Polifenoles en cacao y su variación durante los procesos poscosecha Luisa Fernanda Rojas M.Sc.

Grupo de Biotecnología Universidad de Antioquia-SIU Medellín-Colombia Email: [email protected]

Contenido •Introducción •Biosíntesis

de polifenoles en el reino vegetal y en Theobroma cacao

•Composición

del cacao: valor agregado

•Procesamiento

del cacao

•Fermentación •Secado •Tostión •Cambios

en la composición química del cacao durante su procesamiento

Introducción

Polifenoles •

Sustancias antioxidantes: quimiopreventivos naturales

Previenen las iniciación y la propagación de las reacciones de cadena oxidativa en el organismo

•

• •

En las últimas décadas han recibido especial atención Múltiples funciones fisiológicas: • Actividad antimutagénica • Actividad antitumoral • Actividad antimicrobiana • Prevención de enfermedades cardio y cerebrovasculares

Biosíntesis de polifenoles en el reino vegetal y en Theobroma cacao

Polifenoles: Compuestos antioxidantes derivadados de la ruta de Shikimato y el Acetato O OH HO

OH

OH

O

HO

OH

HO HO

OH OH

O CH3

OH

Fuente de antioxidantes

O

HO

O

O

8000 sustancias, 22 grupos OH

OH

HO

HO

OH

O

OH

HO

O

O

OH

OH

OH OH

O CH3

Othman et al., 2005; Matkowski, 2008; Heim et al., 2002; Lee et al., 2003

Echeverri, 2010

El cacao y su importancia social y económica

Cacao: fuente de polifenoles

OH OH

B

O

HO

A

C OH

OH

Flavanoles

O

Lee et al., 2003

Flavanoles del cacao

OH OH

OH

•Catequinas

HO

(37%):

HO

O OH

O OH OH

OH

OH

OH

OH

OH

(-)Epigallocatequina

OH HO

O

HO

(-)Epicatequina

OH

OH

Astringente

OH OH

OH OH

(+)Catequina

•Antocianinas

O

(+)Gallocatequina

(4%)

OH

OH

OH OH

OH

HO

HO

O OH

HO

O

HO

O OH

+

O OH

O

OH

O

OH

O

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

O

OH

HO

OH

O

OH

OH

OH

OH OH

Catequina

Cianidina-3-D-galactosa

•Procianidinas

OH

Cianidina-3-D-arabinosa

Cianidina-3-D-galactosido

(58%)

OH

HO

O OH

OH OH OH HO

O OH

OH OH

Procianidina, dimero 4-6 catequina-catequina Procianidina, dímero 4,6-catequina-catequina

Romanczyk et al., 1997

Una de las rutas biosintéticas mejor caracterizadas (Zea maiz, Arabidopsis thaliana)

Ruta metabólica Dixon y Paiva, 1995; Winkel-Shirley, 2002

Dixon y Paiva, 1995; Winkel-Shirley, 2002

Ruta metabólica

Ruta metabólica

Patrón de coordinación en la síntesis de flavanoles

Dixon y Paiva, 1995; Winkel-Shirley, 2002, Cakirer, 2003

Polifenoles en el reino vegetal

Dixon y Paiva, 1995

Biogénesis

15-20% (peso seco) Células parenquimáticas Células pigmentadoras Tejido vascular

Theobroma cacao

Wollgast & Anklam 2000; Martini et al., 2008

Polifenoles en la semilla de cacao •Mecanismo

de protección frente al ataque de herbívoros o patógenos •Propiedades

organolépticas al cacao procesado

•Factores

de disuasión gustativa: producen una sensación de quemazón al contacto con la lengua •Grado

de polimerización de polifenoles

•Formación

lengua.

de complejos con las proteínas de la Lawless y Hildegarde, 1988; Cakirer, 2003

a

Sección transversal de semillas de Theobroma cacao. a. Cotiledón fresco. b. Cotiledón teñido con azul de Toluidina (Martini b et al, 2003)

