PREDICCIÓN DE BIOMARCADORES EN MUCOPOLISACARIDOSIS EMPLEANDO UNA RED METABÓLICA HUMANA

TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR AL TÍTULO DE MAGISTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

DIEGO A. SALAZAR BARRETO

TUTORA: JANNETH GONZÁLEZ SANTOS

CO-TUTORES: CARLOS JAVIER ALMÉCIGA DÍAZ GEORGE EMILIO BARRETO SAMPAIO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS BOGOTÁ D.C. COLOMBIA DICIEMBRE 2014

ARTÍCULO 23, RESOLUCIÓN #13 DE 1946. “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vean en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”

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PREDICCIÓN DE BIOMARCADORES EN MUCOPOLISACARIDOSIS EMPLEANDO UNA RED METABÓLICA HUMANA

DIEGO A SALAZAR BARRETO

________________________

_______________________

Manuel A. Franco Cortés MD., PhD.

Concepción Judith Puerta Bula PhD

Director Posgrado

Decana

Facultad de Ciencias

Facultad de Ciencias

Bogotá D.C. Diciembre 2014

5

DEDICATORIA

A Dios, mi Mamá, mi hermana y a María Isabella.

6

CONTENIDO pág. 1

Resumen .................................................................................................................................... 12

2

Abstract ..................................................................................................................................... 13

3

Alcance y definición del problema de Investigación ................................................................. 14

4

Marco Teórico ........................................................................................................................... 17 4.1

Errores innatos del metabolismo y mucopolisacaridosis .................................................. 17

4.1.1

Errores innatos en el metabolismo ........................................................................... 17

4.1.2

Enfermedades de depósito lisosomal ....................................................................... 18

4.1.3

Glucosaminoglicanos y Proteoglicanos ..................................................................... 22

4.1.4

Mucopolisacaridosis .................................................................................................. 25

4.1.5

Tipos de mucopolisacaridosis.................................................................................... 26

4.2

Diagnóstico y tratamiento de mucopolisacaridosis .......................................................... 30

4.2.1

5

6

Biomarcadores para el diagnóstico de mucopolisacaridosis .................................... 32

4.3

Aproximaciones computacionales para la predicción de biomarcadores. ....................... 34

4.4

Biología de sistemas .......................................................................................................... 35

4.4.1

Redes biológicas ........................................................................................................ 35

4.4.2

Tipos de redes biológicas .......................................................................................... 37

4.4.3

Redes metabólicas y su análisis................................................................................. 38

Objetivos e Hipótesis................................................................................................................. 44 5.1

Objetivo general ................................................................................................................ 44

5.2

Objetivos específicos ......................................................................................................... 44

5.3

Hipótesis ............................................................................................................................ 44

Métodos .................................................................................................................................... 45 6.1

Reconocimiento del modelo recon 2. ............................................................................... 46

6.2

Identificación enzimática y generación de modelos. ........................................................ 46

6.3

Definición de la función objetivo y Análisis de balance de flujos. .................................... 47

6.4

Análisis de enriquecimiento génico .................................................................................. 47 7

7

6.5

Análisis de variabilidad de flujos y determinación de biomarcadores. ............................. 47

6.6

Análisis estadístico. ........................................................................................................... 48

6.7

Validación de resultados. .................................................................................................. 49

Resultados y discusión .............................................................................................................. 50 7.1

Consideraciones iniciales. ................................................................................................. 50

7.2

Depuración del modelo ..................................................................................................... 51

7.3

Identificación de reacciones asociadas con MPS y generación de modelos..................... 54

7.4

Verificación silenciamiento de reacciones en modelos MPS. ........................................... 57

7.5

Optimización por análisis de balance de flujos para los modelos recon 2 y tipos de MPS. 57

7.6

Validación de los flujos para los modelos MPS y EDL. ...................................................... 58

7.7

Comparación por grupos y rutas metabólicas de los modelos MPS contra recon2. ........ 60

7.8

Descripción metabólica de los flujos. ................................................................................ 60

