PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

ESTANDARIZACIÓN DEL TIEMPO DE INCUBACIÓN Y CONCENTRACIÓN DE CaCO3, SO4(NH4)2 Y KNO3 PARA LA PRUEBA DEL NMP CON BACTERIAS NITRIFICANTES Y DENITRIFICANTES USANDO COMO MATRIZ COMPOST

NATALIA CAROLINA RODRIGUEZ MORENO CHRISTIAN ALFONSO TORO LOZANO TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al título de

MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

Bogotá, D.C. Noviembre 22 del 2006

NOTA DE ADVERTENCIA "La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia". Artículo 23 de la Resolución No13 de julio de 1946.

ESTANDARIZACIÓN DEL TIEMPO DE INCUBACIÓN Y CONCENTRACIÓN DE CaCO3, SO4(NH4)2 Y KNO3 PARA LA PRUEBA DEL NMP CON BACTERIAS NITRIFICANTES Y DENITRIFICANTES USANDO COMO MATRIZ COMPOST

NATALIA CAROLINA RODRÍGUEZ MORENO CHRISTIAN ALFONSO TORO LOZANO

APROBADO

__________________________ Maria Mercedes Martínez M. Sc.

_________________________ Marcela Mercado Reyes M. Sc.

Directora

Asesora

__________________________

_________________________

Ruth Bonilla Ph. D.

Amanda Lozano M. Sc.

Jurado

Jurado

ESTANDARIZACIÓN DEL TIEMPO DE INCUBACIÓN Y CONCENTRACIÓN DE CaCO3, SO4(NH4)2 Y KNO3 PARA LA PRUEBA DEL NMP CON BACTERIAS NITRIFICANTES Y DENITRIFICANTES USANDO COMO MATRIZ COMPOST

NATALIA CAROLINA RODRIGUEZ MORENO CHRISTIAN ALFONSO TORO LOZANO

__________________________ Ángela Umaña Muñoz M. Phil.

_____________________________ David Gómez M. Sc.

Decana Académica

Director Carrera de Microbiología

Facultad de Ciencias

Agrícola y Veterinaria e Industrial

DEDICATORIA

DEDICADO A NUESTROS PADRES, HERMANOS Y AMIGOS POR QUIENES FUE POSIBLE ALCANZAR ESTE LOGRO TAN IMPORTANTE EN NUESTRAS VIDAS

AGRADECIMIENTOS

•

A la Pontificia Universidad Javeriana por el préstamo de sus instalaciones y equipos para el desarrollo del trabajo.

•

A la Doctora María Mercedes Martínez por la confianza depositada en nosotros en momentos tan difíciles, su paciencia, asesoría y sugerencias.

•

A la Doctora Marcela Mercado por sus valiosos aportes.

•

A nuestros Padres y hermanos por su confianza, paciencia y dedicación.

•

A nuestros amigos y compañeros por su apoyo incondicional.

•

A Ti, por que sin tu apoyo y fortaleza nada habría sido posible.

TABLA DE CONTENIDO Pág. 1. INTRODUCCION

13

2. MARCO TEORICO

14

2.1. Bioinsumos agrícolas

14

2.2. Ciclos biogeoquímicos

16

2.2.1. Nitrógeno

16

2.2.1.1. Nitrificación

18

2.2.1.2. Reducción del nitrato y desnitrificación

21

2.3. Determinación microbiológica de la nitrificación y desnitrificación 23 2.4.Técnica del número más probable 3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION

25 26

3.1.Formulación del problema

26

3.2.Justificación

26

4. OBJETIVOS

27

4.1.Objetivo general

27

4.2.Objetivos Específicos

27

5. MATERIALES Y METODOS

27

5.1. Diseño de la Investigación

27

5.1.2. Población de Estudio y Muestra

28

5.1.3. Recolección de las Muestras

28

5.1.4. Regularidad de la Toma de Muestras

29

5.1.5. Variables de Estudio

29

5.2. Métodos

29

5.2.1. Determinación del pH del compost

29

5.2.2. Estandarización del Tiempo

30

5.2.3. Estandarización de Sales

30

5.2.4. Número Más Probable Bacterias Nitrificantes

31

5.2.5. Número Más Probable Bacterias Denitrificantes

32

Pág. 5.2.6. Análisis de Información 6. RESULTADOS

32 34

6.1. Muestras para estandarización del tiempo de incubación

35

6.2. Muestras para estandarización de sales

36

6.3. Estandarización del tiempo de incubación

39

6.4. Estandarización de Sales

47

6.4.1. Estandarización de la concentración de SO4(NH4)2 y la adición o no de CaCO3 para bacterias nitrificantes

47

6.4.2. Estandarización de la concentración de KNO3 y la adición o no de CaCO3 para bacterias denitrificantes

52

7. CONCLUSIONES

57

8. RECOMENDACIONES

58

9. BIBLIOGRAFÍA

59

ANEXOS

75

LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 1. Niveles del factor de diseño utilizados para estandarizar la concentración de SO4(NH4)2 y KNO3 y la adición o no de CaCO3 Figura 2. Pilas de compostaje muestreadas, Cultivos del Norte

28 35

Figura 3. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias nitrificantes con desviación estándar

39

Figura 4. Registro de las medias del NMP/g de bacterias nitrificantes el día 15 de las muestras recolectadas para la estandarización del tiempo de incubación

40

Figura 5. Prueba positiva (roja) en caldo amonio para bacterias nitrificantes, a los 15 días de incubación

41

Figura 6. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias de denitrificantes con desviación estándar

43

Figura 7. Prueba negativa (roja) en caldo nitrato para bacterias denitrificantes a los 15 días de incubación

45

Figura 8. Prueba positiva (amarilla) producida luego de la incubación durante 15 días en caldo nitrato para bacterias denitrificantes

45

Figura 9. Registro del NMP/g de bacterias denitrificantes de las muestras recolectadas para la estandarización del tiempo de incubación

46

Figura 10. Registro de las medias por tratamiento del NMP/g de bacterias nitrificantes con desviación estándar

49

Figura 11. Registro de las medias por tratamiento del NMP/g de bacterias denitrificantes con desviación estándar

53

LISTA DE TABLAS

Pág.

Tabla 1. Medio amonio (anexo 1) con componentes a diferentes concentraciones

31

Tabla 2. Medio nitrato (anexo 1) con componentes a diferentes concentraciones

31

Tabla 3. Muestras recolectadas para la estandarización del tiempo de incubación

del

NMP

en

bacterias

nitrificantes

y

denitrificantes.

36

Tabla 4. Muestras recolectadas para la estandarización de la concentración de SO4(NH4)2 y KNO3 y adición o no de CaCO3 del NMP en bacterias nitrificantes y denitrificantes

37

Tabla 5. Estadística descriptiva. Media y desviación estándar del NMP de bacterias nitrificantes para estandarización del tiempo

40

Tabla 6. Estadística descriptiva. Media y desviación estándar del NMP de bacterias denitrificantes para estandarización del tiempo

43

Tabla 7. Media, desviación estándar y Test de Shapiro-Wilk aplicado a tratamientos para la estandarización de sales en NMP de bacterias nitrificantes

48

Tabla 8. Media, desviación estándar y Test de Shapiro-Wilk aplicado a tratamientos para la estandarización de sales en NMP de bacterias denitrificantes

53

LISTA DE ANEXOS Pág. Anexo 1. Medios de cultivos y reactivos

75

1.1. Caldo amonio

75

1.2. Caldo nitrato

75

1.3. Reactivo de Nessler

75

1.4. Reactivo de Griess

76

1.5. Solución amortiguadora de pHmetro

76

Anexo 2. Análisis de la información

77

Tabla 9. Media y desviación estándar del NMP/g de compost de bacterias nitrificantes, tomado diariamente para cada una de las muestras.

77

Tabla 10. Media y desviación estándar del NMP/g de compost de bacterias denitrificantes, tomado diariamente para cada una de las muestras.

77

Tabla 11. Test de Shapiro-Wilk aplicado a NMP de bacterias nitrificantes para estandarización del tiempo Tabla 12. Prueba no paramétrica Kruskal-Wallis aplicada para homogeneidad de grupos a NMP de bacterias nitrificantes para estandarización del tiempo Tabla 13. Test de Shapiro-Wilk aplicado a NMP de bacterias denitrificantes para estandarización del tiempo Tabla 14. Prueba no paramétrica Kruskal-Wallis aplicada a homogeneidad de grupos a NMP de bacterias denitrificantes para estandarización

78 78 78 79

del tiempo Tabla 15. Prueba no paramétrica Kruskal-Wallis aplicada para homogeneidad de grupos a NMP de bacterias nitrificantes para

79

estandarización de sales con un α 0.05 Tabla 16. Prueba no paramétrica Kruskal-Wallis aplicada para homogeneidad de grupos a NMP de bacterias denitrificantes para estandarización de sales α 0.05

79

RESUMEN En Colombia no se han realizado estudios para estandarizar metodologías que permitan determinar la concentración de bacterias nitrificantes y denitrificantes en compost. Las bacterias nitrificantes y denitrificantes basan su importancia en el ciclaje del nitrógeno en diferentes ambientes, llevándolo de la forma más oxidada (NO3) a la más reducida (N2). La importancia de estudiar estas bacterias en compost se debe al uso de este bioinsumo en el país, por lo que resulta importante cuantificar la presencia de estas bacterias en el compost para el suelo al que vaya a ser aplicado. La técnica que se utilizó fue la del numero mas probable (NMP), revelando los tubos con reactivo de Griess (nitrito), reactivo de Nessler (amonio), y el polvo de zinc (nitrato). En este trabajo, se estandarizó el tiempo de crecimiento de estas bacterias, dos concentraciones diferentes del sustrato, y la necesidad de agregar o no CaCO3 al medio para obtener un mejor crecimiento, con estas últimas dos variables se aplicaron 4 tratamientos para bacterias nitrificantes y denitrificantes respectivamente, trabajando a concentraciones de 0.5 o 0.33 g de SO4(NH4)2 y 0.5 o 2 g de KNO3. Las tres variables se evaluaron con respecto al mayor crecimiento de biomasa. No se encontró diferencias significativas en la biomasa de los días 14, 15 y 16 para las bacterias nitrificantes, pero el día con mayor reporte fue el 15 con 115.88 NMP/g de compost, mientras que para las bacterias denitrificantes el día 15 y 16 arrojaron el mismo resultado con 31.42 NMP/g de compost. El tratamiento 1 (0.5 g de SO4(NH4)2 con 1 g

de CaCO3 en nitrificantes y 0.5 g de KNO3 con 5 g de CaCO3 en

denitrificantes) obtuvo el mejor crecimiento en bacterias nitrificantes y denitrificantes con 112.67 NMP/g de compost y 27.53 NMP/g de compost respectivamente. Los resultados obtenidos, determinaron que el crecimiento optimo para los dos grupos de bacterias se encuentra el día 15 debido a que es el tiempo que necesitan para desarrollar su maquinaria enzimática y reproducirse, así como la importancia de la cantidad de sustrato, y la adición del CaCO3 para el mantenimiento del pH en el medio, promoviendo las reacciones y evitando la inhibición de las enzimas por este factor.

1. INTRODUCCIÓN El nitrógeno, uno de los macronutrientes de mayor importancia en los procesos biológicos, es para los agricultores uno de los mayores problemas debido al costo de los fertilizantes nitrogenados y a la facilidad con la que el sistema puede perderlos. Los microorganismos en el suelo desarrollan funciones bioquímicas de gran importancia en el ciclaje de nutrientes debido a que muchos de los compuestos orgánicos pueden ser degradados o transformados como ocurre en los procesos de compostaje o degradación de materia orgánica. En general dependiendo del sustrato que utilicen, los microorganismos asociados a la transformación del nitrógeno, incluyen grupos funcionales que realizan procesos de oxidorreducción como bacterias nitrificantes y denitrificantes. La importancia agronómica de las bacterias nitrificantes se basa en la capacidad de oxidar el NH4 a formas más asimilables como NO3 para las plantas. Los grupos bacterianos que intervienen en este proceso son las bacterias oxidantes de amonio como Nitrosomonas sp., y las bacterias oxidantes de nitrito como Nitrobacter sp. Las bacterias denitrificantes evitan las perdidas de nitrógeno por escorrentía y lixiviación, al reducir formas oxidadas del nitrógeno reintegrándolo al ambiente. Algunas bacterias de este grupo incluyen varias especies de Pseudomonas., Alcaligenes y Bacillus. La técnica del numero mas probable (NMP) se utiliza para observar la densidad poblacional de un grupo determinado de microorganismos de forma indirecta. Girard y Rougieux desde 1964 describieron la metodología NMP para realizar recuento de bacterias nitrificantes y denitrificantes empleando suelo como matriz, con 0.5 g de SO4(NH4)2 como sustrato y adicionando CaCO3 como estabilizador de pH. En 1991, Verhagen y Laandbroek, realizaron un recuento de bacterias nitrificantes quimiolitotrófas y heterótrofas utilizando una concentración de 2 g de KNO3 para la

13

misma técnica sin adición de CaCO3. Hashimoto et al., en el 2005 modificaron la técnica del NMP de Tiedje 1982 para enumerar bacterias denitrificantes copiótrofas y oligótrofas de la superficie del suelo en la región de Okinawa en el sur de Japón, usando 0.5 g de SO4(NH4)2. Sin embargo en matrices diferentes a suelo como es el caso de compost, no se han reportado estudios con relación a tiempos de incubación, concentraciones de sustrato y requerimiento de CaCO3. Siendo el nitrógeno necesario para la descomposición de la materia orgánica por parte de los microorganismos y pretendiendo concluir que tan determinante es la concentración del sustrato, la adición de CaCO3 y el tiempo de incubación en el crecimiento de bacterias nitrificantes y denitrificantes recolectadas a partir de una pila de compostaje se estandarizará una técnica que aun no ha sido reportada para dicha matriz, que a su vez sea aplicable como una herramienta confiable y de fácil manejo.

