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Testosterona Libre Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de Testosterona Libre en Suero o Plasma Orina humano Para uso In Vitro únicamente

Número del Producto: DNOV009 (96 Determinaciones)

2 CONTENIDO 1. INTRODUCCION__________________________________________________________________ 3 2. USO______________________________________________________________________________ 3 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO___________________________________________ 4. MATERIALES___________________________________________________ 4.1. REACTIVOS SUMINISTRADOS 4.2. MATERIALES SUMINISTRADOS 4.3. MATERIALES Y EQUIPOS NECESARIOS 5. ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO ____________________________________

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6. PREPARACION DE REACTIVOS_______________________________________ 6.1. TIRAS RECUBIERTAS 6.2. CONJUGADO –TESTOSTERONA-HRP 6.3. ESTANDARES TESTOSTERONA 6.4. SOLUCION SUSTRATO TMB 6.5. SOLUCION DE PARADA

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7. COLECCION Y PREPARACION DE MUESTRAS_______________________________

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8. PROCEDMIENTO DE ENSAYO___________________________________________ 8.1. PREPARACION DE LA PRUEBA 8.2. MEDICION

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9. RESULTADOS______________________________________________________ 9.1. CALCULOS DE RESULTADOS 9.2. VALORES DE REFERENCIA

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10. CONTROL DE CALIDAD______________________________________________ _

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11. CARACTERISTICAS ESPECIFICAS DE DESEMPEÑO______________________ ___ 11.1. PRECISIÒN 11.2. ESPECIFICIDAD 11.3. SENSIBILIDAD 11.4. CERTERZA 11.5. METODOS DE COMPARACION 11.6. EFECTO HOOK

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12. LIMITACIONES DE PROCEDIMIENTO___________________________________

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13. PRECAUCIONES Y CUIDADOS_________________________________________ 12.1. CONSIDERACIONES DISPONIBLES

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14. LITERATURA____________________ 15. INFORMACION___________________________________

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3 1. INTRODUCCION La Testosterona es una hormona esteroide del grupo androgénico. La Testosterona es secretada inicialmente en los testículos y ovarios aunque pequeñas cantidades son secretadas por la glándula adrenal. Es una hormona sexual masculina principalmente y un esteroide anabólico. En hombres y mujeres juega un papel importante en la salud y bienestar. Solamente el 1-2% de Testosterona circulante existe no ligada o Testosterona Libre. La mayoría aproximadamente el 60% esta ligada a encontrada SHBG con tanta afinidad, mientras la restante es perdida ligada a Albúmina. Tanto la ligada a Albumina ocmo la Testosterona libre puede ser biológicamente ativa, mientras que SHBG inhibe efectivamente la acción de la testostena. Los efectos de la Testosterona pueden ser clasificados como efectos virilizantes y anabólicos. Los efectos anabólicos incluyen crecimiento de la masa muscular e incremento de la densidad ósea, y alargamiento y estimulación del crecimiento linear y maduración del hueso. Los efectos virilizantes incluyen la maduración de los órganos sexuales. Los niveles de Testosterona declinan gradualmente con la edad en hombres. La medición de fracción libre y no ligada de testosterona libre ha sido propuesta como una hormona bioactiva fisiológicamente estimulante. Los niveles de Testosterona Libre son elevados en mujeres con hiperandrogenismo asociado a hirsutismo en la presencia o ausencia de enfermedad poliquística ovárica. Además la medición de Testosterna Libre puede ser m{a útil que tal Testosterna Total en situaciones donde la SHBG se incrementa o disminuye (e.j. hipotiroidismo y obesidad)

2. USO Método Inmunoensayo enzimático colorimétrico Competitivo para la determinación cuantitativa de Testosterona Libre en suero o Plasma.

3. PRINCIPIO DEL ENSAYO Los pozos de las Tiras Microtituladoras están pre-cubiertas con Anticuerpos Anti-Testosterona (Fase-sólida). La Testosterona en la muestra compite con la Testosterona conjugado con peroxidasa de rábano picante por los sitios de unión con el anticuerpo. Después de la incubación una separación de los sitios libros es realizado por lavado de fase sólida. El complejo inmune formado por enzima-Antígeno marcado es visualizado por la adición del sustrato Tetrametilbenzidina (TMB) el cual da un producto de reacción azul, la intensidad es inversamente proporcional a la cantidad de Aldosterona presente en la muestras. El ácido sulfúrico es adicionado para pararla reacción. Esto produce un color de punto final amarillo, la absorción es leída a 450 nm usando un Microlector de ELISA.

