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RECEPTORES Y TRANSMISORES Los receptores son los componentes de una célula que tienen la capacidad de identificar una sustancia, hormona o neurotransmisor. La idea de que existen receptores, viene de principios de siglo, cuando Langley, Dale y cols., sugieren que pueden existir sustancias receptivas en la superficie de las membranas de células excitables: Lo primero, que al menos, dos sustancias especiales (sustancias receptivas), están presentes en la región neural del músculo, y que los impulsos nerviosos sólo pueden causar contracción actuando en una sustancia receptora. Lo segundo que las sustancias receptoras, forman más o menos fácilmente componentes disociables. Así, la nicotina en combinación con esas sustancias... (Langley, 1909). El concepto de receptores como habiamos visto fue introducido por Paul Ehrlich y Paul Langley (1902). Este último llegó a la conclusión de que los fármacos debían fijarse en alguna parte, que debía haber una unidad receptora o de fijación: Esto mediante sus observaciones de los efectos del curare, que produce paralización del músculo estriado por ausencia de respuesta a estímulos, notó que el nervio estaba indemne, al igual que el músculo, era el estímulo el que no se transmitía. Debía existir que había una zona en la que se estaba fijando el F.

Paul Ehrlich y Sachahiro Hata a inicios del siglo XX Posteriormente Ehrlich concluyó que los Fármacos actuaban porque tenían que fijarse en alguna parte. Estudiando tejidos vivos teñidos, consiguió teñir en forma selectiva algunas Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski

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células y no el resto del tejido, descubriendo el principio de la SELECTIVIDAD; una sustancia (F o curare en este caso) puede actuar selectivamente sobre una célula. Luego estudió el tratamiento de algunas enfermedades parasitarias y consiguió obtener algunos Fármacos que podían destruir el parásito sin afectar las células del huésped. Este es el gran principio de la farmacología, en el sentido de obtener los Fármacos más selectivos posible, que actúen exclusivamente sobre la célula enferma (a veces muy difícil, ej. terapia contra el cáncer, ya que antineoplasicos pueden detener el crecimiento de los tumores, pero también afectan tejido sano, vale decir, son fármacos que tienen muy poca selectividad). Ehrlich decía que en la estructura química de los Fármacos había una zona que denominó TOXOFORO, la que ejercía una acción y para ello debía fijarse en alguna parte del tejido: los QUIMIORRECEPTORES. El resto de la molécula del fármaco sirve como transporte para el grupo funcional. Hay algunas propiedades de los Fármacos que refuerzan esta teoría, en el sentido de que la acción debe estar ejercida en una parte específica: o

La potencia, es decir, hay Fármacos que actúan con dosis muy bajas (10-6 M)

o

Existe una especificidad química, los Fármacos con estructura semejante provocan generalmente los mismos efectos.

o

Tambien hay una especificidad biológica, los Fármacos actúan sólo sobre algunas células y no sobre otras, lo que equivale a la selectividad.

Se pueden clasificar los Fármacos en 2 grandes grupos, de acuerdo a la relación que hay entre la estructura química y la actividad: 1º Fármacos estructuralmente inespecíficos: - acción biológica no depende de su estructura química, sino de sus propiedades físicoquímicas (pK, poder de oxido-redución, modificación de la permeabilidad de las membranas). - actúan en dosis relativamente altas - al introducir alteraciones en su estructura química no cambia sustancialmente su actividad. Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski

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Ej.: anestésicos generales, alcohol, antisépticos (cresol). 2º Fármacos estructuralmente específicos: grupo más importante de Fármacos. - actividad biológica depende de la estructura química - modificaciones en la estructura química alteran su efecto, pudiendo aumentar su actividad o incluso generando Fármacos antagonistas. - tienen un alto potencial, se requieren bajas dosis para lograr su acción. RECEPTORES: son moléculas de naturaleza proteica, generalmente asociadas a membranas celulares. Esta proteína puede estar asociada a otros elementos que son los que determinan el efecto. El receptor está encargado de reconocer el ligando, tiene la capacidad de reconocerlo en forma selectiva y se une desencadenándose el efecto, el cual está mediado por otras estructuras que están unidas al R. Un R para ejercer su acción lo tiene que hacer a través de 2dos mensajeros. Se traduce la unión del receptor con el F en una señal que va al interior de la célula, una transducción de la información, y en la célula pueden pasar muchos eventos, entre otras cosas liberación de 2dos mensajeros que promueven cambios en la permeabilidad de las membranas. Hay dos etapas que median la interacción F-R: 1.- Unión: el reconocimiento de los dos elementos moleculares. 2.- Transducción de la señal y la aparición del efecto. La mayoría de los Rs responden a proteínas que están en la membrana. Pero no debemos olvidar que existen también proteínas que están en el citosol, en el citoplasma de la célula, y son unidades de transducción que se relacionan con la respuesta de ciertas hormonas, las cuales se unen a Rs solubles ubicados en el citosol, los que tienen que ver con la asociación con DNA, o sea, una estructura proteica que se une al F y que también se une al DNA, y posteriormente esto es incorporado al núcleo, modificándose de esta manera la síntesis proteica. De esta manera actúan una gran cantidad de hormonas esteroidales. Respuestas funcionales luego de la unión del ligando o F al R:

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a. Modificación a la permeabilidad iónica: un tipo de respuesta al acoplamiento FR es el aumento a la permeabilidad a ciertos iones, vale decir, hay R que están ligados a canales iónicos que al ser estimulados provocan la entrada o salida de ciertos cationes o aniones. b. Modificación de ciertas proteínas asociadas al R: ej.: la familia de las prostaglandinas. Hay Rs que están asociados a sistemas enzimáticos, de modo que al unirse el agonista con su R, se activa este sistema enzimático y aumenta la formación de sustancias intracelulares, que son los 2dos mensajeros. Ej.: Rs

-

adrenérgicos asociado a ciclasa, ésta se activa cuando llega el ligando favoreciéndose la formación de AMPc, que actúa como 2do mensajero. Otros provocan formación de GMPc con movilizaciones de Ca, actúan amplificando la información que viene del R. c. Unidades de transcripción que pueden modificar la síntesis de proteínas.

Tabla : Neurotransmisores conocidos y supuestos. Un enfoque para distinguir clases de receptores es identificar moléculas implicadas en la transmisión rápida comparadas con las de transmisión lenta. Los componentes que generalmente se cree que interactúan con los ligandos de los canales iónicos de apertura y los receptores para la neurotransmisión rápida incluyen: ácido glutámico, acetilcolina, Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski

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GABA y glicina. Los neurotransmisores asociados a cambios en segundos mensajeros intracelulares como el AMP cíclico e inositol trisfosfato, incluyen: serotonina, dopamina, noradrenalina y neurotransmisores asociados a muchos péptidos. Los neurotransmisores que actúan a través de canales iónico y sistemas de segundos mensajeros, considerados de transmisión rápida y lenta respectivamente. Esta categorización simple, es un punto de arranque útil pero hay muchas excepciones notables. Por ejemplo, aunque la acetilcolina y el ácido glutámico a menudo se asocian a (rápido) ligandos de canales iónicos de apertura, pueden también actuar a través de (lento) receptores metabotrópicos para modular los niveles de segundos mensajeros intracelulares. Inversamente, algunos de los efectos de las catecolaminas parece que ocurren a través de la modulación de la conductancia de los canales de calcio y/o potasio.

Categorías de transmisión sináptica.

REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE RECEPTORES La teoría eneunciada anteriormente establece que los receptores ocupan un espacio físico concreto y real, que poseen una estructura, y que dicha estructura tiene que ver con su funcionamiento. Existen diversos modos de representarlos, entre otros el topológico, el esquemático, el que los incluye en una cadena de eventos disparados a partir de su estimulación, entre otros. La conveniencia entre una u otra de dichas representaciones depende de cuál o cuáles aspectos se quieran enfatizar. Veamos cada una de las representaciones mencionadas.

