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1.- OBJETIVO Realizar de una manera adecuada y correcta las técnicas del laboratorio para evaluar la Hemostasia Primaria y/o secundaria

2.- ALCANCE Aplica a todas las muestras y/o pacientes que acuden al AADC solicitando dichas pruebas.

3.- POLITICAS 3.1.- El horario para la toma y/o recepción de las muestras será de 7:00 a 9:00 de la mañana de lunes a viernes.

3.2.- Para hacer efectiva la toma de la muestra el usuario debe cumplir con las condiciones descritas en el instructivo “Requisitos para toma de muestra”. 3.3.- No usar muestras coaguladas.

4.-CONTENIDO

TECNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE PRUEBAS DE HEMOSTASIA Y FIBRINOLISIS  Tiempo de sangrado  Agregación Plaquetaria  Tiempo de Protrombina (TP)  Tiempo de Tromboplastina Parcial activada (TTPa)  Fibrinógeno  Tiempo de Trombina (TT)  Factor VIII

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Factor IX Lisis de Euglobulinas Sulfato de protamina

Nota: Para las pruebas de TP, TTPa, TT y Fibrinógeno consultar el lineamiento para el manejo del equipo Diagnostica Star y los insertos correspondientes de cada reactivo

TIEMPO DE SANGRADO (MÉTODO DE IVY) PRINCIPIO La

prueba de Tiempo de sangrado (TS) valora la capacidad hemostática global in vitro y consiste en medir el tiempo

transcurrido desde la realización de una pequeña incisión cutánea hasta que cesa la hemorragia a través de ella. La prueba mide el tiempo necesario para obtener un tampón hemostático eficaz y, por tanto, representa una valoración global y simultánea de los procesos de adhesión, agregación y liberación plaquetarias. El método original del corte en el lóbulo de la oreja, introducido por Duke en 1912, es poco sensible y menos reproducible, por lo que no es aconsejable seguir utilizándolo hoy en día. En 1941, Ivy introdujo la aplicación de un manguito de presión sanguínea en la parte superior del brazo y se mantiene a una presión de 40 mmHg para controlar la presión intracapilar en el antebrazo. Se elige y prepara un sitio en la superficie anterior del antebrazo para realizar una pequeña incisión. El tiempo de sangrado se define como el tiempo entre la realización de una pequeña incisión en la piel que produce sangrado y el momento en que éste se detiene. Aunque esta definición es aparentemente muy simple, el tiempo de sangrado tiene muchas variables. Es la prueba de hemostasia más difícil de efectuar de forma rutinaria, ya que es relativamente personal y subjetiva. No obstante, si se realiza con cuidado puede dar resultados reproducibles y brindar información importante para la evaluación de los pacientes con tendencia al sangrado.

Material:  Esfigmomanómetro  Lanceta

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Algodón Alcohol Cronómetro Papel filtro Whatman # 42 (110 mm/diámetro)

Técnica 1.-Se coloca el esfigmomanómetro en el brazo del paciente y se regula a 40 mmHg, manteniéndolo a esta presión a lo largo de toda la prueba. 2.-Desinfectar con el algodón la parte superior de la cara anterior del antebrazo. 3.-Con una lanceta se realiza manualmente un corte aproximado de 1cm de longitud por 1mm de profundidad, en la parte superior de la cara anterior del antebrazo, en una zona sin vello y alejada de las venas superficiales, aprox. a unos 3 cm por debajo del pliegue del codo y paralelo al mismo. 4.-Inmediatamente después de realizar la incisión se pone en marcha el cronómetro. 5.-La sangre que brota de forma espontánea se va secando con un papel filtro cada 30 segundos, con la precaución de que el papel solo contacte con la sangre y no con la herida. 6.- Anotar el tiempo que tarda en cesar la hemorragia, que será el resultado de la prueba. Interpretación del resultado Los límites de referencia para el tiempo de sangrado con la metodología descrita, es de 2 hasta 8 minutos, y son claramente patológicos los tiempos superiores a 10 minutos y se consideran graves los superiores a 20 minutos. La prueba se alarga por reducción importante del número de plaquetas o por alteraciones funcionales de estas, congénitas o adquiridas. Es sensible a las reducciones marcadas del hematocrito. El tiempo de sangrado puede prolongarse también cuando existe una reducción o una anormalidad en ciertos factores plasmáticos que intervienen en la adhesividad y agregación de las plaquetas, como el factor von Willebrand, el fibrinógeno, o el factor V.

