PAPEL DE LOS ENZIMAS DE MACERACIÓN EN LA EXTRACCIÓN DE TANINOS DE LAS SEMILLAS Jiménez-Pascual, E.; Busse-Valverde, N.; Gómez-Plaza, E.; López-Roca, J.M.; Bautista-Ortín, A.B.

Departamento de Tecnología de Alimentos, Nutrición y Bromatología, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, Campus de Espinardo, 30071, Murcia. * [email protected], tel. 34968367323, fax 34968364147

RESUMEN Los taninos se encuentran en los hollejos y en las semillas de las uvas y son importantes en la calidad del vino tinto, ya que participan en las sensaciones de astringencia y amargor y en la estabilización del color. Los enzimas de maceración se han utilizado tradicionalmente para mejorar la extracción de compuestos fenólicos de los hollejos y no se ha determinado el papel que pueden jugar en la degradación de las semillas y extracción de sus compuestos fenólicos. En este trabajo se muestra el efecto de distintas actividades enzimáticas puras y un enzima comercial en la liberación de taninos de las semillas de uvas de las variedades Monastrell y Cabernet Sauvignon.

Los resultados obtenidos muestran que los enzimas de

maceración parecen favorecer la degradación de las paredes celulares de las semillas favoreciendo la salida de los taninos.

PALABRAS CLAVE: taninos, semillas de uva, maceración, enzimas de maceración.

ABSTRACT Tannins are localized in the grape skins and seeds and are important for red wine quality since they participate in astringency, bitterness and color stabilization. The maceration enzymes have been traditionally used to improve the extraction of phenolic compounds from skins, but their role on 1

the seed degradation and the phenolic compounds release have not been determined.

This work shows the effect of different pure enzyme activities

and a commercial enzyme in the release of tannins from seeds of Monastrell and Cabernet Sauvignon grape varieties. The results demonstrate that the maceration enzymes seem to favour the degradation of seed cell walls, promoting the diffusion of tannins.

KEYWORDS: tannins, grape seeds, maceration, maceration enzymes

INTRODUCCIÓN Los taninos están localizados en los hollejos y semillas de la uva y su concentración y composición dependen del tejido donde se encuentren (Bourzeix et al., 1986; Ricardo da Silva et al., 1991). Las semillas contienen mayor concentración de taninos que los hollejos y mayor proporción de unidades galoiladas (Labarbe et al., 1999; Prieur et al., 1984), mientras que los hollejos contienen subunidades de epigalocatequina en su estructura (Labarbe et al., 1999; Souquet et al., 1996) y presentan mayor grado de polimerización que los taninos de las semillas (Cheynier et al., 1997; Moutounet et al., 1996). En el hollejo, los taninos se encuentran en las vacuolas como taninos condensadas, ligados a la membrana proteofosfolipídica e integrados en la pared celular (Amrani Joutei y Glories 1994). En las semillas, los taninos ocupan una posición de defensa del embrión, estando presentes en la epidermis, la parte media del tegumento externo y la capa interna del tegumento interno (Cadot et al., 2006). Los flavanoles monoméricos están concentrados en el tegumento externo, por tanto, estos compuestos deberían ser particularmente extraídos durante el proceso de elaboración del vino. Cadot et al. (2006) indicaron que la zona que se encuentra entre la cutícula y las capas internas lignificadas del tegumento externo son, tal vez, las más importantes en cuanto a la concentración de polifenoles, ya que ellas contienen la mayor parte de compuestos solubles. La presencia del tegumento medio, el cual es impermeable y muy duro, podría impedir la extractabilidad de los compuestos fenólicos del tegumento interno durante el proceso de elaboración del vino. 2

Durante el proceso de maceración, estos compuestos pasan al mostovino. La extracción de taninos del hollejo, al igual que para los antocianos, requiere la degradación de las paredes celulares y están presentes en el mosto-vino desde el inicio de la maceración. Se trata esencialmente de un proceso de difusión y la extensión del mismo depende de su concentración, de la composición de las paredes celulares y el método de elaboración (Ortega-Regules et al., 2006;