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Topológica: su énfasis está dirigido a mostrar, aunque esquemáticamente, cuál es la estructura del receptor en sí mismo, identificando sus diferentes dominios y sitios de acción. Un ejemplo típico podría ser el receptor 7TMS (así llamado porque presenta siete hélices proteicas que se encuentran ancladas en la bicapa lipidica de la membrana plasmática) de epinefrina, con siete dominios transmembrana.

Receptor de epinefrina: se puede ver su estructura de siete dominios transmembrana (numerados del I al VII), y los segmentos extra e intracelulares del receptor. AG= agonista; OH= hidroxilos; N= extremo amino terminal (extracelular); C= extremo carboxiterminal (intracelular); Proteína G= señala al sitio de interacción con el receptor. •

Esquemática de la transducción de señales a partir del receptor: señala, simplemente, el o los caminos (muchas veces hipotéticos o en plena revisión a medida que se obtiene mayor evidencia experimental) que sigue la transducción de señales a partir de la estimulación de un receptor dado. Ver más adelante

•

Esquemática de los sitios de acción presentes en un receptor: tiene por objetivo señalar cuál o cuáles son los dominios que se reconocen en la estructura de un receptor, pero de un modo claramente esquemático, tendiendo a enfatizar la Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski

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función y no su estructura topológica. Como ejemplo vemos el receptor GABA, muy abundante en el SNC.

Receptor de Gaba/canal de cloro. Tomado de "Basic Neurochemistry" (GJ. Siegel) Se observa los siguientes dominios del receptor GABA y sus sitios regulatorios. Las siglas representan lo siguiente: Cl-= canal de cloro (aumentada por la activación del receptor GABA, y al ingresar más cloro se refuerza la hiperpolarización de la célula -típico receptor inhibitorio); BDZ= benzodiacepinas (grupo muy conspicuo de drogas con propiedades ansiolíticas, hipnóforas, miorrelajantes y anticonvulsivantes). Típicamente su unión a ligandos exógenos (también se han propuesto ligandos endógenos) aumenta la frecuencia de apertura del canal de cloro producida por estimulación GABA; BARB= barbitúricos (v.g. fenobarbital, tiopental sódico, pentobarbital). Prolongan la duración de la apertura del canal de cloro producida por estimulación GABA; PICRO=picrotoxina. Disminuye el ingreso de cloro a la célula, cumpliendo el efecto contrario a la estimulación GABA. Teoría de la Ocupación: es la más usada y la más antigua. Fue postulada por Clark en 1920. Según esta teoría, la interacción entre un F y su R es igual que cualquier otra reacción química que sigue la ley de acción de masas.Una de las primeras cosas a tener en cuenta en relación al tema del que nos ocupamos, es que los receptores (y por lo tanto los conceptos asociados a dicho término) determinan en gran medida las relaciones

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cuantitativas que ejercen las drogas. Esto queda ilustrado en el siguiente gráfico, denominado del tipo curva dosis-respuesta:

Como se puede apreciar en la curva de la izquierda, se ha graficado en las abscisas la concentración creciente de una droga, de izquierda a derecha, en tanto las ordenadas señalan el efecto, también creciente de dicha droga hipotética. A medida que se incrementa la dosis (C), también se va incrementando proporcionalmente la respuesta (E), hasta que se llega a una meseta en donde a pesar de que se incremente la dosis la respuesta no aumentará. El punto en el cual se alcanza el máximo de la respuesta para la droga en cuestión se denomina E máximo (Emax). Por otra parte, la C en la que se alcanza la mitad del Emax se denomina EC50. Sin embargo, lo dicho no nos dice nada acerca de receptores. Sin embargo veamos la curva de la derecha, que repetimos abajo para mayor comodidad:

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La curva es, sin ninguna duda, muy similar a la que acabamos de mencionar, y sin embargo está haciendo referencia a otro tema: la ordenada representa esta vez la cantidad de receptores (B) que están ocupados a cada concentración dada (C) de una droga determinada. La forma de una y otra curva nos hacen prestar atención, fundamentalmente, al hecho que a través de su parecido podemos comenzar a sospechar la existencia de una íntima relación entre la concentración de una droga, los receptores que posee el organismo para esa droga, y el efecto que se obtendrá de la utilización de la misma, cosa que ampliaremos luego.

Esquema General del equilibrio aplicado al modelo de droga receptor. Desde el punto de vista de la cinética química : si x es la concentración molar del fármaco y a su vez A es el número total de receptores por unidad de volumen (si bien esto no suele ser conocido) y a su vez y es la concentración de los receptores ocupados por el fármaco. Podemos enunciar una ecuación de cinética química como: Velocidad de formación

Vf

= k1 x (A - y)

Velocidad de disgregación Vd

= k2 (y)

En el estado estacionario

= Vd

Vf

k1 x (A - y) = k2 (y) k1 x / k2 = (y) / (A - y)

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Las ecuaciones se completan desde el equilibrio químico, dado que muchos de los factores de la ecuación anterior no son conocidos ni pueden ser medidos (A, y ). Considerando el equilibrio químico : Kf

F

+

R

FR Kd

Donde

Kd = [F] [R] / [FR]

Recordemos que en cualquier momento la cantidad total de receptores van a ser la suma de los receptores libres del sistema sumados a los que ya están formando complejo droga receptor. Asi pues: R totales = [R libres]

+ [FR]

Seguramente no podemos conocer con exactitud la concentración total de los receptores pero si podemos tratar de simplificar estos términos si utilizamos una serie de experimentos donde graficamos los efectos biológicos de acuerdo a las concentraciones de droga. Recordemos que estos conceptos son similares a los que vimos inicialmente en las curvas de efecto biológico concentración:

Efecto máximo supone la totalidad de los receptores ocupados Cualquier porcentaje de efecto a lo largo de la curva Por ejemplo el 50% del efecto

Definamos en forma teórica el hecho de que el efecto es una función de la cantidad de complejos FR existentes (aunque no conozcamos la función matemática):

E=

f

(FR) Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski 10

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Si comparamos ambos efectos tendremos, dividiendo el efecto por el efecto máximo que :

E/ E max =

f

(FR)

/f

[R]+ [FR]

Porque Emax =

f

R totales

Es decir que al efecto máximo la cantidad de receptores totales forman complejo FR y no existen R libres

R totales = [FR]máximo

y [R libres] = 0

Cancelando la expresión de las funciones tendremos que se obtiene por comparación:

E/ E max =

[FR]

E/ E max =

/ [R]+ [FR]

[F] [R] / Kd [R]+ [FR]

Convirtiendo toda la expresión por la propiedad de las fracciones :

E/ E max =

[F]

Kd / [R] x

( [R]+ [FR])

Siguiendo las operaciones , efectuando un producto distribuitivo en el denominador

E/ E max =

[F]

(Kd +

)

Kd . [FR] /[R]

Y si recordamos de la ecuación de equilibrio químico [F] = Kd . [FR] /[R] . La ecuación se simplifica en términos que podemos medir dado que se pueden medir los efectos [E] y las concentraciones de fármaco [F] .

E/ E max =

(

)

[F] / Kd + [F]

Determinar la Kd es sencillo dado que si medimos y comparamos el E maximo con la mitad del efecto E 50%

nos es sencillo inferir que :

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E/ E max = ½

y

Kd = [F] 50

Es decir que la KD será la concentración de fármaco que determine la mitad del efecto biológico.

