¿Por qué hacer estudios genómicos en mirtáceas nativas en Uruguay? Dos ejemplos.

Marianella Quezada Clara Pritsch Jornada Técnica en Biotecnología Forestal INIA Tacuarembó 2012

Genómica Se enfoca al estudio de la información codificada en el ADN de un individuo Algunas preguntas que estudia la Genómica ¿Cuáles son las diferencias y semejanzas en el ADN entre individuos de diferentes especies, poblaciones, tipos de plantas? ¿Cómo está organizado físicamente (estructura) el genoma de una especie? ¿Cuáles regiones en el ADN contienen los genes responsables de la expresión de una característica agronómica productiva en particular como : sabor de fruta, largo de ciclo etc? ¿Cuáles son los individuos portadores de información genética mas favorable?

La genómica de las mirtáceas está en gran desarrollo

Distribución de la familia Myrtaceae

Adaptado de Heywood 1996

Organización de las mirtáceas en tribus Grattapaglia, 2012

Mirtáceas nativas

Guayabo

Pitanga

Arazá

(33)

E. globulus

E. grandis

Mirtáceas exóticas

Importancia económica Aceites

Fuente madera o fibra

Eucalyptus grandis

Melaleuca alternifolia

Especies

Producción de fruta fresca

Psidium guava

Pimenta dioica

La importancia económica de esta familia ha incentivado la realización de estudios genómicos pero con nivel de desarrollo variable.

Estudios genómicos Como todo proceso generador de conocimiento los énfasis en los estudios genómicos se balancean entre: EXPLORACION

VS.

EXPLOTACION

Eucalyptus género pilar en la exploración del genoma: 9 Desarrollo del primer mapa de ligamiento para una especie leñosa. Actualmente mapas altamente saturados 9 Publicación del primer genoma de referencia completamente anotado (E. grandis, BRASUZ1) (2012) 9 Identificación de genes asociados a caracteres de interés: crecimiento y propiedades de la madera, resistencias a estrés biótico y abiótico

Exploración de la información genómica en Eucalyptus Conocimiento Genómica  estructural

Genómica  funcional

Herramientas

Tamaño del genoma

Mapas genéticos

Número de genes

Mapas físicos

Variantes alélicas

Mapas funcionales

Familia de secuencias repetidas

Bibliotecas genómicas

Organización de la información genética

Microarreglos (DArT, SFPs)

Localización de genes y QTLs asociados a  caracteres de interés (formación de madera,  estrés biótico y abiótico, propagación  vegetativa)

Borrador del genoma  ensamblado de E. grandis

Catalogo y perfil de expresión de genes  vinculados a: estrés por frío, formación de  madera, resistencia a enfermedades,  metabolismo secundario

Base de datos de EST

Identificación de genes candidatos

Validación de la función  propuesta del gen  candidato:

Explotación de la información genómica en Eucalyptus Manejo de poblaciones Diversidad genética, prueba de paternidad, estimación de heterocigosis, identificación de clones Selección asistida por marcadores Con dificultades de implementación en familias poco relacionadas Selección genómica Resultados preliminares prometedores Tecnología transgénica Tolerancia a helada

Ejemplo: explotación de la información genómica

Grattapaglia, 2004

Situación de los estudios genómicos en otras mirtáceas

Eucalypteae Myrteae

.

P cattleianum

P. acutangulum

Guayabo del país (Acca sellowiana)

Psidium guajava

Psidium guajava

Pimenta idoica

Campomanesia adamantium

E. grandis

Gomidesia affins

Calyptranthes brasiliensis

Accara elegans

Acca sellowiana

E. globulus

Myrciaria glazioviana

Eugebnia uniflora

Corymbia citriodora

E. camaldulensis

Eucalyptus urophylla

Eucalyptus urophylla

Eucalyptus globulus

1.000

Eucalyptus globulus

Eucalyptus grandis

Eucalyptus grandis

Contenido 1C de ADN (pg)

Tamaño del genoma en mirtáceas

Adaptado de Grattapaglia 2012

Guayabo brasilero (Psidium guajava) Arazá (Psidium cattleianum)

0.800

0.600

0.400

0.200

0.000

Guayabo del país (Acca sellowiana) 9 Buena producción de fruta 9Fruto con propiedades nutracéuticas 9Vitamina C, Iodo 9 Rico en bioactivos con propiedades biomédicas (Bontempo et al., 2007) • antimicrobiana • anti-oxidante • anti-inflamatoria • anti-cancerígena • inmunoestimulante 9 Integrante de la comunidad de especies que comparte microorganismos beneficiosos y patógenos con Eucalyptus

