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ORIGINAL

Pérdida ósea posmenopáusica: estudio del polimorfismo genético y efecto de la administración de fitoestrógenos sobre los marcadores de metabolismo óseo Postmenopausal bone loss: Study of genetic polymorphism and effect of phytoestrogen administration upon bone metabolism markers García-Pérez M. A. Pineda B. 1 Cano A. 2

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1

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Unidad de Investigación del Hospital Clínico Universitario de Valencia Departamento de Pediatría, Obstetricia y Ginecología, Facultad de Medicina Universidad de Valencia

RESUMEN

ABSTRACT

Objetivo: Estudiar el efecto de la administración de fitoestrógenos (flavonoides) sobre determinados marcadores bioquímicos de metabolismo óseo a corto plazo (3 meses) en mujeres posmenopáusicas y analizar la asociación de algunos polimorfismos genéticos sobre el índice de masa corporal (IMC).

Objective: To study the short-term (3 months) effect of phytoestrogen (flavonoid) administration upon certain biochemical markers of bone metabolism in postmenopausal women, with an analysis of the association of certain genetic polymorphisms to body mass index (BMI).

Material y método: Se seleccionaron 54 mujeres en los primeros años de la menopausia para el estudio bioquímico y 102 formaron parte del estudio genético. El estudio bioquímico, lo finalizaron 49 mujeres, 22 en el grupo control y 27 tratadas con extracto de isoflavonas de soja (PhytoSoya®). Se determinó el IMC (Kg/m2), varios marcadores de metabolismo óseo como el fragmento amino-terminal del colágeno tipo I (NTx), fosfatasa alcalina ósea y total, hormona paratiroidea, etc., hormonas como la testosterona y el estradiol y citoquinas como la interleuquina-6, la osteoprotegerina, y RANKL. El ADN se obtuvo de células de sangre periférica y los polimorfismos en los genes de receptor de estrógenos alfa (ERα), CD40 y Runx2 se genotiparon mediante la técnica de PCR-RFLP.

Material and method: Fifty-four women in the first years of menopause were selected for the biochemical study, while 102 formed part of the genetic study. The biochemical study was completed by 49 women, 22 in the control group and 27 in the group treated with soy isoflavone extract (Phyto-Soya®). Determinations were made of BMI (kg/m2), several bone metabolism markers such as amino-terminal fragment of collagen type I (NTx), total and bone alkaline phosphatase, parathyroid hormone, etc., hormones such as testosterone and estradiol, and cytokines such as interleukin-6 (IL-6), osteoprotegerin, and RANKL. DNA was obtained from peripheral blood cells, and the polymorphisms of the alpha-estrogen receptor (ERα), CD40 and Runx2 genes were genotyped using the PCR-RFLP technique.

Correspondencia M. A. García-Pérez Fundación – Unidad de Investigación Hospital Clínico Universitario Avda. Blasco Ibáñez 17 46010 Valencia [email protected]

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Resultados: A los 3 meses de administrar fitoestrógenos, el perfil de metabolismo óseo no se modificó aunque disminuyó el nivel de interleuquina-6. El genotipo de los polimorfismos de restricción del gen del ERα (PvuII y XbaI) y el polimorfismo de restricción MspA1I y el de longitud (deleción de 11 alaninas) en el gen Runx2 están asociados al IMC. Conclusión: Los fitoestrógenos no han modificado el perfil de los marcadores de metabolismo óseo en un grupo de mujeres pequeño y a corto plazo. Sin embargo, el grupo de mujeres tratadas con fitoestrógenos han mostrado menores niveles de IL-6, una citoquina proinflamatoria relacionada con mayores tasas se resorción ósea. En el estudio genético, el genotipo del gen ERα se ha asociado y predice el IMC y el polimorfismo C/T del gen CD40 se relaciona con la excreción de NTx, un marcador de resorción ósea. Palabras clave: Osteoporosis, menopausia, fitoestrógenos, polimorfismo genético.

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Results: After three months of phytoestrogen administration, the bone metabolic profile showed no changes, though the IL-6 levels decreased. The genotypes of the restriction polymorphisms of the ER· gene (PvuII and XbaI) and the restriction polymorphism MspA1I and length polymorphism (deletion of 11 alanines) in the Runx2 gene are associated to BMI. Conclusion: Phytoestrogens have not modified the bone metabolic marker profile in a small group of women over the short term. However, the women treated with phytoestrogens showed lower levels of IL-6, a proinflammatory cytokine related to increased bone resorption rates. In the genetic analysis, the ERα gene genotype has been associated with, and predicts BMI, while C/T polymorphism of the CD40 gene is related to the excretion of NTx, a bone resorption marker. Key words: Osteoporosis, menopause, phytoestrogens, genetic polymorphism.

