MICROBIOLOGÍA

CASO CLÍNICO: TINCIÓN DE GRAM EN SANGRE PERIFÉRICA PARA EL ESTUDIO DE FIEBRE DE ORIGEN DESCONOCIDO Margaret Ordóñez Smith de Danies*, Gustavo Garnica Quintero**, Emily Danies Ordóñez***, Jorge Mario Rodríguez Fernández****.

RESUMEN

P

aciente femenina de 21 años con cuadro clínico de fiebre persistente por mes y medio asociado a fractura de cráneo secundaria a accidente automovilístico. Consultó tres centros de salud sin poder esclarecer el factor etiológico, a pesar de hacerle múltiples hemocultivos para gérmenes aerobios que bajo los estándares de Bacteriología, todos fueron negativos. Además se realizaron varios estudios diagnósticos y manejo de múltiples tratamientos. El médico tratante asegura un mal pronóstico oscilando entre 3 a 5 días fallecía. Se realiza un hemocultivo modificado para bacterias anaerobias estrictas, facultativas, aerobias y hongos, y a la vez se hace un frotis de sangre periférica de sangre total para la tinción de Gram. Se observan a 100X estructuras de hongos y bacterias, iniciándose el mismo día tratamiento antimicótico. A los dos días siguientes se confirma el crecimiento de Serra-

* Microbióloga y Bacterióloga de la Universidad de Los Andes, Especialización en Microbiología e Inmunología de la Universidad Federal de Río de Janeiro, Brasil, Master en Microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana y Doctorado en Biología de la Atlantic International University, EU. Directora Instituto de Microbiología Colombiano Ltda. [email protected] ** Médico, Neurólogo y Neurocirujano de la Pontificia Universidad Javeriana y Nancy-Université de Francia, fallecido el 26 de agosto de 2005. *** Médica General de la Pontificia Universidad Javeriana. Asistente de investigación en NYU -Universidad de New York, Langone Medical Center, EU [email protected] **** Médico General de la Pontificia Universidad Javeriana. Científico asistente en investigación NYSPI- Columbia University Medical Center NY. EU [email protected]

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tia marcescens y a los 10 días de Candida albicans. La paciente al finalizar el tratamiento tiene resolución completa del cuadro clínico. Dada la simplicidad, facilidad, rapidez y efectividad de esta técnica diagnóstica económica, se desea resaltar la utilidad de realizarla en escenarios clínicos con casos de fiebre de origen desconocido como lo puede ser las unidades de cuidado intensivo, salas de urgencia y hospitalización. Palabras clave: Fiebre de origen desconocido, Frotis de Gram, Sepsis bacteriana, Candidemia. TRABAJO ORIGINAL INTRODUCCIÓN El objetivo de presentar esta nueva técnica de “Frotis de Gram en sangre total para septicemias y bacteremias”, es dar a conocer un análisis muy sencillo, rápido, útil, económico y valioso en el cual después de 5 a 10 minutos permite dar un diagnóstico en los casos de una bacteremia o septicemia. Considerando el manejo en equipo con el cuerpo médico, permite informar cuál es el germen causal y de esta manera iniciar tratamiento empírico, ahorrando días de estancia hospitalaria, evitando el uso indiscriminado de antibióticos de amplio espectro y obteniendo economía por parte de medicamentos y exámenes de diagnóstico prolongados (1). En las sepsis siempre se debe de esperar mínimo dos a tres días porque no es factible que todos los laboratorios tengan un equipo costoso para que les informe en 48 a 60 horas el tipo de germen. El reporte del Gram de los hemocultivos positivos es de gran ayuda, Laboratorio Actual • No. 44 • Noviembre de 2013

