Optimización del proceso de fermentación de la fábrica de licores y alcoholes de antioquia (fla).

POR: Sara Restrepo Pineda Restrepo Ingeniería Biológica

Informe final de la práctica profesional realizada en la Fábrica de Licores y Alcoholes de Antioquia.

Tutor laboral: Gustavo Cadavid Wendell Director de Procesos

Tutor académico: Mario Evelio Arias Zabala Ingeniero Químico

Asesoría: Alexandra Porras Cárdenas Bacterióloga

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Sede Medellín 2012 1

LISTA DE FIGURAS Figura 1. Esquema bioquímico de la fermentación. Figura 2. Fermentación alcohólica. Figura 3. Etapas de un proceso de fermentación. Figura 4. Saccharomyces cerevisiae. Figura 5. Curva de crecimiento de las levaduras. Figura 6. Factores que inducen al estrés de S. cerevisiae durante la fermentación. Figura 7. Influencia de la temperatura en la actividad de las levaduras. Figura 8. Floculación de levaduras mediante lectinas. Figura 9. Diferentes sustratos utilizados para la producción de etanol. Figura10. Hidrólisis de la sacarosa. Figura 11. Reacción de Fehling. Figura 12. Reacción del ácido 3,5-dinitrosalicílico. Figura 13. Procedimiento para el tratamiento de la crema de levadura. Figura 14. Aerómetros o sacarímetros para medición de grados Brix. Figura 15. Alcoholímetro automático. Figura 16. Cámara de Neubauer. Figura 17. Cuadrícula para recuento celular. Figura 18. Curva de calibración con glucosa 0,4 g/L. Figura 19. Curva de calibración con sacarosa 0,4 g/L. Figura 20. Grados Brix, pH y temperatura con respecto al tiempo (cuba 1). Figura 21. Grado de alcohol del vino con respecto al tiempo (cuba 1). Figura 22. Concentración de ATR con respecto al tiempo (cuba 1). Figura 23. Recuento de levadura con respecto al tiempo (cuba 1). Figura 24. Comparación de los ATR iniciales, azúcares residuales y grado de alcohol para cada una de las 4 cubas. Figura 25. Muestras de melaza analizadas por DNS.

2

9 10 13 18 19 19 21 24 27 33 35 37 44 49 50 50 51 57 57 60 61 62 62 64 66

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Productividad en la obtención de etanol para varias configuraciones. Tabla 2. Composición de la melaza de caña de azúcar. Tabla 3. Diluciones de una muestra de mosto para recuento de levadura. Tabla 4. Esquema de estándares de glucosa. Tabla 5. Diluciones para una muestra con absorbancia por fuera del rango de medida de la curva de calibración. Tabla 6. Resumen estadístico de los Grados Brix, pH y Temperatura para todas las cubas. Tabla 7. Resumen estadístico de los ATR, el Rendimiento y Grado Alcohólico del vino para todas las cubas. Tabla 8. Resumen estadístico de los Recuentos de Levadura para todas las cubas. Tabla 9. Seguimiento cada dos horas de todos los parámetros para la cuba1. Tabla 10. Promedio de la concentración de ATR y rendimiento del proceso para cada cuba. Tabla 11. Promedio del grado de alcohol para cada cuba. Tabla 11. Promedio del grado de alcohol para cada cuba. Tabla 12. Resultados de los ATR utilizando los métodos de Fehling, DNS y HPLC.

3

16 29 50 52 53 55 58 59 60 63 64 65

TABLA DE CONTENIDO

1.

INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 7

2.

MARCO TEÓRICO................................................................................................. 8

2.1.

PROCESO FERMENTATIVO ........................................................................... 8

2.1.1.

DEFINICIÓN DEL CONCEPTO DE FERMENTACIÓN .................................. 8

2.1.2.

ANTECEDENTES DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA ...................... 10

2.1.3.

ETAPAS DE UNA FERMENTACIÓN ............................................................ 11

2.1.4.

FACTORES IMPORTANTES EN LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA .... 13

2.1.5.

TIPOS DE PROCESOS FERMENTATIVOS A ESCALA INDUSTRIAL ....... 14

2.1.6.

OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO FERMENTATIVO.................................... 16

2.2.

AGENTES DE LA FERMENTACIÓN: Levaduras ......................................... 17

2.2.1.

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS....................................................... 17

2.2.2.

REPRODUCCIÓN ........................................................................................... 17

2.2.3.

FASES DE CRECIMIENTO ............................................................................ 18

2.2.4.

FACTORES QUE INHIBEN A LAS LEVADURAS ....................................... 19

2.2.5.

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES ....................................................... 21

2.2.6.

INCORPORACIÓN DE AZÚCARES .............................................................. 22

2.2.7.

FLOCULACIÓN .............................................................................................. 22

2.2.8.

LEVADURAS COMERCIALES...................................................................... 24

2.3. 2.3.1.

SUSTRATOS DE LA FERMENTACIÓN ........................................................ 25 TIPOS DE SUSTRATOS ................................................................................. 26 4

2.3.1.1. MATERIALES QUE CONTIENEN ALMIDÓN COMO FUENTE DE AZÚCARES .................................................................................................................... 26 2.3.1.2. MATERIALES QUE CONTIENEN CELULOSA COMO FUENTE DE AZÚCARES .................................................................................................................... 26 2.3.1.3. MATERIALES QUE CONTIENEN CARBOHIDRATOS COMO FUENTE DE AZÚCARES .................................................................................................................... 27 2.3.2.

MELAZA DE CAÑA DE AZÚCAR ................................................................ 27

2.3.2.1. CLASIFICACIÓN ............................................................................................ 28 2.3.2.2. COMPOSICIÓN .............................................................................................. 28 2.3.2.3. PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS ............................................................. 31 2.3.2.4. CONTENIDO MICROBIANO ......................................................................... 31 2.3.2.5. TRATAMIENTOS PREVIOS .......................................................................... 32 2.3.2.6. ALMACENAMIENTO .................................................................................... 32 2.4.

AZÚCARES ........................................................................................................ 33

2.4.1.

MÉTODOS PARA DETERMINAR AZÚCARES REDUCTORES ................. 34

2.4.1.1. MÉTODO DE FEHLING ................................................................................. 35 2.4.1.2. CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) .............. 35 2.4.1.3. MÉTODO DEL ÁCIDO 3,5-DINITROSALICÍLICO (DNS) ........................... 36 3. PRODUCCIÓN DE ALCOHOL DE LA FÁBRICA DE LICORES Y ALCOHOLES DE ANTIOQUIA (FLA) ....................................................................... 39 3.1.

ALGUNOS CONCEPTOS GENERALES............................................................ 39

3.2.

DESCRIPCIÓN DEL PROCESO ......................................................................... 40

3.2.1.

PROPAGACIÓN DE LOS CULTIVOS ........................................................... 40

3.2.2.

FERMENTACIÓN ........................................................................................... 41

3.2.3.

DESTILACIÓN................................................................................................ 44

4.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .............................................................. 45 5

5.

OBJETIVOS........................................................................................................... 47

6.

MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 48

6.1.

MUESTREO ........................................................................................................ 48

6.2.

MEDICIÓN DE pH .............................................................................................. 48

6.3.

MEDICIÓN GRADOS BRIX ............................................................................... 48

6.4.

MEDICIÓN DEL PORCENTAJE DE ALCOHOL............................................... 49

6.5.

RECUENTO DE LEVADURAS .......................................................................... 50

6.6. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES TOTALES REDUCTORES EN MOSTO DE FERMENTACIÓN POR DNS ................................................................................... 51 6.7. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES TOTALES REDUCTORES EN MELAZA POR DNS ........................................................................................................................ 54 7.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 55

7.1. COMPORTAMIENTO GENERAL DE LA FERMENTACIÓN - DATOS DE TODAS LAS CUBAS ..................................................................................................... 55 7.1.1.

GRADOS BRIX, PH Y TEMPERATURA ....................................................... 55

7.1.2.

AZÚCARES TOTALES REDUCTORES Y PORCENTAJE ALCOHÓLICO.. 56

7.1.3.

RECUENTO DE LEVADURAS ...................................................................... 59

7.2. COMPORTAMIENTO DE LA FERMENTACIÓN CON RESPECTO AL TIEMPO- DATOS DE LA CUBA1 ................................................................................. 60 7.3.

COMPARACIÓN DE LA FERMENTACIÓN ENTRE CUBAS .......................... 63

7.4.

AZÚCARES REDUCTORES EN MELAZA DE CAÑA DE AZÚCAR .............. 65

8.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ..................................................... 67

9.

REFERENCIAS ..................................................................................................... 69

10.

ANEXOS................................................................................................................ 73

6

1. INTRODUCCIÓN

Como es bien sabido, la fermentación microbiana tiene un sin número de usos y aplicaciones en la industria hoy día. Mediante la fermentación microbiana se ha logrado la elaboración de diferentes productos como alimentos, vitaminas, bebidas alcohólicas, productos farmacéuticos, químicos, combustibles, enzimas, biomasa, proteínas, entre otros. Una de las aplicaciones más antiguas, interesantes y de amplio uso, ha sido la fermentación alcohólica, cuyo principal producto es el etanol, que puede emplearse para la preparación de diferentes licores. Sin duda alguna, nuestro país ocupa un puesto importante en este ámbito, incluso en los últimos años la industria alcoholera ha crecido tanto, que Colombia pasó a ocupar el segundo puesto en la producción de etanol a base de caña de azúcar en América Latina (Martínez, 2011). La Fábrica de Licores y Alcoholes de Antioquia (FLA) es una de las industrias colombianas mejor posicionadas por su gran experiencia en el país, pues cuenta con 90 años elaborando licores y alcoholes con el sello característico de la calidad de sus productos y sus procesos certificados. A pesar de que la fermentación en la FLA presenta un alto rendimiento y la mayoría de los parámetros están estandarizados, aún quedan muchas dudas por resolver y muchos conocimientos por descubrir. Esto ha incentivado el inicio de algunas investigaciones centradas en conocer las condiciones óptimas a las cuales trabaja mejor la levadura y bajo las cuales se consiguen porcentajes altos de etanol. Por ejemplo, se ha evaluado la influencia de algunos iones en la actividad metabólica del microorganismo, se ha estimado la necesidad de suplementar las melazas con urea y fosfato, incluso se han hecho ensayos sobre la floculación de la levadura y los factores que la pueden inducir. Cada vez es mayor la necesidad de aumentar el rendimiento de los procesos de fermentación, encontrando soluciones que impliquen poca inversión económica, menor consumo de sustrato y un aumento en la producción de etanol, sin que la levadura pierda su viabilidad. Así, en este trabajo se evalúan las diferentes variables y condiciones que van a permitir optimizar el proceso de fermentación de la Fábrica de Licores y Alcoholes de Antioquia, realizando un seguimiento y control de los azúcares totales reductores desde el inicio hasta el final de cada ciclo fermentativo, teniendo en cuenta además, la variación de los grados Brix, el pH, la temperatura, el porcentaje de alcohol y el recuento de levadura.

7

2. MARCO TEÓRICO 2.1.

PROCESO FERMENTATIVO

2.1.1. DEFINICIÓN DEL CONCEPTO DE FERMENTACIÓN En general, los procesos biológicos pueden ser clasificados como enzimáticos o fermentativos: -Un proceso enzimático utiliza enzimas ó complejos enzimáticos aislados de las células para llevar a cabo una transformación. Es un proceso catalítico, donde la enzima se conserva, pero no se reproduce. -Por el contrario, un proceso fermentativo utiliza las células libres en suspensión ó inmovilizadas en soportes físicos como agentes de la biotransformación. Es por tanto un proceso autocatalítico, donde no sólo se conserva la célula inicial, sino que también se reproduce; cada vez hay más células generando un metabolito de interés. La fermentación desde su acepción general, consiste en la conversión de glucosa en metabolitos de interés y dióxido de carbono, debido a la acción de ciertos microorganismos. Este proceso ocurre en ausencia de oxígeno y tiene como finalidad biológica proporcionar energía a las células. Así, a nivel bioquímico, la fermentación se define como una actividad celular de obtención de energía, donde se da la descomposición de compuestos orgánicos sin recurrir al ciclo de Krebs ni a una cadena transportadora de electrones. Sólo utiliza una molécula orgánica como aceptor final de electrones. Como se observa en la figura 1, el primer paso es la glucólisis, es decir, la conversión de glucosa en ácido pirúvico. En el segundo paso las coenzimas reducidas durante la glucólisis o sus productos resultantes (NADH, NADPH) donan sus electrones e hidrogeniones al ácido pirúvico o aun derivado del ácido pirúvico para formar un producto final de la fermentación. Los productos finales dependen del tipo de microorganismo, del tipo de sustrato y del tipo de enzimas presentes (Tortora, 2007).

8

a)

b) Figura 1. Esquema bioquímico de la fermentación. a) Glucólisis; b) Productos de fermentación según el tipo de microorganismo.

Cuando se habla estrictamente de fermentación alcohólica (figura 2), el producto principal, como su nombre lo dice, es el alcohol etílico. En este proceso, el acido pirúvico sufre una descarboxilación con desprendimiento de dióxido de carbono para formar aldehído y, a su vez, éste último sufre una reducción por medio de una alcohol deshidrogenasa para formar etanol (Mathews, 1999). El anhídrido carbónico (CO2) que se genera, es lo que provoca el burbujeo, la ebullición y el aroma característico de una cuba de mosto en fermentación. Además, como subproductos, puede quedar el acetaldehído, metanol, esteres y algunos alcoholes superiores.

9

Figura 2. Fermentación alcohólica.

Es preciso aclarar que la fermentación alcohólica no es una utilización eficiente del sustrato glucídico, fundamentalmente por su carácter anaerobio. Si se compara con la degradación aeróbica de la glucosa, se llega a la conclusión de que esta última pone a disposición de la actividad celular de las levaduras, un 40,4 % del total de la energía. En cambio, en la fermentación sólo se consigue abastecer a las células de las levaduras con un 2,16 % de la energía total, almacenada en forma de ATP (Usseglio-Tomasset, 1998). Sin embargo, pese a esta baja eficiencia energética con respecto al proceso aerobio, la transformación de 1Kg de glucosa produce, aproximadamente entre 500g y 520g de alcohol etílico y entre 480g y 500g de dióxido de carbono (Prescott & Dunn, 1959). Por eso, la fermentación más que solamente un proceso que produce energía, es un medio de obtener productos naturales útiles para el consumo humano como: pan, vino, cerveza, champagne y todo tipo de bebidas alcohólicas fermentadas. 2.1.2. ANTECEDENTES DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA La fermentación del azúcar por la levadura con formación de alcohol etílico, es conocida por el hombre desde los tiempos más antiguos. Sin embargo, sólo se logró obtener bebidas alcohólicas cuando se aprendió a destilar. Esto ocurrió aproximadamente entre los siglos XI y XII. La esencia de la fermentación permaneció mucho tiempo desconocida, pero pudo aclararse cuando el microscopio reveló el crecimiento de microorganismos en alimentos (Mayer, 1987). La fermentación alcohólica fue determinada cuantitativamente por Lavoisier, quien estudiando esta fermentación, en 1789 enuncia el principio de conservación de la materia y expresa una ecuación que describe este fenómeno: Mosto de uva = Ácido carbónico + Alcohol Con el advenimiento de los descubrimientos químicos en el año 1815 el investigador francés Joseph Louis Gay-Lussac expresa en una ecuación más detallada la producción etanol a partir de glucosa: C6H12O6  2 C2H6O + 2 CO2 + 57 Kcal/mol