2. MARCO TEÓRICO

2.1.

BIOINSUMOS AGRÍCOLAS

Los bioinsumos son recursos o productos de origen biológico elaborados comercialmente con el fin de ser utilizados en nutrición vegetal principalmente en programas de control, manejo integrado de los cultivos o mejoramiento de las características biológicas del suelo (ICA 2004). Dentro de los bioinsumos se incluyen agentes biológicos para el control de plagas, inoculantes biológicos, bioabonos, inóculos microbiales para compostaje y productos bioquímicos. Es importante destacar que no se consideran bioinsumos los extractos botánicos complejos como rotenona, piretrinas, butóxido de piperonilo; productos obtenidos de algas, tales como: giberelinas y citoquininas, ni productos de fermentación, como antibióticos y betaexotoxina de Bacillus thuringiensis (Gutiérrez et al., 2005).

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El compost es un tipo de bioinsumo en el cual se produce una transformación de los materiales orgánicos, de tal suerte que ya no es posible reconocer a las partes que le dieron origen. Este producto rico en nutrimentos (carbono, nitrógeno, fósforo, azufre, etc.) y flora microbiana ayuda a mejorar la estructura del suelo haciéndolo mas esponjoso y permitiendo aumentar la densidad poblacional de los organismos habitantes en el suelo (Labrador 1996). Un factor que afecta el proceso de compostaje es la temperatura, la cual depende de la flora microbiana y puede disminuir si hay falta de oxigeno y humedad (Cegarra 1994). El compost alcanza su máxima eficiencia con una humedad entre 50 y 60% debido a que por debajo del 40% la descomposición es aeróbica y por ende mas lenta, mientras que por encima del 60% la cantidad de poros libres de agua es muy pequeña con dificultad para la difusión de oxigeno, con lo cual se obtiene como resultado la anaerobiosis (Pla 1994). La concentración de oxigeno necesaria para que no se limite el proceso esta entre el 5 y el 10% en los macroporos, pero si la concentración de oxigeno es alta en los macroporos es posible que se presente anaerobiosis en los microporos (Cegarra 1994). La relación C:N ideal para un compostaje rápido es 25:35, debido a que relaciones menores pueden causar la volatilización del amonio y relaciones mayores resultan en compostaje mas lento. Durante el compostaje el nitrógeno total disminuye relativamente rápido al comienzo y luego se re distribuye entre fracciones sin perdidas significativas (Paré et al., 1998). Los compuestos nitrogenados presentes en residuos orgánicos son elevadamente heterogéneos y los materiales proteínicos son algunos de los primeros en ser usados por los microorganismos. Otras formas más complejas de nitrógeno sufren cambios a fin de proveer a la planta de formas asimilables de nitrógeno, debido a que no son inmediatamente amonificables (Dalzell et al., 1987). El compostaje genera amonio y nitrato, y compuestos aminos que son rápidamente asimilados por la planta antes o después de la hidrólisis por las enzimas del suelo. Todos estos compuestos están asociados con las perdidas de nitrógeno (Smith et al., 1989).

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El valor optimo de pH esta entre seis y siete cinco, debido a que los valores extremos inhiben la actividad microbiana durante el proceso de degradación. Al disminuir el tamaño de las partículas aumenta la superficie para el ataque microbiano, por esta razón el exceso de partículas mas pequeñas puede conducir a la compactación y formación de gran cantidad de microporos, favoreciendo el desarrollo de condiciones anaeróbicas (Labrador 1996, Mejía et al, 2005 y Osorio 2005).

2.2.

CICLOS BIOGEOQUIMICOS

Los ciclos biogeoquímicos describen el movimiento de materia a través de reacciones en toda la biosfera de manera cíclica. Los principales elementos de la biomasa que son ciclados por los microorganismos son carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y oxigeno. Las actividades humanas, como la liberación de desechos, uso de agroinsumos, deforestación, pueden tener una gran influencia en las tasas de actividad cíclicas de los microorganismos, ocasionando cambios significativos en las características bioquímicas de un hábitat determinado (Gómez 2004).

2.2.1.

NITROGENO

El nitrógeno es uno de los elementos mas ampliamente distribuidos en la naturaleza. En la atmósfera se halla en forma de dinitrógeno N2, donde representa alrededor del 78%, lo que equivale a 2.8 x 1014 Tm de nitrógeno. El N en la atmósfera se encuentra presente un 25%, mientras que en la litosfera se encuentra estable en rocas primarias y sedimentarias, de modo que únicamente un 0.03% se encuentra en el suelo y que de este suelo una proporción muy pequeña esta en forma asimilable por los seres vivos (Guerrero 1990; Atlas y Bartha 2002). El nitrógeno es un elemento muy importante para las plantas debido a que es un constituyente de los tejidos vegetales, formando parte de numerosas biomoléculas, como los son las proteínas, ácidos nucleicos, porfirinas y alcaloides (Ingham et al.

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1978). Al fijarse nitrógeno (reducción del N2 atmosférico), las plantas pueden obtener nitrógeno por absorción del suelo en forma de NO3 y NH4, estableciendo asociaciones simbióticas con diversas bacterias, no obstante este debe ser modificado antes de que pueda ser utilizado por la mayoría de los sistemas vivos. Dicho elemento sufre una serie de transformaciones en las cuales participan compuestos orgánicos e inorgánicos (Aparicio y Arrese 1996). No es posible que una planta asimile nitrógeno orgánico directamente, necesita determinadas condiciones de humedad, temperatura y la actividad de la enzima ureasa para transformarlo rápidamente en nitrógeno amoniacal, el cual es soluble en agua y es retenido por absorción del suelo (Aparicio y Arrese 1996, Mayea 1982).

El ciclo inicia con la materia orgánica muerta estructurada de compuestos orgánicos complejos ricos en nitrógeno de modo que hongos y bacterias presentes en los suelos lo transforman a partir de aminoácidos y proteínas, y se deshacen del nitrógeno restante en forma de iones amonio, proceso denominado amonificación (Atlas y Bartha 2002). En los suelos habitan bacterias capaces de oxidar iones amonio al transformarlos en iones de nitrato produciendo energía en el proceso denominado nitrificación (Prosser 1989). La aminación consiste en que estos iones de nitrato penetran en las células de las plantas, donde son nuevamente reducidos a iones amonio y transformados en componentes que contienen carbono para producir aminoácidos y otros componentes orgánicos ricos en nitrógeno. Los aminoácidos y componentes orgánicos retornan al suelo al morir las plantas, o a través de los excrementos de los animales que las ingieren. De este modo se vuelve a dar comienzo el proceso denominado amonificación (Madigan et al., 2000; Atlas y Bartha 2002). El ciclo del nitrógeno comprende varias etapas en las que participan diversos organismos edáficos. Fijación de nitrógeno, mineralización o amonificación, inmovilización, nitrificación y desnitrificación (Atlas y Bartha 2002).

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2.2.1.1. NITRIFICACIÓN En medios alcalinos se puede liberar nitrógeno a la atmósfera en forma de amoníaco gaseoso, y otra gran parte del amoníaco sufre el proceso denominado nitrificación, en el cual los iones de amonio se oxidan a iones nitritos y estos son transformados a iones nitrato. Este proceso parece estar limitado en su mayor parte a un número restringido a microorganismos aerobios quimiolitoautótrofos (Focht y Verstraete 1977; Hooper 1990; Owen y Jones, 2001). La formación de nitrito y de nitrato la realizan poblaciones de bacterias distintas, sin embargo, los dos están muy relacionados de modo que no habría una acumulación de nitrito (De Boer and Kowalchuck 2001). La oxidación del amonio a nitrito y luego a nitrato son procesos exotérmicos. Debido a que las bacterias nitrificantes son quimiolitotrofas utilizan la energía derivada de la nitrificación para asimilar el CO2 en el paso del amonio a nitrito en donde el oxigeno molecular se incorpora a la molécula de amonio. Las bacterias que usan estos compuestos como dadores de electrones utilizan un complejo de citocromos para bombear al espacio periplásmico protones que usarán luego en la síntesis de ATP. A partir del CO2 se generarán compuestos orgánicos utilizando la energía acumulada en el ATP. Hay un primer grupo de bacterias que oxidan el amoníaco a nitrito en una reacción catalizada por la enzima amoníaco monooxigenasa (Ecuación 1), posteriormente la hidroxilamina oxidorreductasa oxida la hidroxilamina a nitrito (Ecuación 2), por ultimo un grupo de bacterias se encarga de oxidar los nitritos a nitratos usando la nitrito oxidorreductasa (Ecuación 3) (Harrison 2003; Maier 2000). NH3 + O2 + 2H+ + 2e- → NH2OH + H2O (1) NH2OH + H2O → NO2- + 5H+ (2) NO2- + H2O → NO3- + 2H+ (3)

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La cantidad de energía que obtienen estas bacterias a partir de estos procesos es bastante baja, de ahí que sean especies con crecimiento lento. (Koops and Pommerening 2001; Atlas y Bartha 2002; Myrold 2002). El paso de nitrito a nitrato depende también del oxigeno el cual se obtiene de una molécula de agua; pero el oxigeno molecular solo sirve como aceptor de electrones. La oxidación del nitrito es un proceso de un paso que produce una pequeña cantidad de energía (Atlas y Bartha 2002). Las bacterias nitrificantes se encuentran en la mayoría de los suelos y aguas con pH de 4.5 a 8.0, teniendo un óptimo desempeño entre 6.6 y 7.8; estas no son activas a un pH menor de 4.5 (Maier 2000). Las especies nitrificantes son bacterias de los géneros Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus, Nitrosolobus y Nitrosovibrio que están especializadas para convertir amonio a nitrito, y además de Nitrobacter miembros de los géneros Nitrospira, Nitrospina y Nitrococcus están especializadas para convertir nitrito a nitrato (Head et al., 1993; Bock et al. 1990). La acumulación de nitrito inhibe la acción de Nitrosomonas, así que dependen de Nitrobacter para que lo conviertan en nitrato. A su vez, Nitrobacter depende de Nitrosomonas para generar nitrito (Utåker y Nes 1998). Es posible que cualquier tipo de estrés ambiental afecte gravemente el proceso de nitrificación debido a que son relativamente pocos los géneros bacterianos los que intervienen en él (Bollag y Kurek 1980; Bremner y McCarty 1993; Teske et al., 1993; De Boer y Kowalchuck 2001). Las bacterias nitrificantes son comunes en un suelo oxigenado y con agua adecuada, de manera que generan importantes consecuencias ambientales, la mayoría del amonio que capturan es convertido a nitrato. Casi la totalidad de plantas y microorganismos pueden tomar tanto amonio como nitrato. Sin embargo, el nitrato con carga negativa no es retenido por el suelo como se retiene el amonio por su carga positiva ya que las arcillas y coloides están cargados negativamente, por esta razón el nitrato puede ser fácilmente lixiviado o lavado. Es así como se puede perder nitrógeno de los suelos (Utåker y Nes 1998).

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La disponibilidad de nitrógeno usualmente limita la productividad de las plantas en ecosistemas terrestres. Los factores que controlan la mineralización y la nitrificación han sido estudiados porque estos procesos determinan la disponibilidad de nitrógeno para plantas y la captación microbial (Montagninp et al., 1989). El resultado de la nitrificación es la formación de iones de nitrato que pueden lixiviarse, readucirse o perderse en formas gaseosas. Los factores que afectan principalmente la nitrificación son la temperatura, humedad, pH, y substratos como NH4-N, 02 y CO2 (Stevenson 1986). Evidencia de que la nitrificación se inhibe por la descomposición de los productos de residuos orgánicos en los suelos, o por excreción de metabolitos por parte de plantas o microorganismos aun no se han podido establecer (Montagninp et al., 1989). En suelos ácidos no hay fosfato ni calcio disponible, los cuales son esenciales para las bacterias nitrificantes (Bundy y Bremner 1973; De Boer y Kowalchuck 2001). El suelo inicialmente esta cargado positivamente pero al llevarse a cabo el proceso de nitrificación, se realiza una transformación de iones amonio a nitrito y nitrato y se provoca un cambio en la carga de la molécula de modo que esta pasa a ser negativa (Atlas y Bartha 2002). Durante dicho proceso las bacterias nitrificantes se especializan en obtener energía de la oxidación del amonio y la utilización del CO2 como fuente de carbono para la síntesis de compuestos orgánicos. El proceso de nitrificación debe verse como un proceso de movilización del nitrógeno entre diferentes hábitat del suelo. En el suelo el amonio es oxidado por acción de las bacterias nitrificantes de modo que las plantas pueden asimilarlo en forma de compuestos orgánicos (Atlas y Bartha 2002), no obstante, la captación de nitrato y nitrito puede provocar una perdida por lixiviación debido a que dichos iones son fácilmente lavados y dirigidos generalmente a aguas subterráneas (Maier 2000), perdiendo así, suelo que podría ser utilizado por las plantas para producir biomasa (Atlas y Bartha 2002).