Busse-Valverde et al., 2010). En cambio,

parece ser, que los taninos de las semillas solo serán extraídos hacia el final del proceso de maceración, cuando los lípidos de las semillas sean eliminados (Glories y Saucier, 2000) por la presencia de altos contenidos de etanol. Los taninos son importantes en la calidad del vino tinto, ya que ellos participan en las sensaciones de astringencia y amargor (Gawel, 1998; Vidal et al., 2003) y en la estabilización del color (Cheynier et al., 2006). Estas sensaciones dependen del grado medio de polimerización de los taninos, es decir del tamaño medio de estos compuestos, y especialmente de la composición de los mismos, de tal manera que la astringencia es mayor al incrementar el grado medio de polimerización y el porcentaje de galoilación de los taninos (Llaudy et al., 2004). En cambio, la presencia de unidades de epigalocatequina en los taninos parece disminuir esta percepción en el vino (Vidal et al., 2003; Fernández et al., 2007). Por ello, los taninos de los hollejos se han considerado mejores organolépticamente que los taninos de las semillas y la utilización de diferentes técnicas de elaboración han buscado ayudar a modular la proporción de taninos de hollejos y semillas en los vinos. Una de estas técnicas de elaboración es el uso de enzimas de maceración. El efecto de estos enzimas sobre los antocianos y el color de los vinos tintos ha sido ampliamente estudiado, aunque a veces los resultados han sido contradictorios (Canal-Llaubères y Pouns, 2002; Pardo et al., 1999; Revilla y Gonzalez-Sanjose, 2002; Watson et al., 1999; BautistaOrtín et al., 2005). Por el contrario, apenas se ha estudiado su papel en la extracción de taninos, aunque algunos autores han encontrado un aumento de estos compuestos en vinos donde se han utilizado enzimas de maceración (Bautista-Ortín et al., 2005, Romero-Cascales et al., 2008; GilMuñoz et al., 2009; Ducasse et al., 2010), resultados que se han atribuido a 3

una mayor degradación de las paredes celulares del hollejo, ya que la acción de los enzimas sobre la extracción de polifenoles de las semillas no ha sido todavía demostrada. El objetivo de este estudio pretende conocer si las actividades enzimáticas normalmente presentes en los enzimas de maceración comerciales, así como un producto comercial que integra varias de estas actividades, actúan en la liberación de los taninos de las semillas de uvas de las variedades Monastrell y Cabernet Sauvignon.

MATERIALES Y MÉTODOS El material vegetal de estudio ha sido semillas de uvas de las variedades Monastrell y Cabernet Sauvignon, cultivadas en secano en una parcela de la D. O. de Jumilla, pertenecientes a la bodega Finca Omblancas. Las uvas presentaban un grado de maduración entorno a 15 º Be. 0.5 g de semillas de ambas variedades fueron maceradas con 15 mL de dos soluciones modelo: una acuosa (5 g/L de ácido tartárico) y otra hidroalcohólica (12,5% etanol y 5 g/L ácido tartárico), ambas ajustadas a pH 3,6. La extracción se llevó a cabo en un agitador magnético a 700 rpm y a temperatura ambiente durante 48 horas, todo ello en oscuridad. Transcurrido el tiempo de extracción, el sobrenadante fue separado y filtrado usando filtros de Nylon de 0,2 μm. Posteriormente, 4 mL del extracto filtrado fueron concentrados en un centrivap (Labconco, USA) a 50º C durante 8 horas. El extracto seco obtenido fue redisuelto en 0,8 mL de metanol. También se realizaron ensayos con diferentes enzimas, 4 puros y un enzima comercial, usado normalmente en el proceso de elaboración de los vinos tintos, para poder comprobar si este tiene algún efecto en la extracción de taninos de las semillas: xilanasa, celulasa, poligalacturonasa y pectínmetilesterasa (Sigma Aldrich) y Enozym vintage (Agrovin, Alcazar de San Juan) con actividad poligalacturonasa, pectínliasa, pectínesterasa y βglucanasa. Todos los ensayos fueron realizados por triplicado. Para poder tener información sobre el contenido, porcentaje de galoilación y grado medio de polimerización de los taninos (GPm) en semillas de uva se ha utilizado el método de la fluoroglucinolisis propuesto por Kennedy y Jones (2001). Este método está basado en la ruptura de los 4

enlaces interflavánicos en medio ácido y en presencia de un agente nucleofílico (fluoroglucinol), seguido de un análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de los productos de reacción según el método propuesto por Busse-Valverde et al. (2010). El tratamiento estadístico de los datos se ha realizado utilizando el paquete estadístico Statgraphics 5.0 Plus.