La unión de un F con su R no es distinta de la unión de una enzima con su

sustrato. La teoría de la ocupación ha sido bastante útil porque permite explicar como actúa un F y también permite hacer representaciones gráficas de la relación dosis-efecto. Si la relación del efecto es la mitad del efecto máximo, resulta que: KD = (F) que produce el 50% del efecto máximo. Si la relación entre el efecto y el efecto máximo es ½. resulta que: la KD es igual a la [F] que produce el 50% del efecto máximo, lo que se conoce también como DOSIS ACTIVA 50. Esta teoría de la ocupación parte de algunos supuestos: ·Ej. : todos los Fármacos actúan de la misma manera, es decir, todos los Fármacos son capaces de producir el efecto máximo, sin embargo se descubrió que habían agonistas que a pesar de cantidades muy grandes nunca alcanzaban el efecto máximo, los cuales fueron llamados agonistas parciales, son Fármacos que a pesar de que se aumente la dosis van a llegar a un plateau que será inferior a los agonistas que producen el efecto máximo. También hay Fármacos que son muy potentes y que no requieren ocupar todos los Rs para producir el efecto máximo, es decir, les basta ocupar una cierta fracción de Rs para producir el efecto máximo. Aquí se introdujo un concepto, que es el concepto de receptores de reserva; aquellos Rs que no necesitan ser ocupados para alcanzar efectos máximos. Supongamos que del 100% de los Rs, a un F le basta ocupar un 60% de ellos para lograr el efecto máximo, de tal manera que el restante 40% constituirían los Rs de reserva.

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Alfred Joseph Clark y Robert Stephenson principales teóricos de la Universidad de Edimburgo en el estudio de fenómenos de receptores durante los años 30 y50 Estos son dos inconvenientes que tiene la teoría de la ocupación, que no fueron consideradas por Clark, llevó a hacer modificaciones a esta teoría, las cuales fueron hechas por ARIENS Y STEPHENSON. ARIENS postuló que no basta que un F tenga afinidad por su R para producir el efecto, (porque con la teoría de la ocupación lo principal de todo era la afinidad). Si sólo bastara la afinidad ningún F lograría el efecto máximo, en cambio, hay fármacos que no lo producen, y lo que postuló Ariens es que se necesita otra propiedad del F para producir el efecto: en primer lugar se necesita afinidad y tambien se necesita una capacidad propia del F para generar un efecto, el llamó a esa capacidad ACTIVIDAD INTRINSECA (AI) Entonces: E (efecto) = α [FR] donde [FR] es la concentración de F unido a su R. E máx. = α [RT] donde RT son los Rs totales. Un F que produce el efecto máximo se conoce como agonista completo y se dice que su α es igual a 1.Si el agonista se une a un R y no produce ningún efecto decimos que carece de actividad intrínseca, por lo tanto α = 0, y ese F se comporta como un antagonista porque es capaz de unirse al R pero impide que el agonista ejerza su acción. Si 0 < α < 1 el F, agonista, será capaz de producir un efecto inferior al efecto máximo. La actividad intrínseca es importante porque determina que la unión del F al R se traduzca en un efecto. Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski 13

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STEPHENSON decía que la relación entre el efecto y el efecto máximo es una función de un estímulo (S), función que no necesariamente es lineal, el que es igual a una constante llamada eficacia (e) por la fracción unida al R

A

B

Potencia: equivale a la cantidad de F necesaria para producir determinado efecto. La más característica es la estimada para lograr el 50% del efecto. En el gráfico el F B es menos potente que el F A. Desde el punto de vista práctico lo que importa es la eficacia. En el gráfico el F A tiene igual eficacia que el F B, ambos alcanzan el mismo efecto. Un F más potente es aquel en el que necesito menor dosis para alcanzar el efecto deseado (en comparación con otro F que logra el mismo efecto, pero a dosis mayores). La potencia se relaciona con la afinidad del F por su R. La eficacia es el equivalente de la actividad intrínseca. Está representando la capacidad del F de producir un efecto. Para Ariens es una f(x) lineal y para Stephenson la respuesta puede ser de cualquier tipo.

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Representaciones gráficas de la relación dosis /efecto. Tomado de Farmacología de Flores

TEORÍA DE LOS ESTADOS CONFORMACIONALES Plantea que los Rs farmacológicos pueden estar en 2 estados de actividad; en forma activa o en forma inactiva. Esto se planteó fundamentalmente en relación a los Rs que están unidos a canales iónicos, de tal manera que la forma activa del R sería aquella que produce apertura del canal y el R está inactivo cuando el canal está cerrado. Esto se asocia a los estados productivos o improductivos de la proteína G; el R está activo cuando la proteína G puede provocar la formación de otros 2dos mensajeros.

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Heiz Otto Schild Teórico de las formas matemáticas aplicadas a la teoría ocupacional de receptores

RA: receptor activo, RI: receptor inactivo, E: constante alostérica. Ambas formas (RA y RI) se encuentran en equilibrio en ausencia de F. El F se puede unir a ambas formas dando lugar a los complejos FRA con las consiguientes constantes de disociación. Puede ser que F tenga mayor afinidad por la forma activa del R, y ese F se va a presentar como un agonista, y si su afinidad es tan grande que está desplazada la ecuación exclusivamente hacia el lado de los RA, tendrá una eficacia = 1 y se comportará como un agonista completo. Estos Fármacos son capaces de producir el efecto máximo. Posibilidades de afinidad por la forma activa (RA): - Hay Fármacos que pueden tener afinidad por 2 tipos de Rs Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski 16

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•

Puede ser que el F tenga afinidad tanto por la forma activa como por la forma inactiva. Si la afinidad es mayor por la primera forma tendremos un efecto que será menor comparado con el del agonista completo. La actividad intrínseca será menor que 0, pero mayor que 1.

•

·

F que tiene igual afinidad por las 2 formas de Rs. Si la afinidad es igual no

habrá efecto porque se mantiene el estado de equilibrio previo, por lo tanto esos Fármacos carecen de eficacia y se comportan como antagonistas. •

·

Fármacos que tienen mayor afinidad por la forma inactiva que por la activa.

Situación poco frecuente. El efecto será el opuesto al dado por el agonista, él cerrará los canales iónicos si el agonista los abre; a este F se le ha llamado antagonista negativo o antagonista inverso. Por lo tanto un ligando puede comportarse como: •

agonista completo

•

agonista parcial

•

agonista inverso; se da en relación a los canales iónicos, por ej.: a nivel de los Rs GABA. No es solamente un canal iónico sino que hay sitio de unión de GABA y tb. de otros ligandos: esteroides, barbitúricos, etc. Hay Fármacos que favorecen la apertura del canal (GABA, benzodiazepinas, etc.) pero hay sustancias que ejercen el efecto adverso que al unirse al R se benzodiazepinas, en vez de favorecer la apertura de canales producen un aumento del cierre de ellos.

·

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MECANISMO DE RECEPTORES La especificidad de las reacciones mediadas por un receptor, depende de la naturaleza del transmisor, de receptor y del sistema de mensajeros asociado. Por ejemplo, la acetilcolina puede interactuar con diferentes receptores muscarínicos para inhibir la actividad de la adenil ciclasa, o activar la actividad de la fosfolipasa C o los canales de potasio. La noradrenalina y la serotonina pueden actuar para estimular o inhibir la actividad de la adenil ciclasa, estimular la actividad de la fosfolipasa C y estimular o inhibir los canales de potasio o calcio. PROTEINAS TRANSMEMBRANA La actividad de los neurotransmisores es mediada por interacción con los miembros de un número limitado de familias de receptores. Estas familias incluyen los ligandos de canales iónicos de apertura, los receptores asociados a proteína G, factor de crecimiento que tienen actividad tirosina quinasa y los receptores esteroideos que son macromoléculas intracelulares que funcionan para transportar esteroides dentro del núcleo donde actúan para modular la actividad transcriptora.