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La ingesta de aspirina en los días que preceden a la prueba suele inducir ligeras alteraciones en los resultados de sujetos normales, pero magnifica la prolongación secundaria a cualquier defecto hemostático. PRUEBA DE AGREGACIÓN PLAQUETARIA Fundamento.- El estudio de la agregación plaquetaria se ha hecho técnicamente asequible con el moderno instrumental y la aparición de reactivos de simple utilización. Las plaquetas se agregan unas con otras en las fases iniciales del proceso hemostático, por lo que un defecto grave en esta etapa se asocia con hemorragia potencial, mientras que la hiper agregación puede producir o facilitar la trombosis. El proceso de agregación se estudia en el laboratorio utilizando sustancias con capacidad agregante, como ADP, epinefrina y Ristocetina. El método empleado generalmente es el turbidimetria, la agregación plaquetaria es un método fundamental para obtener información sobre la hemostasia primaria. Consiste en disponer de un plasma rico en plaquetas (PRP), obtenido a partir de sangre citratada, en una cubeta transparente, a una temperatura de 37°C y con agitación continua por medio de una barrita de hierro sometida a un campo magnético giratorio. La cubeta es atravesada por un haz de luz y cuando, se le adiciona un agente inductor, se produce la agregación, aumenta la transmisión de luz a través de la cubeta y su intensidad es recogida gráficamente. MATERIAL  Agregómetro  Cubetas y barritas de agitación magnética  Micropipetas  Puntas de 200 µL y 1 mL  Plasma Citrato del paciente y testigo  Agentes Agregantes: ADP Adrenalina Ristocetina Método.- Óptico

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Técnica Preparación de la muestra. 1.-Obtencion de plasma rico en plaquetas (PRP) a.-Obtener sangre con anticoagulante de citrato sódico al 3.2 %, en los tubos habitualmente utilizados para pruebas de coagulación. (Paciente y Testigo). Tomar la cantidad necesaria para las pruebas a realizar. b.-Centrifugar la sangre a 900 rpm por 15 minutos para obtener el plasma rico en plaquetas (PRP). Esto se debe hacer después de tomar la muestra ya que la vida media de las plaquetas es de aproximadamente 3 hrs. c.-Separar 500 µL del PRP y ponerlo en un tubo de plástico (falcon) rotulado como PRP para el paciente y el mismo procedimiento se hace con el testigo.

2.-Obtencion de plasma pobre en plaquetas (PPP) a.-Centrifugar de nuevo el remanente de los tubos de sangre total a 3500 rpm por 15 minutos para obtener el plasma pobre en plaquetas (PPP). b.-Se obtiene un plasma claro donde todas las plaquetas por la fuerza centrífuga ya están sedimentadas al igual que los eritrocitos. 3.-Cuantificacion de plaquetas del PRP Al PRP que se obtiene; realizar un conteo automatizado de plaquetas (SYSMEX KX-21). Una vez obtenida la tira con el resultado de las plaquetas estas se ajustan a 200 mil si fueran necesarias. Calculo para ajustar las plaquetas a 200 mil Fórmula: C1V1 = C2V2

V1 = C2V2 C1

C1= # de plaquetas automatizadas V1 = ? (Vol del plasma rico en plaquetas) C2= 200 (concentración final)

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V2= 2 ml (volumen final) Reactivos. Adrenalina.-Preparar una dilución 1:10 con solución salina. Tomar de esta dilución 50µL y añadirlo al PRP y/o usar 5µL del reactivo.

ADP.- Añadir 5 µL de este reactivo al PRP Ristocetina.-Añadir 5 µL de este reactivo al PRP PROGRAMA AGROLINK PARA AGREGACIÓN PLAQUETARIA. 1.- Encender el regulador 2.-Encender el equipo Chrono-Log Aggro/Link que es complementario del equipo de agregometría. 3.-Conectar la computadora. 4.-Esperar que el equipo alcance una temperatura de 37°C 5.-Seleccionar el Icono Aggrolink 6.-Seleccionar Run New 7.-En la ventana de Run Test llenar los siguientes datos Test Identificación: en trace 1 poner los datos del paciente Test Procedure: seleccionar edit Define Test Procedure: seleccionar el agonista a usar. Seleccionar Ok. PROCEDIMIENTO 1.-Disponer de 450 µL de PRP en tantas cubetas como pruebas se vayan a realizar conteniendo una barrita de agitación cada una de ella.