7.9

Reacciones encendidas y apagadas. ................................................................................. 65

7.10

Diferenciación entre modelos MPS................................................................................... 72

7.11

Análisis de variabilidad de flujos. ...................................................................................... 73

8

Conclusiones.............................................................................................................................. 78

9

Perspectivas y aplicaciones ....................................................................................................... 79

10 Bibliografía ................................................................................................................................ 80 11 ANEXOS ..................................................................................................................................... 96

8

ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Funciones lisosomales. ------------------------------------------------------------------------------------------------ 19 Tabla 2. Tipos de GAG. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 25 Tabla 3. Resumen de las características bioquímicas y genéticas de las MPS. ---------------------------- 29 Tabla 4. Diferencias entre recon 1 y recon 2. ----------------------------------------------------------------------------- 42 Tabla 5. Reacciones eliminadas durante la depuración de recon 2. --------------------------------------------- 52 Tabla 6. Número de reacciones asociadas a cada enzima de MPS y presentes en el modelo recon 2. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 55 Tabla 7. Comparación de flujos entre los 14 modelos (recon2, MPS y EDL). -------------------------------- 59 Tabla 8. Tendencia de las reacciones en los diferentes grupos metabólicos para los modelos MPS comparados contra los obtenidos en recon2. ----------------------------------------------------------------------------- 65 Tabla 9. Reacciones que se silenciaron o activaron en los modelos MPS. ----------------------------------- 69 Tabla 10. Comparación metabólica entre los modelos de MPS.--------------------------------------------------- 74 Tabla 11. Tipos de rangos obtenidos para los diferentes modelos MPS. -------------------------------------- 74 Tabla 12. Biomarcadores de alta y baja confidencia predichos por FVA. -------------------------------------- 75

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ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Esquema de las diferentes enfermedades de depósito lisosomal. ___________________ 21 Figura 2. Diferentes rutas de degradación de GAG. ________________________________________ 24 Figura 3. Esquema de una red metabólica. ________________________________________________ 37 Figura 4. Diferentes representaciones de una red. _________________________________________ 37 Figura 5. Esquema del procedimiento de análisis para un modelo metabólico. _________________ 41 Figura 6. Solución de la matriz estequiométrica. ___________________________________________ 41 Figura 7. Diagrama de flujo de la metodología seguida para la obtención y análisis de los modelos. ______________________________________________________________________________________ 45 Figura 8. Definición de rangos para determinación de biomarcadores. ________________________ 48 Figura 9. Degradación de queratan sulfato. ________________________________________________ 56 Figura 10. Análisis de componentes principales de los modelos de MPS y recon 2. ____________ 61 Figura 11. Número de reacciones empleadas y alteradas por modelos MPS y recon 2. _________ 63 Figura 12. Numero de reacciones que se silenciaron y se activaron en los modelos de MPS comparando los flujos contra los obtenidos en recon 2. _____________________________________ 68 Figura 13. Análisis de enriquecimiento génico para los genes que se encendieron en los diferentes modelos de MPS. ______________________________________________________________________ 70 Figura 14. Análisis de enriquecimiento génico para los genes que se apagaron en los diferentes modelos de MPS. ______________________________________________________________________ 71 Figura 15. Número de reacciones que se identificaron como biomarcadores por ruta metabólica para los modelos MPS tipo IVA, IVB, VI y VII. __________________________________________________ 75