Clases de receptores. Receptores de membrana y Receptores citoplasmáticos Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski 18

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Los ligandos de canales iónicos de apertura son receptores heteroméricos que contienen múltiples subunidades. El análisis hidrofóbico sugiere que cada uno incluye muchas hélices transmembrana. El miembro prototípico de esta familia de receptores es el receptor colinérgico nicotínico. Este receptor está compuesto por cinco subunidades, dos cadenas α y una cadena β, δ y γ.

Características estructurales de los receptores colinérgicos. Tomado de "Basic Neurochemistry" (GJ. Siegel)

El receptor b-adrenérgico, fue el primer miembro aislado, clonado y secuenciado de lo que se conoce como la superfamilia de receptores asociados a la proteína G. Los miembros de esta familia, tienen secuencias y estructuras muy similares.

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Diagrama esquemático generalizado del receptor asociado a la proteína G. Tomado de "Southeastern Louisiana University” Los miembros de la familia de receptores asociados a la proteína G, actúan a través de un mecanismo que implica la intervención del guanidín trifosfato. Al menos se han identificado, por ahora, cuatro familias de proteínas G.

Estructura y composición de sistemas de traducción por proteína G. Tomado de "SigmaAldrich, Inc” La modulación de los niveles intracelulares de AMP cíclico y los cambios en la hidrólisis fosfoinositol son reacciones mediadas por una proteína G asociada a receptores. La Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski 20

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estimulación e inhibición de la actividad de la adenil ciclasa implica reacciones semejantes en las cuáles, el GTP se une a la subunidad a de Gs o Gi. El resultado final es un cambio en la actividad de la adenil ciclasa y un cambio en los niveles intracelulares de AMP cíclico. El AMP cíclico, sucesivamente se une a la subunidad reguladora de la proteína quinasa A, permitiendo que la fosforilación mediada por la subunidad catalítica de quinasa A, se produzca. La terminación de la señal implica hidrólisis enzimática de AMP cíclico por la fosfodiesterasa y la conversión de GTP en GDP por la actividad de la GTPasa en las subunidades a de las proteínas G. El complejo ternario compuesto por agonista, receptor y proteína G, representa un estado de alta afinidad del receptor. En otros casos, se da la activación mediada por el transmisor de la fosfolipasa C. Esto produce la escisión del fosfatidil inositol bifosfato. Tanto el diacilglicerol (DAG) como el inositol trifosfato (IP3) resultantes de esta reacción, son activos biológicamente. El diacilglicerol, que contiene dos moléculas de ácido graso, se difunde en el plano de la membrana y activa una enzima, proteínquinasa C. El inositol trifosfato, por otro lado, causa liberación de Ca2+ desde los almacenes en el retículo endoplasmático. ESTUDIO DE RECEPTORES En 1971, el primer ensayo de acoplamiento con radioligandos exitoso, hizo posible estudiar los receptores colinérgicos nicotínicos en los órganos eléctricos de peces y anguilas. En 1973, se describió por primera vez la unión esteroespecífica de opiáceos radiomarcados en lugares de unión en cerebros de mamíferos. En los diez años siguientes, los ensayos de unión de radioligandos cuantitativos fueron desarrollados para receptores en variedad de sustancias y transmisores y ligandos radiomarcados con 3H o 125I están ahora disponibles para el estudio de muchas clases de receptores. Esta amplia disponibilidad de ligandos apropiados ha llevado a una expansión rápida en el uso de ensayos de unión con radioligandos para caracterizar receptores y subtipos de receptores. Antes del empleo extendido de ensayos de acoplamiento in vitro, las propiedades de los receptores, se inferían de la medida de respuesta biológica. Este enfoque demostró ser productivo en la clasificación de receptores e incluso llevó a la identificación de subtipos de receptores; sin embargo, medir una repuesta biológica tanto in vivo como in situ puede ser muy diferente que medir la unión del receptor in vitro. Por ejemplo, la distribución en el Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski 21

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tejido de una sustancia administrada in vivo, puede variar dependiendo de su capacidad para cruzar las barreras de difusión, así como la barrera hematoencefálica o en la extensión en la cuál la sustancia se une con las proteínas plasmáticas. La naturaleza lipofílica o hidrofílica de un componente puede determinar si tiene igual acceso o no a todos los receptores a un tejido dado. También, las sustancias pueden ser metabolizadas antes de que tengan una oportunidad de interactuar con un receptor. Estas transformaciones metabólicas pueden producir componentes que son más o menos activos que la sustancia previa y así puede alterar marcadamente la especificidad farmacológica observada. Las sustancias no sujetas a alteraciones estructurales son a menudo eliminadas del medio extracelular por mecanismos de recogida neuronal y extraneuronal. Además, in vivo, la reacción de una sustancia es frecuentemente atenuada por mecanismos compensatorios de retroalimentación. La interpretación de una reacción biológica medida también puede ser difícil si la sustancia tiene múltiples lugares de acción, un fenómeno que también puede suceder in vitro con tejido que contienen múltiples clases de subtipos de receptores. A veces, los subtipos del receptor median la misma reacción fisiológica y pueden ejercer estos efectos a través del mismo sistema efector. La reacción farmacológica observada puede ser afectada por el grado de selectividad de la sustancia y por las densidades relativas de los subtipos que están en el tejido. En general, la característica más segura de los receptores viene de estudios llevados a cabo con preparaciones simples de aislamiento de tejidos que muestran curvas reproducibles graduadas dosis-respuesta. Incluso con estas preparaciones, es a menudo imposible definir exactamente las características cinéticas de las interacciones sustanciareceptor. Los radioligandos proporcionan pruebas precisas que permiten el examen específico de la interacción inicial entre una sustancia y su lugar de acoplamiento. Por ejemplo, las cinéticas de asociación y disociación de un complejo receptor-radioligando, puede ser determinado exactamente usando un simple tejido homogenizado. Un perfil farmacológico que está basado en la disociación del equilibrio constante de unas series de ligandos no marcados pueden ser definidos midiendo la inhibición de la unión de un radioligando con esos componentes no marcados. El uso de radioligandos también permite la caracterización de receptores en ausencia de una reacción biológica medible. Esto puede ser importante, por ejemplo, en el estudio de receptores del SNC, donde los efectos de neurotransmisores son preparaciones de tejidos complejos y aislados son difíciles de Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski 22

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obtener. El uso de ensayos de acoplamiento con radioligandos puede dar estimaciones significativas

del

número

o

densidad

de

receptores

en

un

tejido

particular.

Consecuentemente, pueden observarse cambios en la densidad de los receptores resultante de condiciones patológicas o intervenciones farmacológicas. Los ensayos de acoplamiento pueden también emplearse para discriminar múltiples clases de receptores en un único tejido y para estimar sus proporciones relativas. Además, los ensayos de acoplamiento con radioligandos proporcionan la única medida por la cuál los receptores pueden ser medidos durante la solubilización, purificación y reconstitución, pasos necesarios para la comprensión completa de la función del receptor.