10

Berzelius describe la fermentación como un fenómeno catalítico, similar a la descomposición del agua oxigenada por una esponja de platino y expresa la idea de fermentos orgánicos. Posteriormente Cagniard de la Tour y Schwan observan en el microscopio que existía una estrecha dependencia entre la multiplicación de pequeños microorganismos y la intensidad de la fermentación de mostos de vinos o de cervezas donde se desarrollaban. Sin embargo el mundo científico no aceptaba esta opinión hasta que Pasteur demostró en 1872 que aquellos microorganismos vivían y se desarrollaban a expensas de las materias primas azucaradas, descomponiéndolas en alcohol y CO2, y que tales organismos vivientes constituían los “fermentos organizados”. Liebig se declaró contrario a dicha hipótesis considerando que los fermentos orgánicos eran sustancias de naturaleza proteica que producían un desdoblamiento natural de las moléculas de azúcar. Estas opiniones de Liebig, verdaderamente eran precursoras del concepto de enzimas, pero no fueron aceptadas en su época. Entonces surgieron muchas preguntas, por ejemplo cómo lleva a cabo la levadura la fermentación, si en virtud de su misma actividad vital ó merced de algún proceso bioquímico originado por ella. En 1896, Buchner efectuó un descubrimiento importante que compatibilizaba la idea de “microorganismos fermentativos” de Pasteur y de “enzimas” de Liebig, demostrando que la acción fermentativa estaba en las células vivas de levaduras, pero que podía ser extraída de ellas destruyendo las células con acetona o triturando con arena, obteniendo un jugo que a pesar de hallarse libre de células era capaz de reproducir todas las fases de la fermentación alcohólica de la glucosa (Brock & Madigan, 1991). Los descubrimientos posteriores a partir del periodo que va desde mediados del siglo XX hasta comienzos del siglo XXI se centran exclusivamente en la mejora de los procesos de fermentación alcohólica y conciernen más a la optimización del rendimiento industrial bien sea mediante una buena selección de cepas de levaduras, de una temperatura de funcionamiento óptima, de un mejor sustrato en cuanto al contenido de azúcares, entre otros (Vásquez, 2007). 2.1.3. ETAPAS DE UNA FERMENTACIÓN El proceso fermentativo consta de varias etapas secuenciales, las cuales requieren de especial cuidado para garantizar un buen rendimiento en la producción de alcohol (Fiechter, 1984). 1. Preparación de inóculo: Es el cultivo inicial del microorganismo responsable del proceso a nivel de laboratorio. Se siembra un repique en un medio de cultivo a partir de un tubo liofilizado o congelado donde se conserva la cepa de interés. Este 11

material microbiológico seleccionado constituye el punto de partida con el cual se va aumentando el volumen del medio periódicamente como forma de propagación de la cepa. Esta etapa es fundamental para garantizar la mayor cantidad posible de células activas y viables que van a entrar al proceso. 2. Preparación del medio: Es el acondicionamiento del sustrato que contiene los nutrientes necesarios para las células. El medio debe tener una fuente de carbono y energía, una fuente de nitrógeno, micronutrientes y oxígeno, si es un proceso aerobio. Como no todos los medios contienen exactamente lo que requieren las células, muchas veces es necesario complementarlos con urea, algunas sales minerales, fosfato, u otros. Además, se deben ajustar las condiciones del medio para que las células trabajen apropiadamente. 3. Esterilización del medio: Se utilizan altas temperaturas ó antibióticos para desinfectar los equipos y el medio de cultivo donde crecerá la levadura. Esto se hace para asegurar que se tiene un único tipo de células durante la fermentación. 4. Fermentación: Se lleva a cabo en los biorreactores ó cubas de fermentación que tienen capacidad para grandes volúmenes, donde se pone en contacto el cultivo microbiano previamente propagado con el sustrato, dejando actuar el tiempo necesario para el consumo máximo de azúcares y a la vez, máxima producción de alcohol. Es esencial llevar un seguimiento continuo de diferentes variables del proceso, tales como la temperatura, el pH, la agitación, el nivel de espuma, la concentración celular, entre otros. 5. Downstream processing: Es el conjunto de operaciones de separación y purificación de los productos, subproductos y residuos que quedan al final de la fermentación. Generalmente se utiliza la filtración, centrifugación, decantación; extracción líquido-líquido, cromatografía de afinidad, etc. 6. Tratamiento de efluentes: Si bien no tiene una relación directa con el producto, que es la razón de ser de la industria de fermentación, representa una etapa imprescindible porque es fundamental controlar la calidad del efluente que sale de la fábrica y que es enviado generalmente a un curso de agua, sea un canal, arroyo, un río o al mar.

12

Figura 3. Etapas de un proceso de fermentación.

Es importante tener en cuenta que todas las etapas de un proceso de fermentación deben estar íntimamente ligadas e integradas ya que es indispensable que el proceso sea optimizado globalmente. 2.1.4. FACTORES IMPORTANTES EN LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA (Palacios, 1956) Concentración de azúcares: Para la multiplicación inicial de la levadura, la concentración de azúcares debe mantenerse a niveles bajos, ya que la respiración del microorganismo puede verse afectada con grandes cantidades de azúcar. Oxígeno: En la fermentación, la presencia de oxígeno se traduce en una menor producción de alcohol, debido a que la levadura puede pasar a oxidar carbohidratos por medio de la respiración para obtener energía, generando un crecimiento celular acelerado pero mínima producción de etanol. Agitación: Es un factor que actúa disminuyendo la sedimentación de células, propiciando un contacto eficiente de los microorganismos con el sustrato. Temperatura: Influye directamente en el crecimiento de las levaduras y por tanto en la duración de la fermentación y en el metabolismo de las levaduras, que es el que determina la composición química del producto y la aparición o no de sustancias no deseadas. La temperatura durante la fermentación alcohólica se debe mantener entre 28 y 34°C. Como la fermentación alcohólica es un proceso exotérmico, es decir, se desprende energía en forma de calor, es necesario controlar el aumento de temperatura, ya que temperaturas mayores a 37°C aumentan el efecto inhibitorio del etanol, favorecen el desarrollo bacteriano y las levaduras comenzarían a morir deteniéndose el proceso fermentativo. 13

pH: Considerando que la levadura se desenvuelve perfectamente en medios ácidos, el mosto debe mantenerse a un pH óptimo de 4.5 para evitar el crecimiento de bacterias. Pero hay que tener cuidado porque a un pH por debajo de 4.2, alcohol etílico aumenta su tendencia a oxidarse hacia acido acético. Calidad de la levadura: El éxito o fracaso de un proceso fermentativo está relacionado con el microorganismo utilizado. Para los procesos de fermentación a escala industrial generalmente se busca que la cepa a utilizar sea genéticamente estable, con velocidad de crecimiento alta, que lleve a cabo el proceso fermentativo en un tiempo corto, entre otros. Contenido de alcohol: El máximo contenido de alcohol que se puede alcanzar en la fermentación es de 12% en volumen, ya que a concentraciones más altas ejerce un efecto antibacteriano contra la levadura. Otros nutrientes: Además de los azúcares, es de vital importancia que el medio disponga de una base nutricional adecuada para poder llevar a cabo la fermentación. Éste debe contar con una buena concentración de nitrógeno, fósforo, carbono, azufre, potasio, magnesio, calcio y vitaminas. El nitrógeno por ejemplo, es un factor clave para la multiplicación y la actividad fisiológica de la levadura, pues forma parte de la composición de los aminoácidos, de las proteínas estructurales y de las enzimas que intervienen en las reacciones metabólicas. El fósforo también es necesario porque hace parte de las moléculas de ADN, ARN y de los fosfolípidos en las membranas lipídicas de la levadura; además de ser utilizado para almacenar y transportar la energía mediante el ATP (Fajardo, 2007). La presencia de esteroles y ácidos grasos insaturados es también necesaria para la levadura, obteniéndolos inicialmente del mosto y posteriormente de las células madres. Esteroles y ácidos grasos insaturados de cadena larga son necesarios fundamentalmente para que sus membranas celulares puedan ser funcionales. 2.1.5. TIPOS DE PROCESOS FERMENTATIVOS A ESCALA INDUSTRIAL A través del tiempo se han ido implantando en las industrias diferentes modelos de fermentación, tales como: 

Sistemas Discontinuos

También llamados sistemas Batch o por lotes. El medio y el inóculo se mezclan en el fermentador al inicio del proceso y permanecen allí hasta que éste finalice. Puede considerarse como un sistema cerrado. La composición del medio, la concentración de sustrato, la concentración de biomasa y la concentración de metabolitos cambia continuamente como resultado del metabolismo de la célula (Doran, 1995). La fermentación alcohólica a nivel industrial se lleva a cabo principalmente por procesos discontinuos, donde la cinética propia del proceso permite que los equipos sean operados en intervalos y al final de la fermentación, la levadura puede ser recuperada y reutilizada.

14

Los procesos discontinuos presentan facilidad en sus operaciones, porque disminuyen los requerimientos para obtener su completa esterilización, evitando así, pérdidas financieras y facilitando el manejo de materias primas. Además se obtiene mayor concentración del producto final y la construcción y mantenimiento de la planta es sencillo. Sin embargo, existen desventajas como la baja productividad, porque hay que descargar las cubas y luego volverlas a llenar (tiempos muertos largos), dificultad en automatizar, y costos altos en mano de obra (Quintero, 1981). 

Sistemas Continuos

Hay una entrada continua de nutrientes al proceso y, al mismo tiempo, una salida constante de productos, alcanzando mayores productividades porque no hay tiempos muertos para limpiar equipos. Los procesos continuos tienen mayores ventajas frente a los procesos por lotes, debido a mayores rendimientos, facilidad en la automatización, menos mano de obra y se alcanzan condiciones de estado estacionario. El 30% de las plantas productoras de bioetanol en Brasil emplean el cultivo continuo (Monte Alegre, 2003). La clave de este proceso son las mayores densidades celulares, las cuales se pueden alcanzar por inmovilización de células, recuperación y reciclaje de biomasa o control del crecimiento celular. Sin embargo, las levaduras cultivadas por períodos prolongados en condiciones anaeróbicas disminuyen su capacidad de producir alcohol. Además, hay mayores riesgos de contaminación, por lo que requiere cuidados especiales que pueden incrementar costos del proceso. A tasas de dilución altas que garantizan productividades elevadas, el sustrato no alcanza a ser consumido completamente, por lo que se debe garantizar que los reactivos estén suficiente tiempo en contacto para que la reacción ocurra en la extensión que se desea (Hernández, 2007). Generalmente en la industria, aunque la productividad es importante, es más relevante la conversión del sustrato considerando que la mayor parte de los costos de producción corresponden a la materia prima (Sánchez, 2005). 

Sistemas Semicontinuos

Se adiciona medio de cultivo y varios nutrientes mientras los productos permanecen en el fermentador hasta el final del proceso. Es un método útil para células sensibles a altas concentraciones de sustrato, porque permite adicionarlo gradualmente (Doran, 1995).

15

Tabla 1. Productividad en la obtención de etanol para varias configuraciones.

2.1.6. OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO FERMENTATIVO La mayoría de las industrias que incluyen dentro de sus procesos la fermentación alcohólica, llevan un control estricto de ciertos parámetros que se ajustan a un rango óptimo de producción y aseguran un buen rendimiento global. Sin embargo, cuando se quiere optimizar el proceso fermentativo es necesario ir más allá de un simple control rutinario de la planta. La optimización apunta a reducir costos y aumentar la productividad utilizando diversas estrategias; implica valorar todos los factores que están influyendo en el proceso, desde una caracterización del sustrato que contiene los azúcares, hasta la evaluación del rendimiento de la levadura encargada de la transformación (Doran, 1995). De acuerdo a esto, cuando se piensa en optimizar las condiciones de operación del proceso fermentativo, se debe tener en cuenta parámetros como: -Tipo del fermentador. -Modo de operación (proceso discontinuo, continuo ó semicontinuo). -Tipo de células (nativas ó genéticamente modificadas). -Medio de cultivo (más económico, pero que contenga todos los nutrientes necesarios en una proporción adecuada). -Condiciones de operación óptimas. -Control de variables.

16

2.2.

AGENTES DE LA FERMENTACIÓN: Levaduras

Debido a que el éxito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el microorganismo utilizado, la elección del mismo es un elemento clave que ha sido objeto de numerosas investigaciones. Entre los muchos microorganismos que han sido utilizados para la producción de etanol, Saccharomyces cerevisiae es sin duda alguna la levadura de mayor uso a nivel industrial. Es un organismo de fácil manipulación y recuperación, no es exigente en cuanto a su cultivo, tolera altas concentraciones de etanol y de azúcares, en la fermentación produce bajas concentraciones de subproductos y es osmotolerante (Fajardo, 2007). Sin embargo, bacterias como Zymomonas mobilis también se han estudiado durante las últimos tres décadas, mostrando rendimientos superiores a las levaduras en ciertas condiciones (Bai, 2008). 2.2.1. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Las levaduras son hongos unicelulares, de forma oval o cilíndrica. Normalmente no desarrollan micelio como los hongos filamentosos, sino que permanecen en estado unicelular durante todo el ciclo de crecimiento. Sin embargo, algunas como Candida albicans o incluso Saccharomyces cerevisiae, pueden formar micelio bajo ciertas condiciones (Brock & Madigan, 1991). Las células de levadura son mucho más grandes que las bacterianas y pueden distinguirse no sólo por su tamaño sino por la presencia obvia de elementos intracelulares tales como el núcleo. Una célula de levadura tiene pared celular integrada por polímeros de glucosa y manosa, con cantidades pequeñas de proteínas, lípidos y quitina. No contiene flagelos u otros órganos de locomoción (Nieto, 2009). Las levaduras más importantes desde el punto de vista comercial son las cepas panaderas y productoras de alcohol, las cuales prosperan en hábitats con abundante azúcar, tales como frutas y zumos de frutas. Sin embargo, las levaduras de hoy en día son bastante diferentes de las cepas silvestres, debido muchas veces a la manipulación genética que ha prosperado a través de los años (Brock & Madigan, 1991). 2.2.2. REPRODUCCIÓN La reproducción de las levaduras se lleva a cabo de dos formas: asexualmente por gemación y por reproducción sexual. La reproducción por gemación es la forma más común y es un proceso en el cual, la llamada célula madre desarrolla una pequeña yema que va aumentando de tamaño gradualmente hasta separarse, dejando una cicatriz en la madre como se observa en la figura 4. Una célula de levadura puede generar alrededor de 25 células hijas. La producción sexual se realiza mediante el cruce de esporas, cuando las condiciones de vida son desfavorables, como temperaturas extremas, sequedad excesiva, entre otras (Murillo, 2003). 17

Figura 4. Saccharomyces cerevisiae.

2.2.3. FASES DE CRECIMIENTO El ciclo de crecimiento de levaduras y la cinética de fermentación, puede ser representado mediante una curva, como ilustra la figura 5, donde se aprecian seis fases de desarrollo (Hidalgo, 2002): 1. Fase de latencia: La población de levaduras no aumenta, pues no se producen multiplicaciones celulares, estando las levaduras adaptándose al medio fermentativo. 2. Fase de aceleración: Las levaduras empiezan a multiplicarse, encontrándose una población de unas 105 células/ml. Esta fase junto con la anterior transcurre en pocas horas (4 horas aproximadamente) dependiendo del tipo de proceso y de la temperatura, y termina cuando el mosto se satura de CO2. 3. Fase de crecimiento exponencial: La población de levaduras crece exponencialmente, coincidiendo el número de células totales con las vivas. Cuando se utilizan soluciones nutritivas complejas, frecuentemente se producen dos fases logarítmicas separadas por una fase de latencia. Este proceso se denomina crecimiento diaúxico y se produce debido a que uno de los dos substratos se cataboliza preferentemente. Las enzimas para el catabolismo de los otros sustratos se inducen sólo después de que el primer sustrato haya sido completamente metabolizado. 4. Fase de ralentización del crecimiento: Corresponde a la terminación de la fase anterior, donde debido a “factores limitantes” del medio fermentativo, la población de levaduras deja de crecer, alcanzando un valor aproximado de 100 millones de células por ml. Prácticamente la totalidad de las levaduras están vivas y por lo tanto activas. 5. Fase estacionaria: El crecimiento s nulo, las levaduras no se multiplican, pero la población permanece activa durante cierto tiempo. Debido a la lisis se liberan nuevos sustratos que pueden servir como fuente de energía para el crecimiento lento de los supervivientes. 6. Fase de declive: Transcurre durante un tiempo mucho más largo que el de la fase de crecimiento. La población de levaduras totales disminuye rápidamente, pero son las 18

levaduras vivas las que sufren una importante reducción, debiendo éstas terminar de transformar los últimos azúcares del mosto en condiciones cada vez más adversas. Las células mueren y por autolisis comienzan a excretar al medio las sustancias que contienen. El desarrollo de la fermentación alcohólica está íntimamente ligado a la fase de crecimiento de las levaduras, de tal modo que cuando los mostos son muy ricos en azúcares, una buena parte de la fermentación tiene que realizarse con levaduras en la fase de declive, pudiendo entonces surgir problemas para finalizarla. La razón por la cual las levaduras no se siguen multiplicando no suele estar en una carencia nutricional del medio fermentativo, sino más bien en la aparición de uno o varios “factores limitantes” que frenan el crecimiento de las células. Entre estos factores cabe destacar la acumulación en el medio de sustancias segregadas por las levaduras, que a ciertos niveles pueden ser tóxicas para ellas mismas, como la acumulación de alcohol o de ácidos grasos de cadena media, que dificultan o impiden el transporte de sustancias a través de las membranas celulares.

Figura 5. Curva de crecimiento de las levaduras.

2.2.4. FACTORES QUE INHIBEN A LAS LEVADURAS Durante la fermentación de etanol, las células de levadura sufren varios tipos de estrés. Como muestra la figura 6, algunos son de carácter ambiental, tales como la deficiencia o agotamiento de nutrientes indispensables, las altas temperaturas y la contaminación, mientras que los otros son del metabolismo de la célula de levadura, tales como la acumulación de etanol y la formación de sustancias inhibitorias tras la fermentación (Bai, 2008).

Figura 6. Factores que inducen al estrés de S. cerevisiae durante la fermentación alcohólica.