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ÍNDICE DE ANEXOS Anexo 1. Reacciones específicas para recon 2 que estaban asociadas a las enzimas lisosomales deficientes en MPS.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 96 Anexo 2. Valores de flujos (FBA Y FVA) de cada modelo MPS y recon 2. ------------------------------------ 98 Anexo 3. Categorización de rutas metabólicas detalladas en recon 2 en base a la clasificación realizada en la base de datos KEGG pathway (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html). ---------------- 98 Anexo 4. Comportamiento de los flujos de reacción para los diferentes modelos MPS comparados contra los obtenidos en recon 2. ---------------------------------------------------------------------------------------------- 102 Anexo 5. Comportamiento de los flujos en los modelos MPS comparados contra recon 2. MAA: metab de aminoácidos, MGS: metab de grupo sanguíneo, MC: metab de carbohidratos, Ox: fosforilación oxidativa, Ex: reacciones de intercambio y demanda, MBG: metab y biosíntesis de glicanos, ML: metab de lípidos, MCV: metabolismo de cofactores y vitaminas, MOA: metab de otros aminoácidos, MN: metab de nucleótidos, TM: transporte de metabolitos. ------------------------------------------------------- 103 Anexo 6. Conjunto de genes obtenidos del silenciamiento o activación de reacciones en los modelos MPS. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 104 Anexo 7. Número de reacciones cuyo flujo aumento en un modelo MPS especifico comparado contra los flujos de las demás MPS. -------------------------------------------------------------------------------------------------- 106 Anexo 8. Número de reacciones cuyo flujo disminuyó en un modelo MPS especifico comparado contra los flujos de las demás MPS. ---------------------------------------------------------------------------------------- 107 Anexo 9. Reacciones que presentaron un cambio de límites de flujo en los modelos de MPS IVA, IVB, VI y VII. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 108

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1 RESUMEN Las mucopolisacaridosis (MPS) son enfermedades de depósito lisosomal, caracterizadas por la deficiencia en las enzimas lisosomales encargadas de la degradación de los glucosaminoglicanos (GAG), esto lleva a su acumulación y al inicio de una serie de procesos patológicos característicos de esta enfermedad. La detección e inicio de tratamiento temprano, son importantes para evitar el deterioro en la calidad de vida del paciente. La medición de GAG en biofluidos es el biomarcador universal en estas patologías, sin embargo, el procesamiento y análisis de los resultados de laboratorio pueden llegar a ser de difícil interpretación y varían según cada paciente, por lo que contar con nuevos biomarcadores tendría un impacto en el diagnóstico y seguimiento de estas enfermedades, con lo cual se podría garantizar un mecanismo de aseguramiento en salud adecuado para estas enfermedades. En el siguiente trabajo se presenta una aproximación computacional para predecir marcadores biológicos y alteraciones metabólicas a partir de la variación de flujos (análisis de balance y análisis variabilidad de flujos) de reacción en la reconstrucción metabólica humana –recon 2- para los diferentes tipos de mucopolisacaridosis. Sobre recon 2 se silenciaron de forma independiente las reacciones relacionadas con las enzimas deficientes en 10 tipos de MPS. Se evidenciaron alteraciones metabólicas a nivel de lípidos, carbohidratos y aminoácidos además de aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno. Estos procesos se correlacionaron con los sucesos patológicos secundarios evidenciados para MPS. Los candidatos a biomarcadores se encontraron para MPS IVB y VII, estos se encontraron en la ruta de síntesis de esfingolípidos y en el transporte de diferentes moléculas entre las que se encuentran aminoácidos y aminoazúcares.

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2 ABSTRACT Mucopolysaccharidosis (MPS) are lysosomal storage diseases characterized by a deficiency in the lysosomal enzymes responsible for the degradation of glycosaminoglycans (GAG), this leads to their accumulation and the onset of a number of pathological processes characteristic of this disease. The onset of early detection and treatment are important to prevent deterioration in the quality of life of the patient. Measuring GAG in biofluids is the universal biomarker in these diseases, however, the processing and analysis of laboratory results may become difficult to interpret and vary with each patient, so new biomarkers would have an impact on diagnosis and monitoring of these diseases, which could guarantee health insurance mechanism for these diseases. In this paper presents a computational approximation to predict biological markers and metabolic alterations from flux variation (balance analysis and flow variability analysis) in human metabolic reconstruction –recon 2- for different types of mucopolysaccharidoses. Using recon 2, were silenced the deficient enzymes in 10 types of MPS. Metabolic alterations were in lipids, carbohydrates and amino acids. In addition, there was an increase in the production of reactive oxygen species. These processes are correlated with secondary pathological events evidenced for MPS. Biomarker candidates were found to MPS IVB and VII, these were found in the synthesis pathway of sphingolipids and transport of different molecules which are amino acids and amino sugars.

