué es el cerdo un huésped intermediario apropiado?


Su tracto respiratorio expresa acido siálico (SA) α 2,3 Gal que une la influenza aviar y SA α 2,6 Gal que une la influenza humana, esto permitiría la infección con ambos virus. Ruling out Novel H1N1 Influenza Virus Infection with Direct Fluorescent Antigen Testing. Nira R. Pollock, Scott Duong, Annie Cheng, Linda L. Han, Sandra Smole, and James E. Kirby. Clinical Infectous Diseases 2009; 49: e66-8

Inicios de la pandemia

Nuevo Influenza A H1N1, 2009 Abril: Emerge en México o en USA Se disemina en USA, Canadá y en el mundo La OMS declara alerta Mundial. Junio 3: PANDEMIA FASE 5: transmisión interhumana sostenida Junio 11: FASE 6: PANDEMIA GLOBAL

Hoy

Cambios antigénicos mayores y pandemias de influenza Año

Subtipos

Magnitud

1918-19

HswN1

++++

1946

H1N1

+

1957

H2N2

+++

1968

H3N2

++

1977

H1N1

+

Virus respiratorios: diagnóstico


MÉTODOS DIRECTOS Cultivo: Gold standard clásico Rápidos: Detección de Antígenos: IF, ELISA, Inmunocromatografía Detección de Genomas: PCR, RT-PCR, PCR a tiempo real




MÉTODOS INDIRECTOS: Serología Escaso valor diagnóstico de infección reciente WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update

Obtención de la muestra ¿Cuando? Dentro de los 3 días del inicio del cuadro Aspirado nasofaringeo Hisopados nasal/faríngeo combinado Hisopado nasofaríngeo Hisopado nasal Aspirado traqueal BAL Biopsia WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update

Transporte y conservación 

Medios de transporte para virus: Caldo triptosa/Solución salina Hanks + gelatina ó albúmina al 1% + atb-antimicóticos 1%



Transporte: en frío. A 4 ºC menos de 72 hs. No congelar

Conservación por tiempos mayores a 72 hs –70 °C ó N2 líquido (Para aislamiento)



ASPIRADO NASOFARINGEO

Métodos clásicos

Métodos Rápidos IFI

Cultivo

Centrifugación sobrenadante

sedimento

HEP 2 o MRC 5 ó MDCK ó LLC-MK2 ACP

IFI células infectadas

tinción IFI

IFI panel respiratorio ☯ Virus sincicial respiratorio (Paramixoviridae) ☯ Adenovirus (Adenoviridae) ☯ Influenza A (Orthomixoviridae) ☯ Influenza B (Orthomixoviridae) ☯ Parainfluenza (Paramixoviridae)

Ruling out Novel H1N1 Influenza Virus Infection with Direct Fluorescent Antigen Testing. Nira R. Pollock, Scott Duong, Annie Cheng, Linda L. Han, Sandra Smole, and James E. Kirby. Clinical Infectous Diseases 2009; 49: e66-8

Detección directa de antígeno: IFI en ANF Ventajas: Rápida < costo Desventaja: Personal entrenado Adecuado Nº células Requiere microscopio IF

Ruling out Novel H1N1 Influenza Virus Infection with Direct Fluorescent Antigen Testing. Nira R. Pollock, Scott Duong, Annie Cheng, Linda L. Han, Sandra Smole, and James E. Kirby. Clinical Infectous Diseases 2009; 49: e66-8

ASPIRADO NASOFARINGEO

Diagnóstico molecular
PCR, RT-PCR
PCR en tiempo real. Permite cuantificar WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update

Diagnóstico molecular de nuevo H1N1



Diferentes protocolos Genes targets importantes:   

Gen de proteína de la matriz de influenza A Gen de hemaglutinina específico de H1N1 Gen de hemaglutinina específico para influenza estacional

WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update

Diagnóstico La OMS recomienda que los casos sospechosos de Influenza A H1N1 sean confirmados por:






Ensayos RT-PCR que diferencien S-OIV de los virus de influenza estacional Aislamiento e identificación de Influenza H1N1 La detección de un aumento de cuatro veces en los anticuerpos S-OIV por neutralización o inhibición de la hemoaglutinación (HAI). WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update Ruling out Novel H1N1 Influenza Virus Infection with Direct Fluorescent Antigen Testing. Nira R. Pollock, Scott Duong, Annie Cheng, Linda L. Han, Sandra Smole, and James E. Kirby. Clinical Infectous Diseases 2009; 49: e66-8

