I.

INTRODUCCIÓN

El fósforo (P) es un elemento escaso en la naturaleza. Las mayores reservas se encuentran en los sedimentos marinos que constituyen una fuente muy difícil de utilizar (Cramer 2010). El contenido total de P en la capa superior del suelo varía entre 50 a 3000 mg kg-1 (Sims y Pierzynski 2005). El P absorbido por las plantas alcanza solamente un 0.1% del total (Chen et al. 2006, Sample et al. 1980), y está representado por los iones ortofosfato H2PO4- y HPO42- (Walker y Syers 1976, Foth y Ellis 1997). La concentración de estas formas está regulada por el pH (Scheffer y Schachtschabel 1992), y en la mayoría de suelos el P en solución es insuficiente para cubrir los requerimientos de la planta (Kirkby y Johnston 2008). Diversos investigadores advierten sobre una inminente crisis de fósforo, ya que las reservas mundiales de fósforo se encuentran en un proceso de agotamiento (Cordell et al. 2009, Vaccari 2009, Gilbert 2009). La distribución de estas reservas es desigual; sólo cuatro países: Marruecos, China, Sudáfrica y Jordania, controlan el 83 % de las reservas mundiales de fosfatos explotables (Vaccari 2009). A esta desigualdad en las reservas de fósforo se añaden dificultades de suministro (FAO 2005). Este desequilibrio convierte al fósforo en un recurso geoestratégico. El Perú tiene reservas importantes de roca fosfórica (RF) en los depósitos sedimentarios de Bayóvar, ubicados en la costa norte en el desierto de Sechura, con reservas potenciales estimadas en 10 mil millones de TM (Alegre y Chumbimune 1991) con una riqueza de 30.5 % de P2O5 (Aguirre 1993). Dada la baja solubilidad de este mineral fosfatado, surge la necesidad de investigar en microorganismos con capacidad para solubilizar RF y fosfatos de calcio. Una cantidad importante de investigaciones han sido orientadas a mejorar la eficiencia de la nutrición fosfórica de las plantas a través de microorganismos que solubilizan FePO4 y AlPO4 en suelos ácidos y Ca3(PO4)2 en suelos básicos. 1

Este trabajo de investigación está dirigido a determinar si en suelos calcáreos del valle del Mantaro existen microorganismos con capacidad de disolución de fosfatos de calcio con énfasis en la RF de Bayóvar. Para ello se plantearon los siguientes objetivos: Objetivo general •

Evaluar la presencia de microorganismos solubilizadores de fosfatos en suelos calcáreos y su potencial para disolver el P inorgánico nativo del suelo y el aportado como roca fosfórica de Bayóvar.

Objetivos específicos •

Obtener aislamientos puros y seleccionar cepas solubilizadoras de fosfatos de calcio promisorias, a partir de suelos calcáreos del valle del Mantaro.

•

Caracterizar taxonómicamente las cepas aisladas a nivel de género mediante pruebas bioquímicas

•

Evaluar la capacidad solubilizadora in vitro de los microorganismos seleccionados en medio de cultivo líquido.

•

Evaluar la capacidad de los microorganismos para solubilizar fosfatos de calcio mediante un ensayo biológico utilizando como plantas indicadoras maíz (Zea mays L.) y frijol Castilla (Vigna unguiculata L.) en un suelo ligeramente alcalino de La Molina.

2

II.

2.1.

REVISIÓN DE LITERATURA

Bacterias solubilizadoras de fosfatos inorgánicos

Diversas especies bacterianas tienen capacidad para solubilizar compuestos inorgánicos de P insolubles como el fosfato tricálcico, dicálcico, hidroxiapatita y en cierta medida rocas fosfóricas. Entre los géneros con esta capacidad se conocen Pseudomonas, Bacillus,

Rhizobium,

Burkholderia,

Achromobacter,

Agrobacterium,

Micrococcus,

Aereobacter, Flavobacterium y Erwinia (Goldstein 1986). En medio sólido NBRI-P, la bacteria diazótrofa endofítica Pantoea sp. (cepa 9C) aislada del interior de tallos de la caña de azúcar (Loiret et al. 2004), mostró halos de solubilización de hasta 6 mm. Con Bacillus sp. y Pseudomonas sp. se han reportado halos de 2 y 8 mm respectivamente (Nautiyal 1999). Tubos de ensayo con 15 mL de medio líquido NBRI-P fueron inoculados con 0.1 mL de una suspensión de 105 UFC mL-1 de Pantoea sp. y luego incubados durante 7 días a 30 °C. Esta bacteria solubilizó 1128 mg P L-1 del Ca3(PO4)2 en medio líquido. Estos valores son superiores a los reportados para Enterobacter absuriae (Gyaneshwar et al. 1999), Pantoea agglomerans (Chung et al. 2005, Pérez et al. 2007, Son et al. 2006), Pantoea ananatis (Pérez et al. 2007) y Pantoea dispersa (Selvakumar et al. 2007) que van de 38 a 510 mg P L-1. El Ca3(PO4)2 es un compuesto muy poco soluble, con una constante de producto de solubilidad (Kps) de 2.83 x 10-30 (Cordero et al. 2008). En el mismo trabajo, plantas de rábano (Raphanus sativus, L. var. Scarlet Globe) fueron cultivadas en un suelo ferralítico e inoculadas con Pantoea sp. (cepa 9C). La concentración foliar de P en la biomasa aérea fue de 3252 mg P kg-1 que constituye un incremento de 60 % con respecto a las plantas no inoculadas, lo cual supera lo informado por El-Komy (2005) quien detectó un incremento de 53 % en plantas de trigo inoculadas con Pseudomonas striata y Bacillus polymyxa, y a lo reportado por Reyes et al. (2002) en plantas 3

de maíz inoculadas con Penicillium rugulosum quien encontró un incremento en el contenido de P de 38 %. Un patrón de incremento y disminución en la concentración de P fue encontrado cuando una mezcla de CaHPO4.2H2O e hidroxiapatita fue solubilizado por Pseudomonas sp. En la caracterización de Pseudomonas fluorescens realizada por Donate-Correa et al. (2005), sugiere que la bacteria, tiene algunas propiedades como promotora del crecimiento vegetal, pero no solubiliza fosfatos, lo cual sorprende ya que la propiedad de solubilización de fosfatos ha sido descrita como muy frecuente en este grupo de bacterias (Illmer et al. 1994). Varias cepas de Pseudomonas fluorescentes aisladas de la rizósfera de arroz y banano, han demostrado tener efecto positivo en la solubilización de Ca3(PO4)2 por la formación de halos de disolución visibles en medio sólido de Pikovskaya. Estas cepas presentan alta variabilidad en su actividad solubilizadora según la fuente de carbono utilizada. En base a la caracterización fenotípica y el análisis filogenético de genes 16S rRNA, las cepas fueron identificadas como Pseudomonas aeruginosa, P. mosselii, P. monteilii, P. putida, P. plecoglossicida, P. fulva y P. fluorescens, lo que indica un alto grado de diversidad genética y funcional entre las Pseudomonas fluorescentes solubilizadoras de fosfatos. Estas cepas también han mostrado ser productoras de enzimas y hormonas que promueven el crecimiento vegetal y de metabolitos antagónicos de hongos fitopatógenos, por tanto, tienen un papel vital en la promoción del crecimiento de las plantas, supresión de enfermedades y el subsecuente incremento del rendimiento (Popavath et al. 2008). Los aislamientos de Pseudomonas fluorescentes fueron obtenidos agitando 10 gramos de suelo de rizósfera (conteniendo raíces con suelo estrechamente adherido) en 90 mL de una solución tamponada de MgSO4.7 H2O 0.1 M, durante 10 minutos a 180 rpm en un agitador rotatorio (Sunish et al. 2005). Las suspensiones resultantes fueron diluidas en serie y alícuotas de 0.1 ml de cada dilución fueron extendidas sobre el medio de cultivo de King B (King et al. 1954). Después de incubar a 28 °C durante 2 días, las colonias en placas fueron identificadas bajo luz UV a 366 nm. Para obtener cultivos puros también fue utilizado el medio de King B (KB). Las cepas se conservaron en caldo nutritivo Luria Bertani (LB) que contiene 50% (w/v) de glicerol y fueron almacenadas a -86 °C (Popavath et al. 2008). 4

Los strains R62 y R81 de Pseudomonas fluorescentes aislados de la rizósfera de trigo y conservados en glicerol al 50% a -20 °C en medio KB, fueron cultivados en frascos con medio modificado Schlegel en un agitador rotatorio. El medio modificado contenía glicerol (10.0 g Ll

), ácido succínico (0.5 g L-l), Na2HPO4 (4.2 g L-l), KH2PO4 (1.3 g L-l), NH4Cl (0.32 g L-l),

urea (0.352 g L-l), KCl (0.35 g L-l), NaCl (0.65 g L-l), MgSO4.7H2O (0.50 g L-l), citrato férrico de amonio (150 µg L-l), CaCl2.2H2O (0.9 g L-l), y solución de elementos traza (0.9 ml L-l). Los cultivos fueron mantenidos a 28 °C durante 30 horas en un agitador orbital a 240 rpm. El efecto de la aplicación de formulaciones inoculantes de los dos strains de Pseudomonas fluorescentes solubilizadoras de P, fue evaluado en Vigna mungo a través de un ensayo de campo. La vermiculita fue utilizada como base inorgánica para desarrollar las formulaciones. La bioinoculación combinada de estos dos organismos mediante una formulación, aumentó el rendimiento de vainas en un 300 % en comparación con el control. También incrementó significativamente el peso seco de la raíz y del follaje, la longitud del tallo y número de ramas por planta (Sarma et al. 2009). Varios investigadores han probado materiales de soporte inorgánicos como talco, vermiculita, perlita, roca fosfórica, y sulfato de calcio; y también soportes orgánicos como carbón y turba, para desarrollar formulaciones en polvo de Pseudomonas fluorescentes que promueven el crecimiento vegetal y el control de enfermedades (Bashan et al. 1988, Bennett y Lane 1992, Beck 1991, Glick 1995, Sarma et al. 2009). Entre las bacterias solubilizadoras de fósforo (BSP), los Pseudomonadales fluorescentes que colonizan agresivamente las raíces de las plantas, son consideradas como un importante grupo de bacterias debido a sus propiedades (biofertilizante y biocontrol). Aunque algunas bacterias que pertenecen a los géneros Mesorhizobium, Rhizobium, Klebsiella, Acinetobacter, Enterobacter, Erwinia, Achrobacter, Micrococcus, Aerobacter y Bacillus se han reportado como solubilizadores de fosfato, las cepas que pertenecen a Pseudomonas se consideran como solubilizadoras eficientes de fosfato (Villegas y Fortin 2001). La inoculación de trigo con Azospirillum brasilense incrementó significativamente el peso seco de la planta, el número de tallos por planta, mejoró la fertilidad y rendimiento de grano (Bashan 1986). La co-inoculación de Azospirillum y Azorhizobium caulinodans en trigo, incrementó significativamente el peso seco y el contenido de nitrógeno, en comparación con 5

las plantas no inoculadas (Sabry et al. 1997). Incluso en condiciones de estrés, la inoculación de Azospirillum en trigo tuvo resultados positivos en el rendimiento de grano y mejoró la nutrición mineral. La disminución del rendimiento de grano en condiciones de sequía fue de 26.5 % en las plantas no inoculadas, mientras que en plantas inoculadas con Azospirillum fue de 14.1 %. Los granos cosechados de plantas inoculadas con Azospirillum tuvieron un contenido más alto de Mg, K y Ca que las plantas no inoculadas (Creus et al. 2004). Por lo tanto, la inoculación puede incrementar el rendimiento de grano y también la acumulación de N total en planta (Boddey y Döbereiner 1988, Steenhoudt y Vanderleyden 2000). La inoculación combinada de Rhizobium sp. y bacterias solubilizadoras de fosfato incrementó la nodulación, crecimiento y los parámetros de rendimiento en garbanzo (Alagawadi y Gaur 1988, Gupta y Namdeo 1997, Jain et al. 1999, Khurana y Sharma 2000). El efecto de la inoculación combinada de Rhizobium sp. y las bacterias solubilizadoras de P Pseudomonas striata o Bacillus polymyxa con y sin adición de fertilizante químico en el rendimiento y contenido de nutrientes de garbanzo fue estudiada bajo condiciones de invernadero. Mientras que la inoculación por separado de Rhizobium incrementó la nodulación y la actividad nitrogenasa, las solubilizadoras de fosfato aumentaron el contenido de P disponible del suelo. La inoculación combinada de Rhizobium sp. y P. striata o B. polymyxa no solo incrementó los parámetros anteriores sino también el contenido de materia seca, el rendimiento de grano y la absorción de N y P, en relación al control sin inocular. Los efectos de la inoculación fueron más evidentes en presencia de fertilizantes. Las posibilidades de ahorro de la mitad de la dosis de N, la sustitución del superfosfato con roca fosfórica y la inoculación con fosfato solubilizadores merecen especial atención (Alagawadi y Gaur 1988). El efecto de la inoculación combinada de la bacteria fijadora de nitrógeno Rhizobium, la bacteria solubilizadora de fosfato Bacillus megaterium subsp. phospaticum cepa-PB y el hongo controlador biológico Trichoderma spp. en el crecimiento, la absorción de nutrientes y el rendimiento de Cicer aritenium (garbanzo), fue estudiado bajo condiciones de invernadero y de campo. La inoculación combinada de estos tres organismos en garbanzo originó mayor germinación, absorción de nutrientes, altura de planta, número de ramas, nodulación, biomasa total y rendimiento, en comparación con cualquiera de las inoculaciones individuales o un control sin inocular. El incremento del crecimiento y los parámetros de rendimiento fueron 6

más evidentes cuando T. harzianum PDBCTH10 fue inoculado con la bacteria solubilizadora de fosfatos y Rhizobium (Rudresh et al. 2005). Algunos investigadores han encontrado resultados contradictorios entre el método de detección del halo en placas y la solubilización de fosfato en cultivos líquidos ya que muchos aislados microbianos no producen halos y son capaces de solubilizar varias fuentes de fosfato inorgánico en medio líquido (Gupta et al. 1994, Nautiyal 1999).

2.2.

Hongos solubilizadores de fosfatos Cepas específicas de los géneros Aspergillus (Banik y Dey 1982, Nunes et al. 2002), y

Penicillium (Nunes et al. 2002, Whitelaw et al. 1999), son consideradas como las más eficientes en la solubilización de formas inorgánicas de fósforo, ya que se ha determinado que tienen mayor potencial solubilizador que otros hongos aislados del suelo. Penicillium radicum aislado a partir de la rizósfera de trigo fue evaluado in vitro añadiendo a los medios líquidos diferentes fuentes de P insoluble: fosfato monohidrogenado de calcio (CaHPO4), ortofosfato de calcio [Ca3(PO4)2], fosfato férrico cristalino (FePO4.4H2O), fosfato de aluminio cristalino (AlPO4), fosfato férrico coloidal o fosfato de aluminio coloidal. Se evaluó además el efecto del NO3- y del NH4+ como fuente de nitrógeno. Se determinó que la solubilización fue alta en CaHPO4, Ca3(PO4)2 y fosfato de aluminio coloidal con 475, 360 y 207 mg P L-1 respectivamente, y la solubilización fue más alta cuando se utilizó NH4+ como fuente de N. Se determinó también que la concentración de P soluble en el medio de cultivo fue directamente proporcional a la acidez titulable y producción de ácidos e inversamente proporcional al pH (Whitelaw et al. 1999). De la rizósfera de arazá Eugenia stipitata McVaugh (Myrtaceae), planta originaria de la selva colombiana, fueron aisladas 18 cepas de hongos con capacidad para solubilizar CaHPO4.2H2O y FePO4.4H2O. Los principales solubilizadores del fosfato de calcio fueron tres cepas de Trichoderma y Aspergillus aculeatus, y del fosfato de hierro Aspergillus oryzae, Paecilomyces sp., Gongronella butleri y Fusarium oxysporum (Vera et al. 2002).