Estructura de membrana. Tomado de "Basic Neurochemistry" (GJ. Siegel) Hay dos tipos básicos de ensayos que emplean radioligandos. El primero, ensayos de unión directos, miden la interacción directa de un radioligando con un receptor. Los ensayos de unión directa permiten la determinación de propiedades cinéticas y de equilibrio y proporciona estimaciones de la densidad de receptores. También se emplean para elegir las condiciones apropiadas y los radioligandos para determinar las propiedades farmacológicas de los receptores. Los segundos, ensayos de unión indirecta, miden la inhibición del acoplamiento de un radioligando a un ligando no marcado para deducir indirectamente la afinidad de los receptores por el ligando no marcado. Este enfoque es particularmente útil en la caracterización farmacológica de receptores porque los estudios pueden llevarse a cabo con componentes que podrían no convenir a los Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski 23

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radioligandos, incluso porque son muy lipofílicos o porque la afinidad del receptor para estos componentes es muy baja. En la practica, el radioligando se une no sólo al receptor, sino también a otros componentes del sistema de ensayo, incluyendo las paredes de los tubos de ensayo, el filtro, y constituyentes del tejido. Aunque la naturaleza exacta de esta unión no específica es generalmente desconocida, a menudo se da instantáneamente. La unión no específica es generalmente no saturable y proporcional a la concentración del radioligando. La mala identificación de este componente no específico es una fuente de error común en el análisis de datos de la unión del radioligando, que produce una sobreestimación de la densidad de receptores y lleva, en algunos casos, a la conclusión incorrecta de que múltiples clases de receptores coexistan en un tejido dado. La unión no específica puede ser cuantificada añadiendo altas concentraciones de un ligando competitivo no marcado que sea específico para el receptor de interés. La cantidad de radioligando que queda unido en presencia del ligando no marcado, se define como acoplamiento no específico. En un experimento de saturación, el componente no específico de unión en cada concentración de radioligando se resta de la cantidad total de radioligando unido que produce la cantidad de radioligando específicamente adherida al receptor. Las interacciones de ligandos no marcados con un receptor, pueden caracterizarse estudiando su capacidad de inhibir la unión de un radioligando. Ya que los ligandos no marcados son mucho más numerosos que los radioligandos, son esenciales los ensayos de unión indirecta para caracterizar una población de receptores completamente. Tradicionalmente, los receptores han sido clasificados en términos del orden de potencia de varios componentes que o causan o antagonizan una respuesta funcional. Los ensayos de unión indirecta, hacen posible definir la especificidad farmacológica de un receptor basado en las conductas de disociación para variedad de componentes determinados desde la inhibición de la unión de un radioligando. Otro uso importante de los ensayos de unión indirecta es definir el nivel de acoplamiento no específica. Una definición exacta de acoplamiento no específico se requiere para el análisis de datos de unión tanto directos como indirectos y debería establecerse antes de determinar las propiedades cinéticas y de equilibrio del radioligando. PROTEÍNAS G

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Existen múltiples formas de las proteínas G en el sistema nervioso, cada proteína G es un heterodímero compuesto de subunidades α, β y γ simples. La actividad funcional de las proteínas G implica su disociación y reasociación en respuesta a señales extracelulares. Las proteínas G unen directamente algunos receptores neurotransmisores con canales iónicos y regulan niveles intracelulares de segundos mensajeros. A finales de los 50 cuando Sutherland y sus colegas demostraron que la adrenalina induce glucogenolisis en el hígado estimulando la síntesis de un segundo mensajero, adenosín 3´, 5´-monofosfato cíclico (AMP o AMPc). Desde aquella época, el AMPc y otras pequeñas moléculas (ej. GMPc, NO y los metabolitos y fosfatidilinositol y del ácido araquidónico). Estos mensajeros median muchas de las acciones de hormonas y neurotransmisores sobre diversos aspectos del funcionamiento neuronal. En la actualidad la atención se ha centrado también en una clase de proteínas unidas al nucleótido guanina, llamadas proteínas G como los factores que típicamente se acoplan a los receptores de membrana para la generación de segundos mensajeros intracelulares. Con la excepción de la transmisión sináptica mediada vía receptores que forma canales iónicos, la familia de proteínas G parece estar implicada en todas las señales de transmembrana en el sistema nervioso. Las proteínas G, identificadas y caracterizadas por Rodbell, Gilman y otros, son llamadas así a causa de la capacidad para unir los nucleótidos de guanina, guanosina trifosfato (GTP) y difosfato guanosina (GDP), también poseen una actividad GTPasa intrínseca. Muchos tipos de proteínas efectoras están influidas por las proteínas G; estas incluyen en canales iónicos, adenil ciclasa, fosfolipasa C (que cataliza la hidrólisis de fosfatidilinositol), fosfolipasa A2 (que catalizas la hidrólisis del ácido araquidónico), y fosfodiesterasa (PDE) (en segmentos exteriores de bastoncillos). Fueron identificadas tres formas de proteína G en estudios tempranos. Gt, denominada transducina, fue identificada como la proteína G que se une a la rodopsina para la regulación del funcionamiento de células fotorreceptoras, y Gs y Gi fueron identificados como las proteínas G que se unen a los receptores de membrana para la estimulación e inhibición, respectivamente, de la adenil ciclasa, la enzima que cataliza la síntesis de AMPc.

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Además de Gt, Gs y Gi, los otros tipos principales de proteína G en el cerebro son designados Go, Golf, Ggust, Gz, Gq y G11-16. Los diferentes tipos de proteínas G contienen distintas subunidades α, que son responsables por su actividad funcional específica. Los tipos de subunidades α de proteínas G que se saben que existen están listados en siguiente tabla.

alfa-subunidades de proteína G heterotriméricas en el cerebro. (Tomado de Basic Neurochemistry, Siegel, G (Ed)) La actividad funcional de las proteínas G implica su disociación y reasociación en respuesta a señales extracelulares. En estado de reposo, las proteínas G funcionan como heterodímeros que están unidos a GDP y no están asociados con receptores extracelulares o con proteínas efectoras intracelulares. Cuando un ligando se une a (y activa) un receptor, da lugar a un cambio conformacional en el receptor, lo que provoca que se asocie a la subunidad α de la proteína G al receptor, esto altera la conformación de la subunidad α y conduce al desplazamiento del GDP por el GTP unido a la subunidad α, a la separación de las subunidades βγ desde la proteína G, y a la liberación de la unión

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receptor-proteína G. Este proceso genera una subunidad α unida a GTP, que es biológicamente activa y que puede regular la actividad funcional de las proteínas efectoras dentro de la célula. El sistema vuelve a su estado de reposo cuando el ligando es liberado desde el receptor y la actividad de la Gtpasa que hidroliza al GTP que estaba unido a la subunidad a en GDP. La acción posterior conduce a la reasociación de las subunidades α libres con las subunidades βγ compuestas para restaurar el heterodímero original, que es la proteína G. Se ha dicho que las proteínas G provocan la fosforilación por medio de proteínas quinasas dependientes de AMPc y calcio-dependientes y por medio de proteínas quinasas tirosina. Las proteínas G controlan los niveles de AMPc intracelular mediando la capacidad de los neurotransmisores para activar o inhibir la adenil ciclasa (siguiente tabla).

Ejemplos de la regulación de neurotransmisores por medio de la adenil ciclasa. (Tomado de Basic Neurochemistry, Siegel, G (Ed)) Las proteínas G asocian algunos receptores de neurotransmisores directamente a los canales iónicos. En la mayoría de los casos, la subunidad α liberada desde la interacción receptor-proteína G directamente abre o cierra un canal iónico específico. Uno de los Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski 27

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ejemplos mejor establecidos de este tipo de mecanismos en el cerebro es la asociación de receptores opiáceos, α2-adrenérgicos, D2 dopaminérgicos, muscarínicos colinérgicos, serotoninérgicos

5-HT1A

y

GABAB.