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2.-En otra cubeta disponer de 450 µL de PPP para usarlo como blanco. 3.-Introducir la cubeta de PPP y una de PRP en el agregómetro en sus posiciones correspondientes. 4.-Presionar en el equipo Chrono-log Lumi-aggregometer los botones de Set baselines aprox. 30 seg. Para obtener el ajuste de la densidad óptica y para que la agregación empiece en 0%. 5.-Dispensar en el fondo de la cubeta que contiene el PRP el agente agregante de la prueba a realizar permitir que esta se desarrolle durante 5 a 6 min y luego detener la prueba. Observar el % de agregación del Paciente ó Testigo. 6.-Retirar la cubeta de PRP y sustituirla por otra para la segunda prueba, en la que se seguirán los mismos pasos. 7.-Después de terminar de realizar las pruebas se sale del programa y apagar el agregómetro, la computadora y reguladores.

INTERPRETACION DEL RESULTADO Es habitual que los enfermos presenten una agregación de 70% o menor con los agonistas mencionados. Las enfermedades de las glicoproteínas plaquetarias, como la tromboastenia de Glazmann, presentan un defecto grave en la agregación con respuesta a agentes como el ADP o la colágena. En la enfermedad de Von Willebrand, la agregación con Ristocetina resulta anormal en la forma habitual y más frecuente de la enfermedad, ya que la Ristocetina sólo produce Agregación en presencia del factor de Von Willebrand. Esta prueba también se puede utilizar para valorar el efecto de los anti-agregantes plaquetarios, como la aspirina, además de los casos de tendencia a la trombosis, como el llamado síndrome de las “plaquetas pegajosas”. DETERMINACION DEL FACTOR VIII El FVIII es una glicoproteína con un peso molecular de aproximadamente 280 KDa. Se encuentra en el hígado, el bazo. El FVIII circula en al plasma formando un complejo no covalente con el factor Von Willebrand (FVIII/FvW). La trombina y el factor Xa activan el factor VIII para que este desencadene la activación del factor X por el factor IXa en presencia de fosfolípidos y iones de calcio. La deficiencia congénita del factor VIII se manifiesta como hemofilia A cuya gravedad depende de la calidad del factor VIII presente: < 1%

Hemofilia severa

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1-5%

Hemofilia moderada

5-25% Hemofilia leve PRINCIPIO.- Después de añadir plasma deficiente del factor VIII a una muestra de plasma citratada diluida, el sistema de coagulación endógeno es activado por un reactivo TTPa apropiado. La adición de iones calcio provoca la coagulación ulterior hasta la formación de coágulos de fibrina. El incremento del tiempo de coagulación es inversamente proporcional a la actividad del factor VIII y se indica como % de la actividad normal. La conversión del tiempo en segundos a un valor porcentual se realiza con una curva de calibración. MATERIAL Reactivo: Plasma Humano deficiente de VIII (liofilizado). Este se disuelve con 1 ml de agua desionizada. Mezclar suavemente para obtener una solución Homogénea. No agitar para evitar la formación de espuma. Dejar reposar 30 minutos de 18 a 25°C. 

Sangre obtenida con citrato de sodio del paciente y testigo



Coagulómetro



Reactivo FVIII



Reactivo de TTPa

TÉCNICA Hacer una dilución 1:10 del plasma paciente y del plasma testigo hacer dilución 1:10, 1:20, 1:40, 1:80. 1.-Colocar las cubetas en el coagulómetro 2.-Añadir la balinita 3.-Anadir 50 µL del reactivo de FVIII 4.-Añadir 50 µL de la muestra diluida 1:10 del paciente 5.-Añadir 50 µL del reactivo de TTPa