7

Aspergillus aculeatus fue aislado de la rizósfera de Cicer ariatenum y evaluado en medio Pikovskaya adicionado con diferentes rocas fosfóricas (RFs) provenientes de China (RFC), Senegal (RFS) y tres RFs de la India: Hirapur (RFH), Sonrai (RFR) y Udaipur (RFU), las cuales presentaron diferente porcentaje de P2O5, por lo que fue aplicada una cantidad equivalente a 50 mg de P2O5 por cada 100 mL de medio en todos los tratamientos; esto en remplazo del fosfato tricálcico (FTC). Fueron evaluadas 11 fuentes de carbono y se determinó que los medios adicionados con fructosa, seguida por la glucosa, son los que presentaron mayor cantidad de P solubilizado. Fueron estudiadas además siete fuentes nitrogenadas y se determinó que el sulfato de amonio fue la mejor fuente de N, seguida de urea y asparagina. La máxima cantidad de P2O5 (mg %) liberado por A. aculeatus de la RFC, RFS, RFP, RFH y RFU fue de 91.6, 28.4, 46.2, 40.7 y 38.1 % respectivamente (Narsian y Patel 2000). La solubilización de la RF en medio líquido por parte de Aspergillus niger, fue evaluada y se encontró que el desarrollo de la biomasa fúngica necesita un período de incubación considerablemente largo para incrementar el P soluble. Este fenómeno se atribuyó al periodo necesario para que los hongos crezcan y produzcan una cantidad suficiente de ácidos orgánicos que puedan ejercer actividad solubilizadora del fósforo (Goenadi et al. 2000). Penicillium aurantiogriseum aislado de suelos forestales, demostró ser muy efectivo en la solubilización in vitro de dos fuentes de P poco solubles: hidroxiapatita [Ca5(PO4)3OH] y brushita CaHPO4.2H2O (Illmer y Schinner 1992). Posteriormente P. aurantiogriseum fue estudiado adicionando 150 mg L-1 de hidroxiapatita o brushita estériles al medio líquido NM8 previamente esterilizado, para determinar los mecanismos de solubilización. Una parte del experimento fue conducido en una cámara llamada Ecologene (ECO) que básicamente fue un conjunto de membranas utilizadas para determinar si es necesario el contacto directo entre el microorganismo y los fosfatos de calcio para la solubilización. En los experimentos que se necesitaba un contacto directo, un lado de la ECO se llenó con 150 mL de NM8 sin apatita o brushita inoculadas y el otro lado se llenó con 150 mL de NM8 conteniendo apatita y brushita pero sin el microorganismo. En los tratamientos sin contacto directo, 15 mg de apatita y brushita fueron colocados en el interior de tubos de diálisis de celulosa regenerada de 1 cm de diámetro, sellados, secados a 80 °C y pesados. Conjuntamente con 140 mL de NM8 sin fosfato de calcio fueron colocados estos 20 pequeños tubos en el interior de la cámara ECO mientras 8

que el otro lado fue suplementado con 150 mL de NM8 sin fosfato de calcio; después de autoclavar todo el sistema este segundo lado fue inoculado. Complementariamente se evaluó la solubilización de fosfatos de aluminio (Illmer y Schinner 1994). Penicillium rugulosum IR-94MF1, aislado de una pastura tropical ubicada sobre una mina no explotada de roca fosfórica, presentó alta capacidad de solubilización de hidroxiapatita (Reyes et al. 1998). En otro trabajo, el mecanismo de acción de los microorganismos solubilizadores de fosfatos minerales (MSP) fue estudiado en el strain tipo silvestre de P. rugulosum IR-94MF1 (Msp+), y los mutantes negativo (Msp-) y superpositivo (Msp++) derivados de este. La actividad de la MSP fue medida en medio líquido usando sacarosa como fuente de carbono, cuatro fuentes nitrogenadas (arginina, nitrato, amonio y nitrato más amonio) y cuatro fuentes de P (KH2PO4, hidroxiapatita, AlPO4 y FePO4). El fenotipo Msp+ fue fuertemente asociado con la producción de ácido glucónico y cítrico. Los resultados también indican que para el mutante Msp-, el mecanismo de la bomba de H+ está implicado en la solubilización de pequeñas cantidades de fosfato (Reyes et al. 1999). Se evaluó además la capacidad de P. rugulosum IR-94MF1(tipo silvestre) y sus dos mutantes Msp++ y Msp-, para solubilizar dos rocas fosfóricas obtenidas de Monte Fresco y San Joaquín de Navay en Venezuela, las cuales fueron comparadas con una apatita mineral de Florida. Se investigó además la solubilización de variscita proveniente de Utah, ya que anteriormente Reyes et al. 1999, demostraron que el microorganismo fue capaz de disolver AlPO4. En medio líquido los tres strains mostraron mejor crecimiento en la RF de Navay que en la RF de Monte Fresco. La variscita de Utah fue la mejor fuente de P para el crecimiento del strain tipo silvestre y el mutante Msp++. La solubilización de varias fuentes de P por el IR94MF1 tipo silvestre y el mutante Msp++ fueron en su mayoría por la acción de ácidos orgánicos. El ácido cítrico parecería ser el factor más activo en la solubilización de la variscita de Utah, mientras que el ácido glucónico parecería ser responsable de la solubilización de la apatita de Florida y de la RF de Monte Fresco. Ambos ácidos orgánicos están envueltos en la solubilización de la RF de Navay. El Msp- cuando creció en todas las fuentes de P no produjo ningún ácido orgánico. En ensayos sobre solubilización de AlPO4 in vitro, se determinó que cuatro especies: Aspergillus niger, Penicillium simplicissimum, Penicillium aurantiogriseum y Pseudomonas 9

sp. fueron muy efectivas (Illmer et al. 1994). En el mismo estudio y utilizando el AlPO4 como única fuente de P, se determinó que los MSP incrementaron el peso seco y el contenido de Al en Lepidium sativum bajo cultivo hidropónico. El contenido de P en planta incrementó únicamente cuando P. simplicissimum fue inoculado (Illmer et al. 1994). Penicillium y Aspergillus se caracterizan por ser abundantes en el suelo rizosférico, lo cual confirma que se tratan de especies marcadamente saprofitas, con capacidad de crecer y reproducirse rápidamente en una amplia variedad de sustratos y tolerar cambios ambientales extremos, lo que los enmarca dentro de la denominación de hongos con alta capacidad competitiva saprobiótica (Heredia et al. 1988).

2.3.

Mecanismos para la solubilización de fosfatos de calcio Por lo general, la actividad in vitro de los microorganismos solubilizadores de P (MSP)

se asocia con una disminución del pH (Asea et al. 1988, Wenzel et al. 1994), sin embargo, varias investigaciones no muestran esa tendencia (Kucey 1983). Los posibles mecanismos para explicar la actividad de los MSP es la acidificación por la producción de ácidos orgánicos (Cunningham y Kuiack 1992) o la producción de protones asociada con la asimilación de amonio (Roos et al. 1984). Los MSP pueden ser muy efectivos en la solubilización de fosfato de calcio (Ca) con la producción de ácidos orgánicos (Cunningham y Kuiack 1992, Vassilev 1996) o sin estos (Illmer y Schinner 1995). La actividad de los MSP usualmente se ha evaluado con diferentes fuentes de carbono como glucosa (Asea et al. 1988, Kucey 1983, Vassilev 1996) o sacarosa (Wenzel et al. 1994, Cunningham y Kuiack 1992). Además, en la mayoría de estudios se encontró que el amonio fue la mejor fuente de N (Asea et al. 1988, Wenzel et al. 1994). Estas observaciones indican que la solubilización de P es un fenómeno complejo que depende de muchos factores, tales como los nutricionales, fisiológicos, y condiciones de crecimiento de los cultivos (Cunningham y Kuiack 1992). Whitelaw (1997), hace referencia que los principales mecanismos son la excreción o producción de ácidos orgánicos principalmente ácido glucónico. Esto conduce a la acidificación del medio y la formación de complejos con el catión, dependiendo de la

10

estructura del ácido orgánico. Fue detectado un solo acido orgánico, que fue el gluconato producido por el hongo Penicillium radicum. El principal mecanismo de Penicillium radicum para solubilizar fosfatos es posiblemente la acidificación o la reducción del pH hasta un valor en el que estos compuestos son más solubles. En fosfatos de Ca, Al y Fe (III) la solubilidad se incrementa por debajo de pH 5 (Stumm y Morgan 1995). La producción de H+ es un mecanismo clave para la solubilización de CaHPO4 y Ca3(PO4)2. Cerezine et al. (1988) también reporto esta correlación entre el pH y la solubilización de fluorapatita por Aspergillus niger en un ensayo con un período de incubación de 14 días. La tendencia de la correlación entre el P soluble y el pH fue menos significativa después de un pico de solubilización de P, e indica que la disminución de la concentración de P soluble fue debido probablemente a factores distintos al pH (Whitelaw et al. 1999). La reducción del pH pueden ser el principal mecanismo de solubilización de P antes del pico de solubilización del P, pero la disminución de concentración de P soluble después del pico no parece deberse a un aumento del pH. Parece que hay dos diferentes mecanismos que afectan el incremento y la disminución de la concentración de P soluble; antes y después del pico de solubilización de P. La tendencia de la relación entre el pH y la solubilización de fósforo puede ser menos significativa después del pico inicial de solubilización de fósforo, lo cual fue también observado en la solubilización de fósforo por Aspergillis aculeatus (Narsian et al. 1995), y Penicillium sp. (Illmer y Schinner 1992, Goenadi y Saraswati 1993). La participación del ácido glucónico en la solubilización de fosfato de Ca se ha reportado para Penicillium sp. (Illmer y Schinner 1992) y Aspergillus niger (Illmer y Schinner 1994). También ha sido relacionado con la solubilización de roca fosfórica por Pennicillium variabile (Vassilev et al. 1996), y liberación de Fe3+, Ca2+ y Al3+ de rocas por Pennicillium frequentans (De La Torre et al. 1993). En Penicillium radicum se encontró que la concentración de gluconato fue más alta en el medio de cultivo que contenía fosfato de calcio En Pantoea sp. la disminución del pH mostró una elevada correlación (r = -0,9557) con los valores de la concentración de P solubilizado, lo que indica que la acidificación en el

11

medio de cultivo podría ser la vía por la cual ocurre el proceso de solubilización por esta bacteria. La producción de ácidos orgánicos por los microorganismos es considerada el mecanismo fundamental de la solubilización del fosfato mineral. La oxidación periplásmica directa de glucosa a ácido glucónico, y a menudo ácido 2-cetoglucónico, conforma la base metabólica de este proceso en algunas bacterias gram negativas (Goldstein 1995), grupo al que pertenece este microorganismo (Cordero et al. 2008). Vassilev et al. (1995) sugiere que la disminución de la acidez titulable y la concentración de P observada durante la solubilización de la roca fosfórica por Aspergillus niger probablemente fue debido a la utilización de ácido cítrico por el hongo en condiciones de agotamiento de los nutrientes. Lo mismo fue observado en la solubilización realizada por Penicillium radicum pero debido al consumo de gluconato. El incremento en la concentración de P soluble en medio liquido previamente inoculado con Penicillium sp. fue relacionado con la secreción de ácidos orgánicos, los cuales pueden correlacionarse con la acidez titulable y el pH del medio (Illmer y Schinner 1992, Narsian et al. 1993, Illmer et al. 1994). Aspergillus niger fue estudiado por Illmer et al. (1994), y se determinó que es un efectivo productor de ácido cítrico, oxalato y gluconato, y este es el mecanismo por el cual solubiliza principalmente AlPO4, y fue el microorganismo más eficiente en solubilizar este fosfato. En la solubilización de CaPO4 por A. niger, se determinó la producción de ácido glucónico (Illmer y Schinner 1994). Se ha encontrado que la bacteria Klebsiella oxytoca es productora de ácido málico durante la solubilización de la roca fosfórica, cuyos valores incrementan y disminuyen con el tiempo según las evaluaciones realizadas periódicamente (Illmer et al. 1994). Se ha reportado que el ácido glucónico participa en la solubilización de fosfato de calcio por Erwinia herbicola (Liu et al. 1992). Los mecanismos de solubilización en dos fosfatos de calcio difícilmente solubles como la hydroxylapatita [Ca5(PO4)3OH] y la brushita (CaHPO4.2H2O) fueron estudiados con Penicillium aurantiogriseum y Pseudomonas sp. La opinión de la mayoría de investigadores

12

de que los fosfatos son solubilizados por la producción de ácidos no parece aplicable a este grupo de organismos (Illmer y Schinner 1994). La razón más probable para la solubilización sin la producción de ácido es la liberación de protones que acompaña la respiración o la asimilación de NH4+. La precipitación y posterior resolubilización de diferentes fosfatos orgánicos o inorgánicos son difícilmente predecibles en medio de cultivo. Pocos autores hacen referencia a la variación de la concentración de P después de diferentes periodos de incubación (Taha et al. 1969, Banik y Dey 1983, Illmer y Schinner 1992, Rogers y Wolfram s.f.). En la cámara Ecologene los primeros tratamientos del ensayo estuvieron en contacto los microorganismos con los fosfatos de calcio y en los demás tratamientos no hubo contacto entre la soluciones que contenían fosfatos de calcio y los microorganismos (blancos), y se observó que la solubilización ocurre igualmente en ambos casos, es decir no es necesario que estén en contacto directo los organismos pero si las sustancias que estos liberan (Illmer y Schinner 1992). La posibilidad de que la movilización de P ocurra directamente en la superficie celular a través de la ATPasa productora de H+, parece poco probable en estos dos organismos. Los protones excretados por la ATPasa permanecen principalmente en la superficie celular, donde la disminución de pH y los mecanismos de transporte son activados (Beever y Burns 1980). La pérdida de estos protones en la pared celular causaría una pérdida severa de la energía celular. En contraste con esto, la solubilidad de fosfatos de calcio parece ser causada por procesos concernientes a la difusión a grandes distancias. Por lo tanto, un agente solvente, como los ácidos orgánicos o protones, tiene que estar involucrado (Illmer y Schinner 1992). Cuatro bacterias solubilizadoras de fosfatos muestran diferentes cambios en la concentración de P y el pH en la solución durante la incubación; que es atribuido a la inducción y represión de los sistemas enzimáticos responsables de la solubilización (Babenko et al. (1984). Los mecanismos de solubilización dependen de la producción de la biomasa microbiana que está en función de la asimilación de NH4+ (Jurinak et al. 1986). Al analizar los resultados de biomasa de Pseudomonas sp. y Penicillium aurantiogriseum, Halvorson et al. (1990) proponen que la mayor efectividad en la absorción de P por los sistemas de 13

microorganismos, es posible por la asimilación del P de la solución, lo cual hace que se altere el equilibrio entre las sales de P y el P en solución, de esta forma los fosfatos de Ca se disolverían indirectamente, mediante la continua remoción del P presente en la solución. Esta teoría podría excluir a un posible mecanismo adicional de solubilización del fósforo. Se podría obviar determinando las concentraciones de fósforo en la biomasa de los microorganismos solubilizadores de fosfatos para determinar si ese efecto significante. La eficiencia en la solubilización de P inorgánico y la mineralización de compuestos orgánicos deben considerarse por separado. La descomposición de sustancias como ATP, ADN, sales del ácido fítico, siempre conducen a una absorción casi completa de fósforo y por tanto su inmovilización dentro de la biomasa microbiana (Dighton y Boddy 1989). En una síntesis del trabajo Illmer y Schinner (1994), mencionan que el ácido glucónico fue reconocido como el único ácido liberado por Penicillium aurantiogriseum y Pseudomonas sp. El comportamiento del ácido glucónico fue evaluado de forma abiótica en diferentes valores de pH, y según Illmer y Schinner (1994), las diferentes concentraciones de éste ácido no tienen efecto en la solubilidad de fosfatos de calcio bajo un pH de aproximadamente 6, aunque el ácido glucónico es completamente disociado a éste pH. Por debajo de 6, es decir, si incrementa la concentración de H+ y por ende se produce la disminución del pH, la concentración de P en los frascos con altas cantidades de ácido glucónico no incrementó más que cualquiera de los otros frascos con pequeñas e inclusive sin ninguna cantidad de ácido glucónico. En el caso anterior el único factor determinante para solubilización de fosfato es la concentración de H+ originada del HCl. Con este simple experimento se podría demostrar que la formación de complejos con el ácido glucónico no tiene ninguna responsabilidad en la solubilización de la apatita y brushita, aunque éste es el único ácido producido por los dos microorganismos solubilizadores de fosfatos. En la literatura, citrato (Cunningham y Kuiack 1992) oxalato (Lapeyrie et al. 1991), α-ketogluconato (Kucey 1988), lactato y succinato (Kucey 1983), gluconato (Eckhardt 1979) y algunos otros ácidos (Berthelin et al. 1991, Yadav y Singh 1991), se piensa que son responsables de la solubilización de fósforo.