RESULTADOS Las Tablas 1 y 2 muestran el contenido y composición de los taninos en las soluciones control; acuosa (SA) e hidroalcohólica (SH) tras el proceso de maceración de las semillas de las variedades Monastrell y Cabernet Sauvignon y el papel de las diferentes actividades enzimáticas. Los resultados muestran que se obtienen altos contenidos de taninos tras el proceso macerativo, incluso cuando el medio extractante no contiene etanol, demostrándose que no es crucial la presencia de etanol en el medio para que se extraigan los compuestos fenólicos de las semillas, contrariamente a lo comentado por otros autores (Singleton y Draper, 1964; Llaudy et al., 2004; Cerpa-Calderón y Kennedy, 2008). De todas formas, se observa que en presencia de alcohol se consigue extraer mayor cantidad de proantocianidinas de las semillas, siendo dicho incremento del 43% para Monastrell y del 80% para Cabernet Sauvignon. El alcohol favorece la eliminación de los lípidos que recubren la semilla (Glories y Saucier, 2000), promoviendo además, una mayor degradación de la cutícula y de las paredes celulares de las células donde se encuentran presentes los taninos y favoreciendo la difusión de los mismos al medio. González-Manzano et al. (2004), en estudios realizados con soluciones modelo, observaron también una ligera extracción de taninos de bajo grado de polimerización de las semillas en ausencia de alcohol, incrementándose la cantidad liberada notablemente con el tiempo de contacto y la concentración de etanol en el medio. En la misma línea, De Freitas et al. (2000) también encontraron un incremento importante de los taninos de las semillas en vinos de Cabernet Sauvignon tras la etapa de maceración post-fermentativa como resultado de un mayor contacto de las mismas con el alcohol obtenido durante el proceso de fermentación. 5

Los contenidos de taninos obtenidos en este estudio son mucho más grandes que los encontrados por Cosme et al. (2009) para vinos de Cabernet Sauvignon a lo largo de tres vendimias (289-776 mg/L) o por Romero-Cascales (2008) y Busse-Valverde et al. (2010) para vinos de Monastrell (489 y 835 mg/L) y de Cabernet S. (757 y 845 mg/L). Es posible que la continua agitación aplicada en los diferentes ensayos haga que la extracción de estos compuestos sea más efectiva que bajo las condiciones de elaboración en bodega, periodo durante el cual sólo una pequeña fracción de taninos, tanto de las pieles como de las semillas de la uva, es extraída. Además, la retención de taninos, sobre todo de aquellos de mayor peso molecular en las paredes celulares de la pulpa, pueden causar una menor presencia de los mismos en el vino (Bindon et al., 2010). El grado medio de polimerización de los taninos (GPm) es mayor en semillas de Monastrell que en las de Cabernet Sauvignon, incrementándose en ambos casos con la presencia de alcohol. Este resultado puede ser debido a que el etanol produzca una mayor extracción de taninos de las paredes celulares, lugar donde se encuentran las más polimerizadas (Geny et al., 2003). Por el contrario, el estudio de Del Llaudy et al. (2008) con soluciones modelo, no encontraron diferencias en los valores de GPm de los taninos extraídos de semillas de Cabernet Sauvignon maceradas con diferente contenido de alcohol, aunque sí en la astringencia de los mismos. Estos autores indicaron que esto podía ser debido a que el GPm no representa el porcentaje de las diferentes fracciones de diferente tamaño que componen a los taninos y por tanto, con el mismo GPm, la proporción de oligómeros puede ser diferente, viéndose afectada tanto la astringencia como el amargor. En el caso del porcentaje de galoilación, en solución acuosa es similar para Monastrell y Cabernet Sauvignon, pero en presencia de etanol, la galoilación de los taninos se incrementa, sobre todo para Cabernet Sauvignon. González-Manzano et al. (2004) también encontraron un incremento en el contenido de derivados galoilados con el aumento del porcentaje de etanol en el medio. Busse-Valverde et al. (2010) encontraron, en vinos, valores de galoilación más bajos a los encontrados en este estudio, lo cual puede ser debido a la contribución de los taninos extraídos del