Síntesis de polifenoles, lípidos y proteínas en el mesófilo del cotiledón. Microscopía Electrónica de Transmisión. (Martini et al, 2003) Martini et al., 2008

Estrés oxidativo en plantas Es producido por un desequilibrio entre la producción de especies oxidantes y la capacidad de la planta de eliminarlas rápidamente o reparar el daño resultante

1O 2

Factores de estrés

Valco et al., 2007

O2Fotólisis del agua

EROs

O3

.OH Respiración celular

SOD, CAT

H2O2

-Procesos de señalización celular -Oxidación de lípidos y proteínas -Daños en el DNA

Blokhina et al., 2003; Ali et al., 2006

Sistemas antioxidantes de defensa •Remoción

catalítica por enzimas (CAT,

SOD) Ciclo Ascorbato-Glutatión •Producción

de Polifenoles Ciclo Flavonoide-Peroxidasa

•Ciclo Agua-Agua •Ciclo

del cloroplasto

de las xantófilas (disipación térmica) Yamasaki et al., 1997

Ciclo Ascorbato-Glutatión Citosol, mitocondrias, cloroplastos y peroxisomas

http://ethesis.helsinki.fi/julkaisut/mat/bioti/vk/blokhina/ch1.html)

Yamasaki et al., 1997; Noctor y Foyer, 1998

Ciclo flavonoide peroxidasa •Capaces

de estabilizar EROs (O2 ó -

Baja difusividad

•

1O

SOD 2

in vitro, H2O2 in vivo)

Alta difusividad

H2O2 baja toxicidad Haber-Weiss

Fe2+ + H2O2 •H2O2



Fe3+ + OH− + •OH

α Flavonoides

Proceso de detoxificación mediado por peroxidasas Miller y Schreler, 1985;Takahama, 1986;Yamasaki et al., 1997

Ciclo flavonoide peroxidasa In vivo: H2O2 sobre hojas de fijol  flavonoides oxidados en epidermis y mesófilo Takahama y Egashira, 1991

In vitro Quercetina

Kaempferol

Q-3-glucosido

K-3-glucósido

Oxidación de flavonoides en presencia de peróxido de hidrógeno y peroxidasa de rábano. (-HRP: en ausencia de peroxidasa, +HRP: en presencia de peroxidasa) (Yamasaki et al., 1997)

Miller y Schreler, 1985;Takahama, 1986;Yamasaki et al., 1997

Ciclo flavonoide peroxidasa In vitro

Efecto cooperativo del ascorbato durante la oxidación de flavonoides en presencia de H2O2. A. Monitoreo a la oxidación de flavonoides en presencia (+ASA) y ausencia de (-ASA) de ascorbato. B. Monitoreo de la oxidación de ascorbato en presencia (+SF1) y ausencia (-SF1) de flavonoides (Yamasaki et al., 1997).

Yamasaki et al., 1997

Mecanismo de acción de los flavonoides

Yamasaki et al., 1997

Composición del cacao: Valor agregado

Fenotipo = Genotipo + Ambiente + Genotipo x Ambiente Respuestas especificas Productos únicos

BIOA

BIOB

Contenido de polifenoles (antioxidantes) en cacaos selectos colombianos

BIOA – Vereda 1

BIOA – Vereda 2

Contenido de polifenoles (antioxidantes) en cacaos selectos colombianos

Antecedentes *Industrial chocolatera: una de las agroindustrias con mayor tradición en el país.

*importación: producción nacional ha venido en descenso (envejecimiento de los cultivos, falta de caracterización de las variedades, enfermedades, etc.) MEJORAMIENTO DE LA COMPETITIVIDAD DE LA CADENA

Proyecto OPTIMIZACION DEL PROCESO DE PRE E INDUSTRIALIZACIÓN DE CACAO PARA OBTENER PRODUCTOS CON ALTO CONTENIDO DE POLIFENOLES OBJETIVO GENERAL: Desarrollar un método industrializable para la conservación de los polifenoles presentes en cacaos colombianos promisorios durante las etapas de pre e industrialización

Procesamiento del cacao

Precursores de aroma ↓humedad

Desarrollo de aroma

Fermentación

Sabor astringente y ácido desagradable por ausencia de fermentación Granos de cacao frescos.