14

Pocos autores han evaluado un solo ácido (Asea et al. 1988, Parks et al. 1990). Por lo tanto, se plantean dudas razonables acerca de si los ácidos orgánicos son real y exclusivamente los que participan en los mecanismos de solubilización tal como lo plantean algunos autores (Jurinak et al. 1986, Asea et al. 1988, Parks et al. 1990, Rogers y Wolfram s.f.). Incluso algunos investigadores creen que la “teoría ácido orgánico” no es capaz ni siquiera de encontrar una correlación entre la cantidad de fósforo solubilizado y las concentraciones de ácidos orgánicos. Al realizar el análisis de las soluciones de cultivo y de los ácidos orgánicos, no se encontró ácidos orgánicos libres o en forma de complejos como oxalato de Ca o no fueron encontrados en cantidades mayores que el límite de detección (1 mM), aunque el sistema aplicado fue capaz de distinguir entre 60 alcoholes, cetonas, ácidos orgánicos y carbohidratos. Esto confirma las investigaciones realizadas anteriormente por estos investigadores y contrasta con el criterio generalizado que la solubilización de P es causada por la liberación de ácidos (Illmer y Schinner 1994). Illmer y Schinner (1992) en relación a la variación de la concentración de calcio y P en el medio de cultivo, sugieren que el aumento y caída de la concentración de P puede deberse a la formación y la posterior solubilización de complejos orgánicos de P. Estos complejos podrían ser utilizados como fuentes de energía o nutrientes, cuando la composición del medio es modificada. Lo cual es posible para los complejos orgánicos que bien pueden dar origen a compuestos inorgánicos, lo que explicaría también el aumento y disminución de las concentraciones Ca y P durante el ensayo. Pero como ningún agente quelante ni ácido orgánico (ni sales de estos) pudo ser detectado, y como no se observó acumulación de Ca (por ejemplo, en forma de cristales de oxalato Ca) en la biomasa microbiana, se puede considerar que procesos indirectos (dependientes de la producción de ácidos húmicos o H2S, en la reducción del Fe3+ y procesos relacionados) no son muy efectivas para solubilizar grandes cantidades de P. La producción de H+, parece ser el mecanismo más probable para explicar la solubilización de fosfatos de Ca, acompañada de una disminución del pH (Illmer y Schinner 1994). La generación de protones durante la asimilación de NH4+ (Taha et al. 1969, Banik y Dey 1983, Kucey 1983, Dighton y Boddy 1989, Parks et al. 1990), así como durante la respiración de H2CO3 (Jurinak et al. 1986); es un fenómeno que se ha observado con 15

frecuencia; pero los H+ de la respiración no es el factor completamente responsable de la solubilización, sin embargo, la acidificación respiratoria puede jugar un papel importante como una ayuda inicial, de tal forma que, la producción de H+ acompañada de la asimilación de NH4+, en principio puede suponer la solubilización total de P, pero estos cálculos deben ser inspeccionados críticamente. En algunos trabajos relacionados, se han reportado diferentes mecanismos de solubilización dependientes de la presencia de NH4+ (Halvorson et al. 1990). La hipótesis de que los MSP tienen la capacidad de producir ácidos orgánicos específicos y/o polisacáridos extracelulares (Kim et al. 1998, Halvorson et al. 1990) ha sido corroborada por clonación de la pirroloquinona sintasa PQQ (Goldstain y Liu 1987, Rodriguez et al. 2000) y genes gabY implicados en la producción de ácido glucónico. El ácido glucónico fue es el principal ácido orgánico producido debido a la oxidación directa de glucosa por Pseudomonas, y está implicado en la solubilización de fosfatos (Goldstein et al. 1993). Illmer y Schinner (1994) en relación a la solubilización de P menciona que existen diferentes criterios sobre los mecanismos de solubilización de P inorgánico Se ha encontrado que los ácidos orgánicos forman complejos solubles con iones metálicos como el Ca2+, Al3+ y Fe3+ que están asociados al fósforo insoluble, reduciendo su adsorción y haciendo que éste quede en forma disponible (Rashid et al. 2004). Las raíces inducen la producción de H+, HCO3-, o compuestos orgánicos que afectan la absorción de iones y por lo tanto el pH (Sylvia et al. 1999). El pH de la rizósfera puede diferenciarse hasta por más de 2 unidades del volumen restante del suelo (Hinsinger y Gilkes 1997, Rubio 2002). El efecto principal de la acidificación de los volúmenes de suelo adyacentes a la raíz es la solubilización de fosfatos ligados al calcio. Esto ocasiona que la biodisponibilidad del P difiera marcadamente en ambas zonas. Tanto el pH como la concentración de ácidos orgánicos en la rizósfera, influyen en la disponibilidad del fósforo (Jones 1998). El hecho que ciertos microorganismos del suelo son capaces de disolver relativamente compuestos insolubles de fósforo (Asea et al. 1988, Goenadi et al. 2000), ha abierto la posibilidad de inducir la solubilización microbiana de los fosfatos del suelo. Por esta razón, 16

muchas plantas se ven beneficiadas por la asociación con microorganismos bajo condiciones de deficiencia de fósforo (Gyaneshwar et al. 2002).

17

III.

AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE CEPAS SOLUBILIZADORAS DE FOSFATOS

3.1.

Ubicación Esta fase fue realizada en el laboratorio de Microbiología del Suelo (LMS) de la

Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM). La ubicación del laboratorio en UTM es 287978 longitud Este, 8663483 latitud Sur; la altitud es de 244 msnm. Las temperaturas máximas y mínimas anuales promedio son aproximadamente 24 y 16 °C respectivamente, la precipitación anual es de 23 mm. 3.2.

Materiales

•

Muestras de suelo

•

Tamiz con malla de 2 mm de diámetro

•

Bandejas de plástico

•

Botellas de 250 mL

•

Placas Petri

•

Material fungible

•

Pipeta volumétrica

•

Micropipetor de 10 mL

•

Vernier

•

Contador de colonias

•

Cámara fotográfica

•

Balanza

•

Autoclave

•

Cámara de flujo laminar

•

Incubadora 18

3.3.

Procedimientos

3.3.1. Selección de suelos para el aislamiento de cepas. Los suelos empleados para el aislamiento e identificación de cepas fueron seleccionados de una colección de 50 muestras de suelo obtenidas de las comunidades de Chacrampa, Aramachay y Sincos (Distrito de Sincos, Provincia de Jauja, Región Junín) en el valle del Mantaro. La colección fue preparada entre los meses de julio a agosto del 2011, como parte del subproyecto 4 del proyecto de investigación en evaluación de sistemas productivos en el marco del convenio IUC-VLIR-UNALM. Las muestras fueron obtenidas de los primeros 30 cm de campos agrícolas cultivados con papa, cebada, avena y leguminosas de grano, manejadas bajo un sistema de rotación que incluye periodos de descanso entre 1 a 2 años. Las propiedades físico-químicas de los suelos relacionadas con su fertilidad fueron determinadas en el Laboratorio de Análisis de Suelos, Plantas, Aguas y Fertilizantes de la UNALM (LASPAF-UNALM). Siete suelos fueron seleccionados por su alto contenido de carbonato de calcio y bajo fósforo disponible. El fósforo disponible fue medido por el método Olsen (Olsen et al. 1954), después de realizar la extracción de las muestras de suelo con NaHCO3 0.5 M a pH 8.5. Un suelo agrícola del campo “Libres” ubicado en el campus de la UNALM, con elevado contenido de calcáreo total, fue también incluido en el proceso de selección La descripción de los suelos se muestra en el cuadro 1.

19

Cuadro 1: Descripción de los suelos utilizados para el aislamiento

CE(1:1) P2O5 CaCO3 Clasificación taxonómica dS m-1 mg kg-1 % Soil Taxonomy (2010)

Suelo

Localidad

Paraje

Altitud msnm

Latitud

Longitud

pH*

1

Aramachay

Chapampa

3698

11º 54' 25.2"

75º 24' 12.7"

7.96

0.26

4.0

33.90

2

Chacrampa-1

Carretera

3607

11° 54' 01.0"

75° 24' 11.8"

7.81

0.25

3.5

6.30

Typic Ustorthents Typic Ustorthents

3

Chacrampa-2

Chalampachimpa

3588

11° 54' 39.5"

75° 25' 41.6"

7.46

0.82

14.7

19.10

Typic Ustorthents

4

Sincos-1

Isquilpuquio

3413

11° 54' 08.8"

75° 22' 44.8"

7.91

0.28

3.4

24.80

Typic Ustorthents

5

Chacrampa-3

Machque

3605

11° 54' 09.5"

75° 24' 23.2"

7.59

0.48

39.2

10.10

Typic Ustorthents

6

Sincos-2

Lulinmayo

3307

11º 53' 27.8"

75º 22' 57.8"

7.57

1.37

16.4

14.30

Typic Ustifluvents

7

Sincos-3

Mayupata

3301

11° 53' 13.8"

75° 23' 06.9"

7.49

2.40

13.3

13.40

Typic Ustifluvents

8

La Molina

Campo Libres

234

12° 04' 56.2"

76° 57' 04.9"

7.33

2.30

28.6

6.30

Ustic Torrifluvents

*Los análisis de caracterización se realizaron en el LASPAF-UNALM

20

3.3.2. Medio de cultivo El medio de cultivo empleado para el aislamiento de cepas y la prueba de solubilización fue el medio de Pikovskaya (PKV), cuadro 2. El medio fue preparado en líquido o solidificado mediante la adición de 15 g L-1 de agar. El medio sólido fue empleado para el aislamiento, selección y caracterización de los microorganismos con capacidad solubilizadora de fosfatos. El medio líquido para evaluar la capacidad solubilizadora in vitro de los microorganismos caracterizados como solubilizadores de fosfatos. Cuadro 2: Composición del medio nutritivo de Pikovskaya (PKV)

Componente

g L-1

Glucosa

10.0

(NH4)2SO4

0.5

MgSO4.7H2O

0.1

Extracto de levadura

0.5

KCl

0.2

NaCl

0.2

FeSO4.7H2O

0.002

MnSO4.H2O

0.002

Ca3(PO4)5

5.0

pH

7.0

Fuente: Pradhan y Sukla 2005. Para la preparación del medio PKV se agregó primero las diferentes sales que conforman el medio y posteriormente se adicionó Ca3(PO4)5 o roca fosfórica (RF)de Bayóvar antes de la esterilización del medio.

21

3.3.3. Aislamiento de microorganismos Para el aislamiento de MSP, las muestras fueron secadas al aire por 48 horas, tamizadas a través de una malla de 2 mm de diámetro para remover los fragmentos gruesos; posteriormente fueron homogenizadas y almacenadas en recipientes herméticos de plástico. Bacterias y hongos se aislaron a partir de ocho suelos descritos anteriormente, mediante la técnica de dilución en placas. El medio PKV fue suplementado con 45 mg L-1 de fluconazol para el cultivo de bacterias y con 50 mg L-1 de estreptomicina para el cultivo de hongos para evitar contaminación. Se trabajó con las diluciones 10-5, 10-6, 10-7 para bacterias y con 10-4, 10-5, 10-6 para hongos; a partir de las cuales se realizó el conteo de colonias totales y colonias que solubilizan fósforo, y en base a esto se determinó la población. Cada dilución tuvo tres repeticiones. El procedimiento empleado para la técnica de diluciones seriadas se describe a continuación: 1. Se preparó una suspensión inicial de suelo-agua de aproximadamente 1/10 (10-1) añadiendo 10 g de suelo seco a un frasco conteniendo 90 mL de solución salina estéril (9 g L-1 de NaCl). Se determinó previamente el estado de humedad del suelo. 2. Se agitó la suspensión por 10 minutos sin dejar que las partículas de suelo sedimenten. 3. Con una pipeta estéril fue transferido 1 mL de la suspensión a un tubo de ensayo que contenía 9 ml de solución salina estéril y se agitó durante un minuto. Esta segunda dilución fue 10-2. 4. Se realizó el mismo procedimiento para las sucesivas diluciones: 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7. 5. Para la siembra, se añadió 1 mL de la dilución respectiva a la placa y asépticamente se colocó aproximadamente 15 mL del medio de cultivo de tal manera que se distribuya de forma uniforme y forme una película de aproximadamente 2 a 3 mm. La temperatura del medio ideal para el plaqueo fue entre 45-50 °C, lo cual coincide cuando el medio se encuentra líquido pero es manipulable sin causar quemaduras. 6. Luego de la solidificación del agar, las placas fueron invertidas para evitar la condensación de vapor sobre el medio y la dispersión de las colonias.

22

7. Las placas fueron colocadas en la cámara de incubación a una temperatura de 28 °C durante 5 días (French y Hebert 1980, García 2010).

3.3.4. Selección de cepas con capacidad de disolución en medio sólido Para la detección selectiva de los MSP se empleó el medio sólido de PKV complementado con 5.0 g L-1 de fosfato tricálcico grado reactivo ó 7.63 g L-1 de roca fosfórica de Bayóvar, para aportar 1000 mg L-1 de P inorgánico. Después de 5 días de incubación a 24 °C, se evaluó si los microorganismos desarrollaron zonas transparentes alrededor de las colonias (halozonas). Las cepas que presentaron esta característica fueron repicadas por un procedimiento de picado con punta de aguja y a los 4 días fue determinado el índice de solubilización. Es importante mencionar que el fosfato tricálcico y la RF se adicionaron en tratamientos diferentes para determinar la presencia de MSP en ambos medios; ya que presentan diferente constante de producto de solubilidad (Kps), siendo la RF más difícil de ser solubilizada. Las colonias dentro de las placas y sus halos de solubilización fueron fotografiados mediante una cámara digital Sony Easyshare®. Los diámetros de crecimiento de cada colonia y los diámetros de los halos de solubilización respectivos fueron medidos con ayuda del software AutoCAD 2012 en español. Los diámetros fueron determinados utilizando fotografías de las placas y calibrándolas dentro del programa a un tamaño real usando referencias de tamaño conocido como el diámetro de la placa, monedas y el tamaño real de las etiquetas presentes en las placas. El índice de solubilización (IS) en los repiques fue calculado mediante la fórmula siguiente (Kumar y Narula 1999):

Donde: Ø Halo = diámetro del halo de solubilización (diámetro colonia + halozona) Ø Colonia = diámetro de la colonia 23

Con el mismo programa y calibrada la fotografía al tamaño real, se determinó el área del halo de solubilización que corresponde al área total (área de la colonia más área de la halozona). 3.4.

Análisis estadístico Para evaluar el índice de solubilización se utilizó un diseño completo al azar (DCA)

simple. El modelo aditivo lineal fue: Yij = µ + ti + εij Donde: Yij = área del halo µ = media general ti = es el efecto que produce la i-ésima cepa εij = es la variación de los factores no controlados (error experimental) El análisis estadístico se realizó empleando el paquete Agricolae del ambiente de proceso estadístico R, versión 2.15.1 (R Development Core Team 2012). Se realizó el análisis de variancia (ANVA) y los promedios fueron comparados mediante la prueba HSD Tukey con un nivel de significación de 0.05 y 19 grados de libertad. Para evaluar el área del halo de solubilización se utilizó el mismo diseño. 3.5.

Resultados y discusión

3.5.1. Aislamiento Fueron encontradas 13 cepas bacterianas y 7 fúngicas con capacidad para disolver fósforo insoluble a partir de las 8 muestras de los suelos descritos anteriormente. Se evaluó la población bacteriana y fúngica que creció en FTC y RF, determinando microorganismos totales y solubilizadores de fosfatos aislados de suelos calcáreos y su proporción respecto del total, los cuales se pueden apreciar en el cuadro 3: 24

Cuadro 3: Microorganismos totales y solubilizadores de fosfatos en dos fuentes de P, aislados de suelos calcáreos del valle del Mantaro Organismos mesófilos totales (UFC / g de suelo seco)* Suelo Localidad

Bacterias Roca Fosfórica Totales Solubilizadoras

1

Aramachay

1.20 x 10

2

Chacrampa-1

3.80 x 10

3

Chacrampa-2

3.74 x 10

4

Sincos-1

4.28 x 10

5

Chacrampa-3

5.56 x 10

6

Sincos-2

4.88 x 10

7

Sincos-3

2.49 x 10

8

La Molina Población Solubilizadores

2.35 x 10

9 9 7 9

2.00 x 10 3.00 x 10 2.00 x 10 3.00 x 10

9 9 9 9

7 6 7

9

2.63 x 10

9 9

2.59 x 10

9

4.16 x 10

9

3.50 x 10

-

6.10 x 10

-

4.84 x 10

8 9

7

3.00 x 10

4.30 x 10

-

1.00 x 10 0.55 %

7

Bacterias Fosfato Tricálcico Totales Solubilizadoras

9

1.30 x 10

9.00x 10

7

3.00 x 10 5.00 x 10 4.60 x 10 4.20 x 10 3.70 x 10 1.70 x 10 9.25 %

*UFC: unidades formadoras de colonias **La población fue cero

25

7

7 7 8 8 8 8

Hongos Roca Fosfórica Hongos Fosfato Tricálcico Totales Solubilizadores Totales Solubilizadores 5

1.30 x 10

5

1.20 x 10

4

7.00 x 10

4

4.00 x 10

4

4.00 x 10

4

4.00 x 10

-

9.00 x 10

1.00 x 10 1.00 x 10 1.00 x 10

4

6.00 x 10

8.00 x 10

1.00 x 10

4 4 4 4

-

1.00 x 10

4

-*

1.00 x 10

15.50 %

8.00 x 10 4.00 x 10 4.00 x 10 3.00 x 10 1.00 x 10

4

3.00 x 10

4 4 4 4 4 4

1.00 x 10 2.00 x 10 2.00 x 10 1.00 x 10 1.00 x 10 2.00 x 10

4 4

4 4 4 4 4 4

1.00 x 10

28.40 %

4

La población de bacterias solubilizadoras de fosfatos en el medio adicionado con RF representa el 0.55 % del total; mientras que la población de estas en medio con FTC fue 9.25% del total de la población encontrada para este grupo microbiano. Para los hongos se determinó que con RF en el medio de cultivo sólido la población de solubilizadores fue de 15.50 % mientras que en presencia de FTC la población de solubilizadores fue de 28.40 %. Se debe tener en cuenta que aunque el porcentaje de solubilizadores fue más alto para los hongos, en número no superan a las bacterias ya que tienen una mayor población en el suelo. En general, la población fue más alta en el medio adicionado con FTC en comparación con la población encontrada en medio con RF, ya que esta última es un compuesto de difícil solubilización, y al no proveer P al medio nutritivo la población fue notablemente menor. 3.5.2. Índice de solubilización De acuerdo al análisis de varianza (ANVA), anexo 1; el índice de solubilización (IS) in vitro en medio sólido presenta alta diferencia significativa entre las 20 cepas (13 cepas de bacterias y 7 de hongos) seleccionadas para su estudio por su capacidad de disolución de fósforo inorgánico. La prueba de comparación de medias HSD Tukey para el IS (cuadro 4), indica que estadísticamente la mejor cepa bacteriana fue la CBact1 aislada del suelo Chacrampa-3, que supera ampliamente a las demás, alcanzando 3.05, seguida por la CBact3 aislada del suelo Chacrampa-1 y CBact6 aislada del suelo La Molina que constituyeron el segundo grupo con 1.94 y 1.75 respectivamente. En relación a las cepas fúngicas la que destacó sobre las demás fue la CFung1 aislada del suelo Chacrampa-1 con 1.45. Es importante mencionar que lo que pretende el trabajo es aportar con cepas promisorias que solubilicen fósforo, en este sentido el objetivo fue seleccionar tres cepas bacterianas para realizar pruebas en la siguiente fase, y de acuerdo al índice de solubilización se seleccionó a la CBact1 y la CBact3 por presentar los valores más altos.