con la nueva técnica no exige tiempo de espera para obtener el crecimiento del cultivo para dar un informe inicial (2, 3). Dentro de las guías prácticas de los laboratorios clínicos no se realiza un Gram o frotis directo de la sangre total (4). En los únicos casos que usamos sangre seca es cuando se busca parásitos con la gota gruesa o para ver la morfología de las células en el frotis de sangre periférica y se colorea con Wright (5). La propuesta es que esta nueva técnica de colorear con Gram la sangre total, se estandarice a nivel mundial para que todo laboratorio clínico o de Microbiología la pueda hacer, pues no requiere de tecnología de avanzada ni de equipos costosos. MATERIALES Y MÉTODOS

lisina O (ASO) de 625 UI, en el cultivo de garganta está la presencia de la Klebsiella oxytoca y Streptococcus no hemolítico. A los 52 días del accidente se hace un frotis de sangre periférico para colorear con Gram y se observan blastoconidias, micelios y bacilos Gram negativos (Figuras No. 1 y 2). Inmediatamente se da el tratamiento con Micostatin (Nistatina) 1gr/8 h. La paciente a los dos días mejora ya no tiene fiebre y a los dos días de la toma de los cultivos se confirma el crecimiento de Serratia marcescens y el antibiograma correspondiente al día siguiente sensible a Netromicina. Luego a los 10 días hay la presencia de Candida albicans. La paciente al finalizar el tratamiento tiene resolución completa del cuadro clínico.

CASO CLÍNICO Paciente femenina de 21 años, natural de Bello, Antioquia procedente de Bogotá quien ingresa a la Clínica Palermo con un cuadro de 15 días de evolución consistente en fiebre de 38.5˚C con un antecedente de trauma cráneo encefálico y hematoma subdural secundario a accidente autovolístico (23 de junio de 1982). La paciente fue atendida inicialmente en la Clínica Nicolás de Federman y posteriormente en el Instituto Neurológico con varios hemocultivos negativos realizados en cada centro de salud. A los 15 días del accidente ingresa levemente taquicárdica, febril (38.5˚C), orientada y con examen neurológico normal. Paraclínicos que muestran cuadro hemático normal, líquido cefalorraquídeo (LCR): negativo, parcial de orina (PO): negativo, antígenos febriles: negativos (a los 19 días del accidente), hemoparásitos: negativos por 7 días consecutivos, cultivo de garganta con Escherichia coli, hemocultivos negativos por 16 días. Tratamientos: recibe tratamiento antimicrobiano por 2 días con gentamicina y luego 6 días con cefalexina y cloranfenicol.

Figura No. 1. El frotis de sangre para hacer la coloración de Gram.

En la segunda hospitalización en la Clínica Palermo (a los 23 días del accidente) continua febril 38.5˚C, de­ sorientada temporo espacialmente. Es tratada con lincomicina y cloranfenicol por 12 días. A los 35 días del accidente continúa con la fiebre de 38.5˚C. Se encuentra en LCR Staphylococcus (no reportan su especie), en frotis de garganta hay Klebsiella oxytoca, realizan otros 10 días de hemocultivos consecutivos y todos negativos. Se da por 6 días clindamicina y sisomicina. A los 47 días del accidente continúa con fiebre de 38.5˚C, diarrea, ictericia, proteínas séricas de 4.09 gr%, leucocitos de 11.800 mm3, Hematocrito de 25%, Hemoglobina 8.1 g%, linfocitos atípicos 5%, antiestrepto-

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Figura No. 2. Imagen al microscopio óptico a 100X del frotis directo de la sangre total con las blastoconidias, micelios y bacilos Gram negativos.

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RESULTADOS DESCRIPCIÓN DE LAS TÉCNICAS DE LABORATORIO

tificaciones de los gérmenes se hacen de acuerdo a las normas de Microbiología (9, 10, 11).