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INTRODUCCIÓN La osteoporosis (OTP) es una enfermedad esquelética caracterizada por una menor resistencia ósea y riesgo aumentado de fractura, siendo la deficiencia estrogénica que se instaura en la menopausia un importante factor de riesgo (1). Según datos de la Sociedad Española de Investigación Ósea y Metabolismo Mineral (SEIOMM), la OTP posmenopáusica afecta al 35% de las mujeres mayores de 50 años y al 52% de las mayores de 70 años. El beneficio óseo de la terapia hormonal sustitutiva (THS) en mujeres posmenopáusicas ha sido efectivo (2). Sin embargo, debido a los efectos colaterales descritos para la THS (3), se están investigando otras opciones terapéuticas. Una de estas alternativas la constituyen los fitoestrógenos, compuestos de origen vegetal que poseen una actividad estrogénica parcial (4). No obstante, aunque estos compuestos están centrando la atención de la opinión pública por su potencial beneficio para prevenir y tratar problemas cardiovasculares, óseos y climatéricos, su efectividad debe ser todavía demostrada. El método más adecuado para el diagnostico de OTP, y para monitorizar el beneficio de las terapias, es la determinación de la DMO. Sin embargo, esta

técnica es cara, lenta, y no está exenta de errores. Otra aproximación para determinar el beneficio de las terapias son los marcadores bioquímicos de metabolismo óseo. En los últimos años se han desarrollado marcadores específicos de resorción ósea, como los telopéptidos del colágeno tipo I (CTx y NTx) o los de formación ósea (fosfatasa alcalina y osteocalcina) (5,6). En numerosos estudios se han relacionado los niveles basales altos de marcadores con importante pérdida ósea (7,8). Todas las mujeres aceleran su tasa de pérdida ósea con la menopausia, sin embargo, no todas desarrollan OTP. Esto es debido a que además de los procesos desencadenados por el déficit de estrógenos, alguno de los cuales involucra al sistema inmune (9), el pico de masa ósea alcanzado en la tercera década de vida es determinante en esta patología. Este pico está controlado por factores genéticos como se ha demostrado en estudios en gemelos (10). Raramente la OTP (o la osteopetrosis) es el resultado de mutaciones en genes únicos, aunque hay ejemplos como la osteogénesis imperfecta (11,12). La variación genética normal en rasgos multigénicos no se debe a mutaciones deletéreas sino a polimorfismos comunes que alteran la función de un gen. Estos «genes de DMO» determinan las dife-

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rencias interindividuales en la DMO que se manifiesta en el pico de DMO o en la velocidad de pérdida de masa ósea con la edad. Estudios de ligamiento han identificado varios loci génicos que muestran ligamiento a la DMO de cadera o de columna como 2p23–24, 14q31–34, 22q12–13, 1p36, etc. (1113). No obstante, la mayor parte de los estudios han consistido en el análisis de genes candidatos, siendo los más estudiados los genes que regulan el metabolismo óseo y los de algunas citoquinas implicadas en la pérdida ósea posmenopáusica como el receptor de la vitamina D, receptor de estrógenos alfa (ERα), colágeno tipo 1-α1, IL-6, OPG, RANKL, etc. (1115). Alguno de ellos ha mostrado asociación a DMO, como el del receptor de la vitamina D (15). Los objetivos de este trabajo son estudiar el efecto de la administración de fitoestrógenos sobre determinados marcadores de metabolismo óseo, en mujeres posmenopáusicas a corto plazo y analizar la asociación de algunos polimorfismos genéticos sobre el índice de masa corporal, parámetro muy relacionado con la DMO. Hemos seleccionados polimorfismos en el gen ERα y Runx2, pero además lo hemos hecho también en el gen CD40 que participa en la presentación antigénica a la célula T y es importante para adquirir memoria inmunológica, habiéndose descrito la importancia de las células T en la pérdida ósea posmenopáusica (16). PACIENTES Y MÉTODOS Las mujeres que han entrado a formar parte de este estudio fueron atendidas en la Unidad de Menopausia del Hospital Clínico de Valencia. El estudio contó con la aprobación del Comité de Ética de nuestro Hospital. Las participantes son mujeres caucásicas en los primeros años de la menopausia (ADM). Esta ha podido ser natural, definida retrospectivamente por al menos un año de amenorrea y un nivel de FSH por encima de 40 UI/ml en mujeres mayores de 40 años, o quirúrgica como consecuencia de una ovariectomía bilateral realizada antes de entrar en la menopausia. Todas ellas son mujeres sanas de acuerdo con su historial médico, un examen básico y una analítica sanguínea rutinaria, no bebedoras y generalmente sedentarias. Fueron consideradas no bebedoras si no tomaban alcohol o la hacían de manera muy moderada (< 5 g día). Los criterios de exclusión fueron la inmovilidad total o parcial y haber sufrido fracturas óseas (cual-