26

Cuadro 4: Índice de solubilización de 20 cepas solubilizadoras de P. Cepas CBact1 CBact3 CBact6 CBact10 CBact13 CFung1 CBact4 CBact12 CBact9 CFung7 CBact5 CBact11 CFung6 CFung5 CBact2 CFung3 CBact7 CFung2 CBact8 CFung4

Índice de solubilización 3.05 a 1.94 b 1.75 bc 1.63 cd 1.49 de 1.45 def 1.39 efg 1.37 efg 1.37 efg 1.33 efgh 1.33 efgh 1.30 efgh 1.30 efgh 1.29 efgh 1.25 fgh 1.23 fgh 1.23 gh 1.22 gh 1.21 gh 1.13 h

3.5.3. Área del halo de solubilización La segunda característica que nos permitió realizar la selección de cepas promisorias fue el área del halo de solubilización, para diferenciar entre bacterias que presentando índices de solubilización similares pueden presentar diferentes áreas de solubilización, es decir, una bacteria pequeña puede presentar el mismo índice de solubilización que una bacteria de mayor tamaño y en este sentido el área del halo de solubilización nos permitió diferenciar cepas que solubilizaron una mayor área y por lo tanto son más promisorias. El ANVA del área del halo de solubilización (anexo 2) indica alta diferencia significativa entre las cepas. La prueba de comparación de medias HSD Tukey (cuadro 5), indica que las cepas bacterianas con el área más alta son la CBact3 (Chacrampa-1), CBact1 (Chacrampa-3), y CBact2 (Sincos-3) con 196.8, 186.4 y 144.4 mm2 respectivamente. Estadísticamente la mejor cepa bacteriana fue la CBact3, seguida por la CBact1 y la CBact2 que presentan áreas muy altas con respecto a las producidas por las demás bacterias. La 27

CFung2, fue la cepa que presentó la mayor área de solubilización con 310.4 mm2.y estadísticamente es superior a todas cepas superando incluso el área producida por las cepas bacterianas. Le siguen la CFung4, CFung5 y la CFung1, las cuales a su vez presentaron diferencia estadísticamente significativa con respecto a las demás con 177.2, 171.2, y 169.9 respectivamente. Relacionando las mejores cepas por la mayor área de halo de solubilización y el alto índice de solubilización, se observa que entre las bacterias la CBact1 y CBact3 presentan los mejores resultados en ambas mediciones y por lo tanto constituyen las cepas más promisorias. Estas dos bacterias fueron seleccionadas para estudios posteriores. Aunque la CBact2 presentó un área del halo solubilización menor que las dos bacterias mencionadas pero mayor al producido por las demás bacterias, también fue considerada para la siguiente fase de laboratorio, ya que si bien no presentó un alto IS, el área de halo solubilizado en medio sólido estuvo entre los más altos. La CBact6 considerada dentro de las tres mejores por su alto IS, no fue considerada para la siguiente prueba ya que el área del halo de solubilización estuvo entre los más bajos, es decir presentó uno de los menores diámetros totales. Aunque las cepas fúngicas CFung2, CFung4, CFung5 y CFung1 fueron las que presentaron la mayor área de halo de solubilización; luego de que fue mediada esta variable, durante los repiques para mantener las cepas, las tres primeras redujeron gradualmente el área del halo de solubilización, llegando incluso a dejar de ser visibles; mientras que la CFung1 siempre mostró la misma área de halo de solubilización y se mantuvo así durante todo el ensayo, por tanto, la cepa fúngica más promisoria de acuerdo al área del halo de solubilización fue la CFung1. Además entre las cepas fúngicas esta cepa presentó el mayor IS. Por las razones mencionadas, se consideró como bacterias solubilizadoras de fosfatos promisorias a las cepas CBact1, CBact2 y CBact3 aisladas de los suelos Chacrampa-3, Sincos3 y Chacrampa-1 respectivamente y como cepa fúngica promisoria la CFung1 aislada del suelo Chacrampa-1, las cuales fueron estudiadas posteriormente.

28

Cuadro 5: Área del halo de solubilización de 20 cepas solubilizadoras de P Cepa CFung2 CBact3 CBact1 CFung4 CFung5 CFung1 CBact2 CBact8 CBact10 CBact7 CBact9 CFung3 CBact13 CBact11 CBact4 CFung6 CBact12 CFung7 CBact6 CBact5

Área del halo de solubilización (mm2) 310.4 a 196.8 b 186.4 bc 177.2 bc 171.2 bc 169.9 bc 144.4 c 39.4 d 34.9 d 31.5 d 21.8 d 19.2 d 17.4 d 14.5 d 14.3 d 10.1 d 9.6 d 8.5 d 5.2 d 1.2 d

A continuación (figura 1) se muestra todas las cepas fúngicas y bacterianas consideradas como solubilizadoras de fosfatos por la presencia de halo alrededor de la colonia.

29

CBact1

CBact2

CBact3

CBact4

CBact5

CBact6

CBact7

CBact8

CBact9

CBact10

CBact11

CBact12

Figura 1: Cepas bacterianas y fúngicas solubilizadoras de fosfatos en medio adicionado con fosfato tricálcico. sigue…

30

…viene

CBact13

CFung1

CFung2

CFung3

CFung4

CFung5

CFung6

CFung7

31

IV. 4.1.

CARACTERIZACIÓN TAXONÓMICA DE LOS MICROORGANISMOS Ubicación La fase de identificación taxonómica de las cepas bacterianas a nivel de género fue

realizada en el Laboratorio de Bacteriología del Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA) en La Molina, Lima. La ubicación del laboratorio en UTM es 288228 longitud Este, 8664179 latitud Sur; la altitud es de 245 msnm. 4.2.

Materiales

•

Placas Petri

•

Tubos de ensayo

•

Reactivos

•

Agua destilada y bidestilada

•

Vortex

•

Micropipetor de 500 y 1000 µL

•

Pipetas volumétricas

•

Pipetas Pasteur

•

Incubadora

•

Balanza de precisión de 3 dígitos

•

Asa de siembra

•

Erlenmeyer

•

Material fungible

•

Potenciómetro

•

Kit de reactivos para Tinción Gram (marca Merck)

•

Escala de McFarland

32

•

Cámara de flujo laminar

•

Cámara para determinación de fluorescencia

•

Baño María con agitador rotatorio incorporado

•

Cámara digital Sony Easyshare®

4.3.

Procedimientos Las tres cepas bacterianas y la cepa fúngica Se seleccionaron las cuales constituyen las

cepas microbianas más promisorias de acuerdo a la evaluación realizada en medio sólido. Estas se mantuvieron en medio PVK para su caracterización e identificación taxonómica. Las cepas bacterianas fueron identificadas a nivel de género a través de pruebas bioquímicas y fisiológicas, las cuales incluyen tinción Gram, crecimiento anaeróbico, pigmentos fluorescentes en medio KB, pigmentos no fluorescentes difusibles en KB, crecimiento a 40 °C, formación de esporas y tamaño; según los procedimientos descritos por Schaad et al. (2001). La cepa fúngica fue identificada por comparación de la estructura microscópica del hongo con claves de identificación taxonómica para géneros Las pruebas realizadas para identificación de las bacterias se describen a continuación. 4.3.1. Tinción Gram Para diferenciar entre bacterias Gram(+) y Gram(–), se empleó un kit de reactivos Merck® (figura 2) que incluye las siguientes soluciones: cristales de violeta, Lugol, decolorante y safranina.

Figura 2: Reactivos Merck para Tinción Gram 33

Las etapas y el tiempo de tinción (cuadro 6) con cada solución se realizó tal como lo indica las especificaciones del fabricante del kit de reactivos: Cuadro 6: Etapas realizadas para la Tinción Gram Etapa

Procedimiento

Tiempo

Solución

1

Tinción

1.5 min

Cristal de violeta

2

Lavado

30 seg

Agua corriente

3

Tinción

3 min

Lugol estabilizado

4

Lavado

20 seg

Agua corriente

5

Decoloración

5-10 seg

Solución decolorante

6

Lavado

30 seg

Agua corriente de grifo

7

Tinción

1 min

Solución de safranina

8

Lavado

1 min

Agua corriente

9

Secado

5 min

Secado a 50 °C

4.3.2. Crecimiento anaeróbico La prueba fue realizada utilizando el medio de Hugh y Leifson (Schaad 2011). La composición del medio se detalla en el cuadro 7: Cuadro 7: Composición del medio de Hugh y Leifson Compuesto Peptona NaCl

por L 2.0 g 5.0 g

KH2PO4 Agar Azul de bromotimol (1% solución acuosa) pH

0.3 g 3.0 g 3.0 mL 7.1

El procedimiento se describe a continuación: •

Cinco mL de medio fueron añadidos en tubos de prueba y esterilizados a 121 °C durante 20 min.

34

•

Se preparó una solución de glucosa al 10% esterilizada por filtrado y se añadió asépticamente 0.5 mL de la solución estéril a cada tubo con medio.

•

Cada cepa bacteriana fue inoculada en tres tubos (repeticiones).

•

Los tubos fueron cubiertos con una capa de estéril de glicerina e incubados a 28 °C.

•

La evaluación fue realizada a las 48 horas. Un cambio de color de azul a amarillo en los tubos fue registrado como positivo para el crecimiento anaeróbico (fermentación).

4.3.3. Presencia de pigmentos fluorescentes en medio de King B (KB) La prueba fue realizada utilizando el medio KB (King et al. 1954). La composición del medio se muestra en el cuadro 8: Cuadro 8: Composición del medio KB Composición Peptona proteosa #3 Difco K2HPO4 MgSO4.7H2O Glicerol Agar pH

por L 20.0 g 1.5 g 1.5 g 15.0 mL 15.0 g 7.2

Placas conteniendo 15 mL del medio KB fueron sembradas por estriado con las cepas bacterianas e incubadas a 25 °C. La determinación de fluorescencia se realizó después de 48 horas de incubación. Las placas fueron observadas en una cámara oscura bajo luz ultravioleta (figura 3) a una longitud de onda de 366 nm. Fueron realizadas tres repeticiones por cada cepa. Las cepas que emitieron luz fluorescente fueron consideradas como positivas. La presencia de pigmentos no fluorescentes difusibles fue determinada también en medio KB, pero la observación se realizó bajo luz normal.

35

Figura 3: Cámara para determinar fluorescencia 4.3.4. Crecimiento a 40 °C Esta prueba fue realizada empleando el medio líquido NBY (Nutrient broth yeast extract). La composición del medio se describe en el cuadro 9: Cuadro 9: Composición del medio NBY Composición Caldo nutritivo (Difco) Extracto de levadura

por L 8.0 g 2.0 g

K2HPO4

2.0 g

KH2PO4 Glucosa

0.5 g 2.5 g

Tubos conteniendo 10 mL de medio fueron esterilizados mediante autoclave. Posteriormente, 1 mL de solución estéril de MgSO4.7H2O 1M fue añadido a cada tubo. Los tubos fueron inoculados con las cepas bacterianas empleando un asa de siembra estéril e incubados en baño María equipado con agitador rotatorio (figura 4) a 27 °C durante una noche. Luego de este tiempo, 50 µL fueron removidos y añadidos a nuevos tubos conteniendo el medio NBY y la solución de MgSO4.7H2O, e incubados nuevamente a 40 °C por 24 horas. La presencia de nata bacteriana o turbidez con respecto al tubo control fue registrada como positiva. El crecimiento fue evaluado a las 15 y 24 horas.

36

Figura 4: Baño María con agitador rotatorio

4.3.5. Formación de esporas Sobre una gota de agua en un portaobjetos, una colonia fue suspendida, dispersada y secada al aire. Luego se inundó el portaobjetos con una solución de verde de malaquita (figura 5) al 5 % (p/v) y se tiñó por 10 minutos; se lavó con abundante agua y se secó. El portaobjetos fue inundado nuevamente con una solución de safranina al 0.5 % (p/v) durante 15 segundos. Finalmente fue lavado y se secado al aire y las células fueron observadas al microscopio con el objetivo de 40x. Es importante recalcar que las células bacterianas se tiñen de rojo y las esporas de verde.

Figura 5: Verde de malaquita y safranina para tinción de esporas 37

4.3.6. Tamaño de las células bacterianas Las bacterias fueron medidas con un microscopio OLYMPUS con cámara digital modelo DP70 con el objetivo de 100x. El largo y ancho de las células bacterianas fue determinado. 4.4.

Resultados y Discusión Los resultados de las pruebas bioquímicas y fisiológicas realizadas se resumen en el

cuadro 10. Cuadro 10: Posibles géneros determinados por pruebas bioquímicas Pruebas

CBact1

CBact2

CBact3

Tinción Gram

-

+

+

Crecimiento anaeróbico

-

-

+++

Crecimiento a 40 °C

-

+

++

Formación de esporas

-

+

+

Fluorescencia en medio KB

+

-

-

Pigmentos no fluorescentes difusibles en medio KB

-

-

-

Bacilos

Bacilos

Bacilos

Largo (µ)

2.50

1.92

3.03

Ancho (µ)

0.94

1.48

2.04

Pseudomonas sp. (fluorescente)

Bacillus sp.

Clostridium sp.

Forma Tamaño medio

Posible género

Las pruebas bioquímicas y fisiológicas realizadas, permitieron identificar como posibles géneros a la CBact1 como Pseudomonas sp., a la CBact2 como Bacillus sp. y a la CBact3 como Clostridium sp.

38

Las cepas bacterianas identificadas como Bacillus sp. y Clostridium sp. presentaron pared celular Gram (+), mientras que la identificada como Pseudomonas sp. presentó pared celular Gram (-). La tinción de estas cepas se puede apreciar visualmente en la figura 6.

Pseudomonas sp. Bacillus sp. Clostridium sp. Gram Gram + Gram + Figura 6: Tinción Gram observada al microscopio con objetivo de 60x Las cepas identificadas como Pseudomonas sp.y Bacillus sp. no mostraron evidencias de crecimiento anaeróbico y se registraron como negativas, mientras que Clostridium sp. fue registrada como positiva por el cambio de color de color del medio de azul a amarillo por fermentación (figura 7).

Pseudomonas sp.

Bacillus sp.

Clostridium sp.

Figura 7: Determinación de crecimiento anaeróbico en medio Hugh y Leifson

39

La fluorescencia en medio KB (figura 8) fue observada únicamente en la cepa identificada como Pseudomonas sp.

Figura 8: Determinación de fluorescencia dentro de la cámara oscura En la en la figura 9 se puede observar con mayor detalle la fluorescencia emitida por Pseudomonas sp.

Figura 9: Pseudomonas sp. fluorescente

40

Las cepas identificadas como Bacillus sp. y Clostridium sp. mostraron evidencias de crecimiento a 40 °C (figura 10), observándose un mayor crecimiento en esta última. Pseudomonas sp. no creció a esta temperatura.

Bacillus sp. Clostridium sp. Figura 10: Crecimiento a 40 °C a las 24 horas En las cepas identificadas como Bacillus sp. y Clostridium sp. fueron determinadas la presencia de esporas en el interior de las células bacterianas. La cepa identificada como Pseudomonas sp. no presentó esporas. La característica que permitió determinar la presencia de esporas fue la coloración verde (figura 11) en el interior de las bacterias, observada al realizar contraste con el tornillo micrométrico del microscopio.

Bacillus sp.

Clostridium sp.

Figura 11: Tinción de esporas observada con objetivo de 100x 41

V.

PRUEBA DE SOLUBILIZACIÓN IN VITRO EN MEDIO LÍQUIDO

5.1.

Ubicación La prueba de solubilización in vitro fue realizada en el LMS-UNALM. La ubicación

del laboratorio en UTM es 287978 longitud Este, 8663483 latitud Sur; la altitud es de 244 msnm. El P soluble fue determinado en el LASPAF-UNALM. La ubicación del laboratorio en UTM es 287999 longitud Este, 8663495 latitud Sur; la altitud es de 240 msnm. 5.2.

Materiales

•

Micropipetor

•

Tubos de 50 mL para centrifuga

•

Erlenmeyer de 250 mL

•

Papel filtro

•

Embudos

•

Fosfato tricálcico grado reactivo

•

Roca fosfórica

•

Balanza de precisión

•

Autoclave

•

Incubadora

•

Centrifuga de 5000 rpm

•

Espectrofotómetro (marca Thermo Scientific® HeλIO5)

•

Cámara de flujo laminar

42

5.3.

Procedimiento Las cepas puras que desarrollaron halo en medio sólido y que presentaron el índice más

alto de solubilización y/o mayor área del halo de solubilización se evaluaron en medio líquido. En frascos conteniendo 150 mL de medio líquido PVK modificado con 1000 mg L-1 de fosfato tricálcico o roca fosfórica de Bayóvar, fue inoculado 1 mL de una suspensión de Bacillus sp., Clostridium sp. y Pseudomonas sp. a una concentración de 3 x 108 ufc mL-1 validada previamente con la escala de McFarland (Perilla 2003), y Penicillium sp. a una concentración de 1 x 106 esporas mL-1 determinada por conteo de conidios con el hemocitómetro de Neubauer según el procedimiento descrito por French y Hebert (1980). La temperatura de incubación fue 28 °C. La concentración de fósforo en la solución nutritiva fue medida a los 5, 10, 15, 20, 25 y 30 días. El muestreo se realizó por descarte tomando una alícuota de las tres repeticiones por tratamiento y un blanco por cada cepa y fuente de P insoluble. Fue determinada también la acidez titulable por el método descrito por Cerezine et al. (1988) y el pH de los filtrados. El ensayo estuvo conformado por las cuatro cepas mencionadas y dos enmiendas que fueron las fuentes de P insoluble (cuadro 11), con un total de 144 unidades experimentales. Cuadro 11: Estructura del ensayo de solubilización in vitro Cepa Bacillus sp. Clostridium sp. Penicillium sp. Pseudomonas sp. Bacillus sp. Clostridium sp. Penicillium sp. Pseudomonas sp.