Fermentación

Secado al sol

Características organolépticas deseables

Granos tostados.

Formación de precursores del aroma y sabor final de las semillas fermentadas

Mucílago.

Proceso artesanal con plástico.

Eliminar la pulpa mucilaginosa que rodea el grano de cacao Proceso artesanal con hojas de biao.

Actividad de la microbiota sobre el mucílago

Bacterias lácticas

H2O + CO2

Levaduras

Etanol + CO2 Calor

Ácido acético + CO2 Microorganismos importantes del proceso: Saccharomyces cerevisiae y Candida celanoides. Lactobacillus plantarum y Lactobacillus acidophilus.

Acetobacter aceti y Gluconobacter sp.

C3H6O3

Cambios bioquímicos al interior de la semilla inducido por la actividad de los microorganismos

Sucesión microbiana durante el proceso de fermentación

Secado

¿POR QUÉ SECAR? • Bajar la humedad para detener el crecimiento de microorganismos • Facilitar el transporte y el almacenamiento

Humedad del cacao durante el secado Preindustrialización Fermentado 60

% Humedad

50

Secado

40 30 20 10

7%

0 0

1

2

3

4

5

6

Dias

7

8

9 10 11 12

Tostión

¿POR QUÉ TOSTAR? •Definir el sabor del cacao, se produce el olor típico del chocolate

EFECTO DE CADA ETAPA SOBRE EL PRODUCTO FINAL

Granos

Fermentación

Descomposición Precursores del aroma

Secado

Tostión

Producto final

Cambio de humedad

Aparición de color y aroma

Aroma (Flavor) > 500 sustancias

Cambios en la composición química del cacao durante su procesamiento

Genotipo

Polifenoles (mg/g)

120 100 80 60 40 20 0 1

2

3

4

5

6

7

8

Fincas (San Vicente)

9

10

¿Cómo se determina el contenido de polifenoles?

Análisis de polifenoles: obtención del extracto

Muestra

Molienda

Secado

Pesaje

Extracción

ANALISIS DE POLIFENOLES

Contenido de polifenoles totales: Método de Folin-Ciocalteu (AOAC)

Análisis de polifenoles: caracterización

Cromatografía

ANALISIS DE POLIFENOLES: HPLC

HPLC HPLC – High Performance Liquid Chromatography - High Pressure Liquid Chromatography - High Pacience Liquid Chromatography

280 nm

• UV/Vis: Solo una λ (aromaticos 280 nm) • DAD (Diode Array Detector): Todo el espectro UV-Vis • Espectrometria de Masas: Peso molecular

ANALISIS DEANALISIS POLIFENOLES: HPLC (Cualitativo) DE POLIFENOLES: HPLC

ANALISIS DE POLIFENOLES DAD1C, Sig=280,4Ref=off (CUANTIEPICATCAT\1AA-0101.D) 10.785

mAU 60

Para qué sirve el estándar?

Estandar de catequina

50

•Corroborar la identidad del pico (alternativa MS) • Cuantificar

40

30

20

4.574

10

0

0

2.5

5

7.5

10

12.5

15

17.5

20

min

DAD1C, Sig=280,4Ref=off (CUANTIEPICATCAT\1DF-3001.D) 8.032

mAU 300

Muestra de cacao

250

200

150

10.753

50

11.475

100

0 0

2.5

5

7.5

10

12.5

15

17.5

20

min

Perfil cromatográfico de las semillas de cacao

Degradación de polifenoles totales Industrialización

100

50

m 2 m 3 m 4 m 5 m 6 m 7 m 8 m 9

S5

S4

S3

S2

5 S1

D

4 D

3 D

2 D

1

0

D

Polifenoles (mg/g)