Algunos

de

estos

mismos

receptores

de

neurotransmisores se han demostrado que se asocian de la misma manera a canales Ca2+ dependientes del voltaje vía los mismos tipos de proteínas G, aunque los canales son inhibidos por esta interacción. El mecanismo por medio del cual los neurotransmisores estimulan la adenil ciclasa está bien establecido. La activación de estos receptores de neurotransmisores que se asocian a Gs resulta en la generación de subunidades Gas que se unen a γ activan directamente la adenil ciclasa. La capacidad de los receptores de neurotransmisores para estimular la vía de segundo mensajero fosfatidilinositol está mediada por la activación de la fosfolipasa C, que cataliza la hidrólisis del fosfatidilinositol en los segundos mensajeros inositol trifosfato y diaciglicerol. Ahora parece que la activación inducida por los neurotransmisores de la fosfolipasa C está mediada vía proteínas G. En la mayoría de los casos, Gq está implicada, y se piensa que Gaq se une a γ directamente activa ciertas formas de fosfolipasa C. El mecanismo por el que las proteínas G median la regulación neurotransmisora del metabolismo del ácido araquidónico, vía la activación o inhibición de la fosfolipasa A2, está menos comprendida, pero puede también implicar a los subtipos Gi y Go. Un rasgo que unifica a las diferentes clases de proteínas G es que la unión a GTP incrementa la afinidad de las proteínas por algunas moléculas objetivos, mientras que la unión de GDP reduce esta afinidad. Una clase principal de proteína G, denominada proteínas G pequeñas, es la familia ras, que fueron inicialmente identificadas como los productos de oncogenes de virus de sarcoma de rata. Homólogos celulares normales de oncogenes son a menudo referidos como proto-oncogenes. ADENILCICLASA

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La regulación de la formación de AMPc por medio de los receptores de neurotransmisor así como las vías de mensajero intracelular está determinada por la actividad de la enzima adenilciclasa (también denominada adenilatociclasa). La adenilciclasa puede también ser activada por la fosfocolina. El sustrato para la adenilciclasa es un compuesto de Mg2+ y ATP. TIPOS DE ADENILCICLASA Hasta la fecha, cuatro formas distintas de la enzima han sido definitivamente identificadas; estas se denominan como tipos I a IV. El tipo I de adenilciclasa se encuentra fundamentalmente en el cerebro. El tipo II es producido a los niveles más altos en el cerebro pero se encuentra también a niveles más bajos en los pulmones y en el tejido olfatorio. El tipo III está en grandes cantidades en el epitelio olfatorio. El tipo IV parece estar ampliamente distribuido y está presente a niveles altos en el cerebro. Las proteínas de adenilciclasa contienen dos grandes regiones hidrofóbicas, cada una de las cuatro tiene seis dominios de unión de membrana putativos. Hay dos grandes dominios citoplasmáticos, uno entre las dos regiones hidrofóbicas y otro en el término carboxi de la proteína. Los dominios citoplasmáticos son las porciones más altamente conservadas de las cuatro proteínas diferentes de la adenil ciclasa, y son similares unas a otras dentro de una molécula enzimática dada. Además, hay alguna homología entre estos dominios y los dominios catalíticos de ciertas guanilil ciclasas (el enzima que cataliza la síntesis de GMPc). Se piensa que estos dominios contienen lugares de unión de los nucleótidos, y ambos parecen ser necesarios para la actividad catalítica; no hay actividad enzimática cuando sólo uno de los dominios es producido, pero la actividad se repone cuando las dos mitades de la molécula son coproducidas. Las adenil ciclasa son glicosiladas y contienen varios lugares potenciales para la fosforilación. Los enzimas del tipo I al IV se diferencian en su capacidad para ser regulados por Ca2+ y por la calmodulina. Los tipos I y III son estimulados por complejos Ca2+/calmodulina, mientras que los tipos II y IV son insensibles. Aunque cada uno de los tipos I a IV de adenil ciclasa es activado por Gas activados (i.e. Gas unido a GTP), estos difieren en su regulación por medio de los compuestos de Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski 29

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subunidades-βγ. En presencia de Gas, la adición de compuestos βγ inhibe el tipo I, esto no afecta al tipo III, y estimula a los tipos II y IV de adenil ciclasas.

Esquema de la actividad de la adenil ciclasa y de la fosfolipasa C. Tomado de "Basic Neurochemistry" (GJ. Siegel) En las células que contienen el tipo I de adenil ciclasa, la formación de AMPc es estimulada por medio de señales extracelulares que aumentan la entrada de Ca2+ en las células, así como por medio de aquellas señales que activan los receptores asociados a Gs. Las células que producen el tipo I de adenil ciclasa pueden tener inherentes altos niveles de formación de AMPc debido a la estimulación basal de Ca2+/calmodulina. De hecho, los altos niveles de actividad enzimática de adenil ciclasa en cerebro relacionado con otros tejidos puede ser explicado de este modo. Este alto nivel de actividad enzimática podría también subyacer el requerimiento para mecanismos adicionales por los que este tipo de adenil ciclasa es inhibido: la formación de AMPc puede ser inhibida en estas células no sólo por medio de señales que activan los receptores acoplados a Gi, sino también por medio de señales adicionales que activan los receptores acoplados a

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otras proteínas G (ej., Go y Gq) conduciendo a la liberación de subunidades-βγ. Esto podría proporcionar un mecanismo para mantener en jaque la alta capacidad sintética del AMPc en el cerebro, así como proporcionar múltiples mecanismos para la regulación de la formación de AMPc por medio de varias señales extracelulares. Una situación muy distinta puede aparecer en células que producen la adenilciclasa tipo II. En estas células, la actividad enzimática no es estimulada por Ca2+/calmodulina, pero es incrementada por medio de señales que activan los receptores asociados a Gs, así como por medio de señales adicionales que activan los receptores asociados a otras proteínas G a través de la generación de compuestos de subunidades-βγ libres. Esto proporciona un mecanismo por el que la formación de AMPc es regulada de manera integrada por múltiples estímulos extracelulares. GUANIDILCICLASA La guanilciclasa (también conocida como guanilato ciclasa) cataliza la síntesis de GMPc desde GTP en una reacción análoga a la de la adenil ciclasa. Las formas unidas a la membrana de guanil ciclasa son receptores de membrana plasmática. Estas proteínas de transmembrana poseen dominio de superficie de célula que funciona como receptor de neuropéptidos que contienen actividad catalítica de guanil ciclasa. La unión de un ligando a, y la consiguiente activación de, el dominio de receptor conduce a la activación del dominio catalítico. Las formas solubles de guanil ciclasa están asociadas con el óxido nítrico. Estas enzimas son homólogas a los dominios catalíticos de las formas de unión de membranas de la guanil ciclasa. Se piensa que NO activa estas enzimas vía interacciones con sus grupos prostéticos hemo. Es a través de la generación de NO que numerosos neurotransmisores, incluyendo el glutamato, acetilcolina, sustancia P, histamina y bradiquinina, se piensa que activan la guanil ciclasa e incrementan los niveles celulares de GMPc en cerebro y otros lugares.