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quier categoría) en el año anterior al estudio, enfermedades neoplásicas, uso de medicación que influye sobre el metabolismo óseo o sintomatología climatérica de una magnitud incompatible con el aplazamiento del tratamiento hormonal. De entre las mujeres seleccionadas, 54 aceptaron entrar en el estudio bioquímico y 53 entraron a formar parte únicamente del estudio genético. A todas ellas se les determinó el IMC (Kg/m2) (17,18). Con respecto al estudio bioquímico, lo finalizaron 49 mujeres, de las cuales 22 entraron a formar parte del grupo control «sin tratamiento» y 27 mujeres al grupo «tratadas con fitoestrógenos». Las mujeres tratadas con fitoestrógenos recibieron 2 cápsulas diarias de extracto de isoflavonas de soja (Phyto-Soya®). A todas ellas se les extrajo una muestra de sangre y orina basal (antes del iniciar el tratamiento si es ese el caso) y a los 3 meses. Tanto el suero como la orina de segunda micción se congeló a -70ºC hasta el día del análisis. Para el estudio genético se enrolaron estas 49 mujeres y otras 53 mujeres (102 mujeres en total). En las 53 mujeres se obtuvo una muestra de sangre y se determinó el IMC, realizándose además un pequeño cuestionario. Ensayos bioquímicos En suero, se determinó el fosfato (mg/dl), calcio total (mg/dl), fosfatasa alcalina sérica total (ALP, U/l), y magnesio (mg/dl), con un autoanalizador (Olympus AV 5200; Tokio, Japón). La PTH (hormona paratiroidea; pg/ml) y la fosfatasa alcalina ósea (ALP ósea, µg/L) se determinaron mediante un ensayo inmunoradiométrico (IRMA). La testosterona (ng/ml) (Biochem Immunosystems, Bolonia, Italia) y el estradiol sérico (pg/ml) (Delfia, Perkin Elmer, Turku, Finlandia) se determinaron mediante ensayos inmunoenzimáticos. La interleuquina-6 (IL-6; pg/ml) se analizó mediante un kit de ELISA de alta sensibilidad (Diaclone, Besançon, Francia) y la osteoprotegerina (OPG, pg/ml) y RANKL (pg/ml) mediante kits ELISA instantáneos (Bender MedSystems GmbH, Viena, Austria). En orina se obtuvo calcio total y creatinina mediante el autoanalizador (Olympus AV 600, Tokio, Japón). La concentración del fragmento amino-terminal del colágeno tipo I (NTx) se midió mediante