4. MATERIALES 4.1. Reactivos Suministrados •

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Pozos Cubiertos con Anticuerpo IgG Anti-Testosterona: 12 tiras rompibles de 8 pozos cubiertas con anti-Cortisol; en bolsa de aluminio resellable. Solución de Parada: 1 botella que contiene 12 ml ácido sulfúrico, 0.15 mol/l (Evitar cualquier contacto con la piel). Conjugado Testosterona –HRP: 1 botella que contiene 22 ml de Testosterona conjugado con peroxidada de rábano picante. Solución Sustrato TMB: 1 botella que contiene 12 ml 3, 3´, 5, 5´-tetrametilbenzidina (TMB-H2O2-TMB 0.25 g/l) (Evitar cualquier contacto con la piel). Estándares de Testosterona: 5 botellas, 1 ml cada uno Estándard 0: 0 ng/ml Estándard 1: 0.2 pg/ml Estándard 2: 1.0 pg/ml Estándard 3: 4.0 pg/ml Estándard 4: 20.0 pg/ml Estándard 5: 100.0 pg/ml

4.2. Materiales suministrados • • • •

1 Soporte de Tiras 2 Láminas Adhesivas 1 Protocolo de prueba 1 Hoja Planeadora de distribución e identificación

4.3. Materiales y Equipos Necesarios • • • • • • •

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Equipo Microlector de ELISA, equipado para la medición de absorbancia de 450 nm. Incubador 37°C Equipo Manual o automático para lavado Pipetas Mezclador de tubos Agua destilada Disponibilidad de tubos Reloj

5. ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO Los reactivos son estables hasta la fecha de vencimiento que viene rotulada cuando es almacenada 2...8 °C en la oscuridad.

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6. PREPARATION DE REACTIVOS Es muy importante dejar todos los reactivos, muestras y estándares a temperatura ambiente (22…28°C) antes de iniciar la corrida del test!

6.1. Tiras recubiertas fraccionables Lista para uso con recubrimiento de Anticuerpo IgG Anti-Testosterona. Almacenamiento de 2…8 °C. Abrir la bolsa cuando se alcance la tempertaura ambiente. Inmediatamente después de remover las tiras las restantes deben almacenarse en la bolsa de aluminio con el desecante suministrado y a 2…8 °C; estabilidad hasta la fecha de expiración. No remover las hojas adhesivas en las tiras no usadas.

6.2. Conjugado Testosterona- HRP El Conjugado de Testosterona –HRP esta listo para el uso.

6.3. Estándares de Testosterona Los estándares están listos para uso y tienen las siguientes concentraciones. Estándard 0: 0 pg/ml Estándard 1: 0.2 pg/ml Estándard 2: 1.0 pg/ml Estándard 3: 4.0 pg/ml Estándard 4: 20.0 pg/ml Estándard 5: 100.0 pg/ml

6.4. Solución Sustrato TMB La botella contiene 12 ml de un sistema de tetrametilbenzidina/Peroxido de hidrogeno. El reactive est alisto para uso y tiene que ser almacenado 2...8°C en la oscuridad. La solución debe ser sin color o podría tener un ligero tinte azul. Si el sustrato se torna azul, puede estar contaminada y debe ser desechada.

6.5. Solución de Parada El frasco contiene 12 ml de Acido Sulfúrico 0.15 M (R 36/38, S 26). Lista para uso y debe ser almacenada de 2...8°C.

7. COLECCION Y PREPARACION DE MUESTRA La muestras de suero o plasma para este ensayo deben ser colectadas de pacientes en ayunas. Sí el ensayo es realizado dentro de las 24 horas después de colectada la muestras, el especien deben ser mantenido de 2…8°C de otra forma debe ser alicuotado y almacenado en congelación de ( -20°C a 70°C). Si la muestra es almacenada en congelación, mezclar bien para evitar el hielo antes de la prueba. Evitar repetidas descongelaciones.