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3 ALCANCE Y DEFINICIÓN DEL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN Las MPS están caracterizadas por la deficiencia de la función catalítica de algunas las enzimas lisosomales encargadas de la degradación de los GAG, llevando a la acumulación en lisosomas de estos compuestos. Hasta la fecha se han descrito 11 subtipos de MPS, cada una caracterizada bioquímica y genéticamente, permitiendo así el desarrollo de algunas alternativas terapéuticas y diagnosticas1,2. Actualmente el diagnóstico de las MPS está basado en la identificación y cuantificación de los GAG, así como en la medición de la actividad enzimática; sin embargo, el procesamiento y análisis de los resultados de laboratorio puede llegar a ser de difícil interpretación y puede variar según las condiciones fisiopatológicas de cada individuo. Adicional, se ha observado la acumulación de diferentes GAG independientemente de la enzima deficiente en MPS, por lo que el análisis de un solo GAG no puede garantizar un diagnóstico certero. Se cree que esta acumulación secundaria de otros GAG se deba a la acumulación primaria de los sustratos no degradados por la enzima deficiente, por lo que es de esperarse que otros sistemas igualmente se alteren por esta misma vía. Los procesos secundarios u otras alteraciones reportadas para MPS han sido: inflamación, daño mitocondrial y alteración en el tráfico de lípidos3–6. Gracias a estos procesos alterados se ha logrado identificar ciertos biomarcadores que se limitan a algunas MPS, se asocian a diferentes estadios de la enfermedad, son tejido específicos y han sido obtenidos de modelos animales y líneas celulares luego no se encuentran validados clínicamente7. Los avances en la detección de biomarcadores para el seguimiento y evaluación de terapias y diagnósticos son importantes en enfermedades huérfanas y de alto costo como las MPS, ya que por ejemplo el precio de la terapia de reemplazo enzimático para un paciente con MPS II con idursulfasa tiene un valor alrededor de quinientos mil dólares, precio que puede variar según las condiciones fisiológicas del paciente, ya que de esto dependerá la dosis a administrar8. Debido a que muchas veces el diagnostico no se realiza a tiempo9,10, las intervenciones que deben realizarse aumentan el gasto de cubrimiento por parte del Estado, además que un diagnóstico tardío trae daños irreversibles sobre el paciente, como retardo mental o deformaciones óseas2,11. Por tal motivo, la investigación en este tipo de enfermedades es importante para mejorar el abordaje clínico, epidemiológico, y social; algunas iniciativas e incentivos legislativos han promovido la investigación en varios aspectos, por ejemplo, en Colombia existe la Ley 1392 de 2010 la cual establece que “...las enfermedades huérfanas, representan un problema de especial 14