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ELISA (Osteomark, Ostex International; Seattle, USA) y se expresó como nmoles de equivalentes de colágeno óseo por mmol de creatinina. Obtención de ADN y genotipado de los polimorfismos El ADN se obtuvo de células de sangre periférica. Las células nucleadas se separaron tras una lisis de los hematíes mediante cloruro amónico (KHCO3 10 mM, NH4Cl 150 mM, EDTA 0.1 mM, pH 7.4). El ADN se preparó a partir de estas células mediante Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Todos los polimorfismos se analizaron con la técnica de PCR-RFLP. Para ello se amplificaron los fragmentos utilizando los oligonucleótidos específicos para cada gen mediante PCR, usando 10 ng de ADN genómico, en una mezcla de reacción conteniendo 10 mM TrisHCl pH 8.3, 50 mM KCl, 15 mM MgCl2 y 0.001% de gelatina, 0.2 mM d-NTPs, 2 µM de cada oligonucleótido, y 0.4 U de Taq polimerasa (Sigma). Los distintos fragmentos de ADN se amplificaron 35-40 ciclos mediante un termociclador (9600 Perkin-Elmer). Para cada fragmento se eligieron las temperaturas óptimas de amplificación, dependiendo del tamaño y de la secuencia de los oligonucleótidos. Para el fragmento del gen Runx2 y CD40 se añadió a la mezcla de reacción 5-10% DMSO. El éxito de la reacción se determinó por electroforesis en gel de agarosa y a continuación se digirieron 7-12 µl del producto amplificado con las enzimas especificas para cada fragmento y el resultado de la digestión se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 3% en TBE 1X (Tris 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA-Na2 2 mM). Todas las enzimas de restricción fueron de New England Biolabs (Ipswich, MA, USA). Estudiamos dos polimorfismo en el gen del ERα (19) y detectados por las enzimas PvuII (T/C en la posición –397int1) y XbaI (A/G posición –351int1). Para ello se amplificó un fragmento del intron 1 del gen ERα mediante los oligonucleótidos ER-F 5'GAT ATC CAG GGT TAT GTG GCA-3' y ER-R 5'AGG TGT TGC CTA TTA TAT TAA CCT TGA-3' lo cual rinde un fragmento de 346 pb. El fragmento digerido por PvuII (T) rinde dos bandas de 103 y 243 pb mientras que el digerido por XbaI (A) rinde dos bandas de 148 y 198 pb. La presencia y ausencia de sitios de restricción para PvuII y XbaI se designó como p/P y x/X respectivamente.

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Estudiamos asimismo dos polimorfismos en el gen Runx2. Uno consiste en un polimorfismo de deleción en la región poli-alaninas de Runx2, siendo un alelo de 17 alaninas (salvaje) y otro de 11 alaninas (18 pb más pequeño). El otro es un polimorfismo sinónimo que se encuentra dentro de la repetición de alaninas y se designa como A/G (20). El fragmento amplificado contiene la mayor parte del exon 1 y algo del intron 1, y se amplificó mediante los oligonucleótidos Runx2-F 5´-CCG GCA AAA TGA GCG ACG-3´ y Runx2-R 5´-GGG CGG TGT AGC CTC TTA CCT T-3´, que producen un fragmento de 336pb para el alelo salvaje y uno de 318-pb para la deleción 11Ala. La presencia del polimorfismo A/G se reveló con la enzima de restricción MspA1I. Hay en este fragmento un sitio para MspA1I no polimórfico que rinde dos fragmentos de 180 y 156 pb. Si adicionalmente existe el sitio polimórfico (A) el fragmento de 156 se divide en dos de 135 y 21 pb. Por último, el alelo 11Ala únicamente da los fragmentos, de 180 y 156 pb, ya que el sitio polimórfico cae en la deleción. Por último, también se estudió el polimorfismo (C/T) en la posición –1 de la secuencia Kozak en la región 5’ del gen CD40 (21). El fragmento de 302 pb se amplificó mediante CD40-F 5’-GAA ACT CCT GCG CGG TGA AT-3’ y CD40-R 5’-CCT CTT CCC CGA AGT CTT CC-3’, y se digirió con la enzima StyI, la cual corta por un sitio no polimórfico rindiendo dos fragmentos de 99 y 203 pb. Si se posee el alelo «C» el fragmento de 203 es digerido en dos de 74 y 129 pb. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se estableció la normalidad de los datos mediante test de Kolmogorov-Smirnov. Si los datos se distribuyeron normalmente, se usó el test de ANOVA para comparación de las medias. Si el test de ANOVA resultó significativo, se aplicó el test LSD de Fisher (varianzas iguales) o el test T3 de Dunnett (varianzas no iguales) para realizar comparaciones por pares. Con el test de Levene se probó la homogeneidad de las varianzas. Si los datos no estuvieron normalmente distribuidos, se aplicó el test no paramétrico de Krustal-Wallis. Se usaron modelos de regresión lineal múltiple para detectar relaciones entre las variables. Un valor de P < 0.05 se consideró como significativo.