La técnica nueva de realizar un frotis de sangre total o sangre periférica y colorearlo con la tinción de Gram, nació un miércoles de junio de 1982, al presentarse el cuadro de una paciente con fiebre de origen desconocido manejada con múltiples tratamientos antibióticos sin mejoría manejada en prestigiosas instituciones. Una colega solicita que: “se le haga un hemocultivo anaerobio estricto porque una familiar de 21 años tuvo una fractura de cráneo, tiene fiebres de 38˚C 40˚C y ningún antibiótico le ha funcionado; está que se muere porque le han realizado unos 40 o más hemocultivos desde hace mes y medio en prestigiosas instituciones y ya le dijeron al marido que le avisara a los parientes para el entierro porque no creían que viviría más de 3 a 5 días”. Cuando se le tomó la muestra se realizó cultivos para anaerobios, facultativos, aerobios y hongos, y se hizo el extendido de frotis periférica de sangre recién tomada de la vena, aunque no es una técnica estándar. La paciente estaba totalmente inconsciente, fue bastante difícil la toma de sangre tocó de la pierna. Gram: En el caso de fiebres altas, es muy útil el frotis de la sangre, se puede hacer al puncionar el dedo o de la vena cuando se van a realizar otros análisis. Y de ahí extraer una gota para realizar un extendido como si fuese un frotis de sangre periférica. (1, 6, 7). Luego se fija con calor o metanol y se hace la Coloración de Gram (Violeta de Gram, Lugol de Gram, alcohol acetona y safranina) (8) (Figura No. 1). Se observa con aceite de inmersión a 100X las estructuras de los hongos y bacterias (Figura No. 2). Cultivos: Inmediatamente se tomó la muestra de sangre de la paciente, se inocularon varias gotas de sangre en los diferentes medios de cultivo sólidos y líquidos. Y en los sólidos se hizo aislamiento con el asa bacteriológica en forma de agotamiento. No se empleó los medios estandarizados para hemocultivos como las botellas de Ruiz Castañeda por no tenerlas en ese momento. Se incuban los medios de cultivo en varios ambientes atmosféricos: aerobios (agar sangre, agar McConkey, agar XLD, agar CLED con indicador de Andrade, agar selectivo para Gram positivos y negativos); en facultativo el caldo tioglicolato y agar chocolate; y en la jarra de anaerobiosis con el gas generador correspondiente el caldo Schaedler, Medio de Carne Cocida y el agar Wilkins Chalgren y para hongos el agar Sabouraud y agar Dermasel. A los dos días, creció en el agar chocolate la Serratia marcescens. Pasados 10 días en el agar Sabouraud la Candida albicans (Figura No. 3). Las iden-

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Figura No. 3. Cultivo de la Candida albicans.

Antibiograma por el método de difusión en disco: Dicho procedimiento se realizó de acuerdo a la estandarización de Kirby Bauer y CLSI (Clinical Laboratory Standards International) (antes NCCLS) en 3 cajas de Petri con agar Mueller Hinton, cada caja con 8 antibióticos diferentes y dieron 23 antibióticos resistentes. Se obtiene la sensibilidad a la netromicina. (10, 11). DISCUSIÓN

Los diagnósticos diferenciales fueron:

• Cráneo encefálico y fractura de cráneo con posible hematoma subdural. • Meningitis. • Hemoparásitos. • Fiebre tifoidea o paratifoidea. • Fiebre reumatoidea. • Brucellosis. Diagnóstico final Septicemia por Candida albicans y Serratia marcescens. La septicemia es una de las principales causas de morbilidad en las unidades de terapia intensiva, se origina por bacterias, hongos o virus, los agentes causales son las bacterias Gram negativas, las endotoxinas constituidas por lipopolisacáridos origina el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica. Otras reacciones similares se deben a exotoxinas de bacterias Gram positivas, las cuales están compuestas por: peptidoglucanos, ácido lipoteicoico, lipoproteínas, ADN, glucolípidos, fragmentos de la pared celular, enterotoxinas, proteasas, virus y levaduras (12). Bacteremias se definen como presencia de bacte-