20

2.2.1.2.REDUCCION DEL NITRATO Y DENITRIFICACION Una gran cantidad de organismos pueden usar el nitrato producido por el proceso anteriormente descrito como fuente de nitrógeno. Muchas bacterias pueden usarlo también como aceptor de electrones en la respiración anaerobia de la materia orgánica, en un proceso de reducción del nitrógeno que finaliza con la liberación a la atmósfera de N2 o, menos comúnmente, de NO o N2O, proceso conocido como desnitrificación (Gottschalk 1986, Robertson 1989). La actividad desnitrificante es controlada por varias condiciones ambientales, como la humedad del suelo, concentración de oxígeno, concentración de NO3-, contenido de carbono, pH y temperatura (Tiedje, 1988; Vermoesen et al., 1993; Nelson y Terry, 1996 Del inicio de estas reacciones se encarga la nitrato reductasa (reacción 1, ecuación 4), una enzima de membrana que incluye molibdeno en su estructura y que se ve inhibida en presencia de O2 (Atlas y Bartha 2002; Priemé et al., 2002). Luego el nitrito es sometido a un proceso de reducción por la nitrito reductasa (reacción 2, ecuación 4), donde el producto inicial es óxido nítrico seguido por el óxido nitroso con la participación de la óxido nítrico reductasa (reacción 3, ecuación 4) y finalmente nitrógeno gaseoso con la óxido nitroso reductasa (reacción 4, ecuación 4) (Maier 2000; Atlas y Bartha 2002). Los sistemas enzimáticos asimiladores de nitrato se inactivan en presencia de amonio o de metabolitos orgánicos nitrogenados reducidos (Atlas y Bartha 2002). Si el amonio esta presente en el ambiente en exceso, la reducción asimilatoria del nitrógeno se podría llegar a interrumpir (Maier 2000; Atlas y Bartha 2002). Las nitrato reductasas asimilatorias (Nas) dependientes de ferredoxina o flavodoxina las poseen las Cianobacterias, Azotobacter sp., respectivamente y las Nas dependientes de NADH son Klebsiella oxytoca, Bacillus subtilis, Rhodobacter capsulatus (Atlas y Bartha 2002; Myrold 2002; Priemé et al., 2002).

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Otras bacterias autótrofas usan el mismo nitrato como fuente de energía, usando la acumulada en los enlaces N-O, pero sin aprovechar el oxígeno que se libera (Ecuación 5). Y así, con el retorno al nitrógeno gas, se cierra el ciclo del nitrógeno. Las verdaderas bacterias denitrificantes realizan todo este proceso. Sin embargo muchas bacterias anaerobias facultativas, enterobacterias principalmente poseen únicamente la nitrato reductasa y sólo son capaces de realizar la reacción (Ecuación 6). 1

2

3

4

NO3 - → NO2 - → NO → N2O → N2 (4) 2NO3- + 5H2 → N2 + 4 H2O + 2OH- (5) NO3- + 2H+ → NO2- + H2O (6)

A partir de aquí usan el nitrito como aceptor de electrones, y así al reducirse y eliminar H2 del medio citoplasmático favorece una reacción fermentativa propia de estas bacterias que transforma acetilfosfato en acetato (o butirilfosfato en butirato), captando el fosfato inorgánico que libera una molécula de ADP para transformarse en ATP (Ye et al., 1994; Vitousek et al., 1997; Myrold 2002). Los microorganismos pueden utilizar el nitrato como aceptor final de electrones durante la respiración anaeróbica y actuar en la oxidación de compuestos orgánicos (Maier 2000). Este proceso se conoce como respiración de nitrato o reducción desasimilatoria de nitrato. Hay dos vías separadas para este procedimiento, uno, es la reducción desasimilatoria de nitrato a amonio donde este es el producto final y otro es la desnitrificación donde una mezcla de gases se producen, incluyendo la formación del N2 y N2O (Maier 2000; Atlas y Bartha 2002). Algunas bacterias anaerobias facultativas como Alkaligenes sp, Escerichia sp., Nocardia sp. y Vibrio sp. reducen el nitrato a nitrito en condiciones anóxicas, en donde dicho proceso permite el uso de compuestos orgánicos con una reducción mayor de energía que la que se obtiene de la fermentación (Atlas y Bartha 2002). A partir del nitrato se produce nitrito que bajo la

22

acción de la hidroxilamina puede producir amonio y muy posiblemente nitrógeno orgánico (Atlas y Bartha 2002; Priemé et al., 2002).

La desnitrificación es un proceso biológico en el cual el nitrato es reducido a nitrógeno gaseoso (Zumft 1997), y esto juega un papel importante en el ambiente global teniendo como rol la reacción inversa a la fijación del nitrógeno (Takaya y Shoun 2000). Por mucho tiempo se pensó que la desnitrificación era una característica exclusiva de los procariotes pero varios hongos filamentosos han sido encontrados exponiendo dicha actividad (Shoun et al. 1992). El sistema de hongos denitrificantes no puede reducir el oxido nitroso (N2O) a nitrógeno gaseoso (N2), y de esta manera N2O queda como producto final (Shoun y Tanimoto 1991). Esto ha sido observado debido a que las enzimas involucradas están localizadas en la mitocondria respaldando la síntesis de ATP (Kobayashi et al. 1996), actuando como sistemas de respiración anaeróbica similar a lo ocurrido en bacterianos (Heiss et al. 1989; Myrold 2002).

La ruta manejada por los reductores de nitrato desnitrificadotes como Paracoccus denitrificans, Thiobacillus denitrificans y diversas Pseudomonadaseas, para convertir de nitrato a nitrógeno atmosférico es activada en carencia de oxigeno (Hutchinson 1970; Zumft 1997), principalmente se habla de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Mycobacterium,

Thermus

thermophilus,

Ralstonia

eutropha,

Paracoccus

denitrificans, Bradyrhizobium japonicum (Tiedje 1994; Nielssen et al. 1996).

2.3.

DETERMINACIÓN MICROBIOLOGICA DE LA NITRIFICACION Y DENITRIFICACIÓN

El nitrógeno disponible es equivalente al nitrógeno mineralizado, que está compuesto por el nitrato y el nitrito soluble, junto con el nitrógeno amónico capaz de intercambiarse y el soluble. Usualmente para el estudio de las diferentes formas de

23

nitrógeno se han utilizado metodologías a nivel químico las cuales exponen datos acerca de los elementos que mas tarde serán definitivos en el éxito de los procesos, entre ellos está la determinación de los nitratos mediante el electrodo selectivo para el ión, la determinación del N amónico extraíble, e innumerables técnicas mas que dependen de la forma de nitrógeno a estudiar, con las cuales es posible determinar la cantidad de nitrógeno disponible en el suelo. Las diferentes concentraciones de nitrógeno fluctúan a lo largo de periodos cortos de tiempo y dependen mucho de la actividad microbiana; como el gas amónico que puede escapar de la muestra por volatilización (Faithfull, 2005). De este modo haciendo un análisis microbiológico con el cual no se tiene en cuenta la cantidad de nitrógeno sino la población microbiana y su actividad que lo hace capaz de ciclar de modo que pueda llevar al nitrógeno a sus formas más oxidadas o a sus formas más reducidas las cuales serán utilizadas por las plantas o retornadas a la atmósfera. Uno de los métodos más utilizados para el estudio de la nitrificación son las curvas de absorbancia las cuales están basadas en técnicas de colorimetría dependiendo de la forma del nitrógeno objeto de estudio, en donde luego de la incubación de la muestra según el protocolo a seguir, arrojará resultados del porcentaje de nitrógeno existente, los cuales serán empleados para determinar la actividad microbiana utilizando cálculos matemáticos (Cataldo et al., 1975). En otra metodología para observación de la actividad nitrificante y/o denitrificante se utilizan tubos inoculados con suelo y con las formas de nitrógeno a estudiar, estos son incubados y por medio de reactivos se verifican los procesos (Loynachan, 1985). Para observar el proceso de desnitrificación se emplea la cromatografía, en la cual se analiza el N2O usando un electrón de nitrógeno marcado el cual funciona como detector, los valores arrojados se llevan a una tabla de factores de corrección con el fin de cuantificar la reducción (Payne 1991). Para la cuantificación de la población se utiliza la técnica de recuento en placa, la cual se fundamenta en la estimación del número de células presentes en la muestra sembrada, por medio de diluciones (Girard, y Rougieux, 1964; Mayea et al. 1982; Tiedje 1994). La siguiente técnica es el número más probable, la cual es una

24

metodología eficiente de estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabililística (Cochran 1950; Rowe et al. 1977; Hashimoto et al. 2005).

2.4. TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE La técnica del numero mas probable (NMP), es un método eficiente de estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible, esta técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia (positivo o negativo) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la población(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabililística (Blodgett 2006). Algunas de las ventajas del NMP son: la capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados, determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente, y suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en cajas de petri, entre otros (Blodgett 2006).

25

3.

3.2.

FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION

Formulación del problema ¿Es determinante la concentración de SO4(NH4)2 o KNO3, la adición o no de CaCO3 y el tiempo de incubación en el crecimiento de bacterias nitrificantes y denitrificantes en compost?

3.3.

Justificación Para favorecer la concentración de nitrógeno disponible en el suelo y mejorar el ciclaje de nutrientes en general se han propuesto técnicas como la rotación de cultivos, uso de labranza conservadora, el manejo integrado de plagas y la aplicación de materia orgánica, rutinas que mantengan un mejor equilibrio en la microbiota del suelo. El compost como bioinsumo con capacidad mejoradora de la estructura del suelo, aporta a este, nutrientes y flora microbiana, puede llegar a utilizarse, como se hace en diferentes agroecosistemas, para optimizar y aliviar los desfavorables resultados de las prácticas regulares, pero debido al desconocimiento de la flora presente, el control de calidad se realiza únicamente desde el punto de vista químico (% N total generalmente). Por lo anterior este proyecto de tesis tuvo como finalidad estandarizar el tiempo de incubación, necesidad de CaCO3, y concentración de SO4(NH4)2 y KNO3 para la prueba del NMP con bacterias nitrificantes y denitrificantes respectivamente usando como matriz compost, para tener una técnica en una matriz diferente al suelo que permita mejorar el control de calidad de bioinsumos agrícolas.

26

4.

4.2.

OBJETIVOS

Objetivo general Estandarizar el tiempo de incubación y concentración de CaCO3, SO4(NH4)2 y KNO3 para la prueba del NMP con bacterias nitrificantes y denitrificantes usando como matriz compost.

4.3.

Objetivos Específicos 4.3.1. Establecer diferencia entre los valores de NMP para bacterias nitrificantes y denitrificantes provenientes del proceso de compostaje determinando el día de mayor abundancia. 4.3.2. Determinar la importancia de la adición de CaCO3 sobre la recuperación de biomasa y actividad de bacterias nitrificantes y denitrificantes provenientes del proceso de compostaje. 4.3.3. Evaluar dos concentraciones de SO4(NH4)2 y KNO3 necesarias para estandarizar cual favorece el mayor recuento de bacterias nitrificantes y denitrificantes respectivamente por la técnica del NMP en compost.

5. MATERIALES Y METODOS

5.1.Diseño de la Investigación La investigación realizada fue de tipo experimental teniendo como factores de diseño: requerimiento de CaCO3, concentración de SO4(NH4)2 y KNO3, y tiempo de incubación. Los niveles del factor de diseño concentración de sales y requerimiento de CaCO3 en los medios de cultivo para bacterias nitrificantes y denitrificantes se presentan en la figura 1.

27

TRATAMIENTOS

Con CaCO3

Medio Amonio

1 0.5 g SO4 (NH4)2

3 0.33 g SO4(NH4)2

Sin CaCO3

Medio Nitrato

1 0.5 KNO3

Medio Amonio

3 2 g KNO3

2 0.5 g SO4(NH4)2

4 0.33 g SO4(NH4)2

Medio Nitrato

2 0.5 KNO3

4 2 g KNO3

Figura 1. Niveles del factor de diseño utilizados para estandarizar la concentración de SO4(NH4)2 y KNO3 y la adición o no de CaCO3

5.1.1. Población de Estudio y Muestra El área de estudio está en las pilas de compostaje del cultivo de flores (Cultivos del Norte) con siembras de rosas, crisantemo y pompón, ubicado en el municipio de Tocancipá departamento de Cundinamarca a 2.600 msnm con temperatura promedio de 14 ºC (IGAC 1996).

5.1.2. Recolección de las Muestras De la pila de compost de 18x1.5x1 m3 proveniente de residuos de flores con 13 semanas de maduración se colectaron 10 submuestras con el fin de obtener una muestra compuesta, este procedimiento de repitió cinco veces utilizando tubos PVC 70 cm y 3” de diámetro. Al iniciar cada muestreo la temperatura de la pila fue registrada y se procedió a tomar las muestras en bolsas ziploc las cuales fueron almacenadas en nevera a 4ºC hasta el momento del procesamiento (24 horas). Luego

28

de tener todas las muestras, se rotularon (nombre del propietario, nombre de la finca, ubicación geográfica, número de muestra y lote, superficie que representa, condiciones climáticas) (Landon 1984).

5.1.3. Regularidad de la Toma de Muestras Para la estandarización del tiempo de incubación se recolectaron 11 muestras durante 22 días de modo que se obtuvo una muestra preliminar y 10 muestras prueba. Para la estandarización de la concentración de sales la recolección de cinco muestras se hizo durante un periodo de 15 días.

5.1.4. Variables de Estudio La variable dependiente fue la concentración de bacterias por el NMP/g de muestra medido en variables independientes de concentración de SO4(NH4)2 y KNO3, requerimiento de CaCO3, y tiempo de incubación de las muestras.

5.2. METODOS Para el análisis de las muestras, a partir de la muestra compuesta se tomaron 10 g aproximadamente y cada uno de los procesos descritos se realizaron con tres réplicas, excepto la determinación del pH.

5.2.1. Determinación del pH del compost. Se determinó el pH utilizando un potenciómetro digital. Se realizó una solución acuosa pesando 10 g de compost con 25 ml de agua desmineralizada. Luego esta mezcla fue agitada por 5 min, y se dejada en reposo 30 min. Nuevamente fue agitada por 2 min, e instantáneamente colocado el electrodo previamente calibrado con la

29

solución amortiguadora (anexo 1). Luego se esperó hasta que arrojó un valor exacto del pH, y este fue el valor correspondiente al pH del compost (Benavides 2004).