19



Efecto del etanol

El etanol es el principal producto de la fermentación de azúcares. Sin embargo, a diferentes concentraciones el etanol puede ser tóxico para la levadura. A bajos niveles de etanol, el ATP producido por la conversión de la glucosa se utiliza para la asimilación de más azúcar por nuevas células y la velocidad de crecimiento es alta. A niveles mayores de etanol, es decir, a medida que procede la fermentación, suceden dos cosas: primero la velocidad de utilización del sustrato disminuye y segundo, la tasa a la que la degradación del azúcar proporciona energía para el crecimiento de las levaduras disminuye. Al elevarse los niveles de etanol, los efectos sobre el crecimiento de la levadura son mayores que los efectos sobre la velocidad de producción de etanol. El etanol causa provoca una alteración de la organización y permeabilidad de la membrana plasmática del microorganismo, lo cual conduce a la salida obligada de cofactores esenciales y coenzimas. También puede provocar la inhibición y desnaturalización de proteínas intracelulares y enzimas glicolíticas, inhibición del transporte de azúcares y aminoácidos, aumento de muerte térmica y mutaciones (D'Amore & Stewart, 1987). 

Efecto del azúcar

El exceso de azúcar puede paralizar o impedir la fermentación, pues bajo estas condiciones osmófilas las levaduras estallarían, buscando expulsar el agua de su interior para equilibrar las concentraciones de solutos en el exterior y en el interior de la célula, lo que se conoce como una plasmólisis. Además, si el nivel inicial de azúcar es suficientemente alto, el nivel de alcohol se hace finalmente tan alto que las células dejan de crecer y comienzan a morir. 

Efecto de la temperatura

Las levaduras son microorganismos mesófilos, esto hace que la fermentación pueda tener lugar en un rango de temperaturas desde los 13 ºC hasta los 35 ºC. La temperatura ejerce un efecto marcado sobre el crecimiento de la levadura (figura 7). Por un lado cada reacción química individual, de todas las que conforman el metabolismo, es afectada por la temperatura, por lo que un incremento de ésta resulta en una mayor velocidad de reacción y en la formación de productos secundarios. Por otra parte, aumentos posteriores de temperatura inactivan las enzimas que catalizan las reacciones, con lo que la tasa de crecimiento celular decrece rápidamente (Murillo, 2003).

20

Figura 7. Influencia de la temperatura en la actividad de las levaduras.

2.2.5. REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES Los nutrientes son sustancias que después de pasar por la membrana celular se emplean como material para sintetizar algunas estructuras celulares o para que la célula obtenga energía. Las levaduras necesitan los mismos elementos químicos que otros seres vivos como son carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrógeno, fósforo, potasio, azufre, magnesio, hierro, zinc, manganeso, cobre y molibdeno. Los últimos cinco elementos se necesitan en cantidades mínimas como componentes o activadores de enzima (Carpenter, 1969). La concentración de nutrientes puede afectar tanto a la velocidad de crecimiento, como al rendimiento del crecimiento del organismo. El efecto de la concentración de nutrientes sobre la producción de células es fácil de comprender: si el nutriente se convierte en material celular, cuanto más nutriente haya, mayor será la producción de células. La razón para reducir la velocidad de crecimiento a concentraciones muy bajas de nutriente, es porque no se puede transportar ese nutriente al interior de la célula con suficiente rapidez para satisfacer las demandas metabólicas del nutriente y la velocidad de crecimiento es proporcional a la concentración de dichos nutrientes; sin embargo, a estas concentraciones bajas, el nutriente es utilizado para la proliferación (Brock & Madigan, 1991). Los principales nutrientes y las formas más comunes de satisfacerlos son (Carballo, 2000; Gamazo, 2005): 1. Carbono: Sirve como fuente de energía y como material constitutivo de masa celular. Saccharomyces cerevisiae usa hexosa, glucosa, fructosa y manosa. 2. Nitrógeno: Este elemento es un constituyente importante en los medios de cultivos para promover el crecimiento, ya que está representado en un 10% del peso de las levaduras. Saccharomyces cerevisiae es capaz de utilizar este elemento en forma de ión amonio. Estos iones pueden ser aportados por el cloruro de amonio, nitrato de amonio, fosfato de amonio y el sulfato de amonio. Otra fuente de amonio son los aminoácidos, dipéptidos, tripéptidos y la urea.

21

3. Fósforo: Es esencial para el crecimiento, regula la síntesis de los lípidos y los carbohidratos y mantiene la integridad de la pared celular. El fósforo es asimilado por la célula en forma de ion fosfato. La fuente de fósforo en el medio de cultivo está constituida por el dihidrogenofosfato de potasio o por el dihidrogenofosfato de sodio. 4. Azufre: Constituye el 0.4% del peso seco de la levadura. Las fuentes de amonio son el sulfato de amonio, el sulfito y el tiosulfito; la metionina puede ser utilizada como fuente única de azufre y permite un crecimiento más rápido que los iones sulfatos. 5. Potasio: A pH ácido estimula la fermentación y la respiración, actúa como efector de numerosas enzimas; piruvato quinasas, aldolasas, aldehídos deshidrogenosas, y permeasas e interviene en la estructura de los ARN. Las fuentes de potasio son el cloruro de potasio y los fosfatos mono y dipotásico. 6. Magnesio: Es activador de las enzimas glucolíticas, estimula la síntesis de los ácidos grasos, regula las ATPasas de la membrana y participa con el potasio en la penetración del fosfato. El magnesio es aportado en los medios de cultivos en forma de sulfato o de cloruro de magnesio. 2.2.6. INCORPORACIÓN DE AZÚCARES La levadura Saccharomyces cerevisiae no puede asimilar directamente la sacarosa que está presente en las melazas de caña de azúcar. Por eso utiliza la enzima invertasa, también conocida como sacarasa, la cual desdobla la sacarosa en fructosa y galactosa, monosacáridos fácilmente digeribles. La levadura posee dos tipos de invertasa, una interna y otra externa. La función de la enzima interna aún no es muy clara. Pero se conoce que la enzima externa, que se encuentra en el espacio periplasmático de la célula, es la empleada por la levadura para hidrolizar la sacarosa (Zech & Görisch, 1995). Después de la hidrólisis, es necesario que los azúcares fermentables entren en el interior del citoplasma celular de las levaduras, donde se localizan los sistemas enzimáticos que hacen posible la fermentación alcohólica. Para ello las levaduras incorporan las hexosas obtenidas (glucosa y fructosa) a través de un mecanismo de difusión facilitada, cuya denominación responde a que es necesaria la presencia de una proteína transportadora (permeasa) que facilita la difusión de estos azúcares a través de las membranas. La fricción de entrada de los azúcares al interior de la célula es responsable del calor generado en el proceso fermentativo junto con la fricción de salida de los productos generados a través de las membranas celulares, de forma que se va generando calor, el cual es necesario controlar mediante sistemas de refrigeración. 2.2.7. FLOCULACIÓN La floculación de levaduras es una agregación de células no sexual y reversible en la que éstas se adhieren entre sí para formar flóculos como mecanismo de defensa en respuesta a diversos factores adversos. Los flóculos contienen un gran número de células que 22

rápidamente se sedimentan en la parte inferior del sustrato líquido de crecimiento (Bauer, 2010). Se debe diferenciar entre la floculación y las otras dos formas de agregación celular en levaduras: la aglutinación sexual y la formación de cadena. En la primera, células haploides de sexo a y  intercambian feromonas o factores a y , y se agregan antes de la fusión celular que formará células diploides. Esto se da mediante aglutininas presentes en la pared celular. Mientras que la formación de cadenas es causada por un fallo en la separación de las células hijas de las células madre. Las células siguen creciendo en cadenas que pueden llegar a tener hasta 100 células (Jin, 1998). Las proteínas responsables de la adhesión de células a otras células en la floculación o a superficies abióticas se denominan adhesinas o floculinas (son proteínas tipo lectinas), se encuentran en la pared celular y son activadas por el ión calcio. Los extremos de estas proteínas son hidrofóbicos. El extremo C-terminal es necesario para el anclaje en la pared celular mientras que el extremo N-terminal reconoce azúcares (Domingues, 2000). Los tipos de adhesión que se han determinado son: adhesión tipo lectina y adhesión no sensible a azúcar. El primero se da por la interacción de las adhesinas y los residuos de azúcar (manosa, glucosa, sacarosa o maltosa) de las paredes célulares de otras células (ver figura 8), mientras que el segundo depende de la unión de las adhesinas a péptidos o de interacciones hidrofóbicas entre las células y las superficies abióticas. Como los residuos de manosa siempre estás presentes en las paredes de las células de levadura, sean floculantes o no, el factor crítico de floculación es claramente la presencia o ausencia de adhesinas. Sin embargo, en algunos casos, la floculación no sólo depende de la presencia de adhesinas, sino que también requiere aglutininas y/o estructuras tipo fimbrias. Incluso en algunas cepas de levadura, la floculación no se altera con la adición de manosa y es independiente del calcio. Algunos de los factores que pueden inducir la floculación de levaduras son: temperatura, pH, agotamiento de nutrientes, concentración de etanol, presencia de iones inorgánicos, aireación, agitación, tamaño y edad de las células, entre muchos otros (Jin, 1998). La industria cervecera saca ventaja de la floculación de Saccharomyces cerevisiae como una forma simple y barata de separar las células de levadura del producto de la fermentación con el fin de volverlas a usar en un nuevo proceso. Sin embargo, aunque se desea que haya floculación al final de la fermentación, a veces las células floculan antes de que ésta finalice (se presenta floculación prematura), lo que genera fermentaciones perezosas (lentas) y, en ocasiones, malos sabores en el producto final. Por lo tanto, lo ideal es que la levadura flocule al final de la fermentación (Domingues, 2000; Zhao, 2009).

23

Figura 8. Floculación de levaduras mediante lectinas.

2.2.8. LEVADURAS COMERCIALES En las industrias de fermentación alcohólica, el uso de levaduras autóctonas es considerado beneficioso debido a que estas ya se encuentran adaptadas al sustrato y generalmente producen metabolitos secundarios que son responsables del aroma y sabor de la bebida, pero estas generalmente presenta una productividad baja. Es por ello, que muchas industrias generalmente buscan levaduras comerciales que presenten altos rendimientos y que puedan adaptarse rápidamente a las condiciones fisicoquímicas del proceso. El uso de levaduras comerciales aporta una mayor continuidad en la calidad de los vinos obtenidos, porque al crecer en el mosto, la levadura no solo transforma los azúcares en etanol sino que también aporta otros productos de su propio metabolismo. Entre ellos cabe mencionar el glicerol, y multitud de compuestos aromáticos, todos ellos importantes para la calidad del producto final. El uso de levaduras comerciales seleccionadas por su adecuación para la producción permite obtener altos rendimientos. Entre las cepas de levaduras que actualmente se comercializan de Saccharomyces cerevisiae se encuentran: Safdistil C-70 y Ethanol RedTM de SC Enzymes & Derivates S.A., Trockenhefe y Fali de SC Protect Consult SRL, Pakmaya de SC Pakmaya S.A. y otras (Patrascu, 2009).

24

2.3.

SUSTRATOS DE LA FERMENTACIÓN

Para que una sustancia sea fermentable ha de contener energía utilizable por un sistema enzimático microbiano. Los azúcares o hidratos de carbono en general son los compuestos universalmente utilizados como sustratos de las fermentaciones, bien en forma de mono o polisacáridos. En algunos procesos industrializados, se utiliza sacarosa, glucosa o lactosa, pero a veces su alto coste hace poco rentable el procedimiento y se aprovechan entonces los hidratos de carbono contenidos en residuos, tanto agrícolas como industriales. Productos agrícolas pueden dar azúcares fermentables mediante hidrólisis enzimática o ácida y se usan en procesos industriales de fabricación de bebidas alcohólicas (Underkofler & Hickey, 1954). Los componentes empleados en las industrias de fermentación son generalmente complejos, siendo importante considerar diferentes aspectos como el costo de los mismos, la disponibilidad y la estabilidad en su composición química. El sustrato debería poseer las siguientes características (López, 2006): 

La concentración de azúcares fermentables debería estar correctamente ajustada a un método particular de fermentación, para asegurar que los azúcares residuales después del proceso sean mantenidos a un nivel mínimo.



El sustrato debe contener los nutrientes adecuados para levadura, no sólo en cuanto al contenido de azúcares, sino también algunos iones necesarios para el desarrollo óptimo de los microorganismos, como nitrógeno y fósforo.



Como los microorganismos diferentes de los del inoculó principal deben ser eliminados por pasteurización, tratamiento con antibióticos, o esterilización, el sustrato debe resistir cambios drásticos de temperatura sin que sus composición pierda propiedades iniciales.



Las sustancias del sustrato no deben ser reactivas, pues muchas veces se emplean ácidos y bases para ajustar el pH al que trabajan las levaduras y pueden generarse reacciones indeseables.



Los efectos adversos de la presión osmótica deberían mantenerse dentro de límites aceptables.

25

2.3.1. TIPOS DE SUSTRATOS Varios autores, coinciden en definir tres tipos de materias primas para la producción de etanol: 2.3.1.1. MATERIALES QUE CONTIENEN ALMIDÓN COMO FUENTE DE AZÚCARES Este sustrato consta de hidratos de carbono complejos, como el almidón, que primero se deben convertir en azúcares fermentables mediante hidrólisis enzimática o ácida. Incluye todos los cereales desde maíz, arroz, trigo, centeno, cebada, entre otros, hasta tubérculos como la yuca y la papa. La reacción de hidrólisis que experimenta el almidón se puede resumir a través de la siguiente ecuación:

2.3.1.2. MATERIALES QUE CONTIENEN CELULOSA COMO FUENTE DE AZÚCARES La alternativa de emplear residuos lignocelulósicos en la producción de etanol, constituye hoy día una posibilidad altamente prometedora por su amplia disponibilidad en el mundo. La existencia en los diversos países iberoamericanos de abundantes recursos lignocelulósicos, justifica la dedicación por estas naciones de un esfuerzo importante al desarrollo y adaptación de tecnologías tendientes a la utilización integral y racional de los mismos. La idea de producir etanol a partir de esta vía data de las décadas de 1940 y 1950, y su producción se ha llevado a escala comercial en algunos países, principalmente del mundo desarrollado. Las principales fuentes de esta materia prima son: -Madera: Residuos primarios del bosque, bosques vírgenes, plantaciones. -Residuos Agrícolas: Se obtienen del procesamiento de cereales (trigo, arroz, cebada), bagazo (caña de azúcar, sorgo dulce). -Residuos Municipales. -Residuos de papel. El proceso de fermentación alcohólica a partir de materiales celulósicos es el más complejo, debido a que estas fuentes contienen mezclas de celulosa, hemicelulosa y lignina. Los principales métodos para extraer los azúcares fermentables son: hidrólisis con ácidos concentrados, hidrólisis con ácidos diluidos e hidrólisis enzimática.

26

2.3.1.3. MATERIALES QUE CONTIENEN CARBOHIDRATOS COMO FUENTE DE AZÚCARES Son materias primas que poseen un alto contenido de azúcares simples y fermentables, como la glucosa, la fructosa, la galactosa y la sacarosa. Las más importantes incluyen jugo de caña de azúcar, melazas, sorgo dulce, frutas y azúcar de remolacha. La ventaja de utilizar este tipo de fuentes consiste en que no es necesario realizar tratamientos previos para obtener los azúcares fermentables, ya que estos se encuentran presentes.

Figura 9. Diferentes sustratos utilizados para la producción de etanol.

2.3.2. MELAZA DE CAÑA DE AZÚCAR Dentro de las materias primas azucaradas más favorables para la fermentación está la miel final de caña (melaza). La melaza es el subproducto de la industria azucarera del cual se ha sustraído el máximo contenido de azúcar. Es un líquido espeso, de aspecto similar al de la miel aunque de color parduzco muy oscuro, prácticamente negro. El sabor es dulce, ligeramente amargo. Para países grandes productores de azúcar de caña tiene una importancia primordial la utilización de esta miel final como fuente de carbono para la fermentación alcohólica, debido a su alta disponibilidad y a sus bajos precios. Sin embargo, ampliando la posibilidad de disponer de nuevas materias primas se han realizado estudios de modelación y optimización de la etapa fermentativa usando diferentes sustratos, tales como vinazas y jugo de los filtros mezclados con miel final en diferentes proporciones (Hernández, 2007).

27

2.3.2.1.

CLASIFICACIÓN

La Asociación Americana de Control Oficial de Alimentos (AAFCO), recomienda diferentes clasificaciones para las melazas, según el azúcar total y el contenido de humedad, así (Castro, 1993): 

Melaza Superior Blackstrap: Melaza de caña que contiene 23,4% de agua o menos y 53,5% o más de azúcares totales.



Melaza Blackstrap: Melaza compuesta por 23,5% a 26,4% de agua y 48,5% a 53,4% de azúcares totales.

Otra clasificación de las melazas, se da por los grados Brix, de la siguiente manera (Castro, 1993): 

Melaza Blackstrap: Es el subproducto de la elaboración del azúcar, cuyo porcentaje de materia sólida en peso (grados Brix) diluido con igual peso de agua, es de 42,5°Brix.



Melaza de Caña Alimentaria: Es la melaza Blackstrap diluida con agua, hasta una concentración en grados Brix, no menor de 39,75.