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TABLA I. Características antropométricas de las poblaciones de mujeres no tratadas y tratadas con fitoestrógenos (Media ± EEM) Sin tratamiento Fitoestrógenos (n = 22) (n = 27) EDAD (años)

56,6 ± 1,0

54,5 ± 0,9

ADM (años)

9,1 ± 1,0

7,0 ± 0,7

Edad menopausia (años)

47,2 ± 1,2

47,5 ± 0,9

Gestaciones

2,8 ± 0,3

2,2 ± 0,2

Partos

2,4 ± 0,2

1,9 ± 0,2

Menopausia natural

17 (77%)

19 (70%)

Menopausia quirúrgica

5 (23%)

8 (30%)

Peso (Kg)

68,0 ± 2,3

66,7 ± 1,7

Talla (cm)

158,1 ± 0,9

160,3 ± 1,3

27,3 ± 1,0

26,1 ± 0,7

2

IMC (Kg/m )

(ADM: años de menopausia; IMC: índice de masa corporal)

El análisis estadístico se llevó a cabo con el programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS Inc., Chicago, IL), v. 12.0 para Windows. RESULTADOS En la Tabla I se muestran las características de la población de mujeres según el tipo de tratamiento. El

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tipo de menopausia fue similar en ambos casos y ambas poblaciones fueron homogéneas. La única variable cercana a alcanzar diferencia significativa fueron los ADM (p = 0,08). En la Tabla II (parte A) se recogen los datos séricos basales y a los 3 meses de los distintos marcadores bioquímicos estudiados. Aunque las poblaciones estudiadas fueron homogéneas en cuanto a los parámetros antropométricos el grupo de mujeres tratadas con fitoestrógenos mostró menores niveles de NTx basales y de magnesio, tanto basales como a los 3 meses. Asimismo, el grupo de mujeres tratadas con fitoestrógenos mostraron mayores niveles de estradiol que las no tratadas a los 3 meses. No obstante, si comparamos la analítica basal con la de los 3 meses para cada grupo, vemos que son prácticamente idénticas con la salvedad del nivel de estradiol, que aumenta con el tratamiento con fitoestrógenos. En la Tabla II (parte B) se relacionan los niveles de marcadores bioquímicos a los 3 meses con la analítica basal para cada tratamiento, apreciando que los niveles de IL-6 aumentaron un 75% en el grupo de mujeres no tratadas y disminuyeron significativamente un 10% en el grupo de mujeres tratadas con fitoestrógenos. Acompañando este cambio y aunque no se ha alcanzado significación estadística, la PTH aumentó más en el grupo de mujeres no tratadas (P = 0,08), mientras que el estradiol lo hizo en el grupo de mujeres tratadas con fitoestrógenos (P = 0,08).

TABLA II. Niveles de marcadores de metabolismo óseo basales y a los 3 meses según el tipo de tratamiento (A) y normalizados al valor basal en cada tratamiento (B) (Media ± EEM) A Sin tratamiento Basal 3 meses

Fitoestrógenos Basal 3 meses

B Sin Tratamiento Fitoestrógenos 3 meses 3 meses

NTx (nmoles/mmol Cr.)

65,0 ± 6,1

71,5 ± 9,5

47,8 ± 4,3 #

52,9 ± 5,1

1,11 ± 0,12

1,24 ± 0,11

Calcio / Creatinina

0,20 ± 0,03

0,20 ± 0,03

0,22 ± 0,03

0,22 ± 0,03

1,24 ± 0,21

1,34 ± 0,19

9,8 ± 0,1

9,8 ± 0,1

9,6 ± 0,1

9,7 ± 0,1

1,01 ± 0,01

1,01 ± 0,01

Calcio (mg/dl) Fósforo (mg/dl)

3,6 ± 0,1

3,6 ± 0,1

3,7 ± 0,1

3,7 ± 0,1

1,00 ± 0,01

0,99 ± 0,01

Magnesio (mg/dl)

1,94 ± 0,13

2,1 ± 0,15

1,85 ± 0,19 #

1,89 ± 0,19§

1,04 ± 0,02

1,04 ± 0,02

PTH (pg/ml)

26,6 ± 3,8

35,3 ± 4,0

23,9 ± 2,2

26,8 ± 2,6

2,23 ± 0,50

1,36 ± 0,20

Fosfatasa alcalina (U/L)

166,2 ± 6,5

174,7 ± 7,9

150,8 ± 8,0

155,1 ± 7,4

1,06 ± 0,03

1,03 ± 0,03

Estradiol (pg/ml)

22,6 ± 3,8

14,6 ± 3,3

22,9 ± 3,40

37,9 ± 5,8 * §§

1,01 ± 0,26

3,06 ± 0,98

Testosterona (ng/ml)