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Esquema de la actividad de guanidil ciclasa. Tomado de "Basic Neurochemistry" (GJ. Siegel)

La síntesis de NO es catalizada por medio de una enzima denominada NO sintasa. Esta enzima convierte la arginina en NO libre y citrulina en una reacción que requiere un cofactor tetrahidrobiopterina y la forma reducida del dinucleótido nicotinamida-adenin fosfato (NADPH). Sólo ciertos tipos de neuronas contienen NO sintasa, aquellas para las que la enzima muestra una alta especificidad de localización en el cerebro. La NO sintasa es una enzima sensible a Ca2+/Calmodulina; la unión de compuestos Ca2+/Calmodulina a la enzima resulta en la activación de la actividad catalítica. Por tanto, se podría esperar que los neurotransmisores que incrementan los niveles de Ca2+ celular estimularan la actividad de la guanil ciclasa en aquellas neuronas que contienen la NO sintasa. PAPELES FUNCIONALES PARA EL AMPC Y EL GMPC Se ha demostrado que el AMPc sirve como un segundo mensajero intracelular para numerosas señales extracelulares en el sistema nervioso. Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski 32

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Primero, el AMPc media aspectos a corto plazo de la transmisión sináptica: algunas acciones rápidas de ciertos neurotransmisores sobre los canales iónicos que no implica la activación de canales de entrada al ligando son mediados a través del AMPc. Segundo, el AMPc, junto con otros mensajeros intracelulares, juega un papel central en la mediación de

varios

aspectos

de

la

transmisión

sináptica:

numerosos

efectos

de

los

neurotransmisores sobre la neurona objetivo que funcionan, tanto a corto como a largo plazo, son conseguidos por medio de mensajeros intracelulares. Esto incluye la regulación del estado metabólico general de neuronas diana, así como efectos moduladores sobre la síntesis, almacenamiento y liberación del neurotransmisor; la sensibilidad del receptor del neurotransmisor; la organización y estructura citoesquelética y el crecimiento y diferenciación neuronal. Esto también incluye aquellas acciones a largo plazo de neurotransmisoress que están mediadas por alteraciones en la expresión genética. Es importante enfatizar que el papel para el AMPc y otros mensajeros intracelulares no está limitado a acciones de neurotransmisores mediadas por medio de receptores unidos a la proteína G. La mayoría de los efectos del AMPc sobre el funcionamiento celular están mediados a través de la fosforilación proteica. Hasta ahora los mecanismos más importantes por medio de los que el AMPc ejerce sus innumerables efectos fisiológicos es a través de la activación de la proteína quinasa dependiente del AMPc. Krebs y sus colaboradores fueron los primeros en demostrarlo para la regulación del AMPc de la glucogenolisis, y poco después Greengard y sus colegas demostraron que era un mecanismo general. De hecho, ahora se sabe que la proteína quinasa dependiente del AMPc fosforila virtualmente a todos los tipos de proteínas neurales; esto responde a la capacidad del AMPc para influir en muchos aspectos diferentes del funcionamiento neuronal. ¿Cómo originan una amplia variedad de neurotransmisores y hormonas respuestas biológicas específicas a la célula y a los tejidos, si muchas de tales respuestas están mediadas por los mismos mensajeros intracelulares?. La especificidad es conseguida a varios niveles: a nivel de receptores específicos de tejidos para el neurotransmisor o hormona, a nivel de subtipos diferentes de proteína de unión de GTP, y a nivel de proteínas de sustrato específicas de tejido para proteínas quinasas. Sólo los tejidos que producen receptores específicos responderán a un neurotransmisor o a una hormona dada. Además, puesto que todas las células contienen subunidades catalíticas similares Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski 33

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para proteínas quinasas dependientes del AMPc, la naturaleza de proteínas fosforiladas en un tejido dado depende de los tipos y cantidades de proteínas producidas en este tejido y sobre su accesibilidad a la proteína quinasa FOSFODIESTERASAS Dado en papel de los nucleótidos cíclicos en vías de transducción de señal, no sorprende que el metabolismo, así como la síntesis, de estos segundos mensajeros esté altamente regulado. Tal metabolismo es conseguido por medio de un gran número de enzimas, las fosfodiesterasas (PDEs), que catalizan la conversión de AMPc y GMPc en 5´-AMP y 5´GMP vía la hidrólisis de los enlaces 3´-fosfoester. TIPOS DE FOSFODIESTERASAS EN EL CEREBRO Se han descrito las cinco principales familias de PDE, sobre la base de dos criterios: (1) los mecanismos para la regulación de la actividad enzimática, y (2) las propiedades kinéticas de los enzimas para hidrolizar los nucleótidos cíclicos. La familia I de PDE es estimulada por Ca2+/calmodulina. Estudios inmunocitoquímicos han revelado que altos niveles de estas enzimas están localizados en densidades sinápticas, en los campos dendríticos de células cerebelares de Purkinje y en células cerebrales corticales piramidales. La actividad de los isozimas I de PDE puede estar regulados bajo condiciones fisiológicas por medio de señales extracelulares que influyen en los niveles de Ca2+ intracelulares. Dos familias de PDE están regulada por GMPc, una que es estimulada (PDE II) y otra que inhibida (PDE III). La PDE II puede ser activada de 10 a 50 veces más por concentraciones de GMPc que se encuentran en las células. Sin embargo, la estimulación es transitoria ya que el GMPc es también un sustrato para la enzima y entonces es rápidamente metabolizado. Los resultados de estudios inmunohistoquímicos demuestran que PDE II es encontrado por todo el cerebro. Por el contrario, actualmente no hay evidencia para la presencia de PDE III inhibida por GMPc en el cerebro.

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PDE IV, que es también conocida como la PDE de bajo Km específica del AMPc, se encuentra en muchos tejidos y es producida abundantemente en el sistema nervioso central. La familia PDE V es también referida como PDEs específicos del GMPc. También muestran una selectividad 50 veces mayor para GMPc en relación con el AMPc. La activación del fotoreceptor PDE en segmentos externos de conos y bastones es mediado por la transducina, una proteína G específica para la retina. Algunos inhibidores de PDE con posible utilidad clínica son inhibidores de PDE III o IV. Basado en la localización de PDE III en el cerebro y tejido vascular y el efecto del AMPc en la contracción del músculo y la relajación de estos tejidos, se ha desarrollado un gran número de inhibidores de PDE III para la posible aplicación clínica del tratamiento de enfermedades cardiovasculares. EJEMPLO DE DROGAS CON ACCIÓN A TRAVES DE INHIBICIÓN DE LA FOSFODIESTERASA MECANISMO DE ACCION DEL SILDENAFIL Por efecto de la excitación sexual se libera, de unas neuronas (NANC) de los cuerpos cavernosos y de las células del interior de las arterias (células endoteliales) óxido nítrico (NO) importante mediador de efecto vasodilatador . Este promueve una serie de cambios que resultan (mediados por la guanosimonofosfato cíclica -GMPc-) en una relajación del músculo liso cavernoso, que permiten la vasodilatación de las arterias del pene y en la subsiguiente erección. Luego de un periodo de tiempo el GMPc es degradada por la fosfodiesterasa tipo 5 (PDE V), responsable de la pérdida de la erección. El sildenafil es un potente inhibidor, altamente selectivo, de la PDE 5, lo que se opone a la degradación de la GMPc, impidiendo así la detumescencia peneana. Dado que es necesaria una estimulación sexual para iniciar la liberación local de NO, el efecto inhibidor del sildenafil sobre la PDEV no tiene lugar en ausencia de esta. La PDEV se encuentra en el músculo liso de los cuerpos cavernosos, en el músculo liso vascular y visceral, en el músculo esquelético, las plaquetas, los riñones, pulmones, cerebelo y páncreas. La droga es unas 10.000 veces más potente sobre la PDEV que sobre otras fosfodiesterasas como la PDE III que se encuentra sobre todo en el corazón y los vasos sanguíneos.

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sildenafil

RECEPTORES NUCLEARES Los receptores a nivel nuclear son un fenómeno importante en la transmisión de estímulos a nivel celular. Muchas hormonas poseen este tipo de mecanismo de acción , generalmente más lento que el de segundo mensajero, no obstante importante en la regulación a largo plazo de la homeostasis celular.