Melaza High Test o Jarabe Invertido: Es el producto obtenido por la concentración el jugo clarificado, hasta un porcentaje de materia sólida en peso de 85% e invertido con ácido o con invertasa.

2.3.2.2.

COMPOSICIÓN

La composición de la melaza es muy heterogénea y puede variar considerablemente dependiendo de la variedad de caña de azúcar, características físico-químicas y microbiológicas del suelo, grado de humedad (ambiente y suelo), clima, periodo de cultivo, estado de madurez de la plantación, grado de despunte del tallo, fertilización aplicada, eficiencia de la operación de la fábrica, sistema de ebullición del azúcar, tipo y capacidad de los evaporadores, entre muchos otros, por lo que la reproductividad de las fermentaciones no es igual (Arévalo, 1998). Las melazas de caña de azúcar contienen sacarosa, que representa las dos terceras partes del total de su contenido de azúcar, el resto es glucosa y fructosa. Proveen azúcar como fuente de carbono y energía y además son fuente de algunos compuestos orgánicos, vitaminas, aminoácidos, minerales y otros elementos traza (Fajardo, 2007), como se observa en la tabla 2.

28

Tabla 2. Composición de la melaza de caña de azúcar.



Azúcares

Los principales azúcares en la melaza son la sacarosa (60-63% en peso), la glucosa o dextrosa (6-9% en peso), y la fructosa o levulosa (5-10% en peso). Estas dos últimas constituyen la mayor porción de los azúcares reductores encontrados en los análisis. La fructosa puede sufrir transformaciones al igual que la glucosa, debido a reacciones dependientes de la temperatura. El contenido de glucosa y fructosa en las melazas puede variar a causa de la hidrólisis de la sacarosa, pH y temperaturas altas (Castro, 1993). 

No Azúcares

Los no azúcares están compuestos por 33% de sustancias inorgánicas; 42% de sustancias nitrogenadas (aminoácidos, péptidos, colorantes); y 25% de sustancias orgánicas libres de nitrógeno (ácidos carboxílicos, fenoles, ésteres, vitaminas, gomas y dextranos) (Castro, 1993). 

Cenizas

En general la composición de las cenizas de las melazas, es cualitativamente similar a la del jugo de caña del cual se obtienen. El contenido de hidróxido de potasio (también conocido como potasa cáustica) varía alrededor del 40% del peso del carbono total de la ceniza, el contenido de cal es de 10% a al 20%, el de sulfatos varía entre el 10 y el 20%, y las sales de 29

magnesio, sodio, aluminio, la sílice, los cloruros, fosfatos y los óxidos de hierro, completan el resto del contenido de cenizas (Castro, 1993). 

Ácidos

El ácido aconítico, es el más abundante de los ácidos orgánicos presentes en la melaza y representa aproximadamente el 6% del peso de sólidos en esta. Los ácidos málico y cítrico están presentes en cantidades apreciables. El ácido fórmico está presente como producto de descomposición. La mayoría de estos ácidos son metabolizados por los microorganismos, como fuente de carbono y no presentan problemas de inhibición (Castro, 1993). 

Vitaminas

Aquellas vitaminas resistentes a la acción del calor y de los álcalis, se encuentran en la melaza. La niacina, ácido pantoténico y riboflavina, importantes para el crecimiento microbiano, pueden estar presentes en cantidades significativas y otras vitaminas lo están en cantidades muy pequeñas (Castro, 1993). 

Fenoles y Compuestos volátiles

Los fenoles presentes en las mieles finales, provienen de la parte fibrosa de la caña y se derivan de los ácidos hidroxicinámico y parahidroxibenzóico. Es necesario tener en cuenta, que desde el punto de vista de la fermentación, algunos fenoles son indeseables, por presentar actividad inhibitoria sobre el crecimiento de los microorganismos (Castro, 1993). 

Compuestos nitrogenados

Están constituidos principalmente por aminoácidos mono y dibásicos, amidas ácidas, betaínas y pequeñas cantidades de peptonas y nitratos. Cuando los azúcares reductores, glucosa y fructosa, son sometidos a los procesos de clarificación, en el tratamiento subsiguiente, se producen varias reacciones, siendo la más importante la de los aminoácidos con estos azúcares, en la cual se forman productos coloreados como las melanoidinas y los residuos fermentables a los cuales se les ha encontrado un contenido aproximado de 68% de nitrógeno combinado, en melazas. El nitrógeno total de las melazas, varía entre 0,4 % y 1,5 % del peso total de la melaza (Castro, 1993). 

Antisépticos

Los más utilizados a nivel industrial son los sulfatos y el ácido sulfúrico. El ácido sulfúrico permite el desdoblamiento de la sacarosa (inversión de la sacarosa), la precipitación de los cationes de calcio y magnesio en forma de sulfatos (ya que estos son ligeramente tóxicos para la levadura) y la disminución del pH y evita crecimiento de bacterias (Murillo, 2003). 

Otros

Con respecto a componentes extraños, que pueden afectar el rendimiento de la levadura durante la fermentación, se han detectado en las melazas algunos pesticidas en el caso de 30

melazas de caña como lindane, aldrin, heptaclor, dieldrin, etc. en cantidades variables desde trazas hasta 0.21mg (Ertola, 2007). 2.3.2.3. 

PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS

Viscosidad

Los compuestos orgánicos no azúcares, tienen un profundo efecto sobre la viscosidad de las melazas, pues constituyen componentes de alto peso molecular que la aumentan considerablemente. En enriquecimiento de calcio aumenta la viscosidad, mientras que un incremento en potasio, la disminuye (Swan & Karalazos, 1990). El efecto de la concentración y la temperatura sobre la viscosidad de las melazas, tiene importancia práctica cuando se necesita pasarla a través de tuberías. La viscosidad de la melaza es reducida ampliamente al calentarla. Por ejemplo, al elevar la temperatura de la melaza de 23º C a 27º C (un aumento sólo del 4%) reducirá la viscosidad de la melaza en un 50% (Zinn, 2002). 

pH

Las melazas de caña son ligeramente ácidas, tienen un pH entre 5,5 y 6,5; un pH bajo es atribuible a la presencia de ácidos alifáticos. El pH de las melazas cambia con la temperatura y depende también de la naturaleza y de la cantidades de sustancias tampón o estabilizadoras de pH que posea (Swan & Karalazos, 1990). 

Densidad

En la práctica, la densidad se determina mediante equivalencia con la concentración en grados Brix. Además, para su determinación se usan tres instrumentos densimétricos: el hidrómetro, la balanza de Westphal y el picnómetro, de los cuales el primero es el más utilizado (Swan & Karalazos, 1990). La melaza con 80% de sólidos totales tiene una densidad de 1450 Kg/m3 (Gnecco, 2006). 2.3.2.4.

CONTENIDO MICROBIANO

Un aspecto importante en la calidad de las mieles finales es su contenido microbiano. Se ha demostrado que las melazas, a pesar de su bajo contenido en nitrógeno y fósforo, constituyen un buen medio nutritivo para muchos microorganismos, tales como levaduras, hongos y bacterias (Ariza & González, 1997). Entre la microflora encontrada en las mieles finales, se hallan el Bacillus subtilis, el Lactobacillus, que puede resistir temperaturas cercanas a 90°C y algunos Micrococos, que resisten las operaciones fabriles, entre otros. Los hongos filamentosos presentes en los jugos parecen no resistir las condiciones de fabricación, puesto que no aparecen en la microflora de las mieles finales. Algunas levaduras se han aislado de las mieles, tales como 31

la S. pombe, Saccharomycodes rousii y Candida tropicalis, entre otras. En resumen, se puede decir que la microflora de las mieles finales está formada principalmente por bacterias (Hernández, 2007). 2.3.2.5.

TRATAMIENTOS PREVIOS (Arévalo, 1998)

- Las melazas tienen aproximadamente unos 80ºBrix, por lo que muchas veces es conveniente diluir el medio con agua hasta llegar a unos 50 o 40ºBrix para facilitar el transporte del sustrato de un lugar a otro. - Las melazas son sometidas a un incremento en la temperatura de hasta 100-120°C, con el fin de esterilizar el medio y eliminar la flora microbiana que puede contaminar a la levadura de interés. La esterilización se realiza por inyección de vapor directa, a la presión atmosférica en la mayor parte de los casos. No se debe calentar excesivamente o almacenar por prolongados tiempos, porque se pueden caramelizar los azúcares fermentables de la melaza. - En algunas industrias se hace un paso previo de clarificación de las melazas antes de la fermentación, porque éstas poseen una gran cantidad de sólidos y materiales insolubles que pueden interferir con el rendimiento del proceso y con el funcionamiento de los equipos. En particular el calcio suspendido, las sales inorgánicas, los coloides, fibras, gomas, ácidos orgánicos y los residuos de tierra deberían ser eliminados hasta un nivel razonable. Se han mencionado como ventajas de utilizar sustratos clarificados que la levadura es más fácil de recuperar. Además, la clarificación probablemente facilita la transferencia de O2 en el medio y reduce la formación de espuma. - Como las melazas presentan deficiencia de fuentes de nitrógeno, el medio líquido debe ser suplementado con amonio, urea, sales de amonio o fosfato y una adición de minerales de calcio, magnesio y trazas de elementos como zinc, molibdeno, níquel y otras vitaminas. 2.3.2.6.

ALMACENAMIENTO

Durante el almacenamiento de la melaza, se presentan cambios como pérdida de sacarosa, ganancia de azúcares reductores, incremento del porcentaje de compuestos orgánicos no azúcares, pérdida de sólidos totales y gran incremento del color; esto debido a la reacción de sustancias orgánicas inestables con los azucares reductores, que forma impurezas coloidales coloreadas, con alto contenido de carbono. Para reducir estos cambios se debe enfriar la melaza recién centrifugada, a la menor temperatura posible antes de ser almacenada. También se debe realizar una limpieza periódica de los tanques de almacenamiento ya que los sólidos sedimentables se adhieren y se compactan con facilidad principalmente en el fondo (Honig, 1974).

32

2.4.

AZÚCARES

Se llama azúcares a los diferentes carbohidratos que generalmente tienen sabor dulce. Los carbohidratos, moléculas formadas por carbono, hidrogeno y oxígeno, se presentan como monosacáridos (azucares simples), oligosacáridos (contienen de dos a diez unidades de monosacáridos) y polisacáridos (glúcidos poliméricos más grandes). Los monosacáridos existen principalmente en forma cíclica, pero debido a que en solución acuosa están en equilibrio con la forma de cadena abierta, el grupo carbonilo presente en ellos podrá dar positiva varias de las pruebas para el reconocimiento de aldehídos y cetonas. Así los carbohidratos pueden ser oxidados con facilidad para producir los ácidos carboxílicos correspondientes, por ello, se denominan azúcares reductores (reductor porque el azúcar reduce al agente oxidante). Pero sólo las estructuras abiertas son responsables de su actividad reductora. Todos los monosacáridos, aldosas o cetosas y la mayoría de los disacáridos son azúcares reductores, excepto la sacarosa, porque uno de sus dos carbonos anoméricos no está formando enlace glucosídico (Berg, 2008). Los azúcares reductores totales son la suma de los azúcares reductores y no reductores, es decir, la glucosa, la fructosa más la sacarosa invertida. 

Sacarosa

La sacarosa es un disacárido producido por la condensación de la glucosa y la fructosa y tiene la fórmula empírica C12H22O11 (peso molecular 342.30 g/mol). Es muy soluble en agua, como lo son casi todos los azúcares. Se hidroliza con facilidad en soluciones ácidas a velocidades que aumentan notablemente con la temperatura, produciendo cantidades equimolares de glucosa y fructosa (figura 10). Esta reacción hidrolítica produce un cambio en la actividad óptica dextrógira propia de la sacarosa a una actividad neta levógira. A la mezcla equimolar se conoce le como azúcar invertida.

Figura10. Hidrólisis de la sacarosa.

La sacarosa es el azúcar de uso domestico e industrial y es el más común en el reino vegetal. La sacarosa se encuentra en todas las partes de la planta de la caña de azúcar donde se almacenan en las vacuolas de la célula, siendo más abundante en el tallo y menos 33

abundante en las regiones que se encuentran en crecimiento activo, especialmente en las porciones de las bandas del extremo del tallo y las hojas enrolladas (Herrera, 2011). 

Glucosa

La glucosa es un monosacárido, tiene la fórmula C6H12O6 (peso molecular 180.16 g/mol). Las moléculas de glucosa se condensan en diferentes maneras para formar almidón, dextrano y celulosa. La glucosa es menos soluble en agua que la sacarosa. La glucosa es metabólicamente el azúcar más importante en las plantas y los animales, y su amplia distribución tanto en el reino vegetal como en el reino animal esta indicada por sinónimos como el azúcar de maíz, azúcar de uva y azúcar de la sangre. Sólo en la proporción de crecimiento activo en la planta el contenido de la glucosa excede al de la sacarosa (Herrera, 2011). 

Fructosa

Llamada también azúcar de frutas, su fórmula empírica es C6H12O6 (peso molecular 180.16g/mol). La fructosa es más dulce que la sacarosa y la glucosa; de las tres es la menos abundante en la caña. A semejanza de la glucosa es más abundante en las partes en crecimiento de la planta y menos abundante en la parte inferior del tallo y las raíces. Al igual que la glucosa la fructosa es un azúcar reductor, pero posee un grupo cetona en lugar de aldehído con el oxígeno fijado en el carbono 2 en lugar de estar en el carbono 1 (Herrera, 2011). 2.4.1. MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES Muchos métodos se han reportado en la literatura, cada uno con sus ventajas y desventajas respectivas. El método de Fehling, por ejemplo, se ha aplicado desde mucho tiempo atrás en numerosas industrias y ha demostrado ser exacto y preciso en la determinación de azúcares reductores en mieles, pero tiene como principal inconveniente el ser un método volumétrico donde el punto final de la valoración se detecta por cambio de color, además es un método poco productivo (Biart, 1976). Sumner y colaboradores desarrollaron otro método utilizando el ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) para calcular la concentración de azúcares reductores en distintos materiales. El procedimiento se basa en una reacción redox que ocurre entre el DNS y los azúcares reductores presentes en la muestra. Este método ha sufrido varias modificaciones a través de los años para adecuarse al análisis de diferentes materiales y su principal ventaja radica en su alta sensibilidad y productividad debido a que es un método espectrofotométrico (Bello, 2006).

34

En la actualidad, el método de Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) está empezando a cubrir los intereses de muchas industrias para la detección de un amplio rango de compuestos (Novales, 2009). 2.4.1.1.

MÉTODO DE FEHLING

El método de Fehling se basa en una reacción de óxido-reducción, donde se calcula el volumen de una muestra de interés que se requiere para precipitar todo el cobre presente en cierta cantidad de solución de Fehling de concentración conocida. Este método se vale de la capacidad que tiene la glucosa, la fructosa y otros azúcares reductores de oxidarse en soluciones alcalinas a sus respectivos ácidos carboxílicos, reduciendo el cobre en estado cúprico (Cu+2) a óxido cuproso (Cu+1). El reactivo de Fehling está compuesto de dos soluciones A y B que deben mezclarse al momento de su uso. La solución A contiene CuSO4. La solución B contiene tartrato de sodio en NaOH. El tartrato tiene la función de acomplejar al Cu2+ produciendo una coloración azul antes de la titulación. La especie oxidante es el Cu2+ que se reduce a Cu+, formando un precipitado rojizo de óxido de cobre Cu2O (figura 11). Como la aparición de este color rojizo se detecta de forma visual, el error del método de Fehling es mayor que el de otros métodos como por ejemplo los espectrofotométricos (Mc Murry, 2001).

Figura 11. Reacción de Fehling.

2.4.1.2.

CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

Es una técnica cromatográfica usada para separar componentes de una muestra que se fraccionan entre una fase móvil líquida y una fase estacionaria sólida compuesta por partículas muy finas contenidas en una columna, y donde se utiliza una presión muy elevada para forzar el paso del disolvente a través de ella, consiguiendo así separaciones de gran resolución, permitiendo su identificación y cuantificación (Figueroa, 2000). La muestra se introduce en pequeños volúmenes a la corriente de la fase móvil bombeada con alta presión a una columna rellena de fase estacionaria y allí el analito se retarda separándose por medio de interacciones químicas con la fase estacionaria mientras atraviesa la columna. El retardo se conoce como tiempo de retención, único para cada 35

analito. Depende de la naturaleza del analito, de la fase estacionaria y de la composición de la fase móvil. El método de HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias o grupos de sustancias en un tiempo corto, tanto cualitativa como cuantitativamente. Como condición, es imprescindible que la muestra sea soluble en un disolvente al ser la fase móvil un líquido. La cromatografía líquida de alta resolución tiene ventajas en el análisis de los azúcares debido a su gran solubilidad en agua y su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles. Es la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada debido a sus cualidades de sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su gran adaptabilidad a sustancias que son de gran interés para la industria, la ciencia y la sociedad, incluyendo sustancias tan diversas como aminoácidos, proteínas, ácidos nucléicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenos, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y una gran variedad de sustancias inorgánicas (Herrera, 2011). 2.4.1.3.