7.1. Precaución No use sueros fuertemente hemolizados o ligeramente lipémicos. Se requiere máxima precisión es requerida para reconstitución y dispensado los reactivos. Evitar la exposición de sustrato TMB substrato a luz directo, metal u oxidantes. Este método permite la determinación de Testosterona Libre desde 0.10 pg/ml a 100,0 pg/ml. Pacientes con tratamiento con Corticosteroides, esteroides natural o sintéticos pueden impedir la determinación de Testosterona Libre.

8. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO 8.1. Preparación de la Prueba Por favor leer el protocolo cuidadosamente antes de realizar el ensayo. La confiabilidad de los resultados depende del estricto seguimiento del protocolo del ensayo, la distribución e identificación para todas las muestras y controles debe ser cuidadosamente establecida en la hoja de resultados suministrados en el estuche. Seleccionar el número de tiras o pozos que se requieran y localícelos en el soporte. El pipeteo de muestras no debe ser mayor de 10 minutos para evitar que se sequen. Si es requerido más de un plato se recomienda repetir la curva correspondiente Por favor localice y distribuya mínimo los siguientes pozos: 1 Pozo (e.j. A1) para blanco de sustrato 2 Pozo (e.j. B1+C1) para Estándar 0 2 Pozo (e.j. D1+E1) para Estándar 1 2 Pozo (e.j. F1+G1) para Estándar 2 2 Pozo (e.j. H1+A2) para Estándar 3 2 Pozo (e.j. B2+C2) para Estándar 4 2 Pozo (e.j. D2+E2) para Estándar 5

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Se recomienda determinar los estándares y muestras de pacientes por duplicado. Realice todos los pasos del ensayo en el orden suministrado y sin demora apreciable en los pasos. Una punta limpia y desechabe debe ser utilizada para distribuir cada estándar y cada muestra de paciente. Ajustar la incubadora a 37°C. 1. Dispensar 20 μl estándar y muestra en los respectivos pozos. 2. Adicionar 200 μl de conjugado-HRP a cada pozo y dejar el pozo A1 para blanco de sustrato. 2. Cubrir los pozos con la lámina adhesiva suministrada en el estuche. 3. Incubar por 1 hora a 37 °C. 4. Cuando la incubación se ha completado, remover la hoja adhesiva y lavar cada pozo dos veces con 300 μl de agua destilada. Evitar excesos desde los pozos de reacción. El tiempo de remojo entre cada lavado debe ser mayor de 5 segundos. Al finalizar remover el fluido por inversión de las tiras sobre papel absorbente antes del próximo paso. Nota: El lavado es crucial! Lavados insuficientes resultan en pérdida de precisión y falsas elevaciones de valores de absorbancias. 5. Dispensar 100 μl Solución Sustrato TMB en todos los pozos. 6. Incubar exactamente por 15 min a temperatura ambiente (22 – 28°C9 en la oscuridad. 7. Dispensar 100 μl de Solución de Parada en todos los pozos en el mismo orden y como fue adicionado el Sustrato TMB. Todo color azul desarrollado durante la incubación se torna en Amarillo. 8. Medición de absorbancia de las muestras a 450 nm dentro de los 30 minutos después de la adición de Solución de Parada.

8.2. Medición Ajustar el Lector de Microelisa a cero usando el blanco de sustrato del pozo A1. Si-debido a razones técnicas – el lector de ELISA no puede ser ajustado usando el blanco de sustrato del pozo A1, sustraer el valor de absorbancia the ELISA reader de todos los valores de absorbancia medidos en orden para obtener un valor de resultado real! Mida la absorbancia de todos los pozos a 450 nm y registre los valores de absorbancia para cada estándar y muestra de paciente en la hoja de distribución e identificación o el planeador. Calcular el promedio de los valores de absorbancia de todos los duplicados.

9. RESULTADOS 9.1. Cálculo de resultados Calcular el promedio de absorbancia de cada punto de los estándares de la curva y cada muestra. Interpole el promedio de los valores de absorbancia de los estándares contra la concentración. Dibuje la mejor curva. (Logistica de Cuatro Parámetros). Interpole los valores de las muestras en la curva estándar para obtener el valor de concentración correspondiente expresada en pg/ml.