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6.-Activar el cronometro (Incubar a 37°C durante 5 minutos) 7.-Añadir 50 µL del Cloruro de calcio. 8.-Observar la formación del coágulo y anotar el tiempo en segundos en que esto ocurrio. 9.-Hacer lo mismo con las otras diluciones del testigo (1:10, 1:20, 1:40, 1:80) para la obtener la curva de calibración. 10.-Usando un papel antilogaritmico graficar la concentración del tiempo en segundos de las diluciones del testigo y obtener la concentración del FVIII del paciente. DETERMINACION DEL FACTOR IX PRINCIPIO.-El factor IX es una glicoproteína con un peso molecular de aproximadamente 56 kilodalton. Se sintetiza en el hígado como precursor fisiológicamente indiferente de la coagulación para adquirir su forma definitiva por acción de la carboxilasa dependiente de la vitamina K. Después de añadir plasma deficiente del factor IX a una muestra de plasma citratado diluido, el sistema de coagulación endógeno se activa con un reactivo TTPa apropiado. La adición de iones calcio provoca la coagulación ulterior hasta la formación de coágulos de fibrina. El tiempo de coagulación prolongado es inversamente proporcional a la actividad del factor IX y se indica como porcentaje de la actividad normal. La conversión del tiempo en segundos a un valor porcentual se realiza con una curva de calibración.

El factor IX se ve activado por dos factores: el factor XIa en presencia de iones cálcicos; el factor VIIa en presencia de iones cálcicos fosfolípidos. Al formar un complejo con el factor VIIIa, el factorIXa transforma el factor X en Xa en presencia de iones calcio y fosfolípidos. La deficiencia congénita del factor IX se manifiesta como hemofilia B cuya gravedad depende de la cantidad del fcator IX presente: < 1%

Hemofilia severa

1-5%

Hemofilia moderada

5-25% Hemofilia leve

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Estados de deficiencia adquirida se producen durante el tratamiento con anticoagulantes orales, en hepatopatías como la cirrosis o la hepatitis, en caso de absorción trastornada de la vitamina K por ejemplo: en enfermedades hemorrágicas del recién nacido, en ictericia o en tratamiento con antibióticos.

MATERIAL Reactivo: Plasma Humano deficiente de IX (liofilizado). Este se disuelve con 1 ml de agua desionizada. Mezclar suavemente para obtener una solución Homogénea. No agitar para evitar la formación de espuma. Dejar reposar 30 minutos de 18 a 25°C. Sangre obtenida con citrato de sodio del paciente y testigo Coagulómetro Reactivo FIX Reactivo de TTPa TÉCNICA Hacer una dilución 1:10 del plasma paciente y del plasma testigo hacer dilución 1:10, 1:20, 1:40, 1:80. 1.-Colocar las cubetitas en el coagulómetro 2.-Anadir la balinita 3.-Anadir 50 µL del reactivo de FIX 4.-Añadir 50 µL de la muestra diluida 1:10 5.-Añadir 50 µL del reactivo de TTPa 6.-Activar el cronometro (Incubar a 37°C durante 180 segundos) 7.-Añadir 50 µL del Cloruro de calcio. 8.-Observar la formación del coágulo y anotar el tiempo en segundos en que esto ocurrió.

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9.-Hacer lo mismo con las diluciones del testigo (1:10, 1:20, 1:40, 1:80) para la obtener la curva de calibración. 10.-Usando un papel antilogaritmico graficar la concentración del tiempo en segundos para obtener la concentración del FIX del paciente. LISIS DE

EUGLOBULINAS

PRINCIPIO.-La fibrinólisis se estudia mediante la prueba de lisis de Euglobulinas. La fracción de Euglobulinas del plasma es precipitada por dilución y acidificación a pH 5.3. En el precipitado se encuentran el fibrinógeno y plasminógeno, que en su estado activo se convierte en plasmina. Esta prueba consiste en precipitar las euglobulinas plasmáticas mediante ácido acético diluido. La precipitación de las euglobulinas, permite la eliminación de inhibidores de la fibrinólisis en el sobrenadante. Las Euglobulinas plasmáticas precipitan con el ácido al 1% y se vuelven a quedar en suspensión en la solución de buffer de boratos para coagular más tarde cuando es añadido el CaCl2. Muestra biológica: Plasma citratado del paciente y testigo Reactivos: Cloruro de calcio (CaCl2 ) 0.025 M Ácido acético al 1% Buffer de boratos pH 9 TÉCNICA 1.-Marcar dos tubos de 10 ml aprox. uno para el paciente y otro para el testigo 2.-Agregar a cada uno de los tubos 9 ml de agua desionizada, 100 µL de Ac. Acético al 1%. 3.-Al tubo del testigo agregar 500 µL de su plasma 4.-Al tubo paciente agregar 500 µL de su plasma 5.-Mezclar bien y guardar a 40 C por 20 min. 6.-Luego repartir en proporciones iguales en 2 tubos de 7 ml el contenido del tubo de 10 ml (dos paciente y dos testigo)