MÉTODO DEL ÁCIDO 3,5-DINITROSALICÍLICO (DNS)

Es una técnica colorimétrica de óxido-reducción que se basa en la capacidad de la glucosa para reducir el ácido 3,5-dinitrosalicílico bajo determinadas condiciones. Esta reducción produce una coloración que se hace más intensa a medida que aumenta la concentración de azúcares reductores. Se evidencia por medio de la lectura de la absorbancia en espectrofotómetro, lo que conlleva a la aplicación de la Ley de Beer-Lambert (Miller, 1959). El fundamento de esta técnica consiste en la oxidación de la glucosa, sin embargo, la glucosa en solución acuosa se encuentra en su forma cíclica que es muy estable y, por lo tanto, no reacciona. Por dicha razón, es necesario calentar la muestra para que el anillo se abra dejando expuesto el aldehído y se de la reacción. Para que se dé la reacción también es necesario proporcionar un medio alcalino; esto es posible gracias a la adición de NaOH o KOH, que son bases fuertes y se ionizan completamente en solución acuosa, permitiendo la oxidación de la glucosa (Routh, 1990). Es preciso mencionar además, que este método únicamente mide azúcares reductores. Como la sacarosa es un disacárido que carece de poder reductor por no poseer carbonos anoméricos libres, cuando se quiere medir sacarosa por DNS, se debe aplicar una hidrólisis ácida (HCl) ó enzimática para la obtención de glucosa y fructosa que sí son azúcares reductores (Godoy, 2002). El uso del reactivo DNS para la determinación de azúcares reductores no sólo es un método ampliamente practicado, sino también es un ensayo recomendado por la Unión Internacional de Química Pura y Química Aplicada (IUPAC) (Najmus, 2011).

36



Mecanismo de reacción

El método determina la presencia de los grupos carbonilo libres (C=O) de los azúcares reductores, como por ejemplo los grupos aldehído en la glucosa o los grupos cetona en la fructosa. El grupo aldehído de la glucosa se oxida a un ácido carboxílico por la pérdida de hidrógeno y la ganancia de oxígeno, obteniéndose el ácido glucónico. Mientras que uno de los grupos nitro del ácido 3,5-dinitrosalicílico es reducido a su forma amino. Generalmente, el grupo de la posición 3 por ser la más reactiva, quedando el ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (figura 12). Cuando el DNS, que es de color amarillo se transforma en ácido 3-amino, 5nitrosalicílico se genera un viraje de color a pardo-rojizo. Luego, se frena la reacción con hielo haciendo que la molécula de glucosa se cierre y adquiera de nuevo su configuración piranosa (Routh, 1990).

Figura 12. Reacción del ácido 3,5-dinitrosalicílico.

Según la reacción, un mol de azúcar reacciona con un mol de DNS, dando lugar a una relación estequiométrica que permite conocer la cantidad de azúcares reductores presentes en la muestra. 

Reactivo

El reactivo consiste en una disolución formada por los siguientes compuestos: 1) ácido 3,5 dinitrosalicílico que actúa como oxidante, 2) sal de Rochelle (tartrato sódico- potásico), que impide la disolución de oxígeno en el reactivo y estabiliza los iones disociados durante el proceso y 3) hidróxido de sodio, que aporta el medio requerido para que se produzca la reacción redox (Grupo biotransformación UdeA). 

Medición

En éste método analítico el DNS está en exceso frente a los grupos reductores y en todas las muestras se adiciona la misma cantidad, de tal forma que mayores concentraciones de azúcares reductores provocan una mayor coloración de la muestra. Estas diferencias de coloración pueden determinarse por espectrofotometría visible, a la longitud de onda de máxima absorbancia de 540nm (Grupo biotransformación UdeA). 37



Características del método

-Limite de detección inferior: 0.04g/L -Limite de Linealidad: 0.4 g/L -Estabilidad después de terminada la reacción: 5 min. -Reactivo estable por 4 meses.

38

3. PRODUCCIÓN DE ALCOHOL DE LA FÁBRICA DE LICORES Y ALCOHOLES DE ANTIOQUIA (FLA) 3.1.

ALGUNOS CONCEPTOS GENERALES

Alcohol Etílico (Etanol): De fórmula química C2H5OH, es el producto de la fermentación alcohólica de mostos o sustratos fermentables de sustancias que contienen azúcar (frutas, caña de azúcar) o que contienen almidones (cereales, papa), transformándolos posteriormente en azúcares. Es la esencia del vino, la cerveza y otras bebidas obtenidas por fermentación. Se obtiene concentrado mediante procesos de destilación de los productos fermentados. Alcoholes Superiores: Para las industrias licoreras como la Fábrica de Licores y Alcoholes de Antioquia son todos aquellos alcoholes de que poseen tres o más carbonos en su estructura. Azúcares Reductores: Aquellos que poseen su grupo carbonilo intacto, a través del cual pueden reaccionar con otras moléculas. Pertenecen a este grupo todos los monosacáidos y algunos disacáridos, excepto la sacarosa y la trehalosa. Azúcares Reductores Totales (ATR): Suma de los contenidos de azúcares reductores libres en la muestra, más los que se obtienen después de la hidrólisis ó inversión de la sacarosa presente. Azúcares Residuales: ATR de las materias primas presentes en el vino fermentado y no transformado en alcohol por la levadura. CAF: Centro Automático de fermentación; es el centro desde donde se controlan la variables del proceso. Cepa: Levadura especializada para ser aplicada a un proceso industrial. Crema: Se llama de esta manera a la levadura que como mínimo ha realizado una fermentación. Cubas: Tanques o equipos diseñados y construidos para realizar el proceso de fermentación. Cultivo: Se le da este nombre a la levadura que va a ser introducida por primera vez en un proceso de fermentación.

39

Flemaza: Subproducto liquido obtenido en la columna rectificadora de alcohol y que sirve como sustituto de agua en procesos de acondicionamiento de mieles. Se compone en su mayoría de agua caliente. Fusel: Mezcla densa que la componen todos los alcoholes superiores obtenidos en la fermentación. Grado Alcoholimétrico: Contenido de alcohol etílico ó etanol (C2H5OH) en una solución acuosa, medido como el porcentaje en volumen de etanol en el volumen de la solución (% v/v) corregido a una temperatura de 20°C. Esta medición se realiza con un densímetro o aerómetro. Grado Brix: Teóricamente se define como el porcentaje de glucosa, en peso, que contiene una mezcla agua – glucosa, corregido a una temperatura de 20ºC. Para nuestro caso es el contenido de sólidos en la mezcla azucarada. Esta medición se realiza con un densímetro o sacarímetro. Melaza: Jarabe o líquido denso y viscoso resultante de la producción de azúcar en grano y del cual no es posible cristalizar más por métodos industriales usuales. Su contenido de azucares totales reductores es de un 50% a un 55%. Tiene un alto contenido de sólidos y sales de calcio. Mosto: Mezcla liquida en la que se realiza el proceso de fermentación, inicialmente se compone de levadura, melaza, nutrientes, agua e impurezas. A medida que avaza la fermentación aumenta su contenido de alcohol. Levadura: Microorganismo encargado de transformar los azucares fermentables en alcohol. Vinaza: Subproducto liquido obtenido en la producción de alcohol al destilar vinos o mostos fermentados. La vinaza se genera como subproducto en las columnas destrozadoras (mosteras). Vino: Liquido oscuro que se obtiene al termino de la fermentación o, en otras palabras, producto de la fermentación libre de levadura y de gran parte de los sólidos. 3.2.

DESCRIPCIÓN DEL PROCESO

3.2.1. PROPAGACIÓN DE LOS CULTIVOS La levadura con la cual se trabaja es una cepa ATCC, es decir, que proviene de un banco de microorganismos ó colección de cultivos, lo que asegura tener un material biológico certificado.

40

La propagación de la levadura consiste en aumentar los grados Brix y el volumen simultáneamente. Primero, en el laboratorio de bacteriología de la FLA, en condiciones de esterilidad, se toma un inóculo de levadura a partir de un medio sólido (Agar OGY) y se transfiere a un frasco shott con aproximadamente 20 ml de mosto (8°Brix y pH 4,5), dejándolo en incubación de 18 a 24 horas a una temperatura entre 30 y 35 ºC. Luego el cultivo obtenido se siembra consecutivamente en volúmenes de 300 ml, 1 l y 7 l, dejando cada volumen en incubación por 24 horas, a temperatura ambiente. Después de este proceso, la levadura queda lista para iniciar cultivo en prefermentadores. 3.2.2. FERMENTACIÓN  Materia Prima: Para el proceso fermentativo se requiere melaza y agua inicialmente. La melaza se compra por licitación pública abierta. En este momento se tiene un contrato con DICSA, que es la comercializadora de melaza que agrupa todos los ingenios azucareros del Valle del Cauca. El agua proviene de EPM, pero se somete a tratamiento químico para bajar la dureza antes de entrar al proceso. Otros insumos son: urea, fosfato de amonio, ácido sulfúrico, soda cáustica, vapor de calderas y flemaza.  Recepción de la materia prima: Con la llegada de la melaza se reporta un peso en báscula. Se hace un documento oficial de ingreso a la fábrica donde se reporta el peso, la procedencia y el carro transportador. El laboratorio de calidad toma una muestra de la melaza de cada compartimiento del carro para analizar parámetros estipulados contractualmente, tales como: 1. Contenido de azúcar (debe estar entre 48% y 55%); 2. Contenido de sólidos no solubles (máximo 8%) y 3. Grados Brix (entre 75 y 82). Si estos parámetros se cumplen, la miel es aceptada. Se procede a evacuar la melaza del carro transportador por gravedad, depositándola en el tanque de recepción de una capacidad de 8 toneladas. Es preciso mencionar, que la planta consume entre 150 y 180 toneladas diarias de melaza, por lo cual se requiere diariamente la llegada de aproximadamente 5-6 carros transportadores de melaza. Mediante bombas se lleva la melaza desde los tanques de recepción hacia los tanques de almacenamiento. Son 3 tanques (T – 1, T – 2 y T – 3), con capacidad de 1,000 toneladas cada uno, los cuales cuentan con sensores de nivel, controladores de espuma y controladores de derrame. Dos veces por semana se realiza un control de azúcares y se lleva un seguimiento de los sedimentos.

41

 Dilutores: La planta cuenta con 2 dilutores (D – 1 y D – 2) cada uno con capacidad de 20,000 litros. En ellos se diluye la melaza con agua y flemaza en línea hasta obtener unos grados Brix de 45. Además se aplica vapor directamente de calderas para aumentar la temperatura a 80°C y se baja el pH a 4,5 (la melaza llega con un pH superior a 5,0) con ácido sulfúrico diluido en línea. La palabra en línea se refiere a que se utilizan mezcladores estáticos para garantizar que la mezcla, como el ácido y el agua, llegue de forma homogénea hasta el dilutor, porque no se cuenta con agitadores mecánicos. Todo lo anterior con el fin de esterilizar y disminuir la viscosidad de la melaza facilitando la precipitación de sólidos (lodos) y la separación de las sales insolubles. Si lo sólidos en la miel son mayores a un 6%, la miel se pasará por clarificadoras de descarga parcial con el fin de remover los sólidos precipitados como las sales de calcio, en este caso las partículas pesadas se descargan en ciclos de 8 minutos y los lodos evacuados van a un recolector de residuos industriales. Luego la melaza pasa por intercambiadores de placa para bajar la temperatura hasta 30°C y llegar así hasta los prefermentadores. Cuando no se lleva a clarificadoras, la melaza pasa directamente desde los dilutores a los intercambiadores y luego a los prefermentadores.  Prefermentadores: Se tienen 4 prefermentadores (P – 1, P – 2, P – 3 y P – 4) de 6,000 litros cada uno. El prefermentador 1 sirve para el almacenamiento de la crema de levadura cuando se ha centrifugado; los prefermentadores 2 y 4 son para el almacenamiento de la miel diluida que estará disponible para ser llevada a las cubas; y el prefermentador 3 es done se hace el cultivo de levadura para cargar las cubas de fermentación ó reforzarlas en caso de ser necesario. Este prefermentador se mantiene generalmente a 30°C, recibe agitación por aire y trabaja a una capacidad del 90% del tanque.  Cubas de Fermentación: Una vez se dispone de la melaza en la planta, se inicia el cargue de cubas de acuerdo a la formulación establecida por el director de procesos. Se cuenta con 5 cubas (C – 1, C – 2, C – 3, C – 4 y C – 5) para llevar a cabo el proceso fermentativo y una sexta cuba (C-6) para el almacenamiento del vino. Las cubas 1 y 6 tienen capacidad para 160,000 litros. Las cubas 2, 3 y 4 son de 200,000 litros y la cuba 5 de 120,000 litros. Todas poseen intercambiadores de calor para controlar la temperatura utilizando el agua de recuperación proveniente de la torre de enfriamiento ó también se puede utilizar agua de acueducto. En las cubas, se ajusta el Brix a 23-22, se realiza la mezcla con la levadura, se agregan los nutrientes correspondientes (urea y fosfato diamónico, en cantidades especificadas según la carga de la cuba) y se inicia el proceso de fermentación anaeróbica, en el cual la levadura 42

por medio de su acción metabólica, transforma los azucares fermentables en etanol y CO2 principalmente. Cuando se está fermentando, la cuba se carga con dos cultivos de levadura, cada uno representa un 60% aproximadamente del prefermentador 3. El 30% restante que queda en el prefermentador se deja como inóculo. Como las cubas no cuentan con agitadores mecánicos, se da una agitación por recirculación ó por inyección de aire. Durante la fermentación se controla la temperatura, el nivel de espuma, el ° Brix, y la viabilidad de la levadura. La temperatura y el nivel de espuma son controlados gracias al sistema automático CAF (Control Automático de fermentación). El ° Brix y la viabilidad de la levadura se evalúan cada dos horas en el laboratorio de bacteriología. La fermentación se da por finalizada cuando el ° Brix se repite en dos horas seguidas.  Separación: Después de culminar el proceso fermentativo, se transporta el mosto hacia unas máquinas centrífugas (CT), donde se obtienen dos fracciones: la crema de la levadura que sale por el fondo (más densa) y una mezcla alcohólica denominada vino (menos densa). Estos equipos trabajan a 1,000 rpm, con una tasa de alimentación de 15 a 20 m3/h. El vino y la crema obtenidos después de la separación van hacia los respectivos tanques de recolección (BL): 2 para el vino y 2 para la crema. De los BL, el vino se almacena en la cuba 6 y la crema pasa hacia el prefermentador 3 para un nuevo ciclo de fermentación.  Crema de levadura: La levadura es reciclada en los tanques de recolección de crema (BL – 3 y BL – 4) si presenta una viabilidad mayor de 60 o 50%. En caso contrario se descarta. La levadura reciclada es analizada en el laboratorio de bacteriología. Allí, se evalúa la viabilidad y la presencia de flóculos y de acuerdo a lo observado se hacen recomendaciones sobre el pretratamiento que debe hacerse antes de utilizarla en los prefermentadores. El pretratamiento generalmente consiste en la adición de ácido sulfúrico hasta que al examinar la levadura no haya formación de flóculos. Esto teniendo en cuenta que el pH del mosto no alcance un valor menor a 2,5. En la figura 2 se expone el procedimiento llevado a cabo para el tratamiento de la crema.

43

Figura 13. Procedimiento llevado a cabo para el tratamiento de la crema de levadura.

 Vino: EL vino es llevado inicialmente a los tanques de recolección (BL – 1 y BL – 2), eventualmente puede se neutralizado con soda cáustica, y se lleva hacia la cuba de almacenamiento de vinos (C – 6) la cual tiene una capacidad de 180m3. De ahí pasaría a la torre de destilación donde el etanol es separado, rectificado y concentrado. 3.2.3. DESTILACIÓN La Fábrica de Licores y Alcoholes de Antioquia cuenta con 6 columnas de destilación: V1 y V2 son las destrozadoras o despojadoras de vino; V5 y V6 se utilizan para la concentración de vapores alcohólicos; la columna V4 es la rectificadora, de donde se obtiene el alcohol para el Ron y la columna V3, sólo se utiliza para la fabricación de alcohol para el Vodka. El vino resultante de la fermentación que se encuentra aproximadamente a 30°C pasa por los condensadores y luego por los intercambiadores de calor para subir la temperatura hasta 89°C, con el fin de comenzar el proceso de destilación. El vino desciende por la columna V1 y en contracorriente sube el vapor permitiendo así la transferencia de masa. De esta columna V1 sale la vinaza aproximadamente a 108 °C y la corriente alcohólica resultante pasa a V5 y a V6 y finalmente a V4, de cuyos fondos se obtiene la flemaza a 103°C aproximadamente. El etanol obtenido de la destilación se encuentra a 94% y se almacena en las tinas de almacenamiento de producto con capacidad de 14,000 litros.