Integración al sistema productivo DESARROLLO TECNOLÓGICO 9Cultivares 9Sistemas de producción 9Sistemas de propagación 9Manejo de post-cosecha 9Marketing

…en Uruguay • Especie prioritaria en el Programa de Selección de Frutas Nativas (FA-UdelaR, INIA, Dirección Forestal-MGAP) • Prospección e Instalación de materiales en la EFFAS para evaluación de caracteres agronómicos • Selección de genotipos destacados por calidad de fruta (tamaño, sabor, productividad) • Realización de cruzamientos dirigidos entre padres seleccionados, con el fin de identificar genotipos recombinantes superiores

Liberación de cultivares adaptados a nuestras condiciones locales Diferentes estrategias de análisis genómico como apoyo al mejoramiento genético

Algunas características de A. sellowiana que facilitan los análisis genéticos • Se cuenta con material , de buen adaptación, genéticamente elite diverso • Diploide • Numero cromosómico conocido 2n = 22 • Genoma pequeño • Especie alógama, con facilidad para realizar cruzamientos • Gran producción de semillas por frutos • Corto período juvenil • Optimización de metodologías de propagación vegetativa • Mapas genéticos disponibles en especies emparentadas (Eucalyptus spp, Psidium guajava,)

Un nuevo desafío:

Profundizar en la exploración del genoma de A. sellowiana

Hacia la caracterización de la estructura del genoma de Acca sellowiana: abordajes genéticos, citológicos y moleculares (2009-2011) Proyecto

¿Que hemos aprendido estudiando el ADN de las diferentes colecciones de guayabo del país? CUATRO POBLACIONES (PLANTAS SILVESTRES)

ALTA DIFERENCIACION GENETICA ENTRE POBLACIONES (Baccino, 2011)

JARDIN DE INTRODUCCION- EEFAS (PLANTAS SELECCIONADAS)

AMPLIA (Y NOVEDOSA) DIVERSIDAD GENETICA ENTRE PLANTAS DE ALTO VALOR AGRONOMICO (Quezada, 2008)

Tamaño del genoma (contenido de ADN en pg) 1. Confirmar el tamaño del genoma del guayabo (contenido total del ADN) con ejemplares de Uruguay

Contenido 1C de ADN (pg)

Metodología: citometría de flujo

0,37 pg El genoma de A. sellowiana es pequeño. 1C = 0,37pg Es tres veces menor que el genoma de Eucalyptus

Número de cromosomas 2. Determinar si existe variación en el número de cromosomas presentes en el genoma dentro de la especie 3. Caracterizar los cromosomas de acuerdo a su morfología y distribución de secuencias de ADN eucromáticas y heterocromáticas

Se confirmó el número cromosómico esperado de 2n = 22. Todos los cromosomas son metacéntricos con un largo entre 0.74 μm y 2.46 μm. El par cromosómico 4 se distingue por presentar una región satelital

Foto: C. Mazzella

Identificación de sitios específicos en el genoma de A. sellowiana 4. Identificar secuencias de ADN reconocibles, como señalizadores de sitios específicos en el genoma (marcadores moleculares).

Utilizando diferentes técnicas de análisis de ADN se detectaron en total 299 marcadores moleculares (cada marcador señala un sitio en el genoma).

Construcción de mapa genético 5. Identificar en el genoma la localización de dichos marcadores y generar un mapa genético que describa dicha información • Cruzamiento biparental entre padres contrastantes en caracteres morfológicos y productivos, que mostraron polimorfismo en los 299 marcadores seleccionados. •Progenitores heterocigotos, Programa de mejoramiento genético • Cruzamiento dirigido oct-2008 • Población F1 de 160 individuos sembrados a campo mayo-2009

X

♀ TCO

♂

BR

Población de mapeo Característica

TCO

BR

Origen

Silvestre

Huerta comercial

Tamaño de fruta

Pequeña

Grande

Amarilla brillante

Verde oscura

Muy fina

Gruesa

Sabor

Muy bueno

Sin sabor

Pulpa

Fundente

No fundente

Bueno

Bueno

Muy bueno

Muy bueno

Color cáscara Grosor cáscara

Desarrollo Productividad

F1 (Salto, EEFAS)