5.2.2. Estandarización del Tiempo Para estandarizar el tiempo de incubación de la técnica se tomó como base la información obtenida de la aplicación de la técnica en matriz suelo (tablas 1 y 2). En esta modificación se utilizó únicamente el tratamiento 1 (figura 3) para los dos grupos debido a que en el único estudio que se ha aplicado NMP para bacterias nitrificantes y denitrificantes según Kowalchuk et al., (1999) fue en compost procedente de desechos animales en donde utilizaron las concentraciones usadas por Verhagen y Laanbroek (1991). Cada muestra compuesta fue sembrada en caldo nitrato (anexo 1) por triplicado y en caldo amonio (anexo 1) por triplicado y la lectura se realizó a los 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18 días, con el fin de estandarizar el tiempo de incubación. Con el análisis estadístico de los resultados obtenidos se seleccionó el día de mayor producción de biomasa para todas las muestras.

5.2.3. Estandarización de Sales Para matriz compost, la modificación con respecto a la técnica propuesta por Girard y Rougieux 1964, Verhagen y Laandbroek 1991 y Hashimoto et al., 2005, se centró en la evaluación de dos concentraciones de SO4(NH4)2 o KNO3, y en la adición o no de CaCO3 sobre la recuperación de la microbiota nitrificante y denitrificante. Se probaron dos medios, amonio y nitrato (anexo 1), con diferentes concentraciones de los mencionados componentes (figura 1) (tablas 1 y 2).

30

Tabla 1. Medio amonio (anexo 1) con componentes a diferentes concentraciones

Concentración de CaCO3

Concentración de SO4(NH4)2

1 g (Verhagen y Laandbroek 1991) 0.5 g (Verhagen y Laandbroek 1991) 0 g (Girard y Rougieux 1964)

0.5 g (Verhagen y Laandbroek 1991)

1 g (Verhagen y Laandbroek 1991)

0.33 g (Girard y Rougieux 1964)

0 g (Girard y Rougieux 1964)

0.33 g (Girard y Rougieux 1964)

Tabla 2. Medio nitrato (anexo 1) con componentes a diferentes concentraciones

Concentración de CaCO3

Concentración de KNO3

5 g (Verhagen y Laandbroek 1991)

0.5 g (Hashimoto et al., 2005)

0 g (Girard y Rougieux 1964)

0.5 g (Hashimoto et al., 2005)

5 g (Verhagen y Laandbroek 1991)

2 g (Girard y Rougieux 1964)

0 g (Girard y Rougieux 1964)

2 g (Girard y Rougieux 1964)

Luego de la estandarización del tiempo se recolectaron cinco muestras nuevas que fueron sembradas en los 4 tratamientos (tabla 1 y 2) y fueron leídos el día de incubación que se determinó previamente.

5.2.4. Número Más Probable Bacterias Nitrificantes Se realizaron diluciones seriadas de la muestra hasta 10-3. Luego se sembró 1 ml en 5 tubos con caldo amonio (anexo 1) para cada una de las diluciones y cada uno de estos fueron incubados a 28 oC en durante dos semanas. Se procedió a calcular el valor de NMP a partir de la determinación del número de tubos positivos, en cada dilución para bacterias oxidantes de amonio. Se adicionaron 2 gotas del reactivo Griess (ver anexo 1) con el fin de realizar la detección de nitritos. Los tubos positivos tomaron coloración roja después de 5 minutos. Los datos fueron anotados según el número de tubos positivos y negativos por dilución. A los tubos negativos se les adicionó polvo de zinc para detectar la presencia de nitrato en el medio, los tubos positivos tomaron

31

coloración rojiza naranja, los que no cambiaron fueron tubos negativos a los cuales se les adicionó reactivo de Nessler (anexo 1), y así se confirmó la presencia de amonio, indicativo de que no existió proceso de nitrificación. Luego se realizó el recuento por medio de las tablas de Cochran (Cochran 1950), con el ajuste dependiendo de las diluciones tomadas para leer (Girard y Rougieux 1964; Schmidt y Belser 1982; Loynachan 1985; Verhagen y Laandbroek 1991; Deni y Penninckx 1999).

5.2.5. Número Más Probable Bacterias Denitrificantes Se realizaron diluciones seriadas de la muestra hasta 10-3. Luego se sembró 1 ml en 5 tubos con caldo nitrato (anexo 1) para cada una de las diluciones y cada uno de estos fue incubado a 28 oC en campanas de anaerobiosis durante dos semanas. Se procedió a calcular el valor de NMP a partir de la determinación del número de tubos positivos, en cada dilución para bacterias reductoras de nitrato. Se adicionaron 2 gotas del reactivo Griess (anexo 1) con el fin de realizar la detección de nitritos. Los tubos positivos tomaron coloración roja después de 5 minutos. Los datos fueron anotados según el número de tubos positivos y negativos por dilución. A los tubos negativos se les adicionó 2 gotas del reactivo de Nessler (anexo 1) para detectar la presencia de amonio en el medio, los tubos positivos tornaron coloración amarilla, los que no viraron fueron tubos negativos y se les adicionó polvo de zinc, confirmando así la presencia de nitratos lo que significó que no hubo desnitrificación. Luego se realizará el recuento por medio de las tablas de Cochran (Cochran 1950), y haciendo el ajuste dependiendo de las diluciones tomadas para leer (Girard y Rougieux 1964; Hashimoto et al. 2005).

5.2.6. Análisis de Información Para definir el tiempo adecuado de incubación se calcularon las medias del resultado de NMP arrojado por las muestras colectadas para dicho fin. Las medias fueron sometidas a la prueba de Shapiro Wilk y al no distribuirse normalmente se les aplicó

32

la prueba de Kruskal-wallis con un α de 0.05 (Sokal y Rohlf 2000). Las hipótesis planteadas fueron las siguientes: H0: las medias de la biomasa en los días 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18 de incubación son iguales Hi : al menos una de las medias es diferente µ1= Biomasa el día 12 µ2= Biomasa el día 13 µ3= Biomasa el día 14

H0 = µ1 = µ2 = µ3 = µ4 = µ5 = µ6 = µ7

µ4= Biomasa el día 15

Hi = µ1 ≠ µ2 = µ3 = µ4 = µ5 = µ6 = µ7

µ5= Biomasa el día 16 µ6= Biomasa el día 17 µ7= Biomasa el día 18 Para determinar si la concentración de SO4(NH4)2 con y sin CaCO3 ejerce diferencia sobre la biomasa de bacterias nitrificantes y denitrificantes, se calcularon las medias del resultado de NMP arrojado por las muestras colectadas para dicho fin. Las medias fueron sometidas a la prueba de Shapiro Wilk y al no distribuirse normalmente se les aplicó la prueba de Kruskal-wallis con un α de 0.05 (Sokal y Rohlf 2000). Las hipótesis planteadas fueron las siguientes: µ1 = Biomasa con 0.33 g de SO4(NH4)2 con CaCO3 µ2 = Biomasa con 0.5 g de SO4(NH4)2 con CaCO3 µ3 = Biomasa con 0.33 g de SO4(NH4)2 sin CaCO3 µ4 = Biomasa con 0.5 g de SO4(NH4)2 sin CaCO3 H0 = µ1 = µ2 = µ3 = µ4 Hi = µ1 ≠ µ2 = µ3 = µ4

33

Para determinar si la concentración de KNO3 con y sin CaCO3 apropiada para la biomasa de bacterias nitrificantes y denitrificantes, se calcularon las medias del resultado de NMP arrojado por las muestras colectadas para dicho fin. Las medias fueron sometidas a la prueba de Shapiro Wilk y al no distribuirse normalmente se les aplicó la prueba de Kruskal-wallis con un α de 0.05 (Sokal y Rohlf 2000). Las hipótesis planteadas fueron las siguientes: µ1 = Biomasa con 2 g de KNO3 con CaCO3 µ2 = Biomasa con 0.5 g de KNO3 con CaCO3

H0 = µ1 = µ2 = µ3 = µ4

µ3 = Biomasa con 2 g de KNO3 sin CaCO3

Hi = µ1 = µ2 ≠ µ3 = µ4

µ4 = Biomasa con 0.5 g de KNO3 sin CaCO3 Cabe resaltar que las desviaciones estándares que se encontraron el los resultados fueron proporcionales a la estadística aplicada para la determinación de biomasa de la tabla del número más probable.

6.

RESULTADOS

Las muestras de compost provienen del cultivo de flores Cultivos del Norte maduradas por 13 semanas, a partir de residuos de pompón, papel, un inoculante microbiano y leche. La adición de estos últimos compuestos se hace de acuerdo a la resolución número 00074 de 2002 del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural en donde se especifica que es posible utilizar las preparaciones apropiadas a base de vegetales o de microorganismos no patógenos y están permitidas las sustancias de origen animal como leche y productos lácteos, respectivamente, para activar el compost. Teniendo en cuenta la adición de residuos de pompón es posible denominar este insumo agrícola también como abono foliar de origen natural y preparados vegetales, el cual tiene como condición de uso la exclusión de sustancias y/o material vegetal de especies de uso restringido (Min. Agrícola 2002).

34

Figura 2. Pilas de compostaje muestreadas, Cultivos del Norte

6.1. Muestras para estandarización del tiempo de incubación Las muestras de compost de flores recolectadas en Cultivos del Norte, para la prueba de estandarización del tiempo de incubación del NMP en bacterias nitrificantes y denitrificantes presentaron un promedio de temperatura de 21ºC con un rango mínimo de 19ºC y máximo de 24ºC y pH entre 7.89 y 8.54 (tabla 3).

35

Tabla 3. Muestras recolectadas para la estandarización del tiempo de incubación del NMP en bacterias nitrificantes y denitrificantes.

1

Fecha montaje de pila de Compost 06/03/06

2

20/03/06

30/06/06

22

8.53

3

20/03/06

30/06/06

22

8.3

4

20/03/06

30/06/06

22

8.54

5

27/03/06

04/07/06

19

8.5

6

27/03/06

05/07/06

19

7.89

7

27/03/06

07/07/06

19

7.89

8

27/03/06

07/07/06

19

8.06

9

10/04/06

18/07/06

21

7.89

10

10/04/06

18/07/06

21

8.14

11

17/04/06

27/07/06

24

8.2

Muestra

Fecha recolección

Temperatura (ºC)

pH

10/06/06

19

8.07

6.2. Muestras para estandarización de Sales Las muestras de compost de flores recolectadas en Cultivos del Norte, para la prueba de estandarización de la concentración de SO4(NH4)2 y KNO3 y adición o no de CaCO3 del NMP en bacterias nitrificantes y denitrificantes presentaron un promedio de temperatura de 21 ºC, con un rango mínimo de 19 ºC y máximo de 24 ºC y pH entre 8.08 y 8.24 (tabla 4).

36

Tabla 4. Muestras recolectadas para la estandarización de la concentración de SO4(NH4)2 y KNO3 y adición o no de CaCO3 del NMP en bacterias nitrificantes y denitrificantes

Tº

pH

12/06/06

Fecha de Recolección 11/09/06

19

8.11

2

19/06/06

18/09/06

23

8.24

3

19/06/06

18/09/06

23

8.17

4

26/06/06

20/09/06

20

8.16

5

26/06/06

20/09/06

20

8.08

Muestra

Fecha Inicio

1

La importancia que tiene el periodo de incubación de muestras (Belser 1977) en general para todos los procesos, y en este caso para los relacionados con el nitrógeno, fue la razón por la cual se tomaron 11 muestras para la estandarización del tiempo, y cinco para la estandarización de las sales, ya que con el seguimiento realizado durante siete días fue posible reconocer la fluctuación de los valores de NMP/g. De otro modo al analizar los resultados obtenidos se demostró que cinco muestras fueron suficientes para lograr resultados estadísticamente significativos para una estandarización. Gephart (2006) observó que en un compost con 60 días de maduración, hay 320 mg NH4/kg de nitrógeno y 240 mg de nitrato/kg de nitrógeno. Se tomó compost de 13 semanas de madurez, debido a que es suficientemente estable por baja emisión de CO2 y alta mineralización (Costa et al. 1991) de modo que pueda ser usado con propósitos agrícolas sin ningún riesgo para la cosecha. El promedio de la temperatura del compost muestreado fue mayor al promedio de la del ambiente (14º), debido posiblemente a la fase de maduración en la que se encuentra el proceso, la cual implica una disminución en la temperatura (Labrador 1996). Zibilske 2005, indica que a los 100 días del proceso, la materia orgánica restante es degradada lentamente, por lo cual la baja actividad microbiana genera menos calor del que se pierde en el sistema, por lo tanto el material se enfría. El pH final del proceso se acercó a la neutralidad, producto de la actividad y procesos metabólicos que afectaban fuertemente el pH de los materiales (Costa et al. 1991).