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7.- Centrifugar 3 min a 1000 rpm 8.-Después decantar el sobrenadante, escurrir y dejar secar (aprox 10 min) 9.-Añadirle 500 µL de buffer de boratos a cada tubo 10.-Meter los tubos a baño maría a 370 C y con un aplicador de manera agitar en el fondo y después añadirle 500 µL de CaCL2 11.-Mezclar bien y se deja en el baño maría a 37 0C 12.-Checar la formación del coágulo y empezar a contar el tiempo si no se disolvió el coágulo después de 120 minutos la prueba es negativa.

SULFATO DE PROTAMINA Fundamento: La adición de sulfato de protamina al plasma da por resultado la formación de fibras de fibrina o gelificación en presencia de monómeros de fibrina a productos de degradación primarios de la fibrina (fdp). Esta prueba aunque parezca fácil de realizar requiere tiempo, debe solicitarse cuando el paciente presenta un cuadro clínico que sugiera una hemorragia masiva y que la sangre no forme coágulo, además de que cuando las otras pruebas de coagulación, como el TP, TTPa, TT estén prolongados, debe considerarse como una urgencia cuando se sospecha la activación del sistema fibrinolítico. La prueba es insensible para el fibrinógeno y productos de degradación del fibrinógeno (FDP). Es negativa en plasma normal y fibrinólisis primaria. Es positivo en Coagulación Intravascular diseminada (CID). Muestra Sangre Obtenida con Citrato de sodio al 3.8% del paciente y testigo Solución salina Ampolleta de Protamina

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Técnica: 1.-Centrifugar las muestras 15 minutos a 3500 rpm 2.-Realizar diluciones seriadas 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 y 1:80 de la Protamina con Solución salina. (Todas las diluciones se preparan en tubos de 5ml) 3.-Marcar 4 tubos con cada una de esas diluciones y agregarle 200 µL de esas diluciones y luego añadirle 200 µL del plasma del paciente a cada tubo 4.-Realizar lo mismo con la muestra del testigo 5.-Mezclar bien e incubar a 37°C 6.-Observar a los 15, 30, 45 y 60 minutos si hay formación del coágulo. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS 

Se considera positiva si se observa formación del coágulo en la dilución 1:10 del paciente.



Negativa si no hay formación del coágulo.

5.-

DOCUMENTOS DE REFERENCIA

Código (cuando aplique)

Nombre del documento

Lugar de almacenamiento

N/A

Fundamentos de Interpretación Clínica de los Examenes de laboratorio.Ruiz Arguelles G. Ed. Medica panamerica.2005

Laboratorio AADC

N/A

Manual de Técnicas de laboratorio en Hematología 1era. Ed.

Laboratorio de AADC

Limitations of using PRP in the study of platelet agggregation. Cronolog-Log.

Laboratorio de AADC

Lineamiento para el manejo de Residuos Peligrosos Biológicos infecciosos (RPBI).

Laboratorio de AADC

N/A L-CIRB-AADC-01

Código: M-CIRB-AADC-01

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6.- CONTROL DE REVISIONES NIVEL DE REVISIÓN 01

02

SECCIÓN Y/O PÁGINA Todo el documento Todo el documento

DESCRIPCIÓN DE LA MODIFICACIÓN Y MEJORA

Se eliminó el código de CIPLADE que no correspondía a este manual. Se mejoró la redacción del escrito Se eliminó el índice, la introducción y el glosario.

FECHA DE MODIFICACIÓN

18- Enero- 2013

18 de Agosto del 2015

Nota: La sección 10 será utilizada a partir de la primera modificación a este documento. La revisión 00, se mantendrá en blanco.

7.- CONTROL DE EMISIONES

Elaboró

Revisó

Aprobó

M en C. Irma Quintal Ortiz Técnico Académico

QFB. Gabriela Alonzo Salomón Responsable del AADC

Dr. Jorge Zavala Castro Director del CIR

Las firmas avalan la responsabilidad de las personas que: elaboran el documento, revisan su adecuación y aprueban para su implementación dentro del Sistema de Gestión de la Calidad de la Universidad Autónoma de Yucatán.