Beatriz Vignale

Ordenamiento de las regiones genómicas definidas por los marcadores moleculares definiendo un mapa genético (pseudo test cross, OneMap)

Características

Mapa Integrado TCO x BR

Número de marcadores mapeados

224

Grupos de ligamiento

38

Largo total del mapa (cM)

2927,9

Largo del grupo mayor (cM)

448,1

Largo del grupo menor (cM)

6,4

Largo promedio de grupos

77,1

Distancia promedio entre marcadores (cM)

16, 0

Densidad de marcadores (cM/numero marcadores)

13,1

Mapa integrado 1

2

E_AAC/M_CTC_291.88_D1.13 AG8TA_14_C8 E_AAT/M_CAG_86.27_C8 E_AAT/M_CAG_122.38_C8 E_AAT/M_CAG_55.39_C8 E_AAT/M_CCG_147.9_D2.18 E_ACG/M_CAC_106.63_C8 E_AAC/M_CTC_83.31_C8 E_AAC/M_CTA_100.79_C8 E_AAT/M_CAG_258.9_C8 E_AAC/M_CTA_101.95_D2.18 E_AAT/M_CAC_307.87_C8 E_ATG/M_CAG_280.68_C8 E_ATG/M_CAG_356.11_C8 E_ATG/M_CAG_299.63_D2.18 E_ATG/M_CAG_190.54_C8 E_ATG/M_CAG_116.34_D2.18 E_AAT/M_CAC_237.24_C8 E_AAT/M_CTC_77.5_C8 E_AAT/M_CAC_283.11_C8 E_AAC/M_CTC_181.28_C8 E_ATG/M_CAG_169.32_C8 E_ACG/M_CTA_205.05_D2.18 E_ACG/M_CTA_201.17_D2.18 E_ACG/M_CTA_68.09_D2.18 E_AAC/M_CGA_294.01_D1.13 E_AAT/M_CGA_230.63_D1.13 E_ACG/M_CCG_101.85_D1.13 E_ACG/M_CCG_72.68_D1.13 E_AAT/M_CAC_238.03_D2.18 E_AAT/M_CAC_236.02_D2.18 AG8TA_03_D1.13

0.0 19.6 39.1 63.0 75.4 86.1 97.6 119.3 140.7 143.1 144.5 169.2 180.4 186.0 186.8 200.6 225.3 233.9 237.9 248.4 258.9 269.1 280.4 307.3 335.9 336.0 353.9 373.6 388.1 402.7 428.7