Fuente de P insoluble Fosfato tricálcico

Roca fosfórica de Bayóvar

Nº repeticiones 3 3 3 3 3 3 3 3

Nº evaluaciones 6 6 6 6 6 6 6 6

Total repeticiones 18 18 18 18 18 18 18 18

La cantidad de fósforo soluble fue medida por el método azul de molibdeno (Watanabe y Olsen 1965), y se expresó en mg P L-1 solubilizado por cada unidad muestreada. Para ello, la

43

alícuota de caldo microbiano se centrifugó a 5000 rpm durante 20 minutos, y posteriormente se filtró con papel Whatman No. 40. 5.4.

Análisis estadístico Un diseño completo al azar (DCA) con arreglo factorial con dos fuentes de variación

que fueron las cepas y las fuentes de P insoluble, fue empleado para la prueba de solubilización en medio líquido. El modelo aditivo lineal fue el siguiente: Yijk = µ + αi + βj + δij + εijk; con i = 1, 2, 3, 4;

j = 1, 2;

k = 1, 2, 3, 4

Donde: Υijk = representa la respuesta (fósforo solubilizado, pH y acidez titulable) µ = representa la media general αi = efecto que produce la i-ésima cepas solubilizadora de P βj = efecto de la j-ésima fuente de P insoluble δij = representa las interacciones para cada combinación de αi por β j εij = error experimental El ANVA (con un nivel de significación de 0.05) y las pruebas de comparación de medias (HSD Tukey) fueron realizadas con el paquete Agricolae del ambiente de proceso estadístico R, versión 2.15.1 (R Development Core Team 2012). 5.5.

Resultados y discusión Se encontró una alta variabilidad temporal en la concentración de P que Bacillus sp.,

Clostridium sp., Pseudomonas sp. y Penicillium sp. solubilizaron in vitro. Se determinó además una relación entre la acidez titulable, pH, y el P solubilizado en medio liquido adicionado con RF y FTC, pero la intensidad de cada uno de estos varía en función de la cepa y la fuente de P insoluble utilizada.

44

Diferencias altamente significativas fueron encontradas para los efectos principales cepas microbianas y enmienda; así como para los efectos de interacción respectivos (anexo 3). En los diferentes tiempos de medición también se encontraron diferencias altamente significativas, es decir que el P solubilizado para una misma cepa y enmienda varió notablemente a través de las evaluaciones realizadas. En el cuadro 12 se puede observar la separación de medias para la fuente de variación cepa. Cuadro 12: Promedio total de P solubilizado por cepa durante el periodo evaluación P soluble (mg P L-1) 196.77 a 147.89 b 74.55 c 48.93 d

Cepas Clostridium sp. Bacillus sp. Pseudomonas sp. Penicillium sp.

Se observa que cada cepa forma un grupo estadísticamente distinto en relación a la cantidad de P solubilizada en medio líquido. Clostridium sp. presenta mayor capacidad para solubilizar P con 196.77 mg P L-1, seguida por Bacillus sp., Pseudomonas sp. y Penicillium sp. respectivamente, siendo esta ultima la que presenta menor solubilización de P con 48.93 mg P L-1. Es importante mencionar que el cuadro 12 considera el promedio de todos los valores registrados en las 6 evaluaciones para cada cepa con valores muy bajos en sus inicios y también con valores muy altos de P liberado en los picos de solubilización. Posteriormente se analiza el comportamiento de las cepas en función a la máxima capacidad solubilizadora de cada cepa. 5.5.1. Fósforo soluble La variación temporal de la concentración de P soluble en el medio nutritivo para las cuatro cepas microbianas, puede apreciarse en la figura 12.

45

Figura 12: Variación de la concentración de P soluble en medio nutritivo adicionado con fosfato tricálcico y roca fosfórica Con Bacillus sp. la mayor concentración de P soluble se alcanzó a los 15 días en las dos fuentes de P insoluble, sin embargo la concentración de P liberado a partir del fosfato tricálcico fue de 304 mg P L-1 mientras que de la roca fosfórica se liberaron solamente 99 mg P L-1. Es importante mencionar que aunque el pico de solubilización para el fosfato tricálcico ocurrió a los 15 días, la concentración de P soluble disminuyó en las dos evaluaciones subsecuentes, pero en la última evaluación realizada, se produjo un incremento de la concentración de P soluble alcanzando esta vez 280 mg P L-1 de P solubilizado que si bien es inferior al pico encontrado, no deja de ser un valor importante. Esta variación en la concentración de P, se explicaría por la incorporación de P soluble al metabolismo de la 46

bacteria, pero luego de este periodo, se comienza nuevamente a liberar P al medio, es decir la bacteria empieza nuevamente a solubilizar P. En la roca fosfórica luego del pico de solubilización encontrado a los 15 días, no ocurre este proceso y el P soluble en el medio presenta valores similares a los registrados antes del valor más alto, esto debido a que la roca fosfórica al tener la constante de producto de solubilidad más alta, es más difícil que se solubilice y por lo tanto la cantidad de P liberado en el medio es escasa. En el medio inoculado con Clostridium sp. se observa que la concentración de P solubilizado a partir de la roca fosfórica a lo largo del tiempo es casi similar durante todo el periodo de evaluación y la máxima concentración liberada a partir de esta fuente de P insoluble fue 59 mg P L-1. En el medio con fosfato tricálcico se observó que a los 20 días ocurrió la mayor liberación de P soluble registrándose una concentración de 429 mg P L-1. Cabe resaltar que las diferencias en las concentraciones P solubilizado a partir de ambas fuentes de P insoluble son mucho mayores que en las otras cepas y que claramente se observa que esta cepa es la que solubilizó la mayor cantidad de P a partir del fosfato tricálcico en comparación con las demás. Además se observó que la concentración de P soluble en el medio líquido adicionado con fosfato tricálcico varió notablemente durante todo el ensayo, lo cual coincide con lo encontrado por Illmer y Schinner (1994), incrementándose gradualmente hasta alcanzar su máximo valor a los 20 días pero luego disminuyó en las dos últimas evaluaciones. Esta disminución puede deberse a que este microorganismo puede utilizar una parte del P soluble que se encuentra en el medio líquido e incorporarlo a su metabolismo. En la solubilización del FTC y la RF realizada por el hongo Penicillium sp. se observa un patrón similar en la concentración P soluble liberado a partir de estas dos fuentes de P insoluble en todo el periodo de evaluación. La máxima concentración de P liberado a partir del fosfato tricálcico fue de 102 mg P L-1 y es el menor valor registrado en esta fuente de P insoluble; mientras que a partir de la roca fosfórica se liberaron 57 mg P L-1, que igualmente es el valor más bajo para esta fuente de P. Ambos valores se registraron 25 días. Por lo tanto, esta cepa fúngica solubilizó la menor cantidad de P en comparación con las tres cepas bacterianas en ambas fuentes de P insoluble.

47

En el medio inoculado con Pseudomonas sp. la mayor concentración de P solubilizado fue 151 mg P L-1 la cual se alcanzó a los 15 días en el medio adicionado con fosfato tricálcico; mientras que cuando se utilizó roca fosfórica la mayor concentración de P solubilizado fue 116 mg P L-1 pero esto ocurrió a los 25 días. Para esta cepa bacteriana, las concentraciones de P liberado al medio a partir del fosfato tricálcico fueron las más bajas en comparación con las otras dos cepas bacterianas, pero superior a las registradas para la cepa fúngica. En relación a la roca fosfórica, aunque Pseudomonas sp. alcanzó el pico más alto en solubilización de P superando a las demás cepas bacterianas y a la fúngica, esta cantidad es baja en comparación con el P liberado a partir del fosfato tricálcico. 5.5.2. pH El valor inicial de pH para el medio de cultivo antes de la esterilización fue 6.98 para el fosfato tricálcico y 7.26 para la roca fosfórica; después de la esterilización el pH para en el medio con fosfato tricálcico varió ligeramente hasta 6.90, mientras que en el medio con roca fosfórica el pH se mantuvo exactamente en el mismo valor. El pH promedio durante todas las evaluaciones en medio adicionado con fosfato tricálcico fue de 4.22, 4.43, 4.59 y 5.26 para Clostridium sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp. y Penicillium sp. respectivamente. El pH promedio en medio con roca fosfórica fue de 4.09, 4.21, 4.24 y 4.61 para Pseudomonas sp., Bacillus sp., Clostridium sp., y Penicillium sp. respectivamente. Las diferentes variaciones en el pH son como resultado de la producción de acidez realizada por las diferentes cepas microbianas y explicada por la producción de ácidos orgánicos como el glucónico, cítrico, málico, láctico entre otros, la liberación de H+ que se produce en la asimilación del amonio, o por la producción de H2CO3 que se supone es una ayuda inicial. La variación temporal del pH en el medio nutritivo para las cuatro cepas microbianas, puede apreciarse en la figura 13.

48

Figura 13: Variación del pH en medio nutritivo adicionado con fosfato tricálcico y roca fosfórica A los 5 días después de la inoculación (ddi) el pH disminuyo drásticamente, el cual para Pseudomonas sp., Bacillus sp. y Clostridium sp. estuvo en el rango de 4.24 a 4.10 en el medio con fosfato tricálcico y de 4.08 a 4.17 en el medio con roca fosfórica. Para Pseudomonas sp. y Bacillus sp. el pH fue ligeramente menor en el medio con roca fosfórica, pero en Clostridium sp. ocurre lo contrario ya que el pH es ligeramente inferior para el medio adicionado con fosfato tricálcico. En el medio inoculado con Penicillium sp. el pH fue de 5.36 para el fosfato tricálcico y de 5.08 para la roca fosfórica, observándose por lo tanto que el menor valor de pH fue observado en el medio con roca fosfórica.

49

Relacionando el pH con el P solubilizado (figura 14) a los 5 ddi en el medio con fosfato tricálcico, la variación de pH no es alta entre las tres cepas bacterianas, a pesar de esto, Clostridium sp. tiene la mayor cantidad de P solubilizado con 255 mg P L-1, seguida por Bacillus sp. con 228 mg P L-1 y Pseudomonas sp. con 57 mg P L-1; mientas que Penicillium sp. que registró un pH notablemente más alto que las tres cepas mencionadas anteriormente, solubilizó únicamente 32 mg P L-1; lo cual quiere decir que la cepa fúngica está generando menor acidez que las otras cepas y esta es considera como uno de los factores responsables de la solubilización, debido a la relación inversamente proporcional que se ha reportado entre el pH y la cantidad de P liberado; pero en las tres cepas bacterianas el pH es similar y por lo tanto no es únicamente el pH el factor que interviene como mecanismo de solubilización.

Figura 14: Relación entre el pH y concentración de P soluble en medio adicionado con fosfato tricálcico En relación al fosfato tricálcico (figura 14), es importante hacer énfasis que para Pseudomonas sp., Bacillus sp. y Clostridium sp. el valor más bajo de pH se registró a los 5 ddi

50

y aunque se produjeron variaciones de pH durante las evaluaciones subsiguientes la tendencia siempre fue a incrementarse ligeramente el pH. En relación a Penicillium sp. se observa claramente que el pH a los 25 ddi fue más bajo que en la otras evaluaciones y es aquí donde se observó la mayor cantidad de P solubilizado. Para Clostridium sp. al igual que con Penicillium sp. se observa que la mayor solubilización ocurrió cuando el pH disminuyó, mientras que para Pseudomonas sp. y Bacillus sp. cuando se alcanzaron los picos más altos de P solubilizado, no se registraron necesariamente los valores más bajos de pH, por lo que otro mecanismo tiene que estar involucrado en la solubilización de P realizada por estas dos cepas bacterianas cuando fosfato tricálcico fue utilizado como fuente de P insoluble. En relación al pH y el P solubilizado en el medio con roca fosfórica (figura 15) se observa que inicialmente, a los 5 ddi, Bacillus sp y Clostridium sp. solubilizaron la mayor cantidad de P con 56 y 53 mg P L-1 respectivamente, seguidas por Pseudomonas sp. con 28 mg P L-1 y Penicillium sp. que solubilizó únicamente 9 mg P L-1. Bacillus sp. que es la que más solubiliza tiene el menor valor de pH con 4.08 y Penicillium sp. que es la que solubiliza la menor cantidad de P tiene el pH más alto con 5.08. Clostridium sp. presentó valores de pH y P similares a Bacillus sp., pero Pseudomonas sp. aunque también logró disminuir el pH signicativamente hasta 4.14, la cantidad de P liberado fue mucho menor con 28 mg P L-1.

51

Figura 15: Relación entre la concentración de P soluble y el pH en medio con roca fosfórica En Bacillus sp. no se observa una relación entre la máxima cantidad de P solubilizado y el pH. En el medio inoculado con Clostridium sp. el P soluble liberado al medio se mantiene prácticamente constante al igual que el pH durante todo el ensayo y se constituye en la cepa con el pico más bajo de solubilización. En Penicillium sp. se observa claramente que la mayor cantidad de P solubilizado ocurrió cuando el pH presentó el valor más bajo, por lo tanto en el medio adicionado con roca fosfórica el pH es el mecanismo que mayor influencia tiene sobre la solubilización, sin embargo en comparación con las cepas bacterianas no logró disminuir el gran medida el pH y por lo tanto el P liberado es menor. En el medio inoculado con Pseudomonas sp. se observa que la mayor cantidad de P liberado a partir de la roca fosfórica fue determinado cuando el pH del medio estuvo en 3.72 que está entre los dos valores más bajos registrados durante todo el ensayo. Además se aprecia 52

claramente en las cepas bacterianas que la disminución en la concentración de P en las ultimas evaluaciones se debe principalmente a que el pH se incrementó, mientras que con Penicillium sp. en las tres últimas evaluaciones ocurrió lo contrario, es decir se produjo la disminución más notable del pH y la concentración de P se incrementó. De las cuatro cepas microbianas, Pseudomonas sp. y Penicillium sp. muestran una clara relación inversamente proporcional entre el P solubilizado y el pH en el pico de solubilización. En Bacillus sp. y Clostridium sp. la máxima disminución de pH no coincide con el valor más alto de fósforo, pero en comparación con el pH inicial del medio, la disminución del pH sería responsable de la solubilización. 5.5.3. Acidez titulable Con Bacillus sp., Clostridium sp. y Penicillium sp. se observa claramente que la mayor cantidad de acidez titulable se produce en el medio adicionado con fosfato tricálcico aunque con algunas particularidades. Bacillus sp. produjo acidez titulable en forma irregular con dos picos pero siempre en mayor cantidad que cuando se utilizó roca fosfórica; Clostridium sp. incrementó gradualmente la acidez titulable (a excepción de penúltima evaluación) y presenta los valores más altos registrados para esta medida; y Penicillium sp. fue quien produjo la menor cantidad de acidez titulable en comparación con todas las cepas, pero igualmente en cantidades superiores al medio con roca fosfórica. En Pseudomonas sp. la mayor cantidad de acidez titulable se produjo en el medio adicionado con roca fosfórica y su valor más alto se registró entre los 20 y 25 ddi, mientras que con fosfato tricálcico la AT muestra una ligera disminución lineal desde la segunda evaluación. La variación temporal de la AT en el medio nutritivo para las cuatro cepas microbianas, puede apreciarse en la figura 16.

53

Figura 16: Variación de la acidez titulable en medio adicionado con fosfato tricálcico y roca fosfórica Relacionando la acidez titulable y el P solubilizado (figura 17) en el medio adicionado con fosfato tricálcico, se observa una relación directamente proporcional y muy evidente entre la cantidad de P solubilizado y la AT, es decir que para todas las cepas, a mayor cantidad de acidez titulable se observa mayor concentración de P solubilizado. Se puede apreciar que la línea de variación del P soluble en todo el periodo de evaluación tiene el mismo comportamiento que la línea de variación de la acidez titulable. Por lo tanto la variable que mayor incidencia tiene sobre la solubilización, o que explicaría de mejor forma la solubilización del fosfato tricálcico es la acidez titulable y en menor medida el pH. La menor cantidad de acidez titulable fue determinada en Penicillium sp. y Pseudomonas sp. y estos dos 54

cepas se registra también la menor cantidad de P soluble. La mayor cantidad de acidez titulable se registró en Clostridium sp. y es en esta cepa donde se encontró la mayor cantidad de P soluble en comparación con las demás cepas, luego le sigue Bacillus sp. que produjo una cantidad menor de acidez titulable y fue la cepa que ocupo el segundo lugar en solubilización de P a partir del fosfato tricálcico.

Figura 17: Relación entre la concentración de P soluble y la acidez titulable en medio adicionado con fosfato tricálcico. En relación a la acidez titulable y el P solubilizado (figura 18) en el medio con roca fosfórica, se observa, al igual que en el caso del fosfato tricálcico, una relación directamente proporcional entre la cantidad de P solubilizado y la acidez titulable. El pico más alto de producción de acidez titulable en medio con roca fosfórica lo produjo Pseudomonas sp. y es aquí donde también se registró la mayor cantidad de P solubilizado, lo cual ocurrió entre los 20 a 25 ddi, la que le sigue es Clostridium sp. que si bien no alcanzó un pico tan alto de acidez

55

titulable, esta se mantuvo prácticamente sin mayor variación durante todas las evaluaciones pero con promedio más alto que el determinado para Pseudomonas sp. en todo el periodo de evaluaciones y como resultado la concentración de P soluble también se mantuvo sin variaciones importantes. Le sigue Bacillus sp. y finalmente Penicillium sp. con la menor producción de acidez titulable y por lo tanto la menor cantidad de P solubilizado. Por lo tanto, también para la roca fosfórica la variable que mayor incidencia tiene sobre la solubilización es la acidez titulable y no únicamente el pH.