Experiencia del CEMIC en el diagnóstico de influenza A H1N1 Objetivos:
Determinar la frecuencia de positividad en nuestro hospital del nuevo influenza A H1N1 por PCR en tiempo real
Evaluar la sensibilidad del panel de virus respiratorio versus la PCR en tiempo real
Evaluar la sensibilidad de un método rápido inmunocromatográfico para screening de nuevo H1N1 versus PCR en tiempo real

Métodos








Inicialmente se utilizó una PCR en tiempo real con el protocolo recomendado por el CDC en el equipo de Smart Cycler II (Cepheid, CA). A partir del 1º de julio se incorporó para el diagnóstico una PCR en Tiempo Real comercial RUO (Research Use Only), el Swine Flu A Detection/ H1N1 en el equipo de Light Cycler 2.0´´ (Roche Diagnostics) La IFI se realizo con monoclonales específicos (Chemicon) sobre las células obtenidas de muestras respiratorias. El método rápido se realizo utilizando un kit inmunocromatográfico SD BIOLINE.

Materiales y Métodos 1741 muestras respiratorias

Buenos Aires y Jujuy Desde 11/06 al 31/08/09

HNF

ANF

Aspirado traqueal BAL

Protocolo CDC (11/06-1/07)

RT-PCR en tiempo real Light Cycler Roche (1/07-31/08)

IFI panel virus respiratorios (Chemicon)

224 muestras respiratorias RT-PCR en tiempo real

Método Inmunocromatográfico (SD Bioline)

16 muestras respiratorias RT-PCR en tiempo real

Método rápido inmunocromatográfico

Método rápido

Método rápido inmunocromatográfico

Método rápido inmunocromatográfico

Resultados

Resultados Figura: Detección de Influenza A H1N1 por PCR en Tiempo Real (n=1741) Periodo 10/06 al 31/08/ 2009 700

Positividad total: 39% Positivos Negativos

600 500 400

n 300

38% 52%

200 100

16%

0 Junio

n: 535

Julio

n: 972

Agosto

n: 234

Meses

Resultados





El porcentaje de positividad total por PCR Tiempo Real fue del 39% (686/1741) siendo del 52% en el mes de junio, 38% en julio y 16% en agosto La IFI mostró una sensibilidad global del 59% con respecto a la PCR en Tiempo Real sin embargo en los meses de junio y julio la sensibilidad fue del 64% con una especificidad del 92%

Resultados Sensibilidad panel viral vs. RT-PCR en tiempo real PCR H1N1 (+)

PCR H1N1(-)

Total

IFI FLUA (+)

45

7

52

IFI FLUA (-)

31

141

172

76

148

224

Total

IFI RSV : 3 (H1N1 +) y 15 ( H1N1-)

Sensibilidad : 59 % VPP: 86 %

Especificidad : 95 % VPN:82%

Resultados Sensibilidad Inmuno-cromatografía vs. RT-PCR en tiempo real PCR H1N1 (+)

PCR H1N1(-)

Total

Inmunocrom atografía (+)

2

0

2

Inmunocrom atografía (-)

11

3

14

Total

13

3

16

Controles Flu A estacional: 2/3 . Controles Flu B estacional: 2/3

Sensibilidad : 15.4 % VPP: 100 %

Especificidad : 100 % VPN: 21%

Conclusiones:


La frecuencia de casos positivos para influenza A H1N1 fue variando a lo largo de los meses siendo mayor al principio de la pandemia (52%).




Comprobamos que los mismos monoclonales que utilizamos para la detección de gripe estacional por IFI también detectan al nuevo influenza, pero con una menor sensibilidad (59%) que la observada para influenza A estacional (70-80%).




Se comprobó que la sensibilidad del método rápido inmunocromatografico estudiado fue baja (15%) y es similar a lo publicado en otros trabajos. Poor Clinical Sensitivity of Rapid Antigen Test for Influenza A Pandemic (H1N1) 2009 Virus. Jan Felix Drexler, Angelica Helmer, Heike Kirberg et al. Emerging Infectious Diseases. Vol 15. N° 10, October 2009. Field performance of an Inluenza Rapid Diagnostic Test in an ambulatory setting. Isabelle Rouleau, Hugues Charest, Monique Douville- Fradet, JCM..00762-09

Muchas gracias por su atención!!

Agradecimientos:





Laboratorio de Virología Dra. Cristina Videla Dr. Alfredo Martínez A nuestras compañeras de residencia