44

4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA En todo proceso fermentativo es indispensable llevar un control estricto de diferentes variables que permitan definir el comportamiento de la levadura y evaluar la tasa de generación del producto de interés. Es necesario que se mantengan unas condiciones óptimas de temperatura, pH, grados Brix, concentración de alcohol, concentración de azúcares, entre otras, para garantizar una fermentación de alto rendimiento, donde se combinen exitosamente tres factores: generación de alcohol etílico en un porcentaje significativo, consumo de una cantidad racional de sustrato y estabilidad de la levadura por varios períodos de tiempo. Sin embargo, cuando se habla de un proceso discontinuo como el de la Fábrica de Licores y Alcoholes de Antioquia, donde existen tiempos muertos entre carga y carga, y donde se está fermentando en varias cubas en distintos momentos, es bastante complicado asegurar que se trabaje exactamente con las mismas condiciones de carga y que se mantenga con el tiempo un valor exacto de pH, temperatura, concentración de células, etc. Esta variación de condiciones en la fermentación se ve reflejada en los resultados inconstantes que se obtienen, por ejemplo, una semana pueden obtenerse grados alcohólicos en los vinos de hasta 8,0 y 8,5 %, con concentraciones de azúcares residuales muy bajas (17-20 g/L), pero a la semana siguiente los azúcares residuales pueden incrementar hasta 24-25 g/L con porcentajes de alcohol de 7%, contrario a lo que dice la teoría, donde la disminución de azúcares residuales al final de un proceso fermentativo, representa un aumento en el contenido de alcohol en el vino final. Por lo tanto, con el fin de aclarar este comportamiento y cuando se piensa en la optimización del proceso, es muy pertinente realizar un seguimiento del contenido de azúcares totales reductores a lo largo del proceso de fermentación para las diferentes cubas en funcionamiento. Esta determinación de los azúcares reductores, puede proporcionar información sobre la calidad del sustrato, la eficiencia de la levadura, permite evaluar la calidad de la materia prima, en este caso, la melaza que llega desde los ingenios azucareros y, también obtener una idea de la eficiencia de la fermentación en cuanto a consumo de sustrato a través del tiempo. En la FLA, históricamente se ha utilizado el mismo método analítico para la determinación de azúcares reductores, que es la técnica de Fehling. Aunque este método arroja buenos resultados y es reproducible, su aplicación es muy subjetiva, pues depende de un concepto visual, siendo menos confiable que un método espectrofotométrico por ejemplo. Así, con el tiempo se ha ido implementando en el laboratorio de Bacteriología el método de DNS, teniendo en cuenta que la medida obtenida puede ser más precisa y que la fábrica cuenta con el equipo requerido. Con base a lo anterior, la finalidad de este trabajo es hacer un seguimiento en el tiempo de las concentraciones de azúcares reductores totales y de otras variables del proceso como 45

pH, temperatura, grados Brix, recuento de levadura y concentración de etanol para todas las cubas, evaluando la relación entre ellas para conocer el rendimiento real del proceso desde el consumo de sustrato.

46

5. OBJETIVOS Objetivo General: Evaluar diferentes variables y condiciones que permitan optimizar el proceso de fermentación de la Fábrica de Licores y Alcoholes de Antioquia. Objetivos Específicos: 

Realizar un seguimiento y control de la cantidad de azúcares reductores presentes en el mosto de fermentación, utilizando el método espectrofotométrico del DNS.



Evaluar la variación de diferentes parámetros de la fermentación, tales como temperatura, pH, grados Brix, porcentaje de alcohol y tiempo de fermentación.



Llevar a cabo el recuento de la levadura a través de la fermentación, utilizando el método de Neubauer.



Comparar algunas técnicas analíticas para la medición de azúcares totales reductores presentes en la melaza de caña de azúcar.

47

6. MATERIALES Y MÉTODOS 6.1.

MUESTREO

Se tomaron directamente muestras de las cubas 1, 2, 3 y 4 desde el comienzo de cada proceso fermentativo (muestra de Brix de carga) hasta la muestra final, que para este estudio es el vino obtenido tras la centrifugación. Las muestras para cada cuba se tomaron cada 2 horas, haciendo un seguimiento de los siguientes parámetros:      

Grados Brix. pH. Temperatura. Porcentaje de alcohol (v/v). Concentración de azúcares totales reductores. Recuento de levadura.

Es preciso mencionar que todas las variables se midieron en el momento de recolección de la muestra, con excepción de los azúcares y los recuentos de levadura que se fueron haciendo después de los ciclos fermentativos, pues requieren de un procedimiento más extenso. Para detener la fermentación en el tiempo, se guardó una pequeña cantidad de cada muestra en tubos ependorff tapa rosca de 2,5 ml y se sometieron a congelación. 6.2.

MEDICIÓN DE pH

En cada medición, se verificó que el pHmetro se encontrara calibrado, de no ser así, era necesario calibrarlo según especificaciones del manual. 1. Se sumerge el electrodo en la muestra a analizar. Luego de que el valor indicado en el pHmetro se haya estabilizado, se hace la lectura del dato. 2. Se lava el electrodo con abundante agua destilada, dejándolo reposar en solución de KCl 3M. 6.3.

MEDICIÓN GRADOS BRIX

1. Se hace agitación de la muestra con el fin de homogenizarla. Se vierte dentro de una probeta de 250 ml hasta que su nivel alcance aproximadamente 5 cm por debajo del borde superior de la probeta, para evitar derrames al sumergir el instrumento. 2. Se introduce el sacarímetro o aerómetro en la muestra sujetándolo de la parte superior del vástago. Vigilar que el menisco se forme de manera regular. 3. Cuando el areómetro haya alcanzado el equilibrio y flote libremente sin tocar las paredes de la probeta, se lee el valor que indique la parte inferior del menisco. Se trabajó con areómetros de diferentes escalas: (0-10), (10-20), (20-30), como indica la figura 14. 48

Figura 14. Aerómetros o sacarímetros para medición de grados Brix.

6.4.

MEDICIÓN DEL PORCENTAJE DE ALCOHOL

Primero fue necesario realizar una destilación para cada una de las muestras de interés, con el fin de obtener una mezcla alcohólica libre de impurezas tales como azúcares, levaduras, nutrientes y sólidos, pues el principio de funcionamiento del lector de alcohol sugiere la medición sobre una mezcla de alcohol y agua. Destilación de mosto fermentado (vino): Las destilaciones fueron realizadas en un equipo con arrastre de vapor (Vapodest 30S, Gerhardt). 1. Se toman 250 ml de mosto fermentado en una probeta graduada de 250 ml, se transfieren a un balón de 500 ml, se adiciona una piedra de ebullición y aproximadamente 0.5 ml de antiespumante y 0.5 ml de acetato de plomo. 2. Se instala el balón en el sistema de calentamiento y se deja allí por los 6 minutos que tarda el proceso. Se debe poner un erlenmeyer para recibir el destilado (aproximadamente 150 ml -200 ml). Tener cuidado al retirar el balón porque aumenta mucho la temperatura. 3. Se lleva el destilado de nuevo a la probeta, completando al volumen inicial de 250 ml con agua destilada fría para luego medir el grado alcoholimétrico. Medición del grado alcoholímetro: El alcohol fue medido con un dispositivo Mettler Toledo, Portable Lab (figura 15) que traduce la densidad en porcentaje de alcohol a 20° C según tablas de la OIML.

49

Figura 15. Alcoholímetro automático.

1. Se homogeniza la muestra para eliminar diferencias de densidad y temperatura. 2.Se sumerge el densito y se extrae un poco de muestra, esperando la lectura del instrumento. 3. Repetir el procedimiento dos ó tres veces, hasta que el valor sea constante. 6.5.

RECUENTO DE LEVADURAS

El recuento se realizó utilizando una cámara de Neubauer, que sirve para hacer el recuento de células en un medio líquido (ver figura 16).

Figura 16. Cámara de Neubauer.

1. Se toma una muestra de mosto, almacenada previamente en congelador. 2. Se agita vigorosamente y se hacen las diluciones pertinentes con agua destilada: Tabla 3. Diluciones de una muestra de mosto para recuento de levadura. DILUCIÓN Para las dos primeras muestras de cada cuba (0 horas-2 horas). Para el resto de muestras de cada cuba (4 horas en adelante).

1/10: 50ﾶl muestra-450ﾶl agua

1/20: 40ﾶl muestra-760ﾶl agua

4. Después de diluir, se toma con micropipeta 10 ﾶl del mosto y se adicionan sobre la entrada superior de la cámara de Neubauer. Lo mismo para la entrada inferior de la cámara. 5. Se deja reposar por un 1-5 minutos y se coloca la cámara en el microscopio. 50

6. Enfocar en el lente 40 X las cuadrículas en rojo de la cámara como se muestra en la figura 17. La suma del número de levaduras de cada uno de los 5 cuadrantes da como resultado el conteo total de la muestra.

Figura 17. Cuadrícula para recuento celular.

7. El conteo de las levaduras se hizo de a cuatro veces para cada muestra, pero como son dos entradas en la placa, fueron 8 datos que se promediaron por muestra. 8. Utilizando la siguiente ecuación, se calculó el número de levaduras por ml de muestra:

6.6. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES TOTALES REDUCTORES EN MOSTO DE FERMENTACIÓN POR DNS Para la medición de azúcares totales reductores se utilizó el método del ácido 3,5dinitrosalicílico o DNS, trabajando con un espectrofotómetro UNICAM UV/visible. El software asociado a este equipo para la realización de la curva de calibración y la cuantificación de las muestras fue el Vision V3.42. Preparación del reactivo: Para 1000 ml del reactivo DNS. 1.   

Pesar en balanza analítica los siguientes compuestos: Ácido 3,5- dinitrosalicilico (DNS) 10g Tartrato de sodio y potasio tetrahidratado 300g NaOH  16g

2. Preparar 200ml de solución de NaOH [2N]: los 16g de NaOH ya pesados se transfieren a un balón de 200ml y se afora con agua destilada.

51

3. Luego se lleva todo a un volumen final de 1000ml, primero la solución de NaOH, luego el tartrato y por último el DNS, aforando con agua destilada y sometiendo a agitación vigorosa para eliminar aglomeraciones. 4. Almacenar en envase de vidrio ámbar, porque el DNS es foto sensible. Construcción de la curva de calibración de glucosa: 1. Preparar solución de glucosa a 0,4g/l. Se pesan 0,4 g de glucosa y se llevan a un balón de 1000ml completando el volumen con agua destilada. 2. Realizar los estándares de glucosa a partir de la solución anterior y como se muestra en la tabla 3 (por duplicado, es decir, 20 estándares más el blanco). Tabla 4. Esquema de estándares de glucosa. Volumen de solución de glucosa a 0,4 g/l (ml) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

Volumen de agua destilada (ml) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

Concentración del estándar (g/l) 0,00 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,24 0,28 0,32 0,36 0,40

3. Agregar 1 ml de DNS a cada una de los estándares anteriores incluyendo el blanco. 4. Mezclar y someter a incubación a 90°C durante 5 minutos. 5. Parar la reacción en frío, poniendo en baño de hielo a 4°C durante 5 minutos. 6. Leer absorbancia a 540 nm. 7. Calcular la ecuación de la recta (el espectrofotómetro la da automáticamente, pero como se hizo por duplicado debe escogerse la mejor). Nota: Cada vez que se prepare el reactivo DNS se debe hacer una nueva curva de calibración. Es preciso mencionar que la curva de calibración también puede hacerse con sacarosa, pero debe incluirse en los pasos una hidrólisis ácida, previa a la incubación en baño maría, para garantizar tener los azúcares reductores. 52

Preparación de las muestras: Para la determinación de los azúcares reductores de una muestra, se toma 1 ml de la misma y se realiza la reacción con 1 ml de DNS, siguiendo el procedimiento que se describe para los estándares de glucosa. Si la absorbancia de la muestra está por fuera del rango de medida de la curva de calibración, se deben realizar diluciones seriadas como se muestra en la tabla 4. Dependiendo de la cantidad de azúcares reductores de la muestra se elige si se hace una dilución 1/10, 1/100 o 1/1000. El blanco siempre será: 1000 µl de agua más 1000 µl de DNS. Tabla 5. Diluciones para una muestra con absorbancia por fuera del rango de medida de la curva de calibración. Componentes Muestra Dilución 1/10 Agua destilada

Dilución 1/10 100 µl --900 µl

Dilución 1/100 --100 µl 900 µl

Dilución 1/1000 --10 µl 990 µl

Como las muestras contienen sacarosa es necesario hacer una hidrólisis ácida, así: 1. Tomar 1 ml de la muestra diluída a tratar y adicionar 20 µL de ácido clorhídrico concentrado al 37%. Agitar. 2. Llevar a baño maría durante 5 minutos a 90 °C. 3. Neutralizar el ácido con 50 µL de KOH [5N] y agitar. 4. Agregar 1 ml de DNS a cada una de las muestras, pero adicionalmente se agregan 70 ml de DNS para asegurar reacción 1:1. 5. Mezclar y someter a incubación a 90°C durante 5 minutos. 5. Parar la reacción en frío, poniendo en baño de hielo a 4°C durante 5 minutos. 6. Leer absorbancia a 540 nm. Nota: Es necesario que cada vez que se lean muestras, se mida también un estándar de sacarosa de una concentración conocida, sea 20, 25 o 30g/l, para darle veracidad al método. Cuando las concentraciones obtenidas en el equipo se alejan de las concentraciones reales, es necesario hacer nuevos estándares o construir una nueva curva de calibración.

53

6.7. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES TOTALES REDUCTORES EN MELAZA POR DNS Muestra: La toma de la muestra se hace volumétricamente. Como primer paso es necesario hacer una dilución de 1:10, debido a la naturaleza viscosa de la melaza que puede interferir en las mediciones posteriores. Para 250ml de muestra: 1. Se homogeniza bien la melaza, mezclando vigorosamente. 2. Se toman 25ml d melaza con una pipeta volumétrica. 3. Se llevan a un balón de 250ml, completando el volumen con agua destilada. Nota: Hay que tener especial cuidado en el momento de transferir la muestra al balón, porque quedan residuos de melaza en las paredes de la pipeta que deben ser removidos totalmente con agua destilada para evitar pérdidas de la muestra de interés. Medición: Se aplica el método de DNS siguiendo los pasos expuestos en el apartado 6.6, haciendo un tratamiento completo de la melaza desde la hidrólisis ácida hasta el baño frío de las muestras. La dilución que debe emplearse es: 1. 100 µl de muestra en 900 µl de agua destilada. 2. De este volumen se toman 10 µl en 990 µl de agua destilada. Nota: Como la melaza ya estaba diluida y se hacen otras dos diluciones, hay que tener en cuenta un factor de 1:1000 para hacer los cálculos posteriores cuando se tengan los resultados del método de DNS.

54

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7.1. COMPORTAMIENTO GENERAL DE LA FERMENTACIÓN DATOS DE TODAS LAS CUBAS Al final de todo el proceso de recolección de datos, se obtuvo un total de 95 muestras, tomadas en un período de tiempo relativamente corto, desde el 20 de marzo al 4 de mayo de 2012, y repartidas entre las 4 cubas así:    

Cuba 1: 40 muestras. Cuba 2: 19 muestras. Cuba 3: 19 muestras. Cuba 4: 17 muestras.