Figura 18: Relación entre la concentración de P soluble y la acidez titulable en medio adicionado con roca fosfórica. A los 20 ddi se registró el valor más alto de solubilización en Clostridium sp. en medio de cultivo con FTC, seguida por Bacillus sp., Penicillium sp. y Pseudomonas sp. Además Clostridium sp. fue la cepa que mayor cantidad de P solubilizó en todas las evaluaciones realizadas a partir del FTC. En la RF se observó poca variabilidad entre el P que puede

56

solubilizar cada cepa. Las cuatro cepas microbianas evaluadas son más efectivas en la solubilización del fosfato tricálcico en comparación con la roca fosfórica (figura 19).

Figura 19: Solubilización de fosfato tricálcico y roca fosfórica a los 20 días después de la inoculación En el cuadro 13 se resume los valores más altos de solubilización alcanzados por cada cepa, la disminución del pH y la acidez titulable producida en la evaluación respectiva. Cuadro 13: Solubilización de fosfato tricálcico y roca fosfórica en medio líquido por las cepas microbianas Cepa

Clostridium sp. Bacillus sp. Pseudomonas sp. Penicillium sp.

Fuente de fósforo Fosfato tricálcico Roca fosfórica pH Acidez P pH final Acidez final titulable mg L-1 titulable meq L-1 meq L-1 4.11 31.69 429.11 4.32 11.76 4.38 28.42 304.42 4.18 12.41 4.47 11.43 151.40 3.72 13.72 4.87 12.09 101.91 4.01 9.47 57

P mg L-1 58.90 99.34 115.73 56.94

VI. 6.1.

ENSAYO BIOLÓGICO DE DISPONIBILIDAD DE FÓSFORO

Ubicación La prueba biológica de evaluación de las cepas en macetas se ejecutó en el invernadero

de Fertilidad del Suelo de la UNALM. La ubicación del laboratorio en UTM es 288170 longitud Este, 8663903 latitud Sur; la altitud es de 243 msnm. Las temperaturas máximas y mínimas anuales promedio son aproximadamente 24 y 16 °C respectivamente, la precipitación anual es de 23 mm. 6.2.

Materiales

•

Semillas de maíz amarillo variedad PM 213

•

Semillas de frijol castilla

•

Macetas

•

Papel filtro

•

Tamiz de malla de bronce de 5 mm

•

Pipetas

•

Agua destilada estéril

•

Suspensión microbiana de 4 cepas

6.3.

Procedimiento Se realizó la prueba biológica en invernadero empleando como plantas indicadoras

maíz (Zea mays L.) y frijol Castilla (Vigna unguiculata L.). Se evaluó la respuesta del maíz y frijol a la inoculación de cepas promisorias con capacidad para disolver fosfatos de calcio. Macetas conteniendo 3 kg de suelo tamizado con malla de 5 mm fueron sembradas con 2 plantas y la respectiva suspensión de esporas o células del microorganismo.

58

Para Bacillus sp., Clostridium sp. y Pseudomonas sp. la suspensión a inocular se preparó a una concentración de 3 x 108 ufc mL-1 validada con la escala de McFarland y Penicillium sp. a una concentración de 1 x 106 conidios mL-1 determinada por conteo de esporas con el hemocitómetro de Neubauer según el procedimiento descrito por French y Hebert (1980). El ensayo estuvo constituido por dos fuentes de P y cuatro cepas más un control (cuadro 14). En total se utilizaron 80 macetas para los dos cultivos. Cuadro 14: Tratamientos del ensayo de macetas con maíz o frijol Fuente de P

Ninguna

Roca fosfórica de Bayóvar (200 mg kg-1)

Cepa

Nº Repeticiones

Pseudomonas sp. Bacillus sp. Clostridium sp. Penicillium sp. Ninguna Pseudomonas sp. Bacillus sp. Clostridium sp. Penicillium sp. Ninguna

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

El suelo de las macetas corresponde a un Ustic Torrifluvents (Soil Taxonomy 2010) del campo “Libres” de la UNALM. Fue seleccionado por presentar principalmente un pH ligeramente alcalino (7.33), similar al que presentan los suelos de donde fueron aislados los microorganismos, para que este factor no influya en la solubilidad de los compuestos fosfatados y además por presentar un contenido medio de CaCO3 (4.40 %) que reduce la disponibilidad de P. Las características del análisis del suelo se muestran en el cuadro 15.

59

Cuadro 15: Características físicas y químicas del suelo empleado en las macetas Características

Unidad

Valor

Clasificación

Arena

%

37

--

Limo

%

46

--

Arcilla

%

17

--

Clase textural

--

--

Franco

pH (H2O)

--

7.33

Ligeramente alcalino

CE(1:1)

dS m-1

2.30

Ligeramente salino

CaCO3

%

4.40

Medio

Materia orgánica

%

Fósforo disponible Potasio disponible

1.50

Bajo

-1

28.6

Alto

-1

mg kg mg kg

191

Medio

-1

10.72

Baja

-1

8.40

Medio

-1

1.68

Medio

-1

0.41

Alto

-1

0.23

Bajo

-1

cmolc kg

0.00

--

%

10.72

Elevado

mg kg-1

1280.00

Alto

cmolc kg

CIC 2+

Ca

cmolc kg

2+

Mg

cmolc kg

+

K

cmolc kg +

cmolc kg

Na

3+

+

Al + H PSB

Fósforo total

Fuente: LASPAF-UNALM, 2012 La materia seca fue determinada al final del ensayo y luego de la digestión de la muestra el porcentaje de P por cada unidad experimental constituida por 2 plantas por maceta. En base a la concentración de P y la materia seca fue determinada la extracción de P. Los resultados están expresados en mg P por maceta. El P fue medido por el método azul de molibdeno (Watanabe y Olsen 1965). Fue determinado además el porcentaje y la extracción de Ca. El Ca fue medido por absorción atómica luego de la digestión de la muestra.

60

6.4.

Análisis estadístico Para cada cultivo se utilizó un diseño completo al azar factorial (fuente de P y cepa). El

modelo aditivo lineal fue: Yijk = µ + αi + βj + (α β)ij + εijk;

i = 1, 2;

j = 1, 2, 3, 4; k = 1, 2, 3, 4

Donde: Υijk = la k-ésima observación del i-ésimo tratamiento (respuesta) µ = estima la media general αi = efecto que produce la i-ésima fuente de P aplicada al suelo βj = efecto debido a la j-ésima cepas solubilizadora de P inoculada al suelo (α β)ij = efecto de la interacción entre la fuente de fuente y la cepa inoculada εijk = efecto aleatorio de variación (error experimental) Se realizó el análisis de variancia (ANVA) con un nivel de significación de 0.05 y los promedios fueron comparados mediante la prueba de comparación de medias HSD Tukey empleando el paquete Agricolae del ambiente de proceso estadístico R, versión 2.15.1 (R Development Core Team 2012). 6.5.

Resultados y discusión en el cultivo de maíz En raíces y parte aérea fueron evaluadas la materia seca y la extracción de P y Ca.

6.5.1. Biomasa aérea y radicular En la biomasa aérea, radicular y total se determinó diferencias altamente significativas únicamente para las cepas microbianas (anexo 4, anexo 5 y anexo 6). También se observó diferencias altamente significativas para las interacciones cepa-sustrato. Las fuentes de P utilizadas no presentaron diferencias significativas en la producción de biomasa. Según la prueba de separación de medias (cuadro 16), Clostridium sp. y Penicillium sp. originaron una mayor producción de biomasa aérea en maíz; siendo estadísticamente 61

superiores a las plantas tratadas con las demás cepas. Pseudomonas sp., Bacillus sp. no causaron un incremento en la materia seca estadísticamente superior con respecto a las plantas sin inocular, aunque estas últimas produjeron la menor cantidad de materia seca. Cuadro 16: Materia seca en la biomasa aérea, radicular y total en plantas de maíz Cepas Clostridium sp. Penicillium sp. Pseudomonas sp. Bacillus sp. Ninguna

Foliar g/maceta 36.14 a 36.52 a 30.70 b 29.44 b 27.16 b

Raíces g/maceta 18.13 a 15.74 b 13.89 bc 12.67 c 12.00 c

Total g/maceta 54.27 a 52.26 a 44.59 b 42.11 bc 39.16 c

Incremento de materia seca 38.59 % 33.45 % 13.86 % 7.53 % -

En raíces, Clostridium sp. estimuló una mayor producción de biomasa, siendo estadísticamente superior a las plantas inoculadas con las demás cepas y al tratamiento sin inocular que presentó el valor más bajo (cuadro 16). Al igual que en la biomasa aérea, Pseudomonas sp. y Bacillus sp. con respecto a las plantas sin inocular, no incrementaron significativamente la biomasa radicular. En la biomasa total se observa que Clostridium sp. y Penicillium sp. originaron una mayor producción de biomasa total (cuadro 16) y fueron estadísticamente superiores a las plantas tratadas con las demás cepas. Pseudomonas sp. y Bacillus sp. no incrementaron significativamente biomasa total con respecto a las plantas sin inocular. Una estrecha relación entre Clostridium sp. que estimuló una mayor producción de biomasa aérea, radicular y total, con los datos obtenidos de la prueba de solubilización in vitro fue encontrada. Esta cepa bacteriana originó en promedio el mayor descenso de pH y la más alta producción de acidez titulable en condiciones de laboratorio, y en la prueba de macetas aunque no se midió el pH de la rizósfera del suelo, se cree que probablemente se comportó de igual forma, es decir, originó un descenso de pH en el suelo cercano a la rizósfera que estimuló la producción de biomasa.

62

Penicillium sp. también estimuló significativamente la producción de biomasa área y total y en menor medida la radicular; aunque presentó el menor descenso de pH y la menor producción de acidez titulable, mecanismos responsables de la solubilización de P en ensayos in vitro, éste hongo debió originar igualmente una reducción del pH de la rizósfera aunque en menor medida que Clostridium sp. Además el incremento en la biomasa podría ser también por otros factores como la producción de sustancias promotoras de crecimiento como el ácido indol acético (AIA). En maíz, todas las cepas lograron incrementar el contenido de materia seca total con respecto a las plantas sin inocular. Clostridium sp. y Penicillium sp. fueron las cepas que mostraron mejores resultados ya que el incremento fue de 38.59 y 33.45 % respectivamente. Bacillus sp. originó el incremento más bajo con 7.53 %. 6.5.2. Extracción de fósforo La extracción de P en la biomasa aérea, radicular y total presentó diferencias altamente significativas para las cepas microbianas (anexo 7, anexo 8, anexo 9). La extracción de P por la biomasa radicular fue la única que presentó diferencias altamente significativas para la fuente de variación sustrato. Mayores niveles de extracción de P en la biomasa aérea de maíz fueron originados por Clostridium sp. y Pseudomonas sp. (cuadro 17); mientras que Penicillium sp. y Bacillus sp. no incrementaron significativamente la extracción de P con respecto al tratamiento sin inocular Cuadro 17: Extracción de fósforo en biomasa aérea, radicular y total en plantas de maíz Cepas Clostridium sp. Pseudomonas sp. Penicillium sp. Bacillus sp. Ninguna

Foliar mg P/maceta 60.44 a 59.28 a 55.25 ab 47.74 b 47.65 b

63

Raíz mg P/maceta 25.98 a 25.59 ab 24.66 abc 19.12 bc 18.45 c

Total mg P/maceta 86.41 a 84.87 a 79.91 a 66.86 b 66.11 b

Una mayor extracción de fósforo en la biomasa radicular fue originada por Clostridium sp. con respecto al tratamiento sin inocular. Una mayor extracción de P en la biomasa total de maíz, fue observada en presencia de Clostridium sp., Pseudomonas sp. y Penicillium sp.; mientras que Bacillus sp. no incrementó significativamente la extracción con respecto a las plantas sin inocular. Clostridium sp. fue la cepa que originó lo niveles más altos de extracción de P en la biomasa aérea, radicular y total. También presentó los valores más altos de materia seca. La disminución del pH y alta producción de acidez titulable determinada en la prueba de laboratorio son responsables no únicamente del incremento de materia seca sino también de la extracción de P, ya que si ocurre una disminución del pH del suelo cercano a la rizósfera hasta un valor en el que estos compuestos son más solubles, la disponibilidad de P para la planta y la extracción también se incrementa. Le sigue Pseudomonas sp. que en la prueba de solubilización in vitro también disminuyó el pH y produjo cantidades significativas de acidez titulable, pero en menor cantidad que la cepa mencionada anteriormente, por lo tanto la cantidad de P que solubilizó a nivel de la rizósfera y que la planta pudo extraer también es menor. Las Pseudomonas fluorescentes colonizan agresivamente las raíces de las plantas y son consideradas un importante grupo debido a su utilidad como biofertilizantes (Villegas y Fortin 2001), y constituyen uno de los géneros bacterianos más estudiadas por su actividad solubilizadora que se refleja en el incremento de la biomasa, extracción de P y rendimiento, por la producción de enzimas y hormonas que promueven el crecimiento (Popavath et al. 2008). Penicillium sp. no solamente incrementó la biomasa total, sino también la extracción total de P con respecto a las plantas sin inocular, pero en menor medida que dos cepas mencionadas anteriormente. Este hongo presentó un buen comportamiento en la prueba de macetas con maíz, sin embargo en condiciones de laboratorio registró el pH promedio más alto y la menor producción de acidez titulable con respecto a las bacterias, por lo que otro mecanismo de incremento de la biomasa y de la extracción de P tiene que estar involucrado, como la producción de varias sustancias promotoras del crecimiento vegetal entre las cuales

64

destacan el AIA. Otros autores han reportado que por debajo de pH 5.5 (Stumm y Morgan 1995) la solubilidad de los fosfatos se incrementa y si este hongo logra disminuir el pH del suelo que fue de 7.33 en la parte rizosférica, la solubilidad del P y la extracción también se incrementaran aunque en menor medida que en las plantas inoculadas con las cepas bacterianas. La extracción de P por las raíces de maíz presentó diferencias en función de la fuente de P utilizada (cuadro 18). El suelo con roca fosfórica originó una mayor extracción de fósforo debido a que probablemente a nivel de raíces cierta cantidad de esta fuente se habría solubilizando por acción de las cepas inoculadas, lo que incrementó la extracción de P en raíces, pero no llega a ser significativa como para inducir los mismo en la extracción de P por la parte aérea. Como esto ocurrió solo en raíces es posible que la rizósfera de maíz también sea responsable del mayor nivel de extracción de P, ya que esta es una planta C4 que se caracteriza por ser extractiva y por la liberar gran cantidad de sustancias en la rizósfera. Cuadro 18: Extracción de fósforo en la biomasa radicular según la fuente de fósforo aplicada en plantas de maíz Fuente de P Con roca fosfórica Sin roca fosfórica

mg P/maceta 24.87 a 20.65 b

En la biomasa aérea y total, la aplicación de roca fosfórica al suelo no incrementó significativamente la extracción de P. Los MSP probablemente liberan al suelo sustancias que acidifican la rizósfera pero eso depende de la eficiencia de la cepa utilizada y se esperaba que la RF incremente la eficiencia de absorción de P inducida por las cepas microbianas si estas conseguían solubilizarla, pero esto no ocurrió, al menos en gran escala, ya que únicamente fue observado un incremento en la extracción de P en la biomasa radicular. La eficiencia de absorción de P para el suelo con roca fosfórica o sin ella es similar, pero los cálculos fueron realizados en base a los promedios de extracción de P obtenidos en las macetas donde fue aplicada la roca fosfórica (anexo 10). El tratamiento sin ninguna cepa presentó una eficiencia de absorción de P de 12.10 %, mientras que el valor más alto se registró cuando Pseudomonas sp. y Clostridium sp. fueron inoculadas, con 15.01 % y 14.16 % 65

respectivamente; es decir que la inoculación con la mejor cepa incrementó la eficiencia de absorción de éste elemento en 2.91%, que es ligeramente menor al encontrado para el tratamiento aditivo llevado a cabo con la adición de superfosfato triple a las macetas que tuvo una eficiencia de absorción de 15.18 % con un incremento de 3.08 % con respecto al tratamiento sin inocular. La aplicación de superfosfato triple no fue parte del diseño estadístico, sino que únicamente fue realizado para determinar la máxima capacidad de absorción bajo las condiciones de suelo que se tuvieron. Estos resultados indican que Pseudomonas sp. alcanzó casi la misma eficiencia que el superfosfato triple que es un fertilizable relativamente soluble, lo cual se debe a que la cepa solubilizó parte del P natural del suelo pero no solubilizó P a partir de la roca fosfórica ya que la extracción con y sin roca fosfórica es similar y la única variación encontrada en la extracción fue en función de las cepas inoculadas. 6.5.3. Extracción de calcio La extracción de calcio por la biomasa aérea de maíz no presento diferencias significativas, pero la extracción por las raíces y la total presentaron diferencias altamente significativas (anexo 11, anexo 12 y anexo 13). Bacillus sp. originó mayor extracción de calcio en la biomasa aérea y fue la única cepa estadísticamente superior al tratamiento sin inocular. En raíces, Clostridium sp. originó mayor extracción de calcio y es estadísticamente superior al tratamiento sin inocular y a Bacillus sp. que presentó la menor extracción de calcio en raíces (cuadro 19). Cuadro 19: Extracción de calcio en plantas de maíz inoculadas con 4 cepas solubilizadoras de fosfatos Cepas Clostridium sp. Pseudomonas sp. Bacillus sp. Penicillium sp. Ninguna

Raíz Foliar mg Ca/maceta mg Ca/maceta 397.4 ab 283.2 a 426.2 ab 248.9 ab 455.8 a 171.2 c 367.3 ab 224.3 abc 287.7 b 180.5 bc

66

Total mg Ca/maceta 680.6 a 675.0 a 627.0 ab 591.6 ab 468.2 b

Únicamente Clostridium sp. y Pseudomonas sp. fueron las cepas que incrementaron la extracción total de calcio con respecto al tratamiento sin inocular. La primera cepa mencionada también incrementó la biomasa foliar y la extracción de P, por lo cual constituye una cepa promisoria. Aunque el P tiende a formar compuestos insolubles con el Ca2+ como el CaPO4 (Kirkby y Johnston 2008), también se ha reportado que los ácidos orgánicos como el glucónico, cítrico, málico, producidos durante la solubilización de P, pueden formar complejos solubles con iones metálicos como el Ca2+, reduciendo la adsorción de P y haciendo que éste se presente en forma disponible (Rashid et al. 2004), quedando libre también el Ca2+ en la zona de la rizósfera, pudiendo ser absorbido e indirectamente la extracción de calcio puede incrementarse. La extracción total de calcio fue significativamente más alta con la aplicación de RF (cuadro 20), lo cual se debe a que según lo mencionado por Hammond (1979), el efecto de las rocas fosfóricas en el pH del suelo varía desde sin efecto hasta un ligero aumento en el pH de 0.2 a 0.4 unidades, dependiendo de la tasa de adición de fósforo y de la reactividad de la roca fosfórica, y si esto ocurre el calcio en solución incrementa lo cual tiene un efecto significativo en la absorción. Es importante considerar que el efecto de la acidificación por los MSP inoculados es responsable del mayor nivel de extracción P, pero en el calcio una mayor extracción del elemento es reportada cuando ocurre lo contrario, es decir cuando el pH se incrementa. Cuadro 20: Extracción total de Ca según la fuente de P en maíz Fuente de P

Total mg Ca/maceta 645.5 a 571.5 b

Roca fosfórica de Bayóvar Ninguna

6.6.