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rias viables en sangre, confirmada por medios de cultivos y puede ser transitoria Ruimy R. et al. (13) afirman que la presencia de una bacteria como el Staphylococci en un extendido no significa que se diagnostique una bacteremia, porque puede haber cocos Gram positivos coagulasa negativo de la piel. En Estados Unidos Flayhart D. et al., presentaron un estudio (14) en que atribuyen la mortalidad del 20% al 50% a las bacteremias. Estudio microbiológico La coloración de Gram ha sido una tinción muy útil desde hace muchos años. Appelbaum (15) describe en orinas el Gram cuantificado y es muy preciso para poder saber el tipo de bacteria y es claro que conociendo el Gram se puede dar el tratamiento apropiado. (15,16,17,18,19). Tabla No. 1. Incidencia de los gérmenes aislados en los hemocultivos de la Clínica Pediátrica Eusalud de Ordóñez Smith M. et al. 2012 (30). Número de casos

Porcentaje

Staphylococcus aureus

3

5.0

Staphylococcus no coagulasa

44

73.3

Streptococcus no hemolítico

1

1.6

Escherichia coli

4

6.6

Enterobacter cloacae

2

3.3

Citrobacter freundii

2

3.3

Klebsiella pneumoniae

2

3.3

Klebsiella oxytoca

2

3.3

Total

60

99.7

Bacteria

La realización de esta nueva técnica permitió esclarecer el diagnóstico de manera pronta al igual que el inicio del tratamiento. La etiología de la resistencia de la Serratia coincide con Bodey GP (20) que encontró con esta bacteria en septicemias, con un patrón de resistencia antimicrobiana en pacientes de cáncer en los Estados Unidos. En el Japón Ikegaya S. et al. (21) reportaron un paciente de 77 años con diagnóstico de septicemia por Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus meticilino resistente con refractariedad al tratamiento, hicieron un análisis de frotis de sangre periférica observaron pseudohifas, inmediatamente inician antimicóticos aunque lamentablemente murió. Después de varios días en el hemocultivo creció Candida albicans y en su autopsia se observaron los hongos. Desde hace varios años se sabe que la Candidemia produce bastante morbilidad y mortalidad sobre todo en los pacientes inmunocomprometidos (22, 23, 24, 25, 26, 27) o cuando han tomando antibióticos la flora intestinal se descompensa y comienza la diarrea, en el estudio de gastroenteritis se encontró un 41.2% de Candida albicans y 21.1% de Candida no albicans (28). Nuestra paciente también presentó diarrea (en el día 47 de su accidente autovolístico) porque se le habían dado varios antibióticos. Elouennass M. et al. 2008 (29) en Francia estudiaron entre el 2002 al 2005 la incidencia de las bacterias en una unidad de cuidado intensivo y se encontró que el 49.3% eran por bacterias Gram negativas y el 46.85% por cocos Gram positivos. La bacteria más frecuente fue Acinetobacter baumannii (13.63%), Staphylococcus aureus (12.6%), Staphylococcus epidermidis (12.6%),y Pseudomonas aeruginosa (7%). En Colombia Ordóñez

Tabla No. 2. Incidencia a nivel mundial de la septicemia y las bacterias aisladas.

Fecha

Autor

País/Población

Incidencia

Porcentaje

2012

Viswanathan (31)

India Neonatos en rural y urbano urbano

Klebsiella pneumoniae Gram negativos no fermentadores

38.3 42.1

2012

Ordóñez Smith M. et al. (30)

Colombia

Staphylococcus no coagulasa Escherichia coli Staphylococcus aureus

73.3

Clínica Pediátrica

6.0 5.0

2012

Micek S. et al. (32)

Estados Unidos

Escherichia coli Klebsiella pneumoniae

30.8 23.2

2012

West B. A. et al. (33)

Africa sub-Sahara Neonatos

Klebsiella pneumoniae Staphylococcus aureus

58.0 20.4

2012

Suárez-García (34)

España Un caso de bacteremia

Lactobacillus jensenii

2011

Shorr AF et al. (35)

Estados Unidos hospitalizados

Escherichia coli Pseudomonas sp

55.1 17.1

2011

Serhan A. A. et al. (25)