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hollejo, que tienen porcentajes de galoilación más bajos que los taninos de semilla. Tras la aplicación de enzimas, en el caso de Monastrell y en medio acuoso (Tabla 2) se observa un aumento importante en la extracción de taninos con los diferentes enzimas utilizados, excepto en el caso de los enzimas xilanasa y pectínmetilesterasa, al mostrar valores de taninos no significativamente diferentes respecto a la solución testigo sin enzima. En el caso de los enzimas puros, la poligalacturonasa consigue triplicar el contenido de taninos y la celulasa duplicarlo, mientras que el complejo enzimático consigue cuadriplicar en el medio los valores de estos compuestos. La pared celular de las células de las semillas está compuesta por hemicelulosa, celulosa y pectinas, por tanto, es de esperar que la celulasa y la poligalacturonasa y el complejo enzimático consigan incrementar el contenido de taninos en el medio, tras una mayor degradación de ésta. Estos resultados fueron previamente intuidos en los estudios de Passos et al. (2009ab), ya que comprobaron que un pretratamiento previo de las semillas de uvas con cócteles enzimáticos a base de celulasa, hemicelulasa, poligalacturonasa y proteasas incrementaba notablemente la extracción de aceite de las semillas, debido a su acción en la destrucción de la organización celular y subcelular de los tejidos de las semillas, tales como las paredes celulares y el citoplasma (Sineiro et al., 1998). El grado medio de polimerización de los taninos se incrementa ligeramente con la adición de enzimas, aunque sólo se observan diferencias significativas

respecto

al

testigo

con

los

enzimas

xilanasa

y

pectínmetilesterasa. Esto puede ser debido a que estos enzimas actúen sólo sobre las paredes celulares de las células de las semillas, lugar donde se encuentran los taninos más polimerizados (Geny et al., 2003), mientras que el resto de enzimas también pueden llegar hasta zonas más internas de las células, favoreciendo la salida de taninos menos polimerizados, viéndose de esta manera compensado el tamaño de los mismos. Respecto al porcentaje de galoilación, este aumenta significativamente con la presencia de cualquiera de los enzimas, excepto en el caso de pectínmetilesterasa y xilanasa. El complejo enzimático y poligalacturonasa dan lugar a la mayor presencia de taninos galoilados, seguidos de celulasa. Geny et al. (2003) encontraron que la proporción de (-)-epicatequina-3-O7

galato era mayor en la fracción de las paredes celulares que en la fracción interna de las células de las semillas, por lo que una mayor degradación de dichas paredes por parte de estos enzimas podría favorecer una mayor liberación de taninos más galoilados. Con la presencia de alcohol, los enzimas también consiguen una mayor difusión de taninos al medio. La celulasa, poligalacturonasa y pectínmetilesterasa (que no tenían efecto en medio acuoso) consiguen triplicar el contenido de taninos, mientras que con el enzima comercial los valores son incrementados aproximadamente sobre seis veces. Estos resultados parecen indicar que la presencia de alcohol facilita aún mas la acción de los enzimas y principalmente de pectínmetilesterasa y Enozym vintage. El medio hidroalcohólico es comparable con un vino, y entre los pocos estudios que hay sobre la influencia de enzimas de maceración en la extracción de taninos (Sun et al., 1998; Romero-Cascales et al., 2008 y GilMuñoz et al., 2009) los resultados han mostrado normalmente un incremento de taninos en el vino, atribuido siempre a la mayor degradación de las pieles por parte de hemicelulasas y celulasas presentes en los enzimas de maceración, proporcionando vinos con más cuerpo y estructura (Watson, 2000). Nosotros demostramos en este estudio, que ese incremento de taninos no es solamente atribuible a los taninos de los hollejos puesto que también se produce la degradación de las semillas. El grado medio de polimerización de los taninos es menor con el enzima comercial y la pectínmetilesterasa. También son observadas diferencias significativas en el caso del porcentaje de galoilación, consiguiendo