4

0.0

0.0 17.0

E_AAT/M_CTA_200.07_D2.18 E_AAC/M_CAA_79.03_C8

GACAC3T_07_D1.13

38.9

E_ATG/M_CCG_414.39_D2.18

E_ACG/M_CGA_152.64_D1.13 E_ACG/M_CCG_234.94_D1.13 CT8TG_01_D2.18 CT8TG_04_D2.18

64.3

E_ACA/M_CAC_267.56_D2.18

136.2

CT8TG_08_C8

171.8 181.5 196.9 203.2 217.5

E_AAT/M_CTA_411.89_C8 CT8TG_02_C8 E_ATG/M_CCG_451.11_C8 E_ATG/M_CCG_449.66_C8 E_ATG/M_CCG_404.38_C8

250.3 260.6

E_ATG/M_CCG_258.29_C8 E_AAT/M_CCG_257.31_D1.13

291.6 317.9 331.0 334.4

E_AAC/M_CTA_479.5_D1.13 E_ACG/M_CAC_152.2_D2.18 E_AAT/M_CCG_137.52_D2.18 E_AAT/M_CCG_222.05_D2.18

104.9

E_AAC/M_CTA_209.08_C8

129.0 139.5 151.8 172.0

E_AAC/M_CGA_86.1_C8 E_AAC/M_CGA_114.75_D2.18 E_AAC/M_CGA_149.84_C8 E_ATG/M_CCG_177.67_D2.18

206.9 213.2

E_ACA/M_CAC_120.02_D2.18 E_AAT/M_CTA_116.03_C8

0.0

E_AAT/M_CGA_89.6_C8 E_AAT/M_CGA_80.96_C8 E_ACG/M_CTC_72.64_C8 E_ATG/M_CAC_175.47_C8 E_ATG/M_CAC_328.23_C8 E_ATG/M_CAC_128.69_C8 E_ATG/M_CAC_130.95_D1.13 E_ATG/M_CAC_206.14_C8 E_ATG/M_CAC_235.89_C8 E_ATG/M_CAC_133.14_C8 E_ATG/M_CAC_157.25_D1.13 E_ATG/M_CAC_298.71_C8 E_ATG/M_CAC_164.04_C8 E_ATG/M_CAC_113.58_C8 E_ATG/M_CAC_54.66_D1.13 E_ATG/M_CAC_102.73_C8 E_ACG/M_CCG_162.2_C8 E_ATG/M_CTT_381.14_D1.13 E_ATG/M_CTT_152.09_C8 E_ATG/M_CTT_222.78_C8 E_ATG/M_CCG_109.39_C8 E_ACA/M_CAA_144.34_C8 E_AAT/M_CTA_72.04_C8 E_AAT/M_CCG_132.34_C8

0.0 14.1 29.7 63.5 83.0 97.7 101.5 120.9 136.0 141.7 153.4 160.3 176.0 188.2 215.4 235.3 237.5 243.7 254.0 262.0 274.2 285.5

6

71.6 79.5 100.7 113.8

42.1

CT8AG_08_C8 CT8AG_01_D1.13 E_ACA/M_CAC_395.28_C8 E_AAT/M_CTA_213.19_C8 E_AAT/M_CTA_162.0_C8 E_AAC/M_CGA_290.38_C8 E_AAC/M_CGA_403.59_C8 E_ATG/M_CCG_124.7_D2.18 E_AAC/M_CGA_360.54_C8 E_AAT/M_CCG_296.43_C8 E_ACG/M_CCG_81.08_C8 E_ACG/M_CGA_129.97_C8 E_ACA/M_CAA_130.48_C8 E_ACA/M_CAC_269.64_C8 E_ACG/M_CCG_441.32_C8 E_AAC/M_CGA_243.7_D1.13 E_AAC/M_CGA_322.81_C8 E_ACA/M_CAA_155.07_C8 E_AAC/M_CAA_368.76_C8 E_ATG/M_CTT_195.66_C8 E_AAC/M_CGA_312.98_D1.13 E_AAT/M_CAG_72.8_C8 E_ATG/M_CCG_85.23_C8 E_ATG/M_CTT_164.44_C8 E_AAC/M_CGA_173.58_C8 E_AAT/M_CCG_187.61_D2.18 E_ACA/M_CAA_86.96_C8 E_AAC/M_CTA_77.25_C8 E_AAT/M_CCG_88.3_C8 E_ATG/M_CTT_324.73_D2.18 E_ACG/M_CTC_56.6_C8 E_ACG/M_CTC_59.12_C8

0.0 22.9 53.4 66.8 74.5 84.3 94.5 99.9 109.3 123.6 132.7 137.6 151.9 171.5 198.9 220.2 225.6 242.4 261.0 261.1 282.0 295.9 315.7 330.5 349.5 355.2 360.4 378.6 400.8 414.5 426.1 448.1

5

CT8TG_03_D1.13

3

7

E_AAT/M_CAC_77.61_C8

29.3 43.1 59.6 79.7 87.5 98.8 105.7

E_AAT/M_CAC_78.71_C8 E_AAT/M_CAC_97.74_C8 E_AAT/M_CAC_66.91_C8 E_AAC/M_CTC_101.69_C8 E_AAC/M_CTC_75.73_C8 E_AAC/M_CTC_97.74_D1.13 E_AAC/M_CTC_77.1_C8