En primer lugar, se reunieron los datos de todas las cubas y se hizo un análisis de estadística descriptiva para cada uno de los parámetros medidos, con el fin de facilitar su estudio posterior utilizando las medidas de resumen más básicas como promedio, moda, valor máximo, mínimo y desviación estándar. 7.1.1. GRADOS BRIX, pH Y TEMPERATURA Durante todas las fermentaciones se hizo un seguimiento completo de los grados Brix, el pH y la temperatura. Para resumir se muestran los valores iniciales y finales, con excepción del pH que permanece prácticamente constante. En la tabla 5, se presenta un resumen de lo obtenido, uniendo la información de todas las cubas. Tabla 6. Resumen estadístico de los Grados Brix, pH y Temperatura para todas las cubas. VARIABLES GRADOS BRIX DE CARGA GRADOS BRIX FINALES pH TEMPERATURA INICIAL (°C) TEMPERATURA FINAL (°C)

PROMEDIO

MODA

MÁXIMO

MÍNIMO

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

22,10

22,00

22,80

21,00

0,52

7,89

7,70

8,50

7,20

0,38

4,72

4,60

5,00

4,53

0,11

29,20

30,00

31,00

27,00

1,40

34,72

35,00

36,00

33,00

0,78

Como es posible observar, el contenido de sólidos al inicio de todo el proceso fermentativo es aproximadamente de 22,00. Este valor del Brix de carga es bastante constante y de fácil control, porque sólo requiere de un manejo adecuado de la melaza y el agua; es cuestión del operario. Sin embargo, hay que tener cuidado porque un valor superior a 23,00 podría generar concentraciones altas de sólidos y azúcares que pueden desestabilizar las condiciones óptimas del medio y causar plasmólisis en las células de levadura. Con un 55

valor por debajo de 21,00 podría decirse que la melaza está muy diluida y no se estaría aprovechando al máximo su contenido en azúcares que son los que finalmente se están convirtiendo en el alcohol de interés. Finalmente, se comprobó que a un Brix de carga de 21,50 la levadura trabaja muy bien y que de alguna forma se está optimizando la melaza, gastando lo suficiente para un buen rendimiento. Para los grados Brix finales, que en este caso fueron los asociados al vino, se tiene un valor promedio de 7,89. Según lo observado, este grado Brix para el vino siempre es inferior en aproximadamente 1,00 grado al Brix de la última muestra, es decir, que el Brix al que generalmente termina una fermentación es 8,89 y se mantiene constante con el paso del tiempo. Por más tiempo que se deje una fermentación, el Brix llega a un punto donde se vuelve invariable, indicando que ya el proceso terminó. Esto tal vez ocurre porque la levadura consumió todos los azúcares fermentables que podía y únicamente queda en la matriz del sustrato los iones, la materia orgánica y los sólidos que no se transforman y que constituyen esos grados Brix finales. Teniendo en cuenta que los grados Brix representan de forma indirecta el contenido de azúcares en la mezcla, si se hace una relación entre el valor inicial del Brix y lo que queda al final, se obtiene un porcentaje de consumo del 64,30%, un valor muy pequeño cuando se piensa en la melaza como un medio rico en azúcares, donde casi todo debe ser consumido por el microorganismo. Lo esperado es que esos grados Brix iniciales representen una carga significativa de compuestos asimilables por la levadura y no una mezcla indefinida de sólidos que no van a ser fermentados, convirtiéndose de alguna forma en impurezas que pueden interferir con los equipos o con el proceso de la levadura como tal. Cuando se analiza el pH, se evidencia en la tabla 5 que el rango óptimo de trabajo está entre 4,50 y 5,00, con un óptimo reproducible de 4,60. Los valores se mantienen muy constantes durante todo el proceso de fermentación, lo que se ve reflejado en una desviación estándar pequeña (0,11). En cuanto a la temperatura, los valores iniciales fueron siempre más pequeños que los valores de la temperatura al final de la fermentación, coincidiendo con las referencias teóricas que indican una reacción exotérmica, donde se libera energía en forma de calor. Es indispensable controlar por medio de intercambiadores de calor la temperatura hasta un máximo de 37-38°C, pues a partir de ahí se comienzan a desnaturalizar las proteínas de las levaduras, e incluso pueden morir. A una temperatura de 35°C que fue el valor que más se repitió en todas las muestras, se consigue una operación fermentativa óptima. 7.1.2. AZÚCARES TOTALES REDUCTORES Y PORCENTAJE ALCOHÓLICO Como se mencionó en apartados anteriores, para la determinación de los azúcares totales reductores (ATR) del mosto se empleó el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico o DNS, para el cual fue necesario realizar una curva de calibración. 56

Durante las pruebas, se construyeron dos curvas de calibración: inicialmente se hizo una curva con glucosa (figura 18), obteniendo un coeficiente cuadrático de 0,990166. Pero buscando unos resultados más precisos, se decidió construir una curva de calibración utilizando sacarosa, con el fin de probar si mejoraba la tendencia de los datos y se obtuvo una curva con r2 = 0,999459, como indica la figura 19. El motivo por el cual la curva de calibración con sacarosa tiene un coeficiente cuadrático mayor y, por tanto, permite un mejor ajuste de los datos, puede ser que tanto las muestras del mosto como los estándares de sacarosa reciben el mismo tratamiento, pues deben pasar por una hidrólisis ácida; contrario al tratamiento de los estándares de glucosa donde se omiten algunos pasos del método, como la adición de soluciones ácido-base, que pueden definir de alguna forma el resultado final del procedimiento. De esta forma, para la medición de los ATR por el método de DNS, se utilizó la curva de calibración de sacarosa 0,4 g/L.

Figura 18. Curva de calibración con glucosa 0,4 g/L.

Figura 19. Curva de calibración con sacarosa 0,4 g/L.

57

Tabla 7. Resumen estadístico de los ATR, el Rendimiento y Grado Alcohólico del vino para todas las cubas.

ATR INICIALES (g/L) ATR FINALES (g/L) RENDIMIENTO (%) GRADO ALCOHOL DEL VINO (% v/v)

PROMEDIO

MODA

MÁXIMO

MÍNIMO

162,95 23,68 85,21

-

202,90 26,79 90,24

134,2 19,08 80,15

DESVIACIÓN ESTÁNDAR 21,65 2,74 2,72

8,04

7,9

9,00

7,3

0,42

Como se observa en la tabla 6, el contenido de azúcares totales reductores al final del proceso de fermentación, es relativamente alto. En promedio quedan 23,68 g de azúcares residuales por litro sin fermentar, que se traducen indirectamente en la incapacidad de la levadura de consumir totalmente los componentes fermentables de la melaza. Se habla de incapacidad de la levadura, porque en un principio se evalúan los azúcares que sí son fermentables y con base a ellos se miden los residuales. Además, algunas pruebas realizadas por grupos de investigación de la Universidad de Antioquia empleando el método de HPLC, han demostrado que en el mosto final quedan pequeños porcentajes de sacarosa, glucosa y fructosa, indicando que no fueron utilizados por el microorganismo. Cuando se analiza aisladamente el valor de los azúcares residuales puede parecer bastante grande, pero cuando se compara con el contenido inicial de ATR de 162,95 g/L, la diferencia no es tan grande. Históricamente se había creído en la FLA que los residuales eran enormes y que el interés de optimizar el proceso fermentativo radicaba precisamente en reducir la concentración de azúcares al final de la fermentación, sin embargo con este estudio, al realizar un seguimiento completo del comportamiento de los ATR desde el Brix de carga hasta el vino obtenido, se comprueba que la cifra no es tan alarmante como que se creía. Por el contrario, cuando se calcula el rendimiento del proceso en términos del consumo de azúcares fermentables, se obtiene un rendimiento promedio de 85,21 %, un valor que deja la seguridad de que el proceso fermentativo es bastante bueno. Incluso si se compara con los rendimientos de otras plantas del mundo, donde se obtienen rendimientos de 87% aproximadamente, el proceso de la FLA está al nivel de las mejores fermentaciones para la obtención de etanol. No es secreto que lo que realmente importa en las aplicaciones industriales es la rentabilidad del proceso, por eso, mientras menos azúcares queden al final de la fermentación, significa que se está aprovechando al máximo el sustrato y se está produciendo mayores porcentajes de alcohol. Sin embargo, esto no siempre se cumple. En algunos ciclos de fermentación, se observó que aunque se tenga una melaza con una concentración inicial de ATR de hasta 202,90 g/L y se logre una concentración final de 19g/L, el grado alcohólico del vino puede ser de 7%, contradiciendo la relación proporcional teórica de consumo de sustrato y generación de producto. Incluso pueden obtenerse concentración de azúcares residuales de 24 - 25 g/L con un alcohol del 8,5%. 58

En la FLA, a pesar de que parámetros como el pH, la temperatura y los grados Brix se controlan estrictamente, es muy difícil esperar un comportamiento constante en los azúcares. Todos los días, en todas las cubas varían los resultados y esto es debido a la calidad de la melaza que llega a la planta. Como es posible observar en la tabla 6, la desviación estándar de la concentración inicial de ATR es demasiado grande (21,65), revelando que en un total de 95 muestras tomadas en tan sólo 1 mes y medio, los valores de los azúcares presentes en la melaza varían enormemente, es decir, un día puede llegar una melaza rica en azúcares y al otro día, una melaza pobre en ellos. Entonces vale la pena preguntarse, si todas las variables se estandarizan, si se tiene la certeza de que el rendimiento de la levadura es excelente, si el proceso es muy eficiente y tarda tan sólo 16 a18 horas, y además, se sabe que la cantidad de sólidos en la melaza es relativamente constante, ¿por qué se necesita cada vez más cantidad de melaza para producir lo mismo en cuanto a contenido de alcohol? La única condición que queda como incógnita es la calidad de la materia prima, que es por lo que se está pagando. La melaza de por sí tiene una composición altamente heterogénea, incluso no hay una moda estadística o un valor que se repita para los ATR, como se ve en la tabla 6; sumado a esto, no se está llevando a cabo ninguna caracterización periódica de la misma. No hay una identificación estricta de lo que realmente es fermentable por la levadura; hace falta conocer cuáles son los componentes que llegan con la melaza, cuáles se generan, cuáles se consumen, cuáles permanecen, cuáles facilitan el metabolismo de la levadura o cuáles lo afectan. Además de eso los análisis que se realizan en el laboratorio de calidad, se quedan pequeños ante tantas preguntas. En pocas palabras, aunque el proceso de la FLA tiene rendimientos muy buenos de 85,21% y se alcanzan en promedio grados alcohólicos de 8,04%, las concentraciones de los azúcares totales reductores son muy variables, demostrando que algo está pasando con la melaza de caña y que debe ser el paso a seguir después de este estudio. 7.1.3. RECUENTO DE LEVADURAS Tabla 8. Resumen estadístico de los Recuentos de Levadura para todas las cubas. VARIABLES RECUENTO DE LEVADURAS AL INICIO (millones de células/ml) RECUENTO DE LEVADURAS AL FINAL (millones de células/ml)

PROMEDIO

MODA

MÁXIMO

MÍNIMO

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

39,12

-

45,36

30,00

6,67

132,56

-

229,06

99,13

48,01

En la tabla 7, se evidencia que el recuento de levaduras genera resultados muy variables. El mosto generalmente tiene una carga inicial de levadura proveniente de los 59

prefermentadores, que está alrededor de los 39 millones de células de levadura por mililitro de medio. Al finalizar el proceso fermentativo, la densidad celular se encuentra entre los 125-135 millones de células/ml. Sólo un día se alcanzaron valores de hasta 229 millones de células/ml, pero generalmente la levadura llega a un punto donde cesa la tasa de reproducción y se mantiene en un estado estacionario, en el que puede permanecer por largo tiempo si cuenta con condiciones favorables. 7.2. COMPORTAMIENTO DE LA FERMENTACIÓN CON RESPECTO AL TIEMPO- DATOS DE LA CUBA1 Como de la cuba 1 se logró recolectar el mayor número de muestras para diferentes ciclos fermentativos, se hizo una tabla resumen (tabla 8) donde se recogió el promedio de las variables medidas, con el fin de graficar posteriormente su comportamiento con respecto al tiempo. Se asumió que el comportamiento de la cuba 1 es un reflejo general de lo que sucede en las otras cubas. Tabla 9. Seguimiento cada dos horas de todos los parámetros para la cuba1. TIEMPO (horas)

GRADOS BRIX

pH

TEMPERATURA (°C)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 (VINO)

22,5 18,7 16,0 13,1 10,9 9,6 9,0 8,9 7,7

4,71 4,60 4,65 4,62 4,64 4,62 4,66 4,62 4,64

30,5 34,0 34,7 34,0 35,3 32,0 35,7 35,0 36,3

GRADOS DE ALCOHOL (%) 1,2 2,7 4,1 5,4 6,5 7,1 7,4 7,6 8,0

CONCENTRACIÓN DE ATR (g/L) 163,50 136,63 113,45 75,50 48,92 34,90 26,98 24,16 24,91

Figura 20. Grados Brix, pH y temperatura con respecto al tiempo (cuba 1).

60

RECUENTO LEVADURA (millones de células/ml) 40,57 74,18 117,07 125,80 126,17 116,65 119,28 121,28 -

En la figura 20, es posible ver que el tiempo promedio que tarda el proceso fermentativo es de 16 horas. Los grados Brix como es de esperarse, van disminuyendo a medida que avanza el tiempo de fermentación, gracias al consumo de los azúcares por parte de la levadura. El grado Brix de carga en las fermentaciones de la cuba 1 es aproximadamente de 22-23 hasta un valor final de 7-8°Brix. La línea rosada que representa el pH del mosto, tiene una distribución completamente uniforme con el tiempo; no hay prácticamente ningún cambio en el pH durante el proceso. Hay una marcada tendencia hacia un pH cercano a 5,0, sin superar este valor. De acuerdo con la figura 20, se puede decir que el rango más adecuado para la temperatura estaría entre los 30-37ºC. Los valores más altos de temperatura se alcanzan al final de la fermentación, por el carácter exotérmico de la reacción como se mencionó anteriormente. Entre más rápido empiece a darse el incremento de la temperatura, mas rápido se activara la fermentación, reflejándose esto en el tiempo total de reacción en la cuba; es decir, que cuando aumenta rápidamente la temperatura pueden esperarse fermentaciones más cortas, con grados alcoholimétricos elevados. Se observa además, que aproximadamente a las 10 horas decrece un poco la temperatura, puede ser por las condiciones desfavorables del medio, donde comienzan a escasear los nutrientes que requiere la levadura para su consumo y cesa su metabolismo, pero se incrementa rápidamente al encontrar otros componentes fermentables o también por la expulsión de productos al exterior celular.

Figura 21. Grado de alcohol del vino con respecto al tiempo (cuba 1).

En la figura 21 se observa un crecimiento continuo del porcentaje de alcohol a medida que transcurre el tiempo. Se observa que el proceso no inicia en ausencia de alcohol, pues siempre se cuenta con un pequeño contenido inicial generado al contacto previo que ha 61

tenido la levadura con la miel diluida durante el proceso de llenado, o también por el alcohol que puede aportar la crema desde su cultivo o tratamiento previo en los prefermentadores. Se alcanzan valores máximos de 8% de alcohol v/v a las 16 horas de fermentación.

Figura 22. Concentración de azúcares totales reductores ATR con respecto al tiempo (cuba 1).

Así como el alcohol va aumentando, la concentración de azúcares totales reductores va disminuyendo con el tiempo, desde 160 g/L hasta 25 g/L, aproximadamente. Tras 16 horas de proceso, la levadura consume casi 135 g de azúcares por litro de mosto, un valor importante cuando se tiene en cuenta que es corto tiempo de fermentación, comparado con otros procesos que pueden tardar hasta días.

Figura 23. Recuento de levadura con respecto al tiempo (cuba 1).

62

En la figura 23 se puede ver que la etapa de latencia es nula, esto se debe a que el inóculo proviene de los prefermentadores, en donde las cremas son cultivadas con la misma melaza que se utiliza en el proceso de fermentación. Esto permite una adaptación previa de los microorganismos al sustrato para evitar esa etapa de latencia cuando lleguen a las cubas de fermentación. A las 4 horas aproximadamente, la levadura pasa de una etapa de crecimiento exponencial a una fase estacionaria, donde la población de levaduras ha llegado a su máximo valor admisible, lo que hace que se alcance un valor estacionario y que la fermentación se mantenga a una velocidad constante. Esta fase se alcanza cuando las bacterias empiezan a agotar los recursos que están disponibles para ellas. Normalmente, las células después de la fase estacionaria presentan una fase de muerte, donde la falta de azúcares o la elevada concentración de alcohol etílico empiezan a matar las levaduras y la población disminuye, con ello la velocidad de fermentación. Sin embargo, en el proceso FLA, la levadura está tan bien adaptada que como se observa en la figura 23 puede permanecer en estado estacionario varios ciclos, pues la idea del proceso es utilizar la levadura tantas veces como el estado de ésta lo permita. Al tener una mortandad casi nula es posible seguir utilizando la crema en otras fermentaciones. Al realizar el seguimiento completo de la fermentación se observo que el crecimiento de la levadura se daba desde una concentración inicial entre 40x106 células/ml hasta una etapa estacionaria o de terminación, con concentraciones entre 125x106 – 130x106 células/ml, valores que se pueden considerar altos en tan sólo 14 horas (se suprimen las dos horas finales correspondientes a la muestra del vino, que por centrifugación no contiene levaduras). 7.3. COMPARACIÓN DE LA FERMENTACIÓN PARA LAS DIFERENTES CUBAS Con base en la información recopilada, se hizo un comparativo de los parámetros promediados según la cuba de fermentación utilizada, demostrando que no hay diferencia significativa entre las cubas. Tabla 10. Promedio de la concentración de ATR y rendimiento del proceso para cada cuba. NÚMERO DE CUBA 1 2 3 4 Desviación Estándar

150,52 187,58 161,53 171,48

PROMEDIO CONCENTRACIÓN DE ATR DE CADAVINO (g/L) 24,91 22,26 22,63 25,85

15,83

1,74

PROMEDIO CONCENTRACIÓN INCIAL DE ATR (g/L)

63

RENDIMIENTOCONSUMO DE SUSTRATO (%) 83,42 88,13 85,99 84,93 1,98

Tabla 11. Promedio del grado de alcohol para cada cuba. NÚMERO DE CUBA 1 2 3 4 Desviación Estándar

PROMEDIO GRADO DE ALCOHOL DE CADA VINO (% v/v) 8,18 8,10 8,00 7,80 0,64

Figura 24. Comparación de los ATR iniciales, azúcares residuales y grado de alcohol para cada una de las 4 cubas.