interés en salud dado que por su baja prevalencia en la población, pero su elevado costo de atención, requieren dentro del Sistema General de Seguridad Social en Salud (SGSSS) un mecanismo de aseguramiento diferente al utilizado para las enfermedades generales…”, luego esta ley favorece la investigación y conocimiento de estas patologías, por ejemplo la identificación de nuevos biomarcadores. El enfoque de la nueva investigación de biomarcadores se basa en el empleo de estudios experimentales y computacionales. Experimentalmente se emplean grupos o conjuntos de proteínas o genes en diferentes patologías de las cuales se pueden observar cambios propios de dicha condición, es decir, sobreexpresión o inhibición. La obtención de estos conjuntos de datos ha formado parte de las omicas, como la proteómica, genómica y metabolómica entre otras más12,13. Las omicas permiten obtener grupos masivos de datos biológicos de cierta condición fisiológica o patológica14, los cuales puedan ser integrados e interpretados por métodos computacionales, dentro de estas se encuentra la bioinformática con la minería de datos y el análisis bioestadístico que permiten extraer y relacionar los datos más relevantes del conjunto de datos 12. Una disciplina naciente conocida como biología de sistemas, ha permitido integrar y estudiar estos datos biológicos u omicos bajo la presunción que cada unidad medida (gen, proteína o metabolito) es un componente de un sistema, por lo que la asociación de cambios o alteraciones significativas en estas puede representar un biomarcador 12. El enfoque que establece biología de sistemas ha permitido comprender como es la integración del funcionamiento de los sistemas o procesos biológicos y profundizar en el entendimiento de sus propiedades. Con lo cual se ha logrado predecir nuevos blancos terapéuticos 15, reacciones adversas a fármacos 16, descubrimiento de rutas metabólicas y de señalización 17, estudio de redes con rutas o genes silenciados 18, establecimiento de asociaciones entre redes evolutivas 19, y modelamiento de redes metabólicas, de señalización o de interacción 20–22. En cuanto a la búsqueda de nuevos biomarcadores, empleando aproximaciones como análisis y reconstrucción de sistemas o redes metabólicas, se han generado modelos de diferentes errores innatos en el metabolismo permitiendo obtener potenciales biomarcadores para estas enfermedades 23. A pesar que las redes metabólicas se han empleado en una amplia variedad de campos, en el caso particular de MPS no existen reportes que hagan uso de aproximaciones como biología de sistemas para comprender el efecto del silenciamiento de las reacciones de degradación de GAG sobre el funcionamiento celular, de señalización o para la identificación de nuevos biomarcadores.

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En resumen, existe evidencia de múltiples cambios que ocurre en MPS, sus daños irreversibles son procesos relacionados a la acumulación de GAG2,24,25, estos se han estudiado de forma individual por más de cien años, pero no se dispone de los mecanismos celulares, moleculares y fisiopatológicos en conjunto para definir el diagnóstico correcto y a tiempo. Adicional, estas deficiencias o vacíos en el conocimiento han generado que los costos de tratamiento de estos pacientes sean elevados. Por lo tanto, marcadores biológicos que puedan ser usados en diagnóstico, pronóstico, seguimiento y evaluación en estas enfermedades son factores importantes para conectar los vacíos en el conocimiento y crear interés en el abordaje investigativo de estas patologías. Por eso estudiar una enfermedad que compromete diferentes procesos funcionales y estructurales de la célula de manera sistémica, permitirá determinar nuevas características o propiedades de los cuales se pueden extraer marcadores biológicos propios de dichos sucesos para su posterior validación y aplicación en el ámbito clínico.

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4 MARCO TEÓRICO 4.1

ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO Y MUCOPOLISACARIDOSIS 4.1.1 Errores innatos en el metabolismo Los errores innatos en el metabolismo (EIM) son enfermedades monogénicas, de herencia autosómica recesiva en su mayoría, que generan alteraciones bioquímicas debido deficiencia en la función de proteínas involucradas en el metabolismo de aminoácidos, carbohidratos, lípidos y nucleótidos 26. La acumulación o ausencia de sustratos por el bloqueo de rutas metabólicas desencadena una serie de procesos patológicos característicos de cada EIM 27. Algunas clasificaciones de los EIM incluyen26: -

-

-

Errores innatos del metabolismo tipo “intoxicación”: en el que progresivamente se van acumulando metabolitos que se vuelven nocivos. Por ejemplo, la acumulación del aminoácido fenilalanina por defecto en sus proteínas de biotransformación. Errores congénitos del metabolismo tipo “déficit energético”: se caracteriza por fallo multi-sistémico general y progresivo y es causado por rutas metabólicas encargadas de generar energía, por ejemplo defectos en la fosforilación oxidativa. Errores congénitos del metabolismo de los organelos celulares: las alteraciones en el metabolismo de macromoléculas genera la acumulación de estos. En esta se encuentra la mucopolisacaridosis que por defectos en alaguna de las proteínas lisosomales encargadas en la degradación de glucosaminoglicanos, se genera una acumulación de estos sustratos en lisosoma.