0,54 ± 0,07

0,50 ± 0,05

0,56 ± 0,05

0,65 ± 0,06

1,26 ± 1,20

1,45 ± 1,25

Interleuquina-6 (pg/ml)

0,91 ± 0,14

1,17 ± 0,20

1,10 ± 0,14

0,87 ± 0,12

1,75 ± 0,41

0,90 ± 0,09 ¶

# p < 0.05 respecto a analítica basal del grupo sin tratamiento, § p < 0.05 y §§ p< 0.01 respecto analítica 3 meses del grupo sin tratamientos.* p < 0.05 respecto a basal dentro del mismo grupo de tratamientos.¶ p < 0.05 respecto a grupo sin tratamientos.

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En la Tabla III se muestran tanto las características antropomórficas como los niveles de varios marcadores bioquímicos del metabolismo óseo de la población de mujeres del estudio genético, una población similar al del estudio bioquímico, con 55 años de edad media y 8 años de media transcurridos desde la menopausia. El porcentaje de mujeres con menopausia natural (76.5%) y quirúrgica (23.5%) también fue similar. Los niveles de IMC y de algunas proteínas y hormonas según el haplotipo del gen del receptor de estrógenos mostraron una tendencia no significativa (p = 0.11) de disminuir el IMC con el genotipo «px», de manera que el grupo de mujeres con dos

TABLA III. Características antropométricas y valores de los principales marcadores de metabolismo óseo basales en el grupo de mujeres del estudio de polimorfismo genético (Media ± EEM) Media ± EEM EDAD (años)

55.2 ± 0.7

ADM (años)

8.2 ± 0.6

Edad menopausia (años)

47.1 ± 0.5

Gestaciones

2.58 ± 0.14

Partos

Fig. 1. Valores de IMC, de RANKL y de osteoprotegerina (OPG) según el genotipo del polimorfismo del gen Runx2. Se han omitido genotipos A + deleción y deleción + deleción ya que son muy minoritarios en nuestra población. (p< 0.05 respecto al genotipo GG).

Fig. 2. Valores de IMC y de NTx según el genotipo del polimorfismo del gen CD40. (p < 0.05 respecto al genotipo CC)

2.23 ± 0.11

Menopausia natural

78 mujeres (76.5 %)

Menopausia quirúrgica

24 mujeres (23.5 %)

Peso (Kg)

65.2 ± 1.0

Talla (cm)

156.3 ± 0.6

IMC (Kg/m2)

26.7 ± 0.4

NTx (nmoles/mmol Cr.)

69.2 ± 3.5

Calcio / Creatinina

0.20 ± 0.02

Calcio (mg/dl)

9.51 ± 0.04

Fósforo (mg/dl)

3.64 ± 0.05

Magnesio (mg/dl)

1.97 ± 0.02

PTH (pg/ml)

41.7 ± 1.5

Fosfatasa alcalina (U/L)

173.7 ± 4.0

Fosfatasa alcalina ósea (µg/L)

13.87 ± 0.66

Estradiol (pg/ml)

15.10 ± 1.48

Testosterona (ng/ml)

0.35 ± 0.02

Interleuquina-6 (pg/ml)

1.79 ± 0.64

Osteoprotegerina (pg/ml)

100.2 ± 4.0

RANKL (pg/ml)

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25.57 ± 1.82

copias de este haplotipo ppxx mostraron menores valores de IMC (Tabla IV). Este grupo de mujeres ppxx también mostraron menores niveles, aunque no significativos, de fosfatasa alcalina ósea y de OPG y mostraron claramente menores niveles de testosterona (p < 0.05) (Tabla IV). Los niveles de IMC, y de RANKL y OPG en suero según el haplotipo del gen Runx2 presentaron un aumento significativo del IMC en el grupo de haplotipo G + deleción (Figura 1) acompañado de una tendencia a mostrar menores niveles de RANKL séricos. La diferencia de los niveles de IMC y de NTx, según el genotipo del gen CD40, no fue significativa, aunque se observó una tendencia a aumentar el IMC con

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TABLA IV. Niveles de IMC y de algunas proteínas y hormonas agrupadas según los tres haplotipos principales de los polimorfismos PvuII y XbaI del receptor de estrógenos. Media ± EEM ppxx

Haplotipo PpXx

IMC (Kg/m2)

26.20 ± 0.79

26.58 ± 0.58

28.31 ± 1.22

Fosfatasa alcalina ósea (µg/L)