Resultados y Discusión en el cultivo de frijol Los resultados analizados corresponden únicamente a la biomasa foliar, ya que al final

del ensayo el suelo contenido en las macetas estuvo compactado y no permitió extraer todas las raíces del cultivo de frijol.

67

6.6.1. Biomasa aérea En frijol, diferencias altamente significativas fueron encontradas únicamente para las cepas microbianas (anexo 14). Clostridium sp. y Bacillus sp. promovieron una mayor producción de biomasa aérea (cuadro 21). Pseudomonas sp. y Penicillium sp. no consiguieron un incremento significativo con respecto a las plantas no inoculadas. Cuadro 21: Materia seca en la biomasa aérea en plantas de frijol Foliar g/maceta 17.02 a

Incremento de materia seca 43.63 %

Bacillus sp.

15.73 a

32.74 %

Pseudomonas sp.

12.57 b

6.08 %

Ninguna Penicillium sp.

12.56 b 11.85 b

5.99 % -

Cepas Clostridium sp.

Clostridium sp. en frijol, al igual que en el cultivo de maíz, originó una mayor producción de biomasa aérea, que se explica por los resultados obtenidos en la prueba de laboratorio, en la que esta cepa logró la mayor acidificación del medio y la más alta producción de acidez titulable, y si ocurrió un incremento de materia seca, fue probablemente porque la bacteria se comportó de forma similar en las macetas, es decir, produciendo ácidos orgánicos y sustancias promotoras del crecimiento vegetal que estimularon una mayor producción de biomasa aérea. Bacillus sp. fue la cepa que en laboratorio, después de

Clostridium sp. produjo

cantidades significativas de acidez titulable y por tanto de sustancias orgánicas que promueven el crecimiento vegetal, y también incrementó significativamente la producción de biomasa área. Penicillium sp. presentó un buen comportamiento en el cultivo de maíz, pero en frijol no incrementó significativamente la producción de biomasa aérea. La liberación de sustancias promotoras de crecimiento vegetal por el hongo posiblemente no ocurrió en este cultivo ya que cada planta es selectiva y permite la presencia de únicamente cierto grupo de 68

microorganismos en la rizósfera, y este hongo parece no ser compatible con la rizósfera del frijol, sino que muestra mejores resultados con la presencia de las dos cepas bacterianas mencionadas anteriormente. 6.6.2. Extracción de fósforo Únicamente las cepas presentaron diferencias altamente significativas en extracción de P en frijol (anexo 15). Clostridium sp. causó el mayor nivel de extracción de P en la biomasa aérea y es estadísticamente superior a las demás cepas y al tratamiento sin inocular que presentó la menor valor (cuadro 22). También presentó los valores más altos de materia seca. La capacidad de esta bacteria para disminuir el pH y producir altos niveles de acidez titulable por la liberación de ácidos orgánicos en condiciones de laboratorio, se relaciona con los datos obtenidos en la extracción de P en frijol, ya que las plantas inoculadas con esta cepa mostraron los niveles más altos, es decir que aunque esta cepa no solubiliza el fósforo de la roca fosfórica, si lo hace con otras fuentes de P insoluble presentes de forma natural en el suelo, lo que incrementa la extracción de este elemento. Cuadro 22: Extracción de fósforo en la biomasa aérea en plantas de frijol Cepas Clostridium sp. Bacillus sp. Penicillium sp. Pseudomonas sp. Ninguna

mg P/maceta 46.02 a 39.14 b 33.30 b 32.87 b 32.66 b

6.6.3. Extracción de calcio En la extracción de calcio de la biomasa aérea de frijol, únicamente las cepas presentaron alta diferencia significativa (anexo 16). Las plantas inoculadas con Clostridium sp. y Bacillus sp. además de incrementar la biomasa aérea y extracción de P, también presentaron el mayor nivel extracción de calcio (cuadro 23), pero éste último, no tiene relación con la cantidad de P solubilizado, debido a que la mayor solubilización de P se consigue al 69

disminuir el pH, mientras que el calcio incrementa su disponibilidad cuando el pH se incrementa, razón por la cual los datos de calcio en frijol no son analizados a mayor detalle. Cuadro 23: Extracción de calcio en la biomasa aérea en plantas de frijol Cepas Bacillus sp. Clostridium sp. Pseudomonas sp. Ninguna Penicillium sp.

mg Ca/maceta 643.0 a 600.8 ab 522.1 bc 511.5 bc 438.3 c

No se analiza la extracción total, ni la eficiencia de absorción, porque la biomasa radicular no fue determinada.

70

VII. CONCLUSIONES •

Fueron aisladas 13 cepas de bacterias y 7 de hongos con capacidad para solubilizar fosfatos. De acuerdo al índice y el área del halo de solubilización se consideró como cepas promisorias la CBact1, CBact2, CBact3 y CFung1.

•

La cepa bacteriana CBact1 corresponde a Pseudomonas sp. (fluorescente), la CBact2 a Bacillus sp. y la CBact3 a Clostridium sp. La CFung1 corresponde a una especie de Penicillium sp.

•

Clostridium sp. fue la cepa con mayor eficiencia de solubilización in vitro, mientras que Penicillium sp. resultó en los valores más bajos a partir del fosfato tricálcico. La cantidad de fósforo solubilizado a partir del fosfato tricálcico fue notablemente mayor que la roca fosfórica.

•

La eficiencia de solubilización del fósforo de la roca fosfórica fue muy baja, lo cual indica que si bien las cepas fueron muy efectivas in vitro, aún no demuestran su capacidad para incrementar la absorción de P por las plantas.

71

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Aguirre, G. 1993. Evaluación de fuentes de fósforo en el rendimiento del cultivo de papa, con énfasis en roca fosfatada y fuentes orgánicas. Anales Científicos Universidad Nacional Agraria La Molina (en línea). Perú. Consultado 27 abr. 2012. Disponible en http://tumi.lamolina.edu.pe/resumen/anales/1999_92.pdf Alagawadi, AR; Gaur, AC. 1988. Associative effect of Rhizobium and phosphatesolubilizing bacteria on the yield and nutrient uptake of chickpea. Plant and Soil 105:241-246. Alegre, J; Chumbimune, R. 1991. Investigaciones y usos de la roca fosfórica en el Perú. II Reunión de la Red Latinoamericana de Roca Fosfórica. Táchira, Venezuela. 13 al 16 de marzo. Asea, P; Kucey, R; Stewart, J. 1988. Inorganic phosphate solubilization by two Penicillium species in solution culture and soil. Soil Biology and Biochemistry. 20:459-464. Atlas, RM. 2010. Handbook of microbiological media. 4 ed. Florida, CRC Press. 2043 p. Babenko, S; Tyrygina, G; Grigor’ev, E; Dolgikh, L; Borisova, T. 1984. Biological activity and physiological-biochemical properties of phosphate-dissolving bacteria. Microbiology 53:533-539. Banik, S; Dey, B. 1983. Available phosphate content of an alluvial soil as influenced by inoculation of some isolated phosphate-solubilizing microorganisms. Plant and Soil 69(3):353-364.

72

Barroso, C; Nahas, E. 2005. The status of soil phosphate fractions and the ability of fungi to dissolve hardly soluble phosphates. Applied Soil Ecology 29:73–83. Bashan, Y. 1986. Enhancement of wheat root colonization and plant development by Azospirillum brasilense Cd. Following temporary depression of rhizosphere microflora. Applied and Environmental Microbiology 51:1067-1071. Bashan, Y; Levanony, H. 1988. Adsorption of the rhizosphere bacterium Azospirillum brasilense Cd to soil, sand and peat particles. General. Microbiology 134:1811-1820. Beever, R; Burns, D. 1980. Phosphorus uptake, storage and utilization by fungi. Advances in Botanical Research 8:121-219. Bennett, JW; Lane, SD. 1992. The potential role of Trichoderma viride in the integrated control of Botrytis fabae. Mycologist 6:199-201. Berthelin, J; Leyval, C; Laheurte, F; De Giudici, P. 1991. Involvement of roots, rhizosphere microflora in the chemical weathering of soil minerals. In Atkinson, D. ed. Plant Root growth: an ecological perspective. Oxford, GB, Blackwell Scientific Publications. p. 187-200. Boddey, R; Döbereiner, J. 1988. Nitrogen fixation associated with grasses and cereals: recent results and perspectives for future research. Plant and Soil 108:53-65. Cerezine, P; Nahas, E; Banzatto, D. 1988. Soluble phosphate accumulation by Aspergillus niger from fluoroapatite. Applied Microbiology and Biotechnology 29: 501-505. Chen, Y; Rekha, P; Arun, A; Shen, F; Lai, W; Young, C. 2006. Phosphate solubilizing bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solubilizing abilities. Applied Soil Ecology 34:33–41. Chung, H; Park, M; Madhaiyan, M; Seshadri, S; Song, J; Cho, H; Sa, T. 2005. Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from the rhizosphere of crop plants of Korea. Soil Biology and Biochemistry 37:1970-1974 73

Cordell, D; Drangert, J; White, S. 2009. The story of phosphorus: global food security and food for thought. Global Environmental Change 19:292–305. Cordero, J; Ortega, P; Ortega, E. 2008. La inoculación de plantas con Pantoea sp., bacteria solubilizadora de fosfatos, incrementa la concentración de P en los tejidos foliares. Revista Colombiana de Biotecnología 10(1):111-121 Cramer, M. 2010. Phosphate as a limiting resource: introduction. Plant and Soil 334:110. Creus, C; Sueldo, R; Barassi, C. 2004 Water relations and yield in Azospirillum inoculated wheat exposed to drought in the field. Can. J. Bot. 82:273-281. Cunningham, J; Kuiack, C. 1992. Production of citric and oxalic acids and solubilization of calcium phosphate by Penicillium bilajii. Applied and Environmental Microbiology 58:1451-1458. Dighton, J; Boddy, L. 1989. Role of fungi in nitrogen, phosphorus and sulphur cycling in temperate forest ecosystems. In: Boddy, L; Marchant, R; Read, D. eds. Nitrogen, phosphorus and sulphur utilization by fungi. Cambridge, GB, Cambridge University Press. p. 269-298. Eckhart, F. 1979. Uber dic Einwirkung heterotropher Mikroorganismen auf die Zersetzung silikatischer Minerale. Pflanzenernährung u. Bodenkunde 142:434-445. El-Komy, HMA. 2005. Coimmobilization of Azospirillum lipoferum and Bacillus megaterium for successful phosphorus and nitrogen nutrition of wheat plants. Food Technology and Biotechnology 43:19-27. FAO. 2005. Tendencias mundiales actuales y perspectivas de los fertilizantes (en línea). Italia. Consultado 26 abr. 2012. Disponible en ftp://ftp.fao.org/agl/agll/docs/cwfto08s.pdf Foth, H; Ellis, B. 1997. Soil Fertility. 2 ed. Boca Raton, Florida. CRC Press. 290 p.

74

French, E; Hebert, T. 1980. Métodos de investigación fitopatológica. San José, Costa Rica. IICA. 289 p. García, SJ. 2010. Guía de prácticas de microbiología del suelo. Sin publicar. Goenadi, D; Saraswati, R. 1993. Phosphate-solubilizing capabilities of selected phosphate-solubilizing fungal isolates. Menara Perkebunan 61:61-66. ________; Siswanto, G; Sugiarto, Y. 2000. Bioactivation of poorly soluble phosphate rocks with a phosphate rocks with a phosphorus solubilizing fungus. Soil Sci. Soc. Am. J. 64:927-932. Goldstein, AH. 1986. Bacterial solubilization of mineral phosphates: historical perspective and future prospects. Am J Altern Agri 1:51–70. ________. 1995. Recent progress in understanding the molecular genetics and biochemistry of calcium phosphate solubilization by gram negative bacteria. Biol Agric Hort 12:185–193. ________; Liu, ST. 1987. Molecular cloning and regulation of a mineral phosphate solubilizing gene from Erwinia herbicola. Biotechnology 5:72-74. ________; Rogers, RD; Mead, G. 1993. Separating phosphate from ores via bioprocessing. Biotechnology 11:1250-1254. Gupta, R; Singal, R; Shankar, A; Kuhad, RC; Saxena, RK. 1994. A modified plate assay for screening phosphate solubilizing microorganisms. Journal of General and Applied Microbiology 40:255-260. Gupta, SC; Namdeo, SL. 1997. Effect of Rhizobium, phosphate solubilizing bacteria and FYM on nodulation, grain yield and quality of chickpea. Indian Journal of Pulses Research 10:171–174. Gyaneshwar, P; Parekh, LJ; Archana, G; Poole, PS; Collins, MD; Hutson, RA; Naresh, G. 1999. Involvement of a phosphate starvation inducible glucose dehydrogenase in

75

soil phosphate solubilization by Enterobacter absuriae. FEMS Microbiology Letters 171:223-229 Halvorson, H; Keynan, A; Kornberg, H. 1990. Utilization of calcium phosphates for microbial growth at alkaline pH. Soil Biology and Biochemistry 22:887-890. Hammond, L. 1979. Agronomic Measurement of Phosphate Rock Effectiveness, Seminar on Phosphate Rock for Direct Application. Special Publication IFDC-S1, International Fertilizer Development Center (IFDC), Muscle Shoals, Alabama, EE.UU. p 147-173. Hissinger, P; Gilkes, R. 1997. Dissolution of phosphate rock in the rhizosphere of five plant species grown in the acid, P-fixing mineral subtrate. Geoderma. 75:231-249. Heredia, G; Ulloa, M; Sosa, V. 1988. Estudio comparativo entre comunidades fúngicas del suelo y de la rizósfera de plantas de espinaca cultivadas bajo el sistema de chinampas. Revista Latinoamericana de Microbiología 30:155-161. Illmer, P; Schinner, F. 1992. Solubilization of inorganic phosphates by microorganism isolated from forest soils. Soil Biology and Biochemistry 24:389-395. ________; Schinner, F. 1994. Solubilization of inorganic calcium phosphates, solubilization mechanisms. Soil Biology and Biochemistry 27(3):257-263. ________; Barbato, A; Schinner, F. 1994. Solubilization of hardly-soluble AlPO4 with P-solubilizing microorganisms. Soil Biology and Biochemistry 27(3):265-270. Jackson, ML. 1958. Soil chemical analysis. New Jersey, Pretince Hall. 662 p. Jain, PC; Kushawaha, PS; Dhakal, US; Khan, H; Trivedi, SM. 1999. Response of chickpea (Cicer arietinum L.) to phosphorus and biofertilizier. Legume Research 22:241-244. Jones, D. 1998. Organics acids in the rhizosphere, a critical review. Plant and Soil.166: 247-257.