Preindustrialización

Degradación de polifenoles (catequina) Preindustrialización

Industrialización

0.6 0.4 0.2

m 9

m 8

m 7

m 6

m 5

m 4

m 3

m 2

S5

S4

S3

S2

S1

D5

D4

D3

D2

0.0 D1

Catequina (mg/g)

0.8

Degradación de polfenoles (epicatequina)

Preindustrialización

Industrialización

10

5

m 9

m 8

m 7

m 6

m 5

m 4

m 3

m 2

S5

S4

S3

S2

S1

D5

D4

D3

D2

0 D1

Epicatequina (mg/g)

15

Degradación de xantinas (cafeína)

Preindustrialización

Industrialización

2.0 1.5 1.0 0.5

9 m

8 m

7 m

6 m

5 m

4 m

3 m

2 m

S5

S4

S3

S2

S1

5 D

4 D

3 D

2 D

1

0.0 D

Cafeina (mg/g)

2.5

Degradación de xantinas (teobromina) Preindustrialización

Industrialización

10

5

9 m

8 m

7 m

6 m

5 m

4 m

3 m

2 m

S5

S4

S3

S2

S1

5 D

4 D

3 D

2 D

1

0 D

Teobromina (mg/g)

15

Pérdida de actividad antioxidante Preindustrialización

100000

Industrialización

60000

40000

20000

9 m

8 m

7 m

6 m

5 m

4 m

3 m

2 m

S5

S4

S3

S2

S1

5 D

4 D

3 D

2 D

1

0 D

mol TE/100g

80000

Secado artificial

Secado artificial

Secado artifical en un horno infrarojo a 50ºC

ESTRATEGIAS PARA MEJORAR EL PROCESO • Centros de acopio para el secado de cacao

• Seguimiento a través de registros • Implementación de Sistemas de Gestión de la Calidad • Producción de polifenoles por métodos alternativos

Referencias bibliográficas Lichtenthaler, H.K. 2004. El estrés y la medida del estrés en plantas. En: Reigosa, M.J., Nuria, P., Sánchez, A. La Ecofisiología Vegetal: Una Ciencia de Síntesis. Ed. Tompsom. España. Mahajan, S., Tuteja, N. 2005. Cold, Salinity and Drought Stresses: An overview. Archives of Biochemistry and Biophysics. 444, 139-158 Martini, M.H., Lenci, C. G., and Tabares, D. Q. 2003. Mucilage pockets in cotyledon tissue of Theobroma speciosum. Acta Microscópica. 1, 65-69 Matkowski, A. 2008. Plant in vitro culture for the production of antioxidants – A review. Biotechnology Advances, 26, 548-560. Othman, A.; Ismail, A.; Ghani, N., Adenan, I. 2005. Antioxidant capacity and phenolic content of cocoa beans. Food Chemistry,100; 1523-1530

Reigosa, M.J., Nuria, P., Sánchez, A. La Ecofisiología Vegetal: Una Ciencia de Síntesis. Ed. Tompsom. España. Romanczyk, L., Hammerstone, J., Buck, M, Post, L, Cipolla, G., Micceland, C., Mundt, J., Schmitz, H. 1997. Cocoa extract compounds and methods for making and using the same. Patent Cooperation Treaty (PCT) WO 97/36497, Mars incorporated, USA. Shao, H.B., Guoc, Q.J., Chuc, L.Y., Zhao, X.N., Suc, Z.L., Hud, Y.C., Chengc, J.F. 2007. Understanding molecular mechanism of higher plant plasticity under abiotic stress. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 54, 37–45

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Takeda, T., Kitagawa, T., Takeuchi, Y., Seki, M., Shintaro, F. 1998. Metabolic Responses of Plant Cell Culture to Hydrodynamic Stress. The Canadian Journal of Chemical Engineering. 76, 267-275 Tanaka, H. 1981. Technological problems in cultivation of plant cells at high density. Biotechnology and Bioengineering. 23(6), 1203-1218 Winkel-Shirley, B. 2001. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology 126: 485-493.

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Gracias!!!!