La presentación clínica de los EIM varía en su edad de inicio y severidad clínica28. Durante el diagnóstico de un EIM se tienen en cuenta aspectos como la historia familiar, examen físico (dermatitis, alopecia, dismorfia facial), estudios iniciales que incluye hemogramas, niveles de electrolitos, glucosa, amonio, lactato, relación lactato/piruvato, sustancias reductoras, ácidos orgánicos, aminoácidos, cetonas), análisis de metabolitos propios del metabolismo de la enfermedad (e.g mucopolisacaridosis, gangliósidos, aminoácidos, ácidos orgánicos), entre otros28–30. Adicionalmente, algunos países realizan tamizajes neonatales para identificar estas patologías antes de presentar los primeros síntomas31,32, sin embargo para algunas enfermedades metabólicas como las aminoacidopatías, academias orgánicas, defectos en el ciclo de la urea, 17

intolerancia a azucares e intoxicación por metales 33 donde se acumulan metabolitos tóxicos el tratamiento se dirige a una dieta controlada entre los que se encuentran restricciones dietarías, administración de suplementos dietarios y estimulación de la actividad residual enzimática por administración de cofactores28. Otras EIM que involucran enzimas peroximales o lisosomales deficientes se emplean como tratamientos principales el reemplazo de células sanas hematopoyéticas y la terapia de reemplazo enzimático; diferentes tratamientos incluyen moléculas chaperonas, terapia génica e inhibidores de sustratos28. Todas estas aproximaciones se realizan de acuerdo a las bases bioquímicas y genéticas de cada patología, por esta razón la búsqueda de propiedades emergentes del defecto de la enfermedad por interacción con el resto del organismo es muy interesante de abordar para encontrar nuevas alternativas terapéuticas y paliativas. Por otro lado, a pesar de que individualmente tienen prevalencias bajas y por lo tanto son considerados como enfermedades raras, en conjunto tienen una alta prevalencia (1/500 recién nacidos vivos) por lo que llegan a ser consideradas como una prioridad de salud. Aunque se han realizado algunas evaluaciones de los EIM que se presentan en Colombia, no se ha logrado determinar cómo es la situación actual en todo el territorio nacional 34. Algunas iniciativas legislativas como la ley 1392 de 2010 estableció que “Por medio de la cual se reconocen las enfermedades huérfanas como de especial interés y se adoptan normas tendientes a garantizar la protección social por parte del Estado colombiano a la población que padece de enfermedades huérfanas y sus cuidadores.”. Estas iniciativas buscan mejorar la financiación en el abordaje terapéutico y diagnóstico, censar las EIM, incentivar la investigación y controlar la correcta prestación de servicio en salud a estos pacientes. 4.1.2 Enfermedades de depósito lisosomal Los lisosomas son el compartimento primario del catabolismo en células eucariotas, en humanos están presentes en todos los tipos de células excepto en eritrocitos. Estos degradan material extracelular que ha sido internalizado por endocitosis y componentes intracelulares que han sido secuestrados por autofagia, manteniendo el balance catabólico-anabólico celular 35. Para el cumplimiento de estas funciones existen dos clases de proteínas que son esenciales en los lisosomas: - Hidrolasas ácidas, entre las que se incluyen proteasas, lipasas, nucleasas, glicosidasas, fosfolipasas, fosfatasas y sulfatasas, las cuales presentan su máxima actividad a pH bajos, que son controlados por bombas ATPasas que 18