37

Aunque el uso del compostaje con desechos vegetales como biofertilizante ha incrementado en estos años, es insuficiente lo que se conoce acerca de los microorganismos responsables de las transformaciones de nitrógeno ocurridas en este. El departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA 2006) ha hecho algunas revisiones con respecto al compost y microorganismos como Azospirillum sp, Bacillus sp, Azospirillum brasilense, fijadores de nitrógeno, bacterias sulfato reductoras, microflora de compost urbano, entre otros. El compost provee productos estables con alta cantidad de nutrientes y de fácil acceso para las plantas, como el amonio, que durante la rápida hidrólisis de la urea y la deaminación de péptidos no incorporados es transformado a NH3+, compuesto nitrogenado mas disponible en compost. Al no ser esta la forma de nitrógeno más usada por las plantas, las bacterias amonio-oxidadoras quimiolitótrofas lo utilizan como sustrato para la nitrificación (Fauci et al., 1999). En el compost, la nitrificación puede llevar a la lixiviación del nitrato que acompañado de una desnitrificación incompleta da como resultado una pérdida de nitrógeno del sistema por la producción de oxido nitroso (Bauhus y Melwes 1991; Paul et al., 1993). La nitrificación es un proceso muy importante para el material compostado, debido a que si no se presenta, el nitrógeno puede perderse por volatilización del amonio, evitando así la acidificación del sustrato (Eghball y Power 1994; Hom et al., 1994). Según Invar et al, 1993, la nitrificación se cualificó como un proceso normal en el compostaje que depende totalmente de las condiciones y sustratos usados en el compost. En la fase de maduración de los sistemas de compostaje, siempre se hallan micro sitios anaeróbicos, los cuales contienen muchos microorganismos anaerobios facultativos encargados de mas de la mitad del proceso de descomposición, obteniendo como resultado productos usualmente reducidos a compuestos como amonio y sulfuro que son acumulados durante el compostaje (Zibilske 2005).

38

6.3. Estandarización del tiempo de Incubación Se decidió estandarizar el tiempo para bacterias nitrificantes y denitrificantes con el T1 (0.5 g de SO4(NH4)2 con 1 g de CaCO3 y 0.5 g de KNO3 con 5 g de CaCO3 respectivamente), debido a que en el único estudio que se ha aplicado NMP para bacterias nitrificantes según Kowalchuk et al., (1999) fue en compost procedente de desechos animales en donde utilizaron las concentraciones usadas por Verhagen y Laanbroek (1991). Con el fin de establecer el mejor día para hacer la lectura después de la incubación, obteniendo mayor biomasa en caldo amonio, se calcularon las medias (tabla 5) para cada una de las muestras registrando el mayor crecimiento el día 15 (figura 3). Dichos datos no se distribuyeron normalmente según el test de Shapiro Wilk (anexo 2 tabla 11), por tanto se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis con un α=0.05, (anexo 2 tabla 12) obteniendo un p 〈 0.00001, con lo que se demostró que no existen diferencias significativas entre los días 14,15 y 16 pero el mayor índice de crecimiento fue del día 15, de modo que se rechaza la Ho de igualdad de medianas y se deduce que por lo menos una de las medianas es diferente (anexo 2, tabla 12).

() bacterias nitrificantes (NMP/g)

150

100

50

0

D12

D13

D14

D15

D16

D17

D18

Tiempo de Incubación (Días)

Figura 3. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias nitrificantes con desviación estándar

39

Tabla 5. Estadística descriptiva. Media y desviación estándar del NMP de bacterias nitrificantes para estandarización del tiempo

Variable

N

Media

D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18

33 33 33 33 33 33 33

13.436 27.394 102.52 115.88 98.394 33.000 13.500

Desviación estándar 2.8877 12.949 31.912 25.134 30.254 18.635 5.2817

Aunque no se presentaron diferencias significativas entre la concentración de bacterias de los días 14, 15 y 16, la concentración máxima de bacterias nitrificantes se obtuvo el día 15, con biomasa mayor de 143 NMP/g de compost de la muestra 10 con (figura 4), mientras que la más baja fue de 70 NMP/g de compost obtenida de la muestra 5 (figura 4). Las diferencias que se encontraron entre las muestras se debieron a la alta variabilidad de la tabla del NMP ya que sus valores oscilan determinantemente dependiendo del número de tubos positivos, sin tener en cuenta la similitud de los resultados cualitativos arrojados. 160

NMP/g

140 120 100 80 60 40 20 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Muestra

Figura 4. Registro de las medias del NMP/g de bacterias nitrificantes el día 15 de las muestras recolectadas para la estandarización del tiempo de incubación

40

Según Neil (1992) al incubar las bacterias nitrificantes siete días, no se observó presencia a causa de que usan varios senderos aeróbicos para reciclar el nitrógeno orgánico compuesto en nitrato y nitrito. Según Verhagen y Laanbroek (1991) 15 días es el tiempo suficiente para que las bacterias amonio-oxidadoras pasen el amonio a nitrito, en condiciones óptimas, lo que sugiere que se gastaría un mes para evidenciar la presencia de bacterias nitrito oxidadoras, ya que en los últimos 15 días de incubación ocurriría el paso de nitrito a nitrato, si se parte de caldo amonio como sustrato. Quastel y Scholefield (1951) utilizaron un aparato de perfusión en el suelo, el cual agregaba cloruro de amonio, y luego tomaban una muestra del suelo perfundido, y leían la cantidad nitrito o nitrato que se acumulaba en el suelo por medio de colorimetría, dándose cuenta que la mayor intensidad de color se daba el día 14 y luego se mantenía, por tanto la formación de nitrato a partir de cloruro de amonio se encontraba del día 14 al 16.

NITRITO POSITIVO

Figura 5. Prueba positiva (roja) en caldo amonio para bacterias nitrificantes, a los 15 días de incubación

Según Yuan et al. (2005) y Degrange y Bardin (1995) el color de los tubos persiste luego de un mes de incubación a 28ºC. Con este fenómeno se sugiere que el NO2

41

puede coexistir con el NO3 en el medio amonio del NMP y los reactivos no diferencian entre NO3 y NO2. Por esto Belser y Schmidt (1978), afirman que el NMP es un acercamiento tradicional a estudiar la dinámica de población de nitrificantes en suelo, y por tanto esta técnica debe leerse cuando se observe la mayor cantidad de tubos positivos, ya que por razones fisicoquímicas, las poblaciones desaparecen a menudo con la incubación. Por tanto cabe la posibilidad de que pasados 15 días de incubación con nitrito o nitrato formado puede suceder desnitrificación incompleta que podría formar oxido nitroso (reacción 7) que se va a perder, por cual los resultados de biomasa del día 16 en adelante resultaron menores, al reaccionar dichos compuestos con el reactivo de Griess o el polvo de Zinc. También puede que se haya dado el ciclo completo del nitrógeno en algunos micrositios por presencia de bacterias capaces de reducir en bajas condiciones de oxigeno, llevando NO3 a N2, (reacción 8) (Cadrin 1997) o por último realice una reducción desasimilatoria que lleve el nitrito o nitrato formado a amonio nuevamente, razón por la cual los tubos dieron negativos a la reacción con el reactivo de Nessler. 4CH2O + 4 NO3 + 4H + 5e → 4CO2 + 2N2O + 6 H2O (7) 5CH2O + 4 NO3 + 4H + 5e → 5CO2 + 2N2 + 7 H2O (8) Fue necesario incubar los tubos de bacterias nitrificantes por 15 días, ya que según Gómez y Nageswara 1995, y Fleisher et al. 1987, el periodo comprendido entre los días 7 y 14 se denomina “lag”, el cual es completamente independiente de la cantidad de material existente en el suelo y representa el tiempo necesario para que estos microorganismos alcancen su máxima actividad y crecimiento. Con el fin de establecer el día de incubación en que se obtuvo mayor biomasa de bacterias denitrificantes en caldo nitrato del NMP, se calcularon las medias para cada una de las muestras (tabla 6) registrando el mayor crecimiento los días 15 y 16 (figura

42

6). Dichos datos no se distribuyeron normalmente según el test de Shapiro Wilk (anexo 2 tabla 13) por tanto se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis con un α=0.05, obteniendo un p 〈 0.00001, (anexo 2 tabla 14) con lo que se demostró nuevamente que el mayor índice de crecimiento se evidenció los días 15 y 16, de modo que se rechaza la Ho de igualdad de medianas y se deduce que por lo menos una de las medianas es diferente (anexo 2, tabla 14).

() bacteria denitrificantes (NMP/g)

40

30

20

10

0

D12

D13

D14

D15

D16

D17

D18

Tiempo de Incubación (días)

Figura 6. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias de denitrificantes con desviación estándar Tabla 6. Estadística descriptiva. Media y desviación estándar del NMP de bacterias denitrificantes para estandarización del tiempo

Variable

n

Media

D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18

33 33 33 33 33 33 33

4.6515 9.4576 21.030 31.424 31.424 21.758 11.358

Desviación estándar 1.9712 2.5720 6.5693 6.2100 6.2100 7.5168 3.3640

Estos resultados contradicen lo descrito por Belser 1977, quien atribuye buenos resultados en experimentos con bacterias denitrificantes a las tres semanas utilizadas

43

como tiempo de incubación, mientras que en el presente estudio se evidenció que luego del aumento inicial de biomasa seguido de una estabilización, el número de individuos disminuye en función del tiempo. Es de resaltar que los días con mayor biomasa presentaron altas desviaciones estándares (anexo 2, tabla 10). En cuanto a la utilización del nitrato como fuente de nitrógeno Samuelsson y Gustafsson en 1988, describen mayor la acumulación de oxido nitroso en siembra con caldo nitrito comparada con el caldo nitrato, posiblemente debido a la toxicidad del nitrito, ya que Kaspar (1982) enuncia que la reducción de nitrito a oxido nitroso puede ser la detoxificación del proceso. Por otro lado las bacterias denitrificantes reducen nitrato produciendo coloración roja con la adición del reactivo de Griess (Valerie y Bardin 1995), indicativo del primer paso de la desnitrificación (nitrato a nitrito) (figura 5); luego con la adición del reactivo de Nessler (Mariorri et al., 1982), la producción de amonio en el medio causa tonalidad amarilla (figura 9). La presencia de nitrato en el medio sumado a la adición de polvo de zinc, indica ausencia de bacterias denitrificantes o alguna falla en el proceso evidenciado con viraje del medio a rojo. Si el color rojo no aparece, el microorganismo ha reducido todo el nitrato y probablemente ha ocurrido desnitrificación. Adicionalmente Samuelsson, 1985, encontró que la desnitrificación puede llevarse a cabo en caldo con medio nutritivo a las 12 horas de incubadas las muestras, de modo que el polvo de zinc pudo haberse inactivado después del un período de almacenamiento; por lo tanto, algunos de los tubos pudieron haber arrojados falsos negativos, aunque este factor pudo haber sido controlado con la observación diaria de la capacidad de reducir nitrato a nitrito.

44

NITRATO POSITIVO

Figura 7. Prueba negativa (roja) en caldo nitrato para bacterias denitrificantes a los 15 días de incubación

AMONIO POSITIVO

Figura 8. Prueba positiva (amarilla) producida luego de la incubación durante 15 días en caldo nitrato para bacterias denitrificantes

45

Con la lectura del NMP para bacterias denitrificantes se obtuvo una concentración máxima de 39 NMP/g de compost, a partir de la muestra 4 (figura 9). Mientras que la mínima fue 23.3 NMP/g de compost obtenido de la muestra 3 (figura 9).

45 40

Concentración (NMP/g)

35 30 25 20 15 10 5 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Número de Muestra

Figura 9. Registro del NMP/g de bacterias denitrificantes de las muestras recolectadas para la estandarización del tiempo de incubación

Pese a que las muestras tres y cuatro fueron recolectadas el mismo día, reportaron pH y temperatura similar, y el tiempo y temperatura de incubación fue la misma, los resultados obtenidos demuestran una biomasa heterogénea. Es posible que tal diferencia se deba a que las muestras no fueron incubadas en la misma campana de anaerobiosis y la muestra tres haya albergado microorganismos denitrificantes que realizan reducción desasimilatoria de nitrato y nitrito y alguna falencia en el procedimiento haya permitido una entrada de oxigeno que interfirió enzimáticamente la desnitrificación ya que inhibió la nitrato, nitrito reductasa (Revsbech 1988) u oxido nitroso reductasa (Bell y Ferguson 1991). En este caso, con el oxigeno y el nitrato como aceptores de electrones puede haberse presentado acumulación de nitrito (Samuelsson y Gustafsson 1988). No obstante Mckenney et al., 1982 encuentra que con establecer condiciones anaeróbicas se muestra un aumento rápido de NO2

46

seguido de su disminución gradual. El comportamiento similar es expuesto por NO y N2O, aunque el aumento inicial de N2O sea menos pronunciado. Respecto a la enzima nitrato reductasa desasimilatoria Letey et al., 1980 encontraron que tiene la capacidad de desarrollarse rápidamente, mientras que la enzima óxido nitroso reductasa desasimilatoria se desarrolla lentamente luego del inicio de las condiciones anóxicas. Es de mencionar que las muestras dos y ocho, las cuales presentaron baja biomasa, fueron incubadas en la misma campana de anaerobiosis donde se incubó la muestra tres. Del mismo modo se evidenció que la actividad denitrificante no fue nula, posiblemente gracias a que los mecanismos de inhibición de las oxido nitroso reductasa difieren por cada enzima. En algunas especies de denitrificantes estas funciones dependen de condiciones aeróbicas o de la presencia de mecanismos para protegerse del oxigeno, como el reportado en Azotobacter sp. para proteger la nitrogenasa (Bell y Ferguson 1991). Los mismos autores concluyeron que la reducción del nitrato y la formación de gas puede observarse en presencia de oxigeno, pero hay directa evidencia de que la producción de nitrógeno atmosférico no es viable, de modo que el oxigeno sigue siendo considerado como inhibidor de la desnitrificación. 6.4. Estandarización de Sales

6.4.1. Estandarización de la concentración de SO4(NH4)2 y la adición o no de CaCO3 para bacterias nitrificantes En la estandarización de dos concentraciones de SO4(NH4)2 y la adición o no de CaCO3 sobre la recuperación de biomasa, actividad y contribución del mayor recuento de bacterias nitrificantes por la técnica del NMP, se trabajaron concentraciones en combinación (tabla 7).