En cuanto a la concentración de ATR al inicio del proceso fermentativo, se observa en la tabla 9 que todas las cubas comienzan con un contenido de azúcares totales reductores entre 150,52g/L y 187,58 g/L, pero existe una distancia considerable entre los datos, representada por una desviación estándar muy alta de 15,83. Como se está hablando de un proceso discontinuo, donde las cubas se van cargando a destiempo y no trabajan a la par, puede ser que la melaza con la que se cargue una cuba provenga de un lote diferente y por tanto, varíe su contenido de azúcares, también puede ser que las condiciones de almacenamiento cambien y afecten la calidad del sustrato o que el tratamiento que recibe la materia prima desde su transporte, su dilución, su acidificación e incluso su calentamiento puedan influir en el contenido de ATR de una cuba a otra. Cuando se habla de los azúcares finales se tienen valores más cercanos para todas las cubas, no hay gran diferencia, manteniéndose en un rango entre 22, 26g/L y 25,85 g/L. Pero entonces surge la pregunta de si los azúcares al comienzo son tan variables y disparejos entre las cubas, ¿por qué los azúcares al final de la fermentación se parecen tanto y no 64

cambian significativamente de una cuba a otra? Esto puede responderse teniendo en cuenta que la levadura trabaja según las condiciones dadas, y a pesar de que una cuba tenga muchos azúcares fermentables el inicio, si no se controlan correctamente otros parámetros como el pH y la temperatura, sus azúcares al final serán los mismos que los de otra cuba que pudo contener con una carga menor de ATR pero cuyas condiciones fueron las mejores para el trabajo microbiano. Pero esta tan sólo es una hipótesis, porque al rededor de esta pregunta pueden generarse otras dudas, que deben resolverse con más estudios. Por otro lado, todas las cubas presentan rendimientos superiores al 83%, que reflejan un proceso de fermentación ideal. Sin embargo, siguen existiendo incoherencias, pues cuando se compara el valor más alto del rendimiento correspondiente a la cuba 2 (88,13%) con el porcentaje de alcohol promedio de esa misma cuba que es 8,10 v/v (tabla 10), es posible darse cuenta que éste no es el valor más grande para el alcohol, pues la cuba 1 alcanza un 8,18% v/v de alcohol. Es decir, aunque el porcentaje de consumo de azúcares fermentables sea muy bueno y se alcance un rendimiento muy alto, esto no garantiza que se esté produciendo el mejor porcentaje alcohólico. 7.4. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES TOTALES REDUCTORES EN MELAZA DE CAÑA DE AZÚCAR Estas pruebas se hicieron con el fin de medir la diferencia existente entre los ATR que se reportan por el método de Fehling y los ATR que se obtienen cuando se aplica el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico o DNS. Para ellos se tomaron únicamente 5 muestras de melaza, pues el propósito no era mirar la reproducibilidad de los datos, ni hacer análisis estadísticos, sino simplemente mirar si había distancia entre los datos según el método. Se consideró una densidad de 1.3600g/ml, partiendo de unos grados Brix de 72 (valores tomados de la gráfica disponible en el anexo). Tabla 12. Resultados de los ATR utilizando los métodos de Fehling, DNS y HPLC. AZÚCARES TOTALES REDUCTORES MUESTRAS

FEHLING

DNS

HPLC

09/05/2012

48,70%

662,32 g/l

40,80%

555 g/l

-

-

11/05/2012

47,70%

648,72 g/l

41,54%

565 g/l

40,15%

546,10 g/l

14/05/2012

48,00%

652,80 g/l

43,38%

590 g/l

-

-

15/05/2012

48,00%

652,80 g/l

41,17%

560 g/l

-

-

23/05/2012

48,00%

652,80 g/l

41,91%

570 g/l

-

-

65

Complementariamente al análisis por Fehling y DNS, se solicitó al Grupo de Biotransformación de la Universidad de Antioquia el análisis de la segunda muestra por medio del método de HPLC.

Figura 25. Muestras de melaza analizadas por DNS.

Como se observa en la tabla 12, hay una diferencia notable en las concentraciones de los azúcares totales reductores según el método analítico que se utilice. Sin embargo, si se compara el 41,54% del DNS y el 40,15% del HPLC se evidencia que no hay una distancia grande entre ambos métodos. Por otro lado, tanto el DNS como el HPLC reportan valores más bajos que lo reportado con el método de Fehling, esto puede deberse a que el Fehling identifica como azúcares reductores otros compuestos que realmente no lo son; además como es un procedimiento manual donde el resultado final es detectado no por un equipo sino por el ojo humano, es posible que existan ciertas errores implícitos en la misma aplicación del método. Finalmente, es muy cuestionable que los resultados de las tres últimas muestras sean tan diferentes entre sí cuando se analizan con DNS (590, 560 y 570 g/L), pero si se analizan con el método de Fehling dan exactamente lo mismo (652,80g/L). Esto no refleja la naturaleza real de la melaza, pues de una muestra a otra la cantidad de azúcares puede variar significativamente por su heterogeneidad. Si sólo se mira el método de Fehling, la melaza sería muy constante en su composición y tendría un alto contenido de azúcares reductores, sin ser esto cierto del todo.

66

8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 

A partir del análisis estadístico sobre el comportamiento general de todas las cubas, puede decirse que los parámetros, que se mantienen durante todo el tiempo de fermentación son el pH y la temperatura. El rango de variación de estos datos en un ciclo fermentativo es muy pequeño: 0,11, 1,40 y 0,78 para el pH, la temperatura de carga y la temperatura final, respectivamente. Lo que indica que ya están prácticamente estandarizados para el proceso, teniendo identificados sus valores óptimos como sigue pH: está entre 4,5 – 5,0 con un óptimo de 4,6, temperatura de carga está entre 27 – 31ºC con un óptimo en 29°C y temperatura final del proceso está entre 33 – 36ºC con una marcada tendencia hacia un temperatura óptima de 35ºC.



Como era de esperarse, los grados Brix junto con la concentración de azúcares totales reductores (ATR) disminuyen a medida que avanza el proceso fermentativo, mientras van aumentando los grados de alcohol del mosto. Para un tiempo aproximado de 16 horas de fermentación se espera un vino con un promedio de 8,0% v/v de alcohol.



La concentración de azúcares fermentables al inicio del proceso es muy inestable, con un rango de variación entre 134 - 200 g/L aproximadamente. Esto se debe a que la melaza que llega diariamente a la planta presenta unas características bastante heterogéneas; así un día se puede recibir una melaza de alta calidad con un buen contenido de azúcares fermentables, pero al día siguiente puede trabajarse con una melaza diluida y con una gran carga de sólidos, aspectos que influyen directamente en la capacidad de la levadura de consumir el sustrato durante la fermentación.



A pesar de que los azúcares residuales se mantienen en un promedio entre 19-26g/L para todas las cubas, el rendimiento del proceso de fermentación en cuanto a consumo de sustrato es muy alto. Se tiene que en promedio es del 85%, un valor ideal que representa la eficiencia y eficacia de la levadura para transformar los azúcares en altos contenidos de alcohol, utilizando tiempos muy cortos.



La levadura de la FLA presenta un crecimiento celular acorde a lo reportado en la literatura, pero se caracteriza por no presentar una fase de latencia gracias a los cultivos que se hacen en los prefermentadotes que facilitan la adaptación del microorganismo al medio. Además, se comprobó que por más levadura que se adicione a las cubas, o por más tiempo que se deje trabajando, el recuento de 67

levadura llega a una fase estacionaria donde no cambia, permanece en una máxima densidad celular entre los 120 – 130 millones de células/ml. 

No existe diferencia significativa entre el comportamiento de la fermentación para las diferentes cubas, pues todas trabajan bajo parámetros similares, aunque varíe un poco el contenido de azúcares al inicio, pero es por la misma inestabilidad de la melaza.



Los métodos analíticos que se emplean para la evaluación de los ATR de la melaza de caña de azúcar arrojan resultados muy diferentes. El DNS y el HPLC son los procedimientos más confiables históricamente, pero en la FLA sigue utilizándose por norma el Fehling.



Cada vez se hace más necesario replantear y estandarizar procedimientos analíticos precisos, de elevada productividad, reproducibilidad y de poca manipulación técnica que permitan llevar con exactitud la valoración de la calidad del sustrato.

68

9. REFERENCIAS 1. TORTORA, Gerard; FUNKE, Berdell y CASE, Christine. Introducción de a la microbiología. Editorial Médica Panamericana. Novena edición, pp. 134-137. Buenos Aires: 2007. 2. VAN-HOLDE, Mathews. Bioquímica. Editorial Mc Graw-Hill Interamericana. Segunda edición. Bogotá: 1999. 3. USSEGLIO-TOMASSET, L. Química Enológica. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid: 1998. 4. PRESCOTT, Samuel C. y DUNN, Cecil G. Industrial microbiology. McGrawHill. Tercera edición. 1959. 5. MAYER, Ludwing. Métodos de la industria química en esquemas de flujo en colores. Editorial Reverté S.A. pp. 149. Barcelona: 1987. 6. BROCK, Thomas, MADIGAN, Michael y MARTINKO, John. Biología de los microorganismos. Décima edición. Prentice Hall. 7. VÁSQUEZ, H.J. Fermentación alcohólica: Una opción para la producción de energía renovable a partir de desechos agrícolas. Ingeniería, Investigación y Tecnología VIII. pp.249-259, 2007. 8. ERTOLA, Rodolfo. Microbiología Industrial – Ebook. Biología UNALM. Programa Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico de la OEA. Buenos Aires: 2007. 9. FIECHTER, A. Physical and chemical Parameters of Microbial Growth. Advances in Biochemical Engineering v. 30, pp. 7-60. Springer-Verlag, 1984. 10. PALACIOS-LLANES, Hernán. Fabricación de alcohol. Salvat Editores S.A. Madrid: 1956. 11. FAJARDO, Erika y SARMIENTO, Sandra. Evaluación de la melaza de caña como sustrato para la producción de Saccharomyces cerevisiae. Facultad de Ciencias Básicas. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá: 2007. 12. DORAN, Pauline. Bioprocess Engineering Principles. Academic Press: 1995. 13. BAI, F.W., ANDERSON, W.A. y MOO-YOUNG, M. Ethanol fermentation technologies from sugar and starch feedstocks. Biotechnology Advances v. 26, pp. 89–105: 2008. 14. HERNÁNDEZ, Maria Teresa. Tendencias actuales en la producción de bioetanol. Facultad de Ingeniería. Universidad Rafael Landívar. Boletín Electrónico No. 08. Guatemala: 2007. 15. NIETO, Hernán. Evaluación de las condiciones de la fermentación alcohólica utilizando Saccharomyces cerevisiae y jugo de caña de azúcar como sustrato para obtener etanol. Universidad Estatal de Bolívar. Ecuador: 2009. 16. MURILLO MOSQUERA, Iliana. Alternativas de aprovechamiento de la crema de levadura reproducida y sobrante en el área de fermentación de la industria licorera de caldas. Universidad Nacional de Colombia. Manizales: 2003. 69

17. D'AMORE, T. y STEWART, GG. Ethanol tolerance of yeast. Enzyme Microbiology Technology, V. 9, pp. 322–30: 1987. 18. CARBALLO, F. (2000). Microbiología Industrial. Madrid, España. Editorial Arcribia. 19. CARPENTER, P. (1969). Microbiología Segunda Edición. Mexico, DF. Editorial Interamerica, S.A. 20. GAMAZO, C. LÓPEZ, I. y DÍAZ, R. (2005). Microbiología. Tercera edición. Barcelona España. Masson S.A. 21. HIDALGO T., José. Tratado de enología. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid: 2002. 22. PATRASCU, Elena; RÂPEANU, Gabriela; BONCIU, Camelia; VICOL, Constanta y BAHRIM, Gabriela. Investigation of yeast performances in the fermentation of beet and cane molasses to ethanol production. Ovidius University Annals of Chemistry, V. 20, No. 2, pp.199-204: 2009. 23. ZECH, Manfred y GÖRISCH, Helmut. Invertase from Saccharomyces cerevisiae: Reversible inactivation by components of industrial molasses media. Enzyme and Microbial Technology, V. 17, pp. 41-46: 1995. 24. UNDERKOFLER, Leland A. y HICKEY, Richard J.Industrial fermentations. Chemical Publishing Co. Nueva York: 1954. 25. CRUZ LÓPEZ, M. Proceso biotecnológico del alcohol. Revista Virtual Pro, Bogotá: 2006. 26. ARÉVALO, Sonia. Optimización de la producción del agente de biocontrol Candida sake (CPA-1). Tesis de doctorado. Universidad de Lleida. España: 1998. 27. CASTRO, M. Estudio de la melaza de caña como sustrato de la fermentación acetobutílica. Tesis pregrado en ingeniería química. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá: 1993. 28. SWAN, H. y KARALAZOS, A. Las melazas y sus derivados. Revista Tecnología. España: 1990. 29. ZINN, R.A. Guía para mezclado de ingredientes. Universidad de California, Los Ángeles: 2002. 30. HONIG, P. Principios de Tecnología Azucarera. Compañía Editorial Continental. Segunda Edición. México: 1974. 31. ARIZA, B. y GONZÁLEZ, L. Producción de Proteína Unicelular a partir de levaduras y melaza de caña de azúcar como sustrato. Tesis de pregrado de Bacteriología. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá: 1997. 32. GNECCO, José. Nota técnica: El precio de la melaza continúa creciendo. SUCROMILES S.A. Cali: 2006. 33. DOMINGUES, L., et al., Applications of yeast flocculation in biotechnological processes. Biotechnology and Bioprocess Engineering. pp. 288-305: 2000. 34. ZHAO, X.Q. y F.W. Bai, Yeast flocculation: New story in fuel ethanol production. Biotechnology Advances. pp. 849-856: 2009. 35. JIN, Yun-Lai y SPEERS, R. Alex. Flocculation of Saccharomyces cerevisiae. Food Research International. pp. 421-440: 1998. 70

36. BAUER, Florian, GOVENDER, Patrick y BESTER, Michael. Yeast flocculation and its biotechnological relevante. Applied microbiology and biotechnology, V. 88. pp. 31-39: 2010. 37. QUINTERO, Rodolfo. Ingeniería Bioquímica. Editorial Alambra. Primera edición. México: 1981. 38. MILLER, Gail Lorenz. Use of Dinitrosalisyc Acid Reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, V. 31. pp. 426-428: 1959. 39. ROUTH, J. Eyman. Compendio esencial de Química General, Orgánica y Bioquímica, tomos I y II. Editorial Reverté. Segunda edición. Bogotá: 1990. 40. GODOY, R. Método DNS para la determinación de azúcares reductores totales en melaza, sustrato de fermentación y vinos. Manual de métodos analíticos. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá: 2002. 41. BIART J. R. Manual de Técnicas analíticas de las plantas de Levadura, ICIDCA (Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar): 1976. 42. BELLO, Daniel, CARRERA, Emilia y DÍAZ, Yuset. Determinación de azúcares reductores totales en jugos mezclados de caña de azúcar utilizando el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico. Revista ICIDCA: Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar, V. 40. pp. 45-50: 2006. 43. NAJMUS, Abdul y WHITNEY, Philip. Differential behaviour of the dinitrosalicylic acid (DNS) reagent towards mono- and di-saccharide sugars. Biomass and bioenergy. V. 35. pp. 748 -750: 2011. 44. Determinación de azúcares residuales, Metodo DNS. Manual de laboratorio grupo biotransformación UdeA. 45. FIGUEROA, Mildred. Comparación de la reproducibilidad de dos métodos para la determinación de azúcares reductores en jugo de caña de azúcar. Tesis pregrado. Universidad de San Carlos. Guatemala: 2000. 46. BERG, Jeremy, STRYER, Lubert y TYMOCZKO, Jhon. Bioquímica. Editorial Reverté S.A. Sexta edición. Barcelona: 2008. 47. MEADE, George P. Manual del Azúcar de Caña: para fabricantes de azúcar de caña y químicos especializados. 9 Ed. Barcelona: Montaner y Simon S.A.. Copyright 1963. 48. HERRERA, Ana C. Estudio comparativo de métodos para la determinación de sacarosa y azúcares reductores en miel virgen de caña utilizados en el ingenio Pichichí S.A. Universidad Tecnológica de Pereira: 2011. 49. NOVALES, Juan Fernández, LÓPEZ, María Isabel y otros. Shortwave-near infrared spectroscopy for determination of reducing sugar content during grape ripening, winemaking, and aging of white and red wines. Food Research International vol. 42 (Córdoba. España: 2009) pág. 285–291 50. SARTINI, Raquel, OLIVEIRA, Claudio y otros. Determination of reducing sugars by flow injection gravimetry. Centro de Energía Nuclear en Agricultura, Universidad de Sao Paulo. Analytica Chimica Acta 366 (Brasil: 1998) 119-125 51. Mc MURRY. Quimica orgánica. Thomson editores. Quinta edición. México: 2001. 71

52. MONTE ALEGRE, R., RIGO, M. y JOEKES, I. Ethanol fermentation of a diluted molasses medium by Saccharomyces cerevisiae immobilized on chrysotile. Brazilian Archives of Biology and Technology. V.46. pp. 751-757: 2003. 53. SÁNCHEZ, Óscar y CARDONA, Carlos. Producción biotecnológica de alcohol carburante I: obtención a partir de diferentes materias primas. Revista Interciencia INCI, V.30. N° 11. Caracas: 2005.

72

10.

ANEXOS

73