atraviesan la membrana lisosomal. Las enzimas lisosomales se unen en complejos multi-enzimáticos que degradan coordinadamente glicoesfingolípidos, glicosaminoglicanos, oligosacáridos y glicoproteínas. Los complejos multi-enzimáticos son un conjunto de enzimas en el que cada producto generado por una enzima es sustrato de las otras. Un ejemplo es neuraminidasa 1 (NEU1) y β-galactosidasa (β-Gal)36. - Proteínas integrales de membrana lisosomal (PIM)37, los cuales residen principalmente en el límite de la membrana lisosomal y tienen diversas funciones, incluyendo acidificación del lumen lisosomal, importación de proteínas desde el citosol, protección de la membrana por acción de las hidrolasas acidas, fusión de membrana y transporte de productos de degradación al citosol. Las PIM más abundantes son las proteínas de membrana asociada al lisosoma (LAMP1, LAMP2, lysosome-associated membrane protein 1), proteína integral de membrana lisosomal 2 (LIMP, lysosome integral membrane protein 2; también conocida como SCARB2) y la tetraspanina CD6337,38. La función lisosomal esta complementada por organelos similares a los lisosomas (OSL), tales como melanosomas, gránulos líticos, compartimentos del complejo mayor de histocompatibilidad clase II y gránulos de plaquetas 38. Los lisosomas y los OSL están involucrados en varios procesos fisiológicos, tales como homeostasis de colesterol, reparación de la membrana plasmática, remodelamiento de tejidos y hueso, defensa contra patógenos, señalización y muerte celular. Estas funciones hacen que el lisosoma se convierta en un organelo dinámico y fundamental37. A partir de sus múltiples componentes estructurales y funcionales los lisosomas cumplen múltiples funciones dentro de los mecanismos normales para la viabilidad celular: autofagia (macroautofagia y autofagia mediada por chaperonas), heterofagia, endocitosis/fagocitosis, exocitosis y muerte celular, ver Tabla 137,39. Tabla 1. Funciones lisosomales. Principales funciones del lisosoma en las células eucariotas. Tomado y modificado de Boya., 2012.

Función lisosomal

Autofagia

Actividades lisosomales Control de calidad de organelos Degradación de macromoléculas Eliminación de agregados Homeostasis de colesterol Procesamiento de proteínas 19

Supervivencia celular Activación de mTOR Reciclaje de receptores de superficie Presentación de antígenos Endocitosis/fagocitosis Degradación de matriz extracelular Remoción de patógenos Reparación de la membrana plasmática Erosión ósea Exocitosis Remodelamiento tisular Metástasis Muerte celular Permeabilización de la membrana lisosomal En general, la ruta de degradación endocítica comienza en la membrana plasmática y termina en el lisosoma donde se hace la captura de algún componente que es internalizado y movilizado a través de diferentes mecanismos. Durante este proceso el cargamento pasa a través de diferentes compartimentos que generan la clasificación del material a ser procesado, se han distinguido endosomas tempranos o también llamados endosomas de clasificación tubular que pueden dirigir el cargamento al aparato de Golgi, también reciben proteínas endógenas provenientes del aparato de Golgi, tales como hidrolasas lisosomales marcadas con manosa-6-fosfato37,39. La carga puede dirigirse a endosomas tardíos o secundarios que distribuirán diferentes vesículas de degradación al lisosoma. Por lo que la principal función de estos endosomas es la de distribuir estas cargas de degradación o reciclaje 39. A diferencia de los procesos de degradación externos, durante la macroautofagia de componentes citoplasmáticos, proteínas deterioradas y organelos completos son degradados y reciclados para generar los bloques de construcción para procesos anabólicos, este proceso ocurre en diferentes estadios metabólicos como la inanición o para la degradación de organelos alterados40. La autofagia mediada por chaperonas (AMC) es un proceso por el cual las proteínas citosólicas, proteínas de membrana, o nucleares que albergan un motivo con secuencias de aminoácidos específicas se incorporan en los lisosomas a través de la acción combinada de una chaperona (usualmente Hcs70) y el receptor lisosomal Lamp-2A39,41. Cuando las funciones normales del lisosoma son interrumpidas se inicia una cascada patológicas incluyendo homeostasis del calcio, estrés oxidativo, 20