taninos

más

galoilados

con

el

enzima

comercial

y

poligalacturonasa, seguidos de celulasa. Hay que destacar que los taninos presentes en la solución testigo sin enzima presentan valores de este porcentaje similares a aquellos obtenidos en medio acuoso, indicando que el alcohol no consigue llegar, en el caso de Monastrell, hasta los taninos que se encuentran en la fracción interna de las células de las semillas. Para semillas de Cabernet Sauvignon y en solución acuosa (Tabla 2), sólo

con

celulosa

y

Enozym

vintage

se

consigue

incrementar

significativamente los valores de taninos en el medio, mientras que en medio alcohólico, xilanasa y el enzima comercial son los únicos enzimas que no 8

muestran ningún efecto. El grado medio de polimerización de los taninos es mayor con xilanasa y menor con celulasa, poligalacturonasa y el enzima comercial en medio acuoso y con la presencia de alcohol, solo poligalacturonasa afecta de forma importante al tamaño de estos compuestos. En cuanto al porcentaje de galoilación, en ausencia de alcohol, o bien no se ve prácticamente afectado, como es el caso de celulasa, poligalacturonasa

y

el

enzima

comercial,

o

bien

disminuye

con

pectínmetilesterasa y xilanasa y en presencia de éste, al igual que ocurre con el grado medio de polimerización, sólo incrementa de forma más significativa con poligalacturonasa. El grado medio de polimerización y el porcentaje de galoilación de los taninos afectan a las características organolépticas del vino, principalmente a las sensaciones de astringencia y amargor, y parece que estas sensaciones son más potenciadas en presencia de alcohol y con algunos de los enzimas empleados tanto para Monastrell como para Cabernet Sauvignon. El diferente comportamiento observado de los enzimas con semillas de Cabernet Sauvignon, respecto al obtenido con semillas de Monastrell en el mismo medio, puede ser indicativo de la existencia de diferencias a nivel estructural y composición entre las semillas de ambas variedades. Dichas diferencias ya fueron encontradas por Ortega-Regules et al. (2008) a nivel del hollejo. Estos resultados indican que los taninos de las semillas pueden ser difundidos al mosto-vino ya desde el inicio de la maceración en ausencia de alcohol, aunque su extracción va a ser más importante cuando el alcohol esté presente. Los enzimas de maceración utilizados normalmente en el proceso de elaboración de los vinos tintos para incrementar el color también pueden incrementar la extracción de los taninos de las semillas (y no solo los del hollejo), estando su efecto más o menos marcado por el tipo de actividad presente en los mismos y la variedad de uva. Esto es importante tenerlo en cuenta, sobre todo cuando la uva llega poco madura a bodega, ya que, en estas condiciones, el uso de enzimas de maceración es bastante común para favorecer la extracción de color, pero estos productos enológicos podrían degradar más fácilmente las paredes celulares de las células de las semillas, 9

al estar menos lignificadas, favoreciendo una mayor salida de taninos al mosto-vino, incrementando el cuerpo, pero sobre todo las sensaciones de astringencia y amargor en el vino.

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N.;

Gomez-Plaza,

E.;

López-Roca,

J.M.;

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Tabla 1. Concentración, grado medio de polimerización (GPm) y porcentaje de galoilación de los taninos en semillas de Monastrell en solución acuosa e hidroalcohólica tras la adición de diferentes enzimas. Taninos mg/L Testigo Celulasa PG Xilanasa PE EV Testigo Celulasa PG Xilanasa PE EV

GPm %Galoilación Solución acuosa 1126a 8,9a 9,0a 2402b 9,5ab 10,6b 3345c 9,1a 14,7c 1535ab 10,3c 10,6b 1168a 9,9bc 7,9a 4622d 9,0a 15,4c Solución hidroalcohólica 1616a 9,1cd 10,2a 4851c 8,9c 13,1b 4501c 9,2cd 15,4c 2444b 9,3d 10,8a 4603c 7,7a 10,3a 7727d 8,3b 15,7c

Abreviaciones: PG: Poligalacturonasa; PE: Pectínmetilesterasa; EV: Enozym vintage. Letras diferentes en una misma columna y para cada medio significa diferencias estadísticamente significativas según el test LSD (P