11.63 ± 1.35

13.94 ± 0.96

16.11 ± 1.74

OPG (pg/ml)

86.51 ± 30.73

96.70 ± 28.70

102.63 ± 24.96

0.27 ± 0.18

0.33 ± 0.18

0.43 ± 0.20 #

Testosterona (ng/ml)

PPXX

# p < 0.05 respecto a grupo ppxx.

TABLA V. Análisis de regresión lineal múltiple entre IMC, NTx y fosfatasa alcalina ósea (ALP ósea) y varias variables clínicas y bioquímicas Ecuación IMC = 19.44

NTx = 98.12

ALP = 4.24

T

P

+ 0.88 (Número de gestaciones)

+ 3.05

< 0.01

+ 1.37 (genotipo ERα)

+ 2.10

< 0.05

– 11.60 (genotipo CD40)

– 2.76

< 0.01

– 1.39 (ADM)

– 2.57

< 0.05

+ 0.16 (RANKL)

+ 3.67

< 0.001

+ 2.85 (genotipo ERα)

+ 2.56

< 0.05

el alelo T, de manera que el grupo de genotipo TT es el de mayor IMC. Esto se acompañó de una disminución significativa de la excreción de NTx en este grupo de mujeres (Figura 2). En la tabla V se muestran los resultados de la regresión lineal del IMC, NTx y fosfatasa alcalina ósea con el número de gestaciones y genotipo ERα para IMC; el genotipo CD40 y los ADM para el NTx y los niveles de RANKL y de nuevo el genotipo para ERαpara la ALP ósea. DISCUSIÓN La retirada de la protección estrogénica durante la menopausia o tras una ovariectomía bilateral produce un aumento del remodelado óseo con el resultado de pérdida ósea neta. La terapia hormonal sustitutiva es un remedio eficaz para combatir la sintomatología climatérica y para evitar la pérdida ósea posmenopáusica. Varios estudios han demostrado que la THS frena e incluso revierte la perdida ósea posmenopáusica (2), ligado a una disminución en los marcadores de metabolismo óseo y de algunas citoquinas proinflamatorias que intervienen en el proceso (22-24).

2

R adj 0.39

0.19

0.21

En la actualidad, sin embargo, los clínicos y las propias mujeres presentan ciertas reticencias hacia la THS tras describirse un aumento en el índice de aparición de cáncer de mama y de algunos problemas vasculares asociados (3,25). Por este motivo se están buscando nuevas posibilidades terapéuticas como las que actúan a través del receptor de estrógenos, entre los cuales están los SERMs (selective estrogen receptor modulators) y los fitoestrógenos. El beneficio óseo de SERMs como el raloxifeno ha sido ampliamente probado (26,27). Sin embargo, aunque se han descrito efectos óseos positivos en modelos animales y en el tratamiento de la sintomatología climatérica en mujeres posmenopáusicas, el beneficio óseo de los fitoestrógenos sobre la perdida ósea posmenopáusica no se ha establecido (4). Hemos administrado en nuestro estudio fitoestrógenos (extractos de isoflavonas) a una población pequeña de mujeres y analizado el comportamiento de varios marcadores bioquímicos relacionados con el metabolismo óseo. Aunque los marcadores de resorción disminuyen a los 3 meses de iniciar terapias, como el THS o bifosfonatos (6), pensamos que para los fitoestró-