47

Tabla 7. Media, desviación estándar y Test de Shapiro-Wilk aplicado a tratamientos para la estandarización de sales en NMP de bacterias nitrificantes Desviación Concentración Adición de Amplitud p media Variable n estándar de SO4(NH4)2 CaCO3

T1 T2 T3 T4

15 15 15 15

0.5 g 0.5 g 0.33 g 0.33 g

1g 0g 1g 0g

112.67 5.3333 27.600 2.6667

7.0373 0.9759 2.2297 0.9759

0.4128 0.6034 0.5470 0.6034

0.0000 0.0000 0.0000 0.0000

Con el objeto de puntualizar con que tratamiento se obtenía mayor biomasa en caldo amonio del NMP para bacterias nitrificantes se calcularon las medias para cada una de las muestras (tabla 7 figura 10) obteniendo el mayor crecimiento para el T1 (tabla 7 figura 10), con 112 NMP/g de compost, mientras que el tratamiento menos eficiente fue el número cuatro (tabla 7 figura 10) con 2.67 NMP/g de compost, con esto se realizó el test de Shapiro Wilk dando como resultado que los datos no se distribuían normalmente (tabla 7), por tanto se realizó una prueba de Kruskal-Wallis con un α=0.05, (anexo 2 tabla 15) obteniendo un p 〈 0.00001, con lo que se demostró nuevamente que el mayor índice de crecimiento fue el del T1 (tabla 7), de modo que se rechaza la Ho de igualdad de medianas y se deduce que por lo menos una de las medianas es diferente (anexo 2, tabla 15).

() bacterias nitrificantes (NMP/g)

120

80

40

0

T1

T2

T3

T4

Tratamiento

Figura 10. Registro de las medias por tratamiento del NMP/g de bacterias nitrificantes con desviación estándar

48

Claramente se observa diferencias significativas entre los tratamientos, demostrando mayor crecimiento el T1 (tabla 7 figura 10) con desviación estándar 112.67± 7.04, y luego el T3 (tabla 7 figura 10) con 27.60 ± 2.23, estos tratamientos eran los que tenían en sus medios CaCO3, demostrando la importancia de adicionarlo en un medio de cultivo para evaluar el crecimiento. La nitrificación es un proceso muy débil, debido a la diversidad de condiciones químicas y físicas que puede inhibirlo como ocurre con la materia orgánica en exceso, los metales tóxicos, exceso de NH3, pH´s drásticos (11), temperaturas extremas (65ºC) o radiación.(Koops y Moller 1992; Hastings et al,. 1997; Mendum et al,. 1999). Según White et al., (1977) un medio de cultivo de bacterias nitrificantes, así como en el suelo se necesita roca fosfórica, como el bicarbonato de Sodio o el CaCO3, con el fin de que se de una pobre nitrificación o hasta se inhiba. Los resultados anteriores se deben a cambios de pH en el caldo amonio a causa de la acidificación que se da por la nitrificación, por lo que la presencia de CaCO3 actúa como estabilizador de pH que mantiene el pH neutro en el medio evitando la inhibición de las enzimas de las bacterias nitrificantes, como son la Amonio Monooxigenasa (AMO), la Hidroxilamina Oxidoreductasa (HAO), y la Nitrito Oxidoreductasa (NOR). Según Juliette et al., (1993), la AMO mas que la HAO es comúnmente identificada como la enzima blanco para inhibir la nitrificación. Es de suma importancia ya que esta enzima se inhibe a pH´s menores de 4.5 y mayores a 11, por esta razón el CaCO3 jugó un papel fundamental en los T1 y T3 (tabla 7), debido a que el segundo paso de la nitrificación es el paso de hidroxilamina a nitrito, en el cual se forma el ácido nítrico, el cual, es el mayor causante del descenso de pH en el medio, por lo que no dejaría producir el nitrito necesario en el T2 y T4 (tabla 7), con esto el reactivo de

49

Griess no tenia sustrato con el que reaccionar, y por ende tampoco el polvo de zinc, por tanto tuvieron tan bajo crecimiento a falta del CaCO3. Por otra parte la oxidación del nitrito según Yuan et al. (2005) debe estar en un rango de pH de 7.5-8.6, por lo tanto el CaCO3 tomó nuevamente importancia al mantener el pH y evitando que se acidificara en los medios del T1 y T3 (tabla 7), y así llevando el amonio hasta nitrato. Christianson et al., (1979) y Gómez y Nageswara (1995), dicen que es posible que bajo condiciones alcalinas del medio, a causa de la no estabilización del pH, la incidencia de estas bacterias resulte aun mayormente afectada, por las altas concentraciones de amonio libre. En general, según Matulewich et al., (1975), los microorganismos nitrificantes de diferentes ambientes (agua, sedimento, suelo) con un buen buffer que les mantenga el pH de 7.8 a 8.5, 0.5 g de SO4(NH4)2 y una alta concentración de oxígeno, son los mas activos, y obtienen mayor crecimiento. La concentración de SO4(NH4)2 a la cual hubo mayor biomasa fue con 0.5 g en el T1 (tabla 7), por encima de los tratamientos dos, tres y cuatro (tabla 7). El segundo tratamiento en crecimiento de biomasa fue el tres (tabla 7), el cual tenia una concentración de 0.33, los dos tenían CaCO3 por lo tanto los otros dos tratamiento no tuvieron posibilidades de crecer a causa de esto (figura 10). A mayor concentración de SO4(NH4)2 no siempre va a ver mayor crecimiento, debido a que el exceso de los iones de amonio, inhiben la nitrificación. Según Quastel y Scholefield (1951) a una concentración de 0.01N y con un pH de 7.5-8.0 inhibe un 18% del crecimiento de la población de bacterias nitrificantes, así como con la misma concentración y un pH de 9.0-9.5 inhibe el 55%. En la nitrificación microbiana el mayor proceso es la oxidación de amonio a nitrito, en el cual la hidroxilamina es el único recurso disponible para la actividad de la

50

AMO, porque la hidroxilamina deriva los electrones a partir de una fuente reductante con el fin de permitir la amoniooxidación (Juliette et al., 1993). Según Juliette et al., (1993) y Hyman et al., (1990) la oxidación del amonio es susceptible a la inhibición con efectos directos sobre la AMO, e indirectos sobre la HAO, como es el suplir electrones a AMO. Al encontrar una mayor cantidad de amonio las bacterias amoniooxidadoras fueron capaces de producir mayor cantidad de hidroxilamina, así mismo como se mencionó anteriormente HAO suplió a AMO de mayor cantidad de electrones dando como resultado mayor cantidad de nitrito formado en T1 (tabla 5) frente al tres (tabla5). El proceso de la nitrificación en su mayoría se presenta por la acción de bacterias autotróficas, aunque con 0.33 las bacterias heterotróficas, muchas veces hacen parte este proceso. El resultado es la inhibición de la nitrificación por causa de la producción de glucosa o compuestos organicos a partir de estas bacterias (Verhagen et al., 1993). Así mismo según Verhagen y Laanbroek (1991) la ausencia o bajos rangos de formación de nitrato se adscrito a la supresión del proceso de nitrificación por más bacterias heterotrofas competitivas. Estas bacterias inmovilizan el nitrógeno mineral existente, por lo cual el crecimiento de las bacterias en el tratamiento con 0.33 g de SO4(NH4)2 fue menor ya que al haber competencia por el sustrato se consumió mucho mas rápido el amonio presente. Por lo tanto el T1 (tabla 7) presentó mayor crecimiento. Quastel y Scholefield (1951) indicaron que el clorato de potasio produce una oxidación bacterisotatica sobre la nitrito oxidación, la cual puede ser otra causa en el crecimiento de las bacterias, ya que el caldo amonio contenía cloruro de sodio y fosfato de potasio en sus componentes pudiéndose dar esta reacción e inhibiendo estas a bacterias, evitando la producción del nitrito. Por otra parte, según Tortoso y Hutchinson (1990), Anderson y Levine (1986) y Goreau et al., (1980) Nitrosomonas europaea tiene la capacidad de producir NO y

51

N2O proveniente de amonio e hidroxilamina, por lo tanto el nitrógeno se estaría perdiendo sin comenzar un proceso de nitrificación, y en el caso del T3 sería mas rápida la perdida al tener menor cantidad de amonio en el medio. Los tratamientos estuvieron los 15 días en una incubadora en ausencia de luz, algo que pudo haber afectado el crecimiento, ya que según White et al., (1977), el efecto de la luz solar aumenta la nitrificación paralelo un aumento en el consumo de oxigeno.

6.4.2. Estandarización de la concentración de KNO3 y la adición o no de CaCO3 para bacterias denitrificantes En la estandarización de dos concentraciones de KNO3 y la adición de CaCO3 sobre la recuperación de biomasa, actividad y contribución del mayor recuento de bacterias denitrificantes por la técnica del NMP fueron calculadas las medias para cada una de las muestras (anexo 2 tabla 19) donde se obtuvo que el tratamiento mas eficaz fue el 1 (tabla 8) con 27.5 NMP/g de compost, mientras que le tratamiento menos eficiente fue el 4 con 3.55 NMP/g de compost. Con esto se realizó el test de Shapiro Wilk dando como resultado que los datos no se distribuían normalmente (tabla 8), por tanto se realizó una prueba de Kruskal-wallis con un α=0.05, (anexo 2 tabla 16) obteniendo un p 〈 0.00001, con lo que se demostró nuevamente que el mayor índice de crecimiento fue el del T1, de modo que se rechaza la Ho de igualdad de medianas y se deduce que por lo menos una de las medianas es diferente (anexo 2, tabla 16).

Tabla 8. Media, desviación estándar y Test de Shapiro-Wilk aplicado a tratamientos para la estandarización de sales en NMP de bacterias denitrificantes Desviación Concentración de Adición de Amplitud p Media Variable estándar KNO3 CaCO3

T1 T2 T3 T4

0.5 g 0.5 g 2g 2g

5g 0g 5g 0g

27.533 6.6867 16.400 3.5533

52

3.6814 1.6177 2.9952 1.3389

0.8114 0.8708 0.9132 0.7869

0.0052 0.0347 0.1514 0.0025

() bacterias denitrificantes (NMP/g)

32

24

16

8

0

T1

T2

T3

T4

Tratamiento

Figura 11. Registro de las medias por tratamiento del NMP/g de bacterias denitrificantes con desviación estándar

Aunque en compost de residuos vegetales no ha sido reportado el uso de la técnica del NMP, la enumeración de las bacterias denitrificantes en suelo por esta técnica fue propuesto primero por Halvorson y Ziegler (1933) y fue mejorado por Alexander (1965) y Focht y Joseph (1973). Weier y Macrae (1992) reportaron la enumeración de bacterias denitrificantes de suelo usando el método del NMP. Los tubos del NMP que resultaron positivos para la desnitrificación fueron sometidos a la prueba confirmatoria de Tiedje (1982) antes de que las bacterias denitrificantes fueran aisladas en cultivos puros. Blaszczyk (1993), estudiando el efecto de la composición del medio sobre la desnitrificación del nitrato hecha por Paracoccus denitrificans, encuentra que los mayores aumentos de la biomasa bacterial durante el proceso son evidenciados en el medio enriquecido con una concentración de 1.8 g/l KNO3, esto difiere a lo encontrado en este estudio donde la concentración mas próxima a la que Blaszczyk utiliza (T3), (tabla 8, figura 11) arrojó menor recuperación de biomasa, actividad y/o mayor recuento de bacterias denitrificantes que el T1 (tabla 8, figura 11).

53

En la misma investigación indican que la dependencia de las bacterias denitrificantes a la fuente de carbono que en ese caso fue almidón y a la concentración de nitrato en el medio, al respecto Mycielski et al., 1985 exponen que la glucosa puede llegar a hacer la selección de las bacterias que son capaces de reducir nitrato a nitrito. Posiblemente las bacterias denitrificantes provenientes del T1 y T3 (tabla 8) capturaron el carbono proveniente de la glucosa y de la adición de CaCO3 de modo que se sustentó la mayor biomasa de bacterias denitrificantes en dichos tratamientos. Posible ecuación (ecuación 9). C6H12O6+4NO3¯

6CO2+6H2O+2N2 (9)

Del mismo modo Smith (1982), encontró que con la baja concentración de glucosa y nitrato el producto predominante es el nitrito y la producción de amonio también se evidencia. Igualmente Samuelsson (1985), plantea que cuando Pseudomonas putrefaciens fue cultivado anaeróbicamente con glucosa como fuente de carbono y nitrato como aceptor de electrones, el consumo de nitrato y la producción de nitrito muestran en mismo patrón reportado para Citrobacter sp. El nitrito fue reducido a amonio tanto como el nitrato se presentó en el medio. Según Smith (1982), esta acumulación de nitrito puede deberse tanto a la toxicidad que se puede presentar en el medio al acumularse nitrito como a la inhibición en el sistema de reducción de nitrito por exceso de nitrato. No obstante algunas especies como Pseudomonas aeruginosa son capaces de reducir nitrato con acumulación de nitrito en el medio (Samuelsson 1985). Es de aclarar que los niveles de nitrito acumulado dependen de la concentración inicial de nitrato en el medio, ya que Blaszczyk et al., (1985), afirma que en altas concentraciones de NO3 la cantidad de nitrito acumulado podría llegar a ser casi 1 g de N por litro de medio y que definitivamente la acumulación de nitrito durante la reducción de nitrato depende del equilibrio apropiado y no apropiado de las fuentes de carbono y nitrógeno.