Hormonas tiroideas: T3 unida a proteínas está en equilibrio con una fracción en estado libre que es 2-3 veces mayor que la del plasma. Pero es en el núcleo donde la T3 se concentra en forma eficiente, siendo la concentración de T3 libre nuclear 50-250 veces mayor que en el citosol. Los núcleos de las células sensibles a T3 poseen proteínas que tienen gran afinidad por T3 y que actúan como receptores. La actividad transcripcional de estas proteínas se modula por la unión del ligando. En ausencia del ligando, poseen una fuerte actividad represora de la actividad génica. La unión de la hormona tiene dos efectos: anular la represión y, dependiendo de la dosis de hormona y del gen diana, Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski 36

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aumentar la transcripción de éste. Estas proteínas tienen gran semejanza con los receptores nucleares para otras hormonas como los esteroides y el ácido retinoico, por lo que se incluyen dentro de una misma familia.

La información codificada en el DNA es organizada, replicada y leída por un variedad de proteínas que se unen al DNA. Algunas proteínas, particularmente las que están involucradas en el empaquetamiento (por ejemplo las histonas) o en procesos de replicación (como las DNA polimerasas), tienen poca o no tienen especificidad hacia una determinada secuencia de DNA mientras que otras proteínas como los represores, activadores transcripcionales y las endonucleasas de restricción tienen una especificidad extremadamente alta para secuencias de DNA y son capaces de encontrar una pequeña secuencia de 10 a 20 pares de bases en un fondo de 106 a 109 pares de bases. Las bases moleculares del reconocimiento de un sitio específico de unión requiere de una caracterización

de

las

conformaciones

tridimensionales

de

las

proteínas,

del

complejoproteína-DNA, de la secuencia del sitio de unión en el DNA, y de los cambios estructurales que suceden como consecuencia de la interacción. Es así que la descripción de especificidad en el reconocimiento de una secuencia de DNA por partede una proteína se realiza en base a observaciones y comparaciones entre los eventos que suceden en los dos tipos de reconocimientos . Estos tipos de proteinas que activan receptores presentan cuatro tipos principales de modelo de estructura proteicas, de las cuales las más importante es la denominada dedos de zinc : DEDOS DE ZINC (Zinc fingers). Son las formas mas comunes de receptores asociados a hormonas y a sus drogas derivadas ( drogas glucocorticoides, drogas de acción tiroideas, estrógenos y progesterona). Los dedos de Zinc son estructuras de unión a DNA que requieren de Zinc para su actividad de unión, y fueron llamados así porque su estructura primaria podía ser dibujada en papel con un átomo de Zinc uniendo residuos de cisteínas e histidinas distantes con una secuencia intermedia descrita como una asa (loop) . Las proteínas de éste tipo usualmente están organizadas en series de 9 dominios repetidos que contienen 30 aminoácidos plegados en una unidad estructural simple alrededor de un átomo de Zinc al que se unen las cisteínas e histidinas en número variable, y que da lugar a las familias descritas hasta el momento: la familia cys-cys-his-his (2 cisteínas y 2 histidinas), la familia cys-cys-cys-cys (4 cisteínas), y la familia cys-cys-his-cys (2 cisteínas

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y 1 histidina). La estructura dedos de Zinc fué descubierta con los estudios de expresión del gene RNA ribosomal 5S de Xenopus laevis

Atomo de Zn coordina zonas de unión al DNA

Simetría en dímero

Estructura del tipo “dedos de zinc”. El esquema pertenece a un motivo de la familia cyscys-hishis, en donde se puede observar a 2 cisteínas (C) y dos histidinas (H) unidas al núcleo central conformado por una molécula de zinc (Z). La proyección resultante de ésta interacción (comprendida entre las dos flechas) es la que se une directamente con la estructura de DNA. . La transcripción del gene 5S es regulado por un promotor interno al cual se une una proteína reguladora rica en cisteína llamada factor de transcripción IIIA (TFIIIA), que en colaboración con por lo menos otras dos proteínas (TFIIIB y TFIIIC) se unen en un complejo estable sobre el gene 5S y el cual entonces es el sitio blanco de la RNA polimerasa III para que se lleve a cabo la transcripción. La proteína reguladora TFIIIA es el prototipo de la más grande superfamilia de factores de transcripción en eucariotas. Alteraciones estructurales de estas proteínas reguladoras ocasionadas por ciertos iones aumentan la carcinogénesis y otros procesos malignos. Técnicas de cristalografía demuestran que los dedos de Zinc se unen a la hendidura mayor del DNA de la forma B y cubriendo parte de la doble hélice , aunque estudios recientes demuestran que los dedos de zinc se unen a sitios del DNA que tienen una conformación intermedia entre la forma A y B del DNA . Las Proteínas reguladoras de levaduras, mosca de la fruta y de humanos exhiben residuos de cisteínas e histidinas organizados en forma muy similar a la observada en TFIIIA (cis2his2) . Otros factores de transcripción que presentan conformación de dedos de Zinc son la proteína GATA-1 expresada en células eritroides y Química Medicinal año 2006 -Dr Juan C. Falkowski 38

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juega un papel fundamental para el desarrollo eritroide normal y la proteína MAZ que juega un papel muy importante en el control de la expresión genética de la glicoproteína de superficie celular CD4.

EJEMPLO DE DROGAS CON ACCIÓN A TRAVES DE RECEPTORES NUCLEARES MECANISMO DE ACCION DE LAS GLITAZONAS Las glitazonas, son una nueva familia de drogas de acción hipoglucemiante derivadas de la estructura tiazolidínodiónica y ejercen su efecto sin estimular la secreción de insulina de las células pancreáticas y necesitan de la presencia de insulina para ejercer su efecto. Estos fármacos disminuyen marcadamente los niveles de glucosa, insulina y triglicéridos en una amplia gama de modelos animales diabéticos Por el contrario, no tienen actividad hipoglicemiante en animales euglucémicos, lo que diferencia claramento estos agentes de otros antidiabéticos orales y de la insulina que tiene un potente efecto hipoglucemiante.

pioglitazona

troglitazona Por regla general, la mejora en la sensibilidad a la insulina requiere varios días de tratamiento, lo que sugiere un efecto transcripcional en alguna parte. Pronto se observó que este efecto tenía preferentemente lugar en el tejido graso y muscular.

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Aunque no se conocen todas los mecanismos que tienen lugar seguidamente, se han postulado varias vías metabólicas en las que se han estudiado las tiazolidindionas. Algunos de los efectos observados son mediados por la unión a los receptores activados por la proliferación de los peroxisomas: estos receptores, conocidos como PPAR (Peroxisome Proliferation Activated Receptor) pertenecen a una superfamilia de factores de transcripción de hormonas esteroídicas y tiroideas. Se conocen hasta el momento tres receptores PPAR, denominados α, γ y δ, los tres con una considerable homología en las secuencias responsables de la fijación al DNA y a sus ligandos. El PPARa es un receptor para los fibratos (fármacos hipolipemiantes a los que pertenece, entre otros, el clofibrato) mientras que el PPARa y el PPARd son receptores para tiazolidinoodionas. En particular, se ha demostrado que la rosiglitazona posee una alta especificidad y afinidad hacia el PPARg.

Se sabe que el PPARg existe formando un heterodímero con otro receptor

nuclear el RXR (Receptor X Retinoico). Una proteína adicional represora mantiene el receptor en estado inactivo. La unión de una glitazona al receptor PPARg ocasiona un cambio conformacional que inactiva o desplaza al represor. El receptor activado puede entonces interaccionar con una secuencia determinada de un gen que pone en marcha la expresión de una proteína inductora de la lipogenesis. En este sentido, el PPARg activado por una glitazona actua igual que lo hace directamente la insulina que activa la expresión del inductor de la lipogenesis al fijarse a una secuencia específica del DNA. Además de mejorar el aprovechamiento de la glucosa, las glitazonas facilita la inhibición de la salida de

glucosa

hepática,

probablemente

debido

a

un

efecto

inhibidor

sobre

la

gluconeogénesis o un efecto inductor de la glicolisis BIBLIOGRAFÍA • • • • • • • •

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