136.1

E_AAC/M_CTC_166.91_C8

166.7 177.8

E_AAT/M_CAC_116.82_C8 E_AAT/M_CAC_414.06_D2.18

0.0

E_ACG/M_CTC_315.96_D2.18

36.3

Ase04_A4

63.2 73.9 91.0

CT8GG_06_D2.18 E_ACA/M_CAC_300.42_D1.13 E_ACG/M_CGA_142.11_D2.18

115.9

E_ACG/M_CTC_306.76_D2.18

Mapa integrado 8

9

GACAC3_09_D2.18 E_ACG/M_CTC_204.58_D2.18 E_ACG/M_CTC_115.35_C8 E_ACG/M_CTC_216.63_D1.13 EMBRA72_D1.9

0.0 24.3 31.8 33.5 36.7

GACAC3_02_D2.18

0.0

E_ACA/M_CAC_131.15_D2.18 E_ATG/M_CCG_69.74_D2.18 E_ACA/M_CAC_115.27_D2.18 E_ACG/M_CTC_450.29_C8

27.5 36.6 57.7 72.3

12

0.0 27.2 30.0 46.9

10

0.0 9.0 16.0 19.5

11

AG8CA_01_D1.13 E_ACG/M_CGA_145.87_D1.13 E_AAC/M_CGA_257.77_D1.13 Ase19_D1.9

13

E_AAT/M_CAC_152.24_C8 E_AAC/M_CTC_164.54_D2.18 E_AAT/M_CAC_121.23_C8 E_AAT/M_CAC_64.35_C8

0.0 19.6 19.9 36.8

0.0 11.8 32.9 46.8

14

E_AAT/M_CTA_82.67_C8 E_AAC/M_CAA_324.55_D2.18 E_AAC/M_CGA_185.61_C8 E_ACA/M_CAC_176.74_C8

E_AAC/M_CGA_215.19_D2.18 E_ACA/M_CAA_107.3_C8 E_ACG/M_CTC_123.08_D2.18 E_ACA/M_CAC_335.99_D2.18

15

0.0

AG8CA_04_C8

21.4 39.7 56.3

AG8CA_01_C8 AG8CA_05_C8 AG8CA_09_C8

0.0 2.0

CT8AG_02_D2.18 CT8AG_05_C8

30.2

CT8AG_09_C8

53.6

CT8AG_11_C8

Transferencia exitosa de marcadores microsatélites de Eucalyptus (EMBRA) en A. sellowiana.

Comparación de mapas de guayabos

Especie

P. guajava

A. sellowiana

2n = 22

2n = 22

0,551

0,503

Tipo marcadores

AFLP, SSR

ISSR, AFLP, SSR

No marcadores mapeados

578 (42 %)

224 (75 %)

11

38

Largo total del mapa (cM)

2179,0

2927,9

Largo promedio de grupos (cM)

198,1

77,1

165, 7 – 232,5

6,4 – 448,1

3,8

13,1

Lepitre et al., 2010

Este trabajo

No cromosómico Contenido 2C ADN (pg)

No grupos de ligamiento

Rango largo de grupos (cM) Densidad de marcadores Referencia

Estudios biológicos y taxonómicos en la especie frutal nativa Psidium cattleianum

Speroni G., et al.

CSIC I+D (2011-2014)

Arazá (Psidium cattleianum) • Buena adaptación • Buena producción de fruta • Alta variabilidad intraespecífica • Reproducción por semilla •Citotipos reportados en la literatura 2n= 44, 66, 77 y 88 •No se conoce la diversidad genética de las poblaciones silvestres en Uruguay •Sistema reproductivo poco estudiado. Especie potencialmente apomíctica

Tamaño del genoma y número cromosómico en P. cattleianum

Color fruto

Origen

2n

Ploidía

Contenido ADN 1C (pg)

amarillo

Uruguay

88

8x

2,1

rojo

Uruguay

88

8x

1,9

El genoma de Arazá es casi 8 veces mayor que el de guayabo

Identificación de marcadores moleculares en el genoma de P. cattleianum Aplicaciones: 9 Estudio de diversidad genética de las poblaciones silvestres de arazá 9 Dilucidación del sistema reproductivos mediante análisis genéticos de la progenie de cruzamientos dirigidos

Prospección (Speroni, G.)

Cruzamientos (Vignale, B.)

Desarrollo de marcadores moleculares microsatélites en arazá mediante transferencia desde otras Mirtáceas

Origen de los iniciadores  microsatélites

No

No de microsatélites  de microsatélites          exitosamente  evaluados transferidos

Psidium guajava      (Lepitre et al., 2010)

15

11

Acca sellowiana        (Santos et al., 2008)

13

7

Myrciaria dubia           (Rojas et al., 2008)

8

5

TOTAL

36

23

QUE SIGUE? EXPLORACION Continuar las actividades de exploración del genoma para ampliar el área explorada nuevas estrategias (nuevos marcadores)

UTILIZACION/EXPLOTACION •Encontrar asociaciones entre secuencias de ADN y funciones biológicas, caracteres productivos, riqueza de compuestos nutracéuticos, biomédicos. •Desarrollar herramientas que faciliten el Mejoramiento genético

Beatriz Vignale Pamela Lombardo

Patricio Hinrichsen Gonzalo Ravest

Cristina Mazzella Paola Gaiero Sandra Vázquez Clara Pritsch Marianella Quezada Paula Silva Gabriela Speroni

Danilo Cabrera

Dr. AAF García

Onofre Nodari Karine dos Santos

Gracias…