54

Benavides (2006), menciona que se determinó que la acumulación del nitrito en todos los aislamientos era más alta cuando el nitrato era la fuente única del nitrógeno. Este estudio sugiere que cuando el amonio existe junto con el nitrato, la reducción aerobia del nitrato no produce una alta acumulación del nitrito. Son varias las razones por las cuales ocurre acumulación de nitrito durante la reducción de nitrato en cultivos con bacterias denitrificantes: la nitrito reductasa puede ser inhibida por nitrato, ya que este puede ser utilizado competitivamente como un aceptor de electrones en la presencia de nitrito (Komada et al., 1969); también la óxido nítrico reductasa puede ser inhibida por el nitrato que precede la inhibición de la nitrito reductasa por el óxido nítrico acumulado (Payne y Riley 1969). Adicionalmente pueden las reacciones de reducción de nitrato y nitrito catalizadas por reductasas apropiadas ser desbalanceadas (Betlach y Tiedje 1981); y la inducción de nitrito reductasa puede retrasarse respecto a la inducción de nitrato reductasa (Williams et al., 1978). Por otra parte, es posible que con la adición de CaCO3 haya sido posible la regulación del pH del medio nitrato de modo que se contribuyera a la recuperación de bacterias denitrificantes como se demuestra en los resultados obtenidos (figura 11) ya que McKeeney, 1985, encontró que en arcilla las condiciones suavemente ácidas pueden llegar a inducir autodescomposición de ácido nitroso (McKeeney et al., 1985) que podría constituir uno de los principales mecanismos de pérdida nitrito (Van Cleemput et al., 1976). Del mismo modo la descomposición de HNO2 es el dependiente pH y es más significativa con pH menor a 5 (Smith y Chalk 1980). Para Fauci et al., 1999 la concentración de nitrato aumenta con la maduración de las pilas de compostaje mientras los niveles de amonio disminuyen rápidamente. Debido a que en la nitrificación se producen reacciones acidas estas concentraciones elevadas de nitrato puede explicar el bajo pH de la mayoría de las pilas de compostaje, hecho confirmado por Campbell et al., 1997.

55

Al medio nitrato se le adiciona solución de oligoelementos que contiene sulfato de cobre, hecho que pudo haber estimulado la enzima oxido nitroso reductasa compensando así, la sensibilidad del dicha enzima por el oxigeno (Snyder 1987). Es importante destacar que es posible que numerosas especies bacterianas puedan desnitrificar en medios de cultivo pero este hecho no asegura que el organismo sea capaz de hacer lo mismo en suelo u otro sustrato (Nash y Bollag 1974). Beijerinck et al., 1970 encontraron que algunos organismos denitrificantes en el suelo, como Bacillus sp. al ser incubado con nitrato no favorecía el proceso de desnitrificación.

56

7. CONCLUSIONES •

La técnica del número mas probable para bacterias nitrificantes y denitrificantes en compost, arrojó datos importantes, teniendo en cuenta que era muy poca la información de esta técnica en esta matriz. Se obtuvo un día ideal para la lectura, en el cual la microbiota tuvo su máximo crecimiento, sin necesidad de hacer nuevamente un seguimiento para observar los procesos que se llevan en diferentes tiempos dentro del medio.

•

Se pudo estandarizar una concentración de sustrato para cada grupo con la cual el microorganismo, va a tener un buen crecimiento, y no va a ser inhibido por exceso del mismo.

•

También se demostró la importancia del CaCO3 en el medio, como buffer para mantener el pH debido a que la carencia de este puede disminuir las reacciones al inhibir la maquinaria enzimática de cada grupo de bacterias en el medio por tanto disminuir la biomasa.

•

Con esto se pudo evidenciar la presencia de bacterias denitrificantes en un proceso “aeróbico” como es el compostaje, lo cual demuestra la microaerofilia o anaerobiosis que se produce en ciertas etapas.

•

Del mismo modo, se evidenció la gran cantidad de bacterias nitrificantes presentes, lo que es muy bueno para los procesos agrícolas, al ser usado el compost como un insumo asegura de cierto modo el ciclaje de nitrógeno en el suelo.

57

8. RECOMENDACIONES •

Debido a que las reacciones colorimétricas difieren dependiendo de las concentraciones de nitrito, nitrato y amonios utilizados como sustratos, se sugiere no confundir falsos negativos.

•

Así mismo se aconseja la utilización de reactivos preparados recientemente con el fin de que estos no interfieran en las reacciones de las pruebas.

•

Realizar la conversión dependiendo de la dilución utilizada para la lectura del número más probable.

•

Para la incubación de bacterias nitrificantes se pueden obtener mejores resultados si los tubos se incuban en presencia de luz.

•

Para la incubación de bacterias denitrificantes se recomienda el uso de campana de CO2 controlado.

•

Por ultimo se señala la inutilidad de la realización de la técnica de recuento en placa para bacterias nitrificantes y denitrificantes debido a la baja sensibilidad de dicho método con respecto al NMP.

58

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74

ANEXOS

ANEXO 1. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 1.3. CALDO AMONIO El agar amonio está compuesto por 0.5 o 0.33 g de sulfato de amonio, 1 g o sin carbonato de calcio, 1 g de fosfato de potasio, 0.3 g de sulfato de magnesio, 0.3 g de cloruro de sodio, 0.03 g de sulfato ferroso, 18 g de agar-agar en caso de requerir medio sólido y 950 ml de agua destilada (Girard y Rougieux 1964; Verhagen and Laandbroek 1991). 1.4. CALDO NITRATO El agar nitrato está compuesto por 2 o 0.5 g de nitrato de potasio, 5 g o sin carbonato de calcio, 10 g de glucosa, 50 ml de solución salina standard, 1 ml de oligoelementos, 18 g de agar-agar en caso de requerir medio sólido y 950 ml de agua destilada (Girard y Rougieux 1964; Verhagen and Laandbroek 1991; Hashimoto et al. 2005). 1.3. REACTIVO DE NESSLER Para la detección de amonio se preparará el reactivo Nessler en el cual se debe utilizar: 50 g de Ioduro mercúrico, 36.5 g de Ioduro de Potasio. Se le añadirá 1 ml de agua destilada y se tritura. Luego se mezcla 150 g de potasa en pastillas y se completa con un litro de agua destilada caliente.

75

1.4. REACTIVO DE GRIESS Para la preparación del reactivo para detección de nitrito se debe utilizar: Solución de ácido sulfanílico: 0.5 g de ácido sulfanílico en 70 ml de agua destilada caliente. Se dejará enfriar y posteriormente se adicionarán 30 ml de ácido acético. 1.5. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE pHmetro Para calibrar el pHmetro a 6.86 se disuelven 3.39 g de Fosfato monopotásico (KH2PO4) y 3.53 g de Fosfato disódico anhidro (Na2HPO4) en agua destilada y diluya a un litro. La solución debe prepararse con agua destilada.

76

ANEXO 2. ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN

Tabla 9. Media y desviación estándar del NMP/g de compost de bacterias nitrificantes, tomado diariamente para cada una de las muestras. Muestra Preliminar 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Día 12

Día 13

Día 14

NMP/g Día 15

Día 16

Día 17

Día 18

8.87±1.85 16.0±1.73 16.0±3.46 16.0±1.73 15.0±1.73 13.0±1.73 15.0±1.73 9.93±1.85 14.0±0.00 12.0±1.73 12.0±1.73

18.3±2.31 26.0±0.00 29.0±3.46 28.3±4.04 23.0±5.20 18.0±1.73 28.0±3.46 22.7±2.89 24.7±2.31 58.7±27.8 24.7±2.31

130±17.3 120±17.3 96.3±42.2 110±30.5 70.0±0.00 113±31.1 125±26.6 83.3±23.1 78.0±13.86 126±45.6 76.3±30.9

130±17.3 120±17.3 120±10.0 120±17.3 70.0±0.00 133±11.6 140±0.00 110±0.00 78.0±13.86 143±23.1 110±0.00

130±17.3 99.7±17.9 94.3±15.5 99.7±46.4 70.0±0.00 118±23.1 104±31.8 94.3±27.1 78.0±13.86 94.3±69.3 99.7±17.9

21.7±4.04 16.0±1.73 30.3±3.79 63.0±12.1 32.7±11.6 63.3±34.5 36.7±4.04 24.3±2.89 18.7±2.89 33.7±6.51 22.7±2.89

6.80±0.00 9.37±2.60 14.0±3.00 19.7±7.77 10.4±1.04 21.7±4.51 18.7±2.89 12.0±1.73 9.93±1.85 14.0±0.00 12.0±1.73

Tabla 10. Media y desviación estándar del NMP/g de compost de bacterias denitrificantes, tomado diariamente para cada una de las muestras.

Muestra Preliminar 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Día 12

Día 13

Día 14

NMP/g Día 15 Día 16

Día 17

Día 18

2.67±1.16 5.87±1.61 3.33±1.15 6.57±0.40 4.00±0.00 4.70±1.21 4.93±1.62 2.67±1.16 4.70±1.21 8.40±1.39 3.33±1.16

7.60±1.38 6.80±0.00 7.60±1.39 13.7±2.89 9.27±0.06 11.7±2.36 8.30±1.82 8.40±1.39 11.1±1.56 11.1±1.56 8.53±3.00

18.0±3.46 15.0±1.73 19.0±6.24 26.3±10.9 20.3±5.77 28.0±11.5 21.7±2.08 17.0±0.00 26.0±6.00 20.0±5.20 20.0±5.20

34.0±3.46 26.0±0.00 23.3±2.31 39.0±0.00 26.7±0.58 38.0±3.46 37.0±3.46 26.0±0.00 29.0±0.00 30.7±4.04 26.0±0.00

21.67±4.04 20.3±6.03 19.7±7.77 25.3±11.9 15.0±1.73 29.3±9.71 23.7±8.32 17.0±7.94 27.7±10.0 21.3±4.51 18.3±2.31

6.80±0.00 12.0±1.73 12.0±1.73 13.0±1.73 6.03±1.73 15.0±1.73 12.7±1.16 8.43±4.96 12.7±1.16 15.0±1.73 11.3±0.58

77

34.0±3.46 26.0±0.00 23.3±2.31 39.0±0.00 26.7±0.58 38.0±3.46 37.0±3.46 26.0±0.00 29.0±0.00 30.7±4.04 26.0±0.00

Tabla 11. Test de Shapiro-Wilk aplicado a NMP de bacterias nitrificantes para estandarización del tiempo

Variable D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18

N 33 33 33 33 33 33 33

Amplitud 0.9022 0.5646 0.9236 0.8868 0.9602 0.7859 0.8896

P 0.0061 0.0000 0.0230 0.0025 0.2616 0.0000 0.0029

Tabla 12. Prueba no paramétrica Kruskal-Wallis aplicada para homogeneidad de grupos a NMP de bacterias nitrificantes para estandarización del tiempo Numero de Homogeneidad de Variable Rango medianas muestras grupos

D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18 Total

37.1 95.5 177.6 190.9 173.7 101.0 36.2 116.0

33 33 33 33 33 33 33 231 Valor de p 0.0000

C B A A A B C

Tabla 13. Test de Shapiro-Wilk aplicado a NMP de bacterias denitrificantes para estandarización del tiempo

Variable D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18

n 33 33 33 33 33 33 33

amplitud 0.8641 0.8689 0.8212 0.8306 0.8306 0.8995 0.8904

78

p 0.0007 0.0009 0.0001 0.0001 0.0001 0.0052 0.0030

Tabla 14. Prueba no paramétrica Kruskal-Wallis aplicada a homogeneidad de grupos a NMP de bacterias denitrificantes para estandarización del tiempo

Variable

Rango mediana

D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18 Total

20.6 59.7 138.2 189.4 189.4 140.0 74.7 116.0

Numero de muestras 33 33 33 33 33 33 33 231

Homogeneidad de Grupos D CD B A A AB C

Valor de 0.0000

Tabla 15. Prueba no paramétrica Kruskal-Wallis aplicada para homogeneidad de grupos a NMP de bacterias nitrificantes para estandarización de sales con un α 0.05

Variable T1 T2 T3 T4 Total

Rango Mediana 53,0 22,2 38,0 8,8 30,5

Numero de muestra 15 15 15 15 60 Valor –P 0.0000

Homogeneidad de grupos A BC AB C

Tabla 16. Prueba no paramétrica Kruskal-Wallis aplicada para homogeneidad de grupos a NMP de bacterias denitrificantes para estandarización de sales α 0.05

Variable T1 T2 T3 T4 Total

Rango Mediana 52,9 22,0 38,1 9,0 30,5

Numero de muestra 15 15 15 15 60 Valor-P 0.0000 1

79

Homogeneidad de grupos A BC AB C

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA E INDUSTRIAL

Estandarización del tiempo de incubación y concentración de CaCO3, SO4(NH4)2 y KNO3 para la prueba del NMP con bacterias nitrificantes y denitrificantes usando como matriz compost NATALIA CAROLINA RODRIGUEZ MORENO CHRISTIAN ALFONSO TORO LOZANO

CICLO DEL NITROGENO

AEROBIOSIS

Remineralización

Nitrificación

N ORG Reducción

Heterótrofos

Amonificación

Desasimilatoria

ifi

N

ni tr

de

De s

ANAEROBIOSIS

ció n

ca ció n

Fij a

Freshwater Ecology, Dodds 2001, Academic press

NITRIFICACION 1

2

NH3 + O2 + 2H+ + 2e- → NH2OH + H2O → NO23 + 5H+ H2O → NO3- + 2H

1. Amonio Monooxigenasa (AMO) 2. Hidroxilamina Oxidoreductasa (HAO) 3. Nitrito Oxidoreductasa (NOR)

BACTERIAS NITRIFICANTES • • • • • •

Gram negativas Bacilar, espiral o esférica Flagelos Quimiolitótrofas / quimioautotrofas pH de 4.5 a 8 / Tº 25-35ºC

Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus, Nitrosolobus y Nitrosovibrio • Nitrobacter, Nitrospira, Nitrospina y Nitrococcus

http://www.procrastin.fr/blog/images/bacterie/Nitrosomonas

(Head et al., 1993; Bock et al. 1990)

Inhibición: Alta humedad, materia orgánica, metales pesados, exceso de amonio http://www.science.oregonstate.edu/bpp/Labs/arpd/Nedivzoomin.jpg