Jordania hospitalizados

Staph epidermidis Gram negativos

47 35

Un caso

(Continúa)

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(Continuación Tabla 2)

Fecha

Autor

País/Población

Porcentaje 5 4.5 2.8 1.0 1.4 1.4 46.85 49.3

2008

Elouennass (29)

Francia Servicio de reanimación

Gram positivas Gram negativas

2006

Morrison (36)

Estados Unidos con cáncer

Gram positivas (Staphylococcus) Gram negativas (E. coli) Hongos

42 45 13

2006

Bodey (20)

Estados Unidos con cáncer

Serratia sp

52

2005

Espino Hernández M. et al. (37)

Cuba Neonatos

Cocos Gram Positivos

66.3

2005

Berkley (38)

Kenya Africa Neonatos

Escherichia coli Streptococci Grupo B

14 11

2004

Muller-Serieys (39)

Francia Bacteremia Gram Negativas

Escherichia coli Klebsiella spp

1998

Zamora (40)

México Neonatos

Cocos Gram Positivos

S. M. et al. (30) realizaron un estudio en una clínica pediátrica con pacientes desde neonatos hasta 12 años con una alta incidencia de las bacterias Gram positivas. Tabla No. 1. Veamos cómo a nivel mundial se observa la etiología de las septicemias en la Tabla No. 2, cinco de los catorce autores enunciados obtuvieron más casos de septicemia con bacterias Gram positivas y nueve de los catorce con Gram negativas. Por lo tanto, hay gran variabilidad de etiología bacteriana por eso es importante antes de dar el tratamiento hacer el Gram de la sangre total. CONCLUSIONES De acuerdo a nuestro caso clínico y de otros autores es bastante probable tener septicemias micóticas, en especial post-tratamientos antimicrobianos. El presente trabajo sugiere la posibilidad de realizar un frotis de sangre total para el estudio del paciente con fiebre desconocida, posiblemente este y futuros estudios muestren la importancia de aplicar esta técnica en urgencias y en cuidados intensivos, lo ideal es prevenir el uso de tratamientos empíricos sin un fundamento claro que pueden llevar a agravar la sintomatología del paciente séptico. Asimismo, todo laboratorio clínico con o sin recursos económicos debe tener en cuenta esta nueva técnica como parte de los procedimientos estándares. Si se trabajan con medios tradicionales se puede sembrar con gotas de sangre directamente y hay una probabilidad de obtener los gérmenes. Sería importante hacer un estudio comparativo de los hemocultivos en las botellas

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Incidencia Candida Cultivo mixto Enterococcus Staphylococcus Bacillus Difteroides

53.3 12.2 55

tradicionales con los medios sólidos. Los hemocultivos son demorados y dicho tiempo puede tener implicaciones nefastas para el paciente. Siempre debemos pensar en salvar vidas y eso se logra con un resultado oportuno y veraz. ¿Cuántos casos no se podrán salvar por hacer un simple frotis de sangre en un caso de fiebre elevada? BIBLIOGRAFÍA 1. Ordóñez Smith de Danies, M. Gram smear of whole blood for sepsis and bacteremia. New simple and inexpensive Technique. Atlantic International University Research for PhD program in Biology. 2012. 1-35. 2. Goodyear N. et al. A 2 year study of Gram stain competency assessment in 40 clinical laboratories. American Journal Clinical Pathology. 2006. 125. 1.28-33. 3. Lagacé-Wiens P. R. S. et al. Identification of blood culture isolates directly from positive blood cultures by use of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry and a commercial extraction system: analysis of performance, cost and turnaround time. Journal Clinical Microbiology. 2012. 50.10. 3324-3328. 4. Dallas S. American Society for Microbiology. ASM Meeting 2012. Worshop 05. The Gram stain: Making the most of the original real-time multiplex test. 5. Froom P., Havis R., Barak M. The rate of manual peripheral blood smear reviews in outpatients. Clinical Chemistry Laboratory Medicine. 2009. 47.11. 1401-1405.

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