9.2. Valores de Referencia Mediana Hombres Normal Mujeres: Ovulación Contraceptivos Oral Postmenopausia

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Promedio± 1SD pg/mL 13 ± 7

Rango pg/mL 4.5 - 42

1.3 0.9 0.8

1.4±0.9 1.1± 0.6 0.9±0.5

ND - 4.1 0.3 - 2.0 0.1 – 1.7

10. CONTROL DE CALIDAD Cada Laboratorio debe ensayar controles de niveles normales, altos y bajos de Testosterona Libre para monitorear el desempeño del ensayo. Estos controles deben ser tratados como desconocidos y determinar los valores en cada procedimiento. Cartas de control de calidad deben ser mantenidas para realizar el seguimiento del desempeño de los reactivos suministrados. Los métodos estadísticos pertinentes deben ser empleados para acertar en la tendencia que se emplee. El laboratorio individual debe poner límites aceptables de confianza de desempeño. Otros parámetros que deben ser monitoreados incluyen el intercepto de 80, 50 y 20% de la reproducibilidad de la curva estándar de corrida a corrida. Además, la absorbancia máxima debe ser coherente con la experiencia en otros montajes. Las desviaciones significativa del desempeño establecido puede indicar cambio inadvertido en condiciones o degradación experimentales de reactivos del estuche. Reactivos frescos deben ser usados para determinar la razón de las variaciones. Si un software es empleado como control de la disminución de datos de los resultados de la prueba, es imprescindible que los valores predichos para la caída de los calibradores este dentro de 10% de las concentraciones asignadas.

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11. CARACTERISTICAS DE DESEMPEÑO ESPECIFICO 11.1. Precisión Variación Intra Ensayo Dentro de la corrida las variaciones fueron determinadas por determinación en duplicado (16x) de dos sueros controles diferentes en un ensayo. La variabilidad del mismo ensayo es de 6,4 %. Variación Inter Ensayo Entre varias corridas las variación fue determinada por medición de tres diferentes sueros controles en dos diferentes lotes, la variación entre ensayos fue de 8,0 %.

11.2. Especificidad La reacción cruzada de anticuerpos calculada a 50% de acuerdo a Abraham es: Testosterona DHT Androstenediona Androsterona DHEA-S Cortisol Cortisona 17 α Estradiol Estrona Prednisona 17 α Etinilestradiol Norgestrel

100.0 % 0.006 % 0.0005 % 0.0 % 0.0 % 0.0 % 0.0 % 0.0 % 0.0 % 0.0 % 0.0 % 0.0 %

11.3. Sensibilidad Analítica La concentración mínima detectable de Cortisol que puede ser diferenciado a partir del estándar cero es 0.002 pg/ml con el 95 % de límite de confianza.

11.4. Comparación Método El estuche de Testostena Libre ELISA de NovaTec fue comparado con otro estuche comercial disponible. 69 muestras de mujeres y 26 de hombres fueron analizados de acuerdo a ambos sistemas. La curva de regresión lineal fue calculada. y = 0.47 x + 0,378 r = 0.86

11.5. Efecto Hook El estuche de Testostena Libre ELISA de NovaTec un inmunoensayo enzimático competitivo, no muestra Efecto Hook hasta 400 pg/ml.

12. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La contaminación bacteriana o repetidos ciclos de descongelación de las muestras pueden afectar los valores de absorbancia.

13. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS •

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 En conformidad con artículo 1 párrafo 2b europeo directivo 98/79/EC para el uso de dispositivos médicos para diagnóstico In Vitro es destinado por el fabricante para asegurar la oportunidad, desempeño y la seguridad del producto. Por lo tanto el procedimiento de prueba, la información, las precauciones y las advertencias en las instrucciones para el uso tienen que ser seguidas estrictamente. El uso del estuche con analizadores y equipo semejante tiene que ser validado. Cualquier cambio en el diseño, composición y procedimiento de prueba así como el empleo en combinación con otros productos no es autorizado por el fabricante; el propio usuario es responsable de tales cambios. El fabricante no es responsable de falsos resultados e incidentes por estas razones. El fabricante no es responsable de ningún resultado por el análisis visual de las muestras pacientes. Solamente para uso de diagnóstico In-Vitro diagnostic use. Todos componentes de origen humano utilizados para la producción de estos reactivos ha sido probado para anticuerpos anti Vih 1+2, anticuerpos de ANTI HCV y HBsAg y ha sido encontrado ser no reactivo. No obstante, todos los materiales deben ser consideradas y deben ser manejadas como potencialmente contagioso. No intercambie reactivos o tiras de diferentes lotes de producción. No debe usarse reactivos de otros manufacturadores con reactivos de este estuche No emplee reactivos después de la fecha de expiración que esta en el rótulo.

7 • • • • •

Use puntas limpias, dispensadores y elementos de Laboratorio. No intercambie las tapas de los viales de reactivos para evitar contaminación cruzada. Cierre los viales de reactivo en forma apretada después de uso para evitar evaporación y contaminación microbiana. Después de una primera apertura y subsecuente almacenamiento chequee el conjugado y frascos de control por contaminación microbiana antes del uso nuevamente. Para evitar contaminación cruzada y resultados elevados falsos pipetee muestras de pacientes y conjugado sin salpicar exactamente en el fondo del pozo.

PRECAUCION: El acido Sulfúrico irrita ojos y piel. Evitar el alcance de niños. Sobre el contacto con los ojos, lavar completamente con agua y consultar a un médico!

13.1. Consideraciones para el Descarte Los residuos de químicos y preparaciones son generalmente considerados como desecho peligroso El descarte de este tipo de desecho es regulado a través de leyes y regulaciones nacionales o regionales. Contacto la autoridad local o compañía de manejo de desechos la cual debe orientar en como manejar el desecho peligroso.

14. LITERATURA McCann D., Kirkish L. (1985) J. Clin. Immunoassay 8, 234 - 6. Ekins RP. (1984) J. Clin. Immunoassay 7(2), 163 – 80. Paulson JD et al. (1977) Am. J Obst. Gynecol 128, 851 – 7. Odlind V. et al. (1982) Clin. Endocrinology 16, 243 – 49. Green PJ. (1982) Clin Chem 28, 1237. Wu CH. (1982) Obstet Gynecol. 60, 188 – 94.

15. INFORMACION PARA ORDENAR EL PRODUCTO Prod. No.: DNOV009 Determinación Testosterona Libre (96 Determinaciones).

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ESQUEMA DEL ENSAYO Testosterona Libre Preparación del Ensayo Preparar reactivos y muestras como lo describe el manufacturador. Establecer la planilla de distribución e identificación para todas las muestras y controles en la hoja de resultados suministrada en el estuche. Seleccionar el número de tiras de microtitulación o pozos y colocarlos en el soporte.

Procedimiento de Ensayo Blanco Sustrato

Estandard 0

Estandard 1

Estandard 2

Estandard 3

Estandard 4

Estandard 5

Muestra

Estandard 0

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20 µl

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-

-

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-

-

Estandard 1

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20 µl

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-

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Estandard 2

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20 µl

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Estandard 3

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-

-

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20 µl

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Estandard 4

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20 µl

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Estandard 5

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20 µl

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Muestra

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-

-

-

-

20 µl

200 µl

200 µl

200 ml

200 µl

200 µl

200 µl

200 µl

Conjugado Diluido

-

100 µl

100 µl

100 µl

100 µl

Cubrir pozos con la hoja adhesiva suministrada en el estuche Incubar por 1 h a 37 °C Lavar los pozos dos veces con 300 μl de agua destilada TMB Sustrato

100 µl

100 µl

100 µl

100 µl

100 µl

100 µl

Incubar por 15 minutos exactamente a T° ambiente en la oscuridad Solución Parada

100 µl

100 µl

100 µl

100 µl

100 µl

100 µl

Medición Fotométrica a 450 nm

Waldstr. 23 A6 D-63128 Dietzenbach, Germany Tel.: +49 (0) 6074-48760 Fax: +49 (0) 6074-487629 Email : [email protected] Internet: www.NovaTec-ID.com DNOV012engl06022007CR

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