DENITRIFICACION 1

2

3

4

NO3 - → NO2 - → NO → N2O → N2 2NO3- + 5H2 → N2 + 4 H2O + 2OH-

(1)Nitrato Reductasa (NAR) (2)Nitrito Reductasa (NIR) (3)Oxido Nítrico Reductasa (NOR) (4)Oxido Nitroso reductasa (NOS)

BACTERIAS DENITRIFICANTES • Características filamentosas • Dependen: Humedad del suelo [] O2 [] de NO3[] carbono pH y Tº

(Tiedje 1988; Vermoesen et al., 1993; Nelson y Terry 1996)

http://genome.jgi-psf.org/draft_microbes/ images/thide.jpg

• Alcaligenes sp, Nocardia sp. E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Paracoccus denitrificans, Thiobacillus

denitrificans, Thiosphaera pantotropha

(Hutchinson 1970; Zumft 1997; Bell y Ferguson)

• Inhibidores: amoniaco o metabolitos orgánicos nitrogenados reducidos, ↑↑ amonio, acidez, Acetileno, O2

(Revsbech et al., 1988; Maier 2000; Atlas y Bartha 2002)

http://v2.pseudomonas.com/images/ paeruginosa.jpg

Técnicas Microbiológicas • Recuento en placa

• Cromatografía http://www.calidadambiental.info/murcia/images/cromatografo.jpg

http://www.isasaleon.com.mx/productos/ovibond/pfx880p.jpg

• Colorimetría

• Numero Mas Probable (NMP)

NMP ⇒ Densidad poblacional de un grupo determinado de microorganismos de forma indirecta

__________________________________________ 1933 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

1964 1965

1973

1982

1991 1992

2005

Halvorson y Ziegler→ Enumeración de las bacterias denitrificantes en suelo Girard y Rougieux → NMP → Describen técnica bacterias nitrificantes y denitrificantes Alexander Focht y Joseph Técnica en Microplacas Tiedje → Describe la técnica para Nitrificantes Verhagen y Laanbroek → bacterias nitrificantes quimiolitotrófas y heterótrofas Weier y Macrae → enumeración de bacterias denitrificantes Hashimoto et al → modificaron NMP de Tiedje

Reactivo de Griess

N

ll

NH2

N

⏐

⏐

⏐

+

HNO2

⏐

SO3H Acido Sulfanílico

+

→

⏐

SO3H Acido Nitroso

Acido sulfanílico diazotizado (sal de diazonio incoloro)

(incolora)

⎯N=N⎯ [C6H5NHN+H3] ⎯ OSO3H

Agente reductor

Polvo de Zn++ Arilhidrazina (compuesto coloreado)

α-Naftilamina

Acoplamiento

(incoloro)

NH2

+ H2O

CH3COOH + Acido acético

⏐ SO3H

⏐ NH2 ρ-Sulfobenceno-azo-α-naftilamina

(colorante azo rojo) (hidrosoluble)

BIOINSUMO

→

Inoculantes microbiales Controlador de plagas Bioabono

Recurso o producto de origen biológico elaborados comercialmente

Nutrición vegetal

MIC

Características biológicas del suelo

COMPOST ↑↑ nutrimento ↑↑ flora microbiana

NH4 Formas inorgánicas nitrogenadas NO3

Mejora calidad del suelo

OBJETIVO GENERAL Estandarizar el tiempo de incubación y concentración de CaCO3, SO4(NH4)2 y KNO3 para la prueba del NMP con bacterias nitrificantes y denitrificantes usando como matriz compost.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Establecer diferencia entre los valores de NMP para bacterias nitrificantes y denitrificantes provenientes del proceso de compostaje determinando el día de mayor abundancia. • Determinar la importancia de la adición de CaCO3 sobre la recuperación de biomasa y actividad de bacterias nitrificantes y denitrificantes provenientes del proceso de compostaje. • Evaluar dos concentraciones de SO4(NH4)2 y KNO3 necesarias para estandarizar cual favorece el mayor recuento de bacterias nitrificantes y denitrificantes respectivamente por la técnica del NMP en compost.

DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

Investigación ⇒ experimental

Factores de diseño Concentración KNO3

Concentración de SO4(NH4)2

Tiempo de incubación

Requerimiento de CaCO3

Niveles del factor de diseño

Concentración de sales y requerimiento de CaCO3 en los medios de cultivo para bacterias nitrificantes y denitrificantes

TRATAMIENTOS

Con CaCO3

Medio Amonio

1 0.5 g SO4 (NH4)2

3 0.33 g SO4(NH4)2

Sin CaCO3

Medio Amonio

Medio Nitrato

1 0.5 KNO3

3 2 g KNO3

2

0.5 g SO4(NH4)2

4 0.33 g SO4(NH4)2

Medio Nitrato

2 0.5 KNO3

Figura 1. Niveles del factor de diseño utilizados para estandarizar la concentración de SO4(NH4)2 y KNO3 y la adición o no de CaCO3

4 2 g KNO3

Población de Estudio y Muestra Compost de 13 semanas a partir de cultivo de flores ↓ Tocancipá (Cundinamarca) ⇓ 2.600 m.s.n.m. temperatura promedio de 14 ºC (IGAC 1996)

Compost de 13 semanas de maduración

10 submuestras

Variable Dependiente ↓ Concentración de bacterias por el NMP/g de muestra

Muestra compuesta

Estandarización del Estandarización de la concentración tiempo de de sales incubación ↓ ↓ 5 muestras 11 muestras durante Variables independientes ↓ 22 días 15 días ↓ muestra preliminar y Concentración de Requerimiento 10 muestras prueba de CaCO3 SO4(NH4)2 y KNO3 Tiempo de incubación

MÉTODOS • Determinación del pH del compost • Estandarización del Tiempo de Incubación • Estandarización de Sales • Número Más Probable Bacterias Nitrificantes • Número Más Probable Bacterias Denitrificantes • Análisis de Información

Estandarización del tiempo de Incubación T1

11 muestras

NITRIFICANTES 1 g CaCO3 0.5 g SO4(NH4)2

CALDO AMONIO

DENITRIFICANTES 5 g CaCO3 0.5 g KNO3

CALDO NITRATO

•

12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18 días

•

Análisis estadístico de los resultados obtenidos se seleccionó el día de mayor producción de biomasa para todas las muestras Kowalchuk et al., 1999

Estandarización de Sales Tabla 2. Medio nitrato con componentes a diferentes concentraciones Tabla 1. Medio amonio con componentes a diferentes concentraciones

Concentración de CaCO3

Concentración de SO4(NH4)2

1 g (Verhagen y Laandbroek 1991)

0.5 g (Verhagen y Laandbroek 1991) 0.33 g (Girard y Rougieux 1964)

0 g (Girard y Rougieux 1964)

0.5 g (Verhagen y Laandbroek 1991) 0.33 g (Girard y Rougieux 1964)

• 5 muestras nuevas • 4 tratamientos • Leídos el día de incubación determinado

Concentración de CaCO3

5 g (Verhagen y Laandbroek 1991)

0 g (Girard y Rougieux 1964)

Concentración de KNO3 0.5 g (Hashimoto et al., 2005) 2 g (Girard y Rougieux 1964) 2 g (Girard y Rougieux 1964) 0.5 g (Hashimoto et al., 2005)

Número Más Probable Bacterias Nitrificantes

10-1

+++++ 1 ml

2 gotas de reactivo de Griess

Caldo amonio 28ºC

10-2

Rojo

2 semanas

1 ml Caldo amonio

Incolora

↓ nitritos

10 g + 90 ml

polvo de zinc

10-3

1 ml

+++++ Caldo amonio

Tablas de Cochran 1950

NaranjaRojo

Incolora

↓

2 gotas de reactivo de Nessler

Nitrato

Amonio

amarillo

Número Más Probable Bacterias Denitrificantes

10-1

+++++ 1 ml

2 gotas de reactivo de Griess

Caldo nitrato

10-2

Rojo

28ºC 2 semanas Anaerobiosis

1 ml

↓

Incolora

nitritos

Caldo nitrato

2 gotas del reactivo de Nessler

10 g + 90 ml

Amarillo

10-3

1 ml

+++++ Caldo nitrato

Tablas de Cochran 1950

↓

Incolora

Amonio

+ polvo de zinc

Análisis de Información

Tiempo de incubación 1. Medias del resultado de NMP 2. Prueba de Shapiro Wilk 3. No distribución normal 4. Kruskal-wallis con un α de 0.05 (Sokal y Rohlf 2000) 5. Hipótesis: H0: Las medias de la biomasa en los días 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18 de incubación son iguales Hi : Al menos una de las medias es diferente

Concentración de SO4(NH4)2 / KNO3 con y sin CaCO3 1. 2. 3. 4.

Medias del resultado de NMP de bacterias Prueba de Shapiro Wilk No distribución normal Kruskal-wallis con un α de 0.05 (Sokal y Rohlf 2000)

5. Hipótesis:

H0 = µ1 = µ2 = µ3 = µ4 Hi = µ1 ≠ µ2 = µ3 = µ4

RESULTADOS

http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/images/Citrobacter.jpg

Residuos de pompón, papel, un inoculante microbiano y leche

00074 de 2002 del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural

Abono foliar de origen natural y preparados vegetales

Figura 2. Pilas de compostaje muestreadas, Cultivos del Norte

Características de las muestras para estandarización del tiempo de Incubación 8.6

25

8.4

20

8.2

Temperatura ºC

30

21ºC 19ºC / 24ºC pH 7.89/ 8.54

T

8

10

7.8

5

7.6

0

7.4

pH

15

pH

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Día de Muestreo

Figura 3. pH y temperatura de las muestras recolectadas para la estandarización del tiempo de incubación del NMP en bacterias nitrificantes y denitrificantes

Tº → ↓ Actividad microbiana pH → Actividad y procesos metabólicos

Características de las muestras para estandarización de Sales 8.3

25

8.25

20

8.2 Temperatura ºC

15 8.15 pH

10

T pH

8.1 5

8.05

0

8 1

2

3

4

5

Día de Muestreo

Figura 4. pH y temperatura de las muestras recolectadas para la estandarización de sales del NMP en bacterias nitrificantes y denitrificantes.

21ºC 19ºC / 24ºC pH 8.08/ 8.24

Estandarización del tiempo de Incubación BACTERIAS NITRIFICANTES BACTERIAS DENITRIFICANTES T1 0.5 g de SO4(NH4)2 con 1 g de CaCO3

0.5 g de KNO3 con 5 g de CaCO3 Verhagen y Laanbroek (1991) Kowalchuk et al., (1999)

BACTERIAS NITRIFICANTES () bacterias nitrificantes (NMP/g)

150

116 NMP/g de compost 14 NMP/g de compost 100

NH4 → NO3 → 15 días Quastel y Scholefield 1951; Verhagen y Laanbroek 1991

50

0

D12

D12

D13 D13

D14 D14

D15 D15

D16 D16

D17 D17

D18 D18

Tiempo de Incubación (Días)

Tiempo de Incubación

Figura 5. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias nitrificantes con desviación estándar

C o n c e n t ra c io n ( N M P /g )

143 NMP/g de compost 70 NMP/g de compost 160 140 120 100 80 60 40 20 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Numero de Muestra Figura 6. Registro de las medias del NMP/g de bacterias nitrificantes el día 15 de las muestras recolectadas para la estandarización del tiempo de incubación

11

Coexisten NO2 y NO3

Yuan et al. (2005) y Degrange y Bardin (1995)

Leer técnica ↑ tubos positivos Belser y Schmidt (1978)

NITRITO POSITIVO

Desnitrificación completa Cadrin 1997

7-14 días → ↑ actividad ↑ crecimiento

Gómez y Nageswara 1995; Fleisher et al. 1987

Figura 7. Prueba positiva (roja) en caldo amonio para bacterias nitrificantes, a los 15 días de incubación

4CH2O + 4 NO3 + 4H + 5e → 4CO2 + 2N2O + 6 H2O 5CH2O + 4 NO3 + 4H + 5e → 5CO2 + 2N2 + 7 H2O

BACTERIAS DENITRIFICANTES () bacteria denitrificantes (NMP/g)

40

31.42 NMP/g de compost

30

20

Suelo árido y suelo humedecido Smith y Parsons 1985

10

0

D12

D12

D13

D13

D14

D14

D15

D15

D16

D16

D17

D17

D18 D18

Tiempo de Incubación (días)

Tiempo de Incubación

Figura 8. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias de denitrificantes con desviación estándar

21 días de incubación a 4 diferentes profundidades de suelo Belser 1977

12 horas ⇓ Incubación ⇓ Sobre incubación de muestras ↓ Zn

Samuelsson 1985

NITRATO POSITIVO

AMONIO POSITIVO

39 NMP/g de compost 23.3 NMP/g de compost

45 C o n c e n t r a c io n ( N M P /g )

40

Concentraciones de biomasa fueron heterogéneas.

35 30 25

Interrupción enzimática del proceso por O2

20 15

↓

10

Nitrato Nitrito Oxido nitroso reductasa

5 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

⇓

P. denitrificans → mRNA

Numero de Muestra Figura 9. Registro del NMP/g de bacterias denitrificantes de las muestras recolectadas para la estandarización del tiempo de incubación Bell y Ferguson 1991

↓

Thiosphaera pantotropha Azotobacter: Nitrogenasa

Acumulación de nitrito

Samuelsson et al., 1988

O2 NO3

P. fluorescens

Estandarización de Sales Estandarización de la concentración de y SO4(NH4)2, KNO3 la adición o no de CaCO3

Bacterias Nitrificantes Bacterias Denitrificantes

BACTERIAS NITRIFICANTES () bacterias nitrificantes (NMP/g)

120

AMO se inhibe