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genos este tipo de estudios debe realizarse a más largo plazo. En este estudio no hemos detectado beneficio óseo en cuanto a los marcadores clásicos de metabolismo óseo (relación calcio/creatinina, fosfatasa alcalina, NTx, etc.) aunque hemos observado una disminución significativa de la IL-6. Cuando se instaura la menopausia o tras una ovariectomía se produce un aumento en el nivel de determinadas citoquinas como la IL-1, el TNF-α y la IL-6 que promueven la resorción ósea. La IL-6 es producida constitutivamente por varias células óseas, particularmente por los osteoblastos y sus precursores (28). La IL-6 promueve la formación de osteoclastos al inducir la síntesis de IL-1 y de TNF-α (29). Asimismo, todo parece indicar que la IL-6 contribuye a la expansión de los osteoclastos a partir de precursores hematopoyéticos. Por tanto, el hecho de que el grupo de mujeres tratadas con fitoestrógenos hayan disminuido los niveles de IL-6 es un dato positivo ya que esta citoquina está relacionada con la pérdida ósea posmenopáusica. El pico de masa ósea alcanzado durante la tercera década de vida es un factor determinante para establecer si una mujer llegará a padecer OTP. Efectivamente, una mujer con alto pico de masa ósea y tasas de pérdida ósea normales, probablemente no desarrollará OTP, por lo que estará más protegida contra la fractura, ya que se ha demostrado que bajos valores de DMO se asocian a riesgo aumentado de fractura. Hay que señalar, que aunque otros factores tales como estilo de vida, tabaco, consumo de corticoides etc. son factores que influyen en la DMO, ésta viene determinada por factores genéticos. En rasgos complejos como la DMO, el tipo de herencia es multigénica y sigue un tipo de herencia cuantitativa, de manera que existen muchos genes que afectan, positiva o negativamente, la DMO. Se han descrito numerosos polimorfismos asociados a la DMO o al riesgo de fractura (11-13,30). En general, se buscan polimorfismos en genes relacionados con el metabolismo óseo o con los de las citoquinas implicadas en el proceso de formación/resorción ósea como la IL-1, IL-6, TNF-α, TGF-β, OPG, RANKL, etc. (11-13,30). En nuestro trabajo investigamos en la población de mujeres 5 polimorfismos. La búsqueda de asociación de los polimorfismos en los genes ERα y Runx2 es obvia ya que los estrógenos son determinantes en el

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metabolismo óseo y porque Runx2 es un factor de transcripción decisivo en la formación de osteoblastos. Los resultados han confirmado otros estudios donde el haplotipo ppxx está relacionado con una menor DMO (19). De hecho, el genotipo ERα es una de las variables (junto a número de gestaciones) que ha entrado en el modelo de predicción de IMC. En nuestra población el menor IMC del grupo ppxx se acompaña de menores niveles de testosterona, hormona que interviene claramente en la DMO (31). En cuanto al gen Runx2 (Figura 1), el haplotipo G + deleción ha mostrado asociación con un mayor IMC. Se ha descrito que las mujeres con el alelo «G» poseen menores niveles de DMO (20). Nuestros resultados están de acuerdo ya que el grupo de mujeres homozigotas para GG poseen menores niveles de IMC. Sin embargo, a diferencia del estudio inicial (20), que no encontró relación del polimorfismo de longitud (deleción de 11 alaninas) con la DMO, hemos demostrado que el haplotipo G + deleción es el que se asocia de manera más poderosa y significativa a altos niveles de IMC. Por último, hemos estudiado la asociación al IMC de un polimorfismo de restricción que se da en la secuencia Kozak del promotor del gen CD40. La razón para empezar este estudio es que el sistema inmune, especialmente la célula T, está muy relacionado con la pérdida ósea en estados de inflamación y en la debida a deficiencia de estrógenos (9,16,32). Los resultados señalan que el genotipo del gen CD40 no está relacionado con el IMC, aunque si que parece estarlo con los niveles de NTx, observando que el alelo T está asociado a una menor excreción de NTx en la orina que el alelo C. De hecho este alelo C, que en nuestra población presenta mayor excreción de NTx, se ha relacionado con enfermedades autoinmunes como la enfermedad de Graves (21) y se han descrito aumentos en la pérdida ósea y, consecuentemente, de los marcadores de resorción en enfermedades autoinmunes, donde las células T están constantemente activadas (9). En resumen, los fitoestrógenos no han modificado el perfil de los marcadores de metabolismo óseo en un grupo de mujeres pequeño y a corto plazo. Sin embargo, el grupo de mujeres tratadas con fitoestrógenos han mostrado menores niveles de IL-6, una citoquina relacionada con la pérdida

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ósea posmenopáusica. En el estudio genético, el genotipo del gen ER· se ha asociado y predice el IMC, un parámetro relacionado con la DMO, mientras que el polimorfismo C/T del gen CD40 se relaciona con la excreción de NTx, uno de los marcadores de resorción ósea que mejor reflejan esta parte del metabolismo óseo.

Pérdida ósea posmenopáusica: estudio del polimorfismo genético y efecto de la administración de fitoestrógenos sobre los marcadores de metabolismo óseo

AGRADECIMIENTOS Queremos agradecer la ayuda técnica prestada por Dª Elvira Calap y Dª Rosa María Aliaga en la realización de este trabajo. Este estudio ha sido posible gracias a la concesión de una beca por parte de FUNDACIÓN MAPFRE.

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