76

Jurinak, J; Dudley, L; Allen, M; Knight, W. 1986. The role of calcium oxalate in the availability of phosphorus in soils of semiarid regions: a thermodynamic study. Soil Science 142:255-261. Khurana, AS; Sharma, P. 2000. Effect of dual inoculation of phosphate solubilizing bacteria, Bradyrhizobium sp. (cicer) and phosphorus on nitrogen fixation and yield of chickpea. Indian J. Pulses. Res. 13:66-67. Kim, KY; Jordan, D; McDonald, GA. 1998. Effect of phosphate-solubilizing bacteria and vesicular-arbuscular mycorrhizae on tomato growth and soil microbial activity. Biol Fertil Soils 26:79-87. King, EO; Ward, MK; Raney, DE. 1954. Two simple media for the demonstration of pyocianin and fluorescein. J. Lab. Clin. Med. 44: 301-307. Kirkby, E; Johnston, A. 2008. Soil and fertilizer phosphorus in relation to crop nutrition. In Hammond, JP; White, PJ. eds. The ecophysiology of plant–phosphorus interactions. Dordrecht, Holanda, Springer. p. 177–223. Kucey, R. 1983. Phosphate-solubilizing bacteria and fungi in various cultivated and virgin Alberta soils. Canadian Journal of Soil Science 63:67l-678. ________. 1988. Effect of Penicillium bilaji on the solubility and uptake of P and micronutrients from soil by wheat. Canadian Journal of Soil Science 68:261-270. Kumar, V; Narula, N. 1999. Solubilization of inorganic phosphates and growth emergente of wheat as affected by Azotobacter chroococum mutans. Biol. Fertil. Soils 28:301-305. Lapeyrie, F; Ranger, J; Varelles, D. 1991. Phosphate solubilizing activity of ectomycorrhizal fungi in vitro. Canadian Journal of Botany 69:342-346. Liu, S; Lee, L; Tai, C; Hung, C; Chang, Y; Wolfram, J; Rogers, R; Goldstein, A. 1992. Cloning of an Erwinia herbicola gene necessary for gluconic acid production and enhanced mineral phosphate solubilisation in E. coli HB101: nucleotide sequence and 77

probable involvement in biosynthesis of the coenzyme pyrroloquinoline quinone. Journal of Bacteriology 174:5814-5819. Loiret, F; Ortega, E; Kleiner, D; Ortega-Rodés, P; Rodés, R; Dong, Z. 2004. A putative new endophytic nitrogen-fixing bacterium Pantoea sp. from sugarcane. Journal of Applied Microbiology 97:504-511 Narsian, V; Thakkar, J; Patel, H. 1993. Solubilization of natural rock phosphates and pure insoluble inorganic phosphates by Aspergillus awamori. Indian J. Exp. Biol. 31: 747-749. ________; Thakkar, J; Patel, H. 1995. Mineral phosphate solubilization by Aspergillus aculeatus. Indian J. Exp. Biol. 33:91-93. ________; Patel, H. 2000. Aspergillus aculeatus as a rock phosphate solubilizer. Soil Biology and Biochemestry 32:559-565. Nautiyal, CS. 1999. An efficient microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing microorganisms. FEMS Microbiology Letters 170: 265-270. Nunes, G; Narloch, C; Scharf, R. 2002. Solubilização de fosfatos naturais por microrganismos isolados de cultivos de Pinus e Eucalyptus de Santa Catarina. Pesquisa Agropecuária Brasileira 37(6):847-854. Olsen, SR; Cole, CV; Watanabe, FS; Dean, LA. 1954. Estimation of available phosphorus in soils by extraction with sodium bicarbonate. USDA Circ. 939. U.S. Govt. Print. Office, Washington, DC. Popavath, RN; Gurusamy, R; Kannan, BN; Natarajan, S. 2008. Assessment of genetic and functional diversity of phosphate solubilizing fluorescent pseudomonads isolated from rhizospheric soil (en línea). BMC Microbiology no. 8. Consultado 6 may. 2012. Disponible en http://www.biomedcentral.com/1471-2180/8/230.htm Pradhan, N; Sukla, L. 2005. Solubilization of inorganic phosphates by fungi isolated from agriculture soil. African Journal of Biotechnology 5(10):850-854. 78

Parks, E; Olson, G; Brinckman, F; Baldi, F. 1990. Characterization by high performance liquid chromatography (HPLC) of the solubilization of phosphorus in iron ore by a fungus. Journal of Industrial Microbiology 5:183-190. Pérez, E; Sulbarán, M; Ball, M; Yarzábal, LA. 2007. Isolation and characterization of mineral phosphate-solubilizing bacteria naturally colonizing a limonitic crust in the south-eastern Venezuelan region. Soil Biology and Biochemistry 39: 2905-2914. Perilla, MJ. 2003. Manual de laboratorio para la identificación y prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos de patógenos bacterianos de importancia para la salud pública en el mundo en desarrollo. USA. 381 p. R Development Core Team. 2012. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-90005107-0, URL http://www.R-project.org/ Reyes, I; Bernier, L; Simard, R; Tanguay, P; Antoun, H. 1998. Characteristics of phosphate solubilization by an isolate of a tropical Penicillium rugulosum and two UVinduced mutants. FEMS Microbiology Ecology 28:291-295. ________; Bernier, L; Simard, R; Antoun, H. 1999. Effect of nitrogen source on the solubilization of different inorganic phosphates by an isolate of Penicillium rugulosum and two UV-induced mutants. FEMS Microbiology Ecology 28:281-290. ________; Baziramakenga, R; Bernier, L; Antoun, H. 2001. Solubilization of phosphate rocks and minerals by a wild-type strain and two UV-induced mutants of Penicillium rugulosum. Soil Biol Biochem. 33:1741–1746. ________; Valery, A; Valduz, Z. 2006. Phosphate-solubilizing microorganisms isolated from rhizospheric and bulk soils of colonizer plants at an abandoned rock phosphate mine. Plant and Soil. 287:69–75. Rodriguez, H; Gonzalez, T; Selman, G. 2000. Expression of a mineral phosphate solubilizing gene from Erwinia herbicola in two rhizobacterial strains. J Biotechnol 84:155-161. 79

Rudresh, DL; Shivaprakash, MK; Prasad, RD. 2005. Effect of combined application of Rhizobium, phosphate solubilizing bacterium and Trichoderma spp. on growth, nutrient uptake and yield of chickpea (Cicer aritenium L.). Applied Soil Ecology 28:139-146. Rubio, G. 2002. Conectando el fósforo del suelo con la planta (en línea). Informaciones Agronómicas del Cono Sur no. 16. Consultado 14 may. 2011. Disponible en http://www.ipni.net/publication/ialacs.nsf/0//$FILE/nota5.pdf. Sabry, S; Saleh, S; Batchelor, C; Jones, J; Jotham, J; Webster, J; Kothari, S; Davey, M; Cocking, E. 1997. Endophytic establishment of Azorhizobium caulinodans in wheat. Proccedings of Royal Society 264-341. Sample, E; Soper, R; Racz, G. 1980. Reactions of phosphate fertilizers in soils. In Khasawneh, FE; Sample, EC; Kamprath, EJ. eds. The role of phosphorus in agriculture. USA, American Society of Agronomy. p. 263–310. Sarma, MV; Saharan, K; Prakash, A; Bisaria, VS; Sahai, V. 2009. Application of fluorescent pseudomonads inoculant formulations on Vigna mungo through field trial. International Journal of Biological and Life Sciences 5(1) 25-29. Sims, J; Pierzynski, G. 2005. Chemistry of phosphorus in soil. In Tabatabai, AM; Sparks, DL. eds. Chemical processes in soil, SSSA book series 8. SSSA, Madison, USA. p. 151–192. Schaad, NW; Jones, JB; Chun, W. 2001. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. The American Phytopathological Society Press. St. Paul, Minnesota, USA. 373 p. Scheffer, F; Schachtschabel, P. 1992. Lehrbuch der Bodenkunde. Verlag Enke, Stuttgart, pp. 280-284. Soil Survey Staff. 2010. Keys to Soil Taxonomy. 11 ed. USDA-Natural Resources Conservation Service, Washington, DC. 365 p.

80

Son, H; Park, G; Cha, M; Heo, M. 2006. Solubilization of insoluble inorganic phosphates by a novel salt- and pH tolerant Pantoea agglomerans R-42 isolated from soybean rhizosphere. Bioresource Technology 97:204-210. Sperber, J. 1958. The incidence of apatite-solubilizing organisms in the rhizosphere and soil. Aust. J. Agric. Res. 9:778–781. Steenhoudt, O; Vanderleyden, J. 2000. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects. FEMS Microbiol. Rev. 24:487-506. Stumm, W; Morgan, J. 1995. Aquatic Chemistry: Chemical Equilibria and Rates in Natural Waters. 3 ed. New York, John Wiley. 1992 p. Sunish, R; Ayyadurai, N; Pandiaraja, P; Reddy, A; Venkateswarlu, Y; Prakash, O; Sakthivel, N. 2005. Characterization of antifungal metabolite produced by a new strain Pseudomonas aeruginosa PUPa3 that exhibits broad-spectrum antifungal activity and biofertilizing traits. J Appl Microbiol 98(1):145-154. Sylvia, D; Fuitrmann, J; Hartel, P; Zubblerer, D. 1999. Principles and application of soil microbiology. New Jersey, Pretince Hall. 548 p. Schmundt, H. 2010. Experts Warn of Impending Phosphorus Crisis (en línea). Alemania. Consultado 6 mar. 2011. Disponible en http://www.spiegel.de/international/world/0,1518,690450,00.html Taha, S; Mahmoud, S; El-Damaty, A; El-Hafez, A. 1969. Activity of phosphate dissolving bacteria in Egyptian soils. Plant and Soil 31:149-160. Torre, M de la; Gomez-Alarcon, G; Vizcaino, C; Garcia, M. 1993. Biochemical mechanisms of stone alteration carried out by filamentous fungi living in monuments. Biogeochemistry 19:129-147. Tarafdar, J; Gharu, A. 2006. Mobilization of organic and poorly soluble phosphates by Chaetomium globosum. Applied Soil Ecology 32:273–283. 81

Gilbert, N. 2009. El nutriente en vías de extinción. Nature 461:716-718. Vaccari, D. 2009. La crisis del fósforo. Investigación y Ciencia, edición española de Scientific American. España 395:22-27. Vassilev N; Baca, M; Vassileva, M; Franco, I; Azcon, R. 1995. Rock phosphate solubilization by Aspergillus niger grown on sugar-beet waste medium. Applied Microbiology and Biotechnology 44:546-549. ________; Fenice, M; Federici, F. 1996. Rock phosphate solubilization with gluconic acid produced by immobilized Penicillium variabile P16. Biotechnology Techniques 10:585-588. Vera, D; Pérez, H; Valencia, H. 2002. Aislamiento y caracterización de hongos solubilizadores de fosfatos de la rizósfera de arazá (Eugenia stipitata McVaugh, Myrtaceae) en dos unidades fisiográficas del departamento del Guaviare. Acta Biológica Colombiana 7:33-40 Villegas, J; Fortin, JA. 2001. Phosphorus solubilization and pH changes as a result of the interactions between soil bacteria and arbuscular mycorrhizal fungi on a medium containing NO3- as nitrogen source. Canadian Journal of Botany 80(5):571-576. Walker, T; Syers, J. 1976. The fate of phosphorus during pedogenesis. Geoderma 15:1–19. Watanabe, F; Olsen, S. 1965. Test of an ascorbic acid method for determining phosphorous in water and NaHCO3 extracts from soil. Soil Sci. Soc. Am. Proc. 29:677–678. Watteau, F; Berthelin, J. 1994. Microbial dissolution of iron and aluminium from soil minerals: efficiency and specificity of hydroxamate siderophores compared to aliphatic acids. European Journal of Soil Biology 30:1–9.

82

Whitelaw, M; Harden, T; Bender, G. 1997. Plant growth promotion of wheat inoculated with Penicillium radicum sp. Australian Journal of Soil Research 35:291300. ________; Harden, T; Helyar, K. 1999. Phosphate solubilisation in solution culture by the soil fungus Penicillium radicum. Soil Biol. Bioche. 31:655-665. Yadav, K; Singh, T. 1991. Phosphorus solubilization by microbial isolate from a Calcifluvent. Journal of Indian Society of Soil Science 39:89-93.

83

IX.

ANEXOS

84

ANEXO 1: Análisis de varianza (ANVA) de índice de solubilización (IS) de 20 cepas solubilizadoras de fosfatos

Fuente de V. G.L. S.C. C.M. Valor F Significación Cepa 19 33.71 1.7741 89.18 < 2e-16 *** Residuales 180 3.58 0.0199 Códigos de Significancia: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 ANEXO 2: ANVA de área del halo de solubilización en mm de las 20 cepas solubilizadoras de fosfatos Fuente de V. Cepa Residuales

G.L. 19 180

S.C. 1603470 133190

C.M. 84393 740

Valor F 114.1

Significación < 2e-16 ***

ANEXO 3: ANVA de P solubilizado in vitro en relación a las diferentes fuentes de variación Fuente de V.

G.L.

Cepa

3

S.C. C.M. 495074 165025

Tiempo

5

32171

Enmienda

1

632036 632036 10387.025

< 2.2e-16 ***

Cepa: Tiempo

15

86944

95.257

< 2.2e-16 ***

Cepa: Enmienda

3

401867 133956

2201.457

< 2.2e-16 ***

Tiempo: Enmienda

5

6914

1383

22.724

5.591e-15 ***

Cepa: Tiempo: Enmienda

15

50640

3376

55.482

< 2.2e-16 ***

Residuales

96

5841

61

6434

5796

85

Valor F 2712.053

Significación < 2.2e-16 ***

105.743

< 2.2e-16 ***

ANEXO 4: ANVA de materia seca de la biomasa aérea en maíz

Fuente de V. Cepa Sustrato Cepa:Sustrato Residuales

G.L. 4 1 4 30

S.C. 554.0 17.7 548.0 241.7

C.M. 138.50 17.10 137.01 8.06

Valor F 17.188 2.197 17.003

Significación 1.98e-07 *** 0.149 2.21e-07 ***

ANEXO 5: ANVA de materia seca biomasa radicular en maíz

Fuente de V. Cepa Sustrato Cepa:Sustrato Residuales

G.L. 4 1 4 30

S.C. 197.50 1.32 90.60 75.27

C.M. 49.38 1.32 22.65 2.51

Valor F 19.679 0.527 9.027

Significación 4.86e-08 *** 0.474 6.55e-05 ***

ANEXO 6: ANVA de materia seca de la biomasa total en maíz

Fuente de V. Cepa Sustrato Cepa:Sustrato Residuales

G.L. 4 1 4 30

S.C. 1363.1 9.4 1046.6 308.6

C.M. 340.8 9.4 261.7 10.3

Valor F 33.131 0.909 25.438

Significación 1.30e-10 *** 0.348 2.89e-09 ***

ANEXO 7: ANVA de extracción de P/maceta en la biomasa aérea en maíz

Fuente de V. Cepa Sustrato Cepa:Sustrato Residuales

G.L. 4 1 4 30

S.C. 1201.6 36.1 557.0 1563.1

C.M. 300.39 36.08 139.26 52.10

86

Valor F 5.765 0.692 2.673

Significación 0.00145 ** 0.41190 0.05107 .

ANEXO 8: ANVA de extracción de P/maceta en la biomasa radicular en maíz

Fuente de V. Cepa Sustrato Cepa:Sustrato Residuales

G.L. 4 1 4 30

S.C. 430.5 178.6 217.2 624.1

C.M. 107.61 178.59 54.31 20.80

Valor F 5.173 8.584 2.611

Significación 0.00273 ** 0.00642 ** 0.05521 .

ANEXO 9: ANVA de extracción de P/maceta en la biomasa total en maíz

Fuente de V. Cepa Sustrato Cepa: Sustrato Residuales

G.L. 4 1 4 30

S.C. 3042.2 54.3 1336.3 1714.1

C.M. 760.5 54.3 334.1 57.1

Valor F 13.311 0.950 5.847

Significación 2.38e-06 *** 0.33758 0.00133 **

ANEXO 10: Eficiencia de absorción de P en las macetas con roca fosfórica en función de las cepas inoculadas

Cepas Superfosfato triple Pseudomonas sp. Clostridium sp. Penicillium sp. Ninguna Bacillus sp.

Extracción total mg P/maceta 91.10 90.50 84.97 84.06 72.58 57.88

87

Eficiencia de absorción de P % 15.18 15.01 14.16 14.01 12.10 9.64

ANEXO 11: ANVA de extracción foliar de Ca/maceta en la biomasa aérea en maíz

Fuente de V. Cepa Sustrato Cepa:Sustrato Residuales

G.L. 4 1 4 30

S.C. 132920 29912 95841 398901

C.M. 33230 29912 23960 13297

Valor F 2.499 2.250 1.802

Significación 0.0635 . 0.1441 0.1545

ANEXO 12: ANVA de extracción de Ca/maceta en la biomasa radicular en maíz

Fuente de V. Cepa Sustrato Cepa:Sustrato Residuales

G.L. 4 1 4 30

S.C. 70185 3706 16741 67768

C.M. 17546 3706 4185 2259

Valor F 7.768 1.641 1.853

Significación 0.000202 *** 0.210046 0.144804

ANEXO 13: ANVA de extracción de Ca/maceta en la biomasa total en maíz

Fuente de V. Cepa Sustrato Cepa:Sustrato Residuales

G.L. 4 1 4 30

S.C. 239492 54676 56360 381745

C.M. 59873 54676 14090 12725

Valor F 4.705 4.297 1.107

Significación 0.00456 ** 0.04687 * 0.37131

ANEXO 14: ANVA de materia seca de la biomasa aérea en frijol

Fuente de V. G.L. Cepa 4 Sustrato 1 Cepa:Sustrato 4 Residuales 30

S.C. 132.38 1.95 4.88 29.58

C.M. Valor F 33.10 29.091 1.95 1.710 1.22 1.073 1.14

88

Significación 2.92e-09 *** 0.202 0.390

ANEXO 15: ANVA de extracción de P/maceta en la biomasa aérea en frijol

Fuente de V. Cepa Sustrato Cepa:Sustrato Residuales

G.L. 4 1 4 30

S.C. 799.4 3.8 14.3 484.6

C.M. 199.86 3.80 3.57 18.64

Valor F 10.722 0.204 0.192

Significación 2.87e-05 *** 0.655 0.941

ANEXO 16: ANVA de extracción foliar de Ca/maceta en frijol

Fuente de V. Cepa Sustrato Cepa:Sustrato Residuales

G.L. 4 1 4 30

S.C. 184742 17760 52499 113935

C.M. 46185 17760 13125 4382

89

Valor F 10.540 4.053 2.995

Significación 3.27e-05 *** 0.0546 . 0.0370 *