inflamación, autofagia, estrés en el retículo endoplasmático, y respuestas autoinmunes37,42,43. Estas deficiencias pueden ocurrir por múltiples mecanismos, el más común es un efecto genético que altere proteínas involucradas en el correcto funcionamiento del lisosoma, estas proteínas pueden ser proteínas de transporte de endosomas, biogénesis del lisosoma, hidrolasas lisosomales, proteínas de membrana lisosomal, o también pueden ser inducidas por fármacos como amiodarodona o cloroquina44. Mayoritariamente estas enfermedades son producto de la deficiencia de las enzimas lisosomales, por lo tanto se han clasificado por la macromolécula que no ha puede ser degradada. Actualmente se conocen 58 enfermedades de depósito entre las que se encuentran las mucopolisacaridosis, la deficiencia múltiple de sulfatasas; las esfingolipidosis (Fabry, Farber lipogranulomatosis, Gaucher, Krabbe, leucodistrofia metacromatica, Nieman-Pick A y B, ganglidiosis GM1 y GM2); las oligosacaridosis y -glucoproteinosis (aspartiglucosaminuria, fucosidosis, alfamanosidosis, beta-manosidosis, sialidosis); y la glucogenosis tipo II (Enfermedad de Pompe)45.

Figura 1. Esquema de las diferentes enfermedades de depósito lisosomal. La enfermedad de Griscelli (GS), Hermansky-Pudlak (HPS) y Chdiak-Higashi (CHS) presentan alteraciones en el tráfico vesicular observándose grandes inclusiones en organelos similares a

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lisosomas (OSL-LRO). Pompe es una patología donde esta alterada la hidrólisis de glicógeno, en Mucopolisacaridosis (MPS) esta alterada la ruta de degradación de glucosaminoglicanos mediada por hidrolasas. Entrelas lipidosis están: Gaucher está asociada con alteraciones en la ruta de degradación de lípidos, Fabry está relacionada con la hidrólisis de glicoesfingolípidos alteración de la función de las balsas lipídicas, Nieman-Pick, relacionada con el metabolismo de colesterol, TaySachs está relacionada con la hidrólisis de esfingolípidos. I-cell es una patología asociada con la deficiencia en el marcaje de las enzimas lisosomales, luego son dirigidas al exterior celular. La deficiencia múltiple de sulfatasas (MSD) es una deficiencia en la activación de sulfatasas luego se acumulan glucosaminoglicanos, sulfátidos y gangliosidos. Tomado y modificado de ParkinsonLawrence et al., 2010.

4.1.3 Glucosaminoglicanos y Proteoglicanos La matriz extracelular (MEC) es un componente dinámico extracelular que forma una compleja y organizada red tridimensional entre las células de diferentes tejidos en un órgano46. La MEC provee un entorno físico para los componentes extracelulares y también está involucrada en el inicio de señales bioquímicas y biomecánicas requeridas para la homeostasis47, diferenciación48 y morfogénesis tisular49. Está compuesta principalmente por dos clases de macromoléculas: proteoglicanos y proteínas fibrosas49, y unas moléculas de funciones específicas conocidas como proteínas matricelulares50, que no tienen un rol estructural pero en cambio estas modulan la función celular por interacciones con los receptores de membrana, proteasas, hormonas y otras moléculas bioefectoras, así como también con proteínas estructurales de la MEC50,51. Los proteoglicanos (PG) son proteínas glicosiladas las cuales están unidos covalentemente a glucosaminoglicanos (GAG) (tabla 2), la unión puede ser por la interacción de sus grupos carboxilo o sulfuro con residuos de aminoácidos básicos (arginina o lisina)52. Los PG se han clasificado de acuerdo al núcleo proteico, la localización y la composición de GAG53. Las tres principales familias son proteoglicanos pequeños ricos en leucina, proteoglicanos modulares y proteoglicanos de superficie celular53. Los GAG con los que pueden interactuar se han denominado como heparan sulfato (HS), condroitin sulfato (CS), dermatan sulfato (DS), queratan sulfato (QS) y ácido hialurónico (HA), este último es el único que se une a proteínas por medio de enlaces covalentes. Los GAG son polisacáridos lineales formados por repeticiones de disacáridos, normalmente entre un amino azúcar, que puede ser N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) o N-acetil-D-galactosamina (GalNAc), y un ácido idurónico que puede ser ácido glucurónico (GlcA) o ácido idurónico (IdoA) (tabla 2), el queratan sulfato está constituido por galactosa en vez del ácido urónico54. Los GAG están implicados en diferentes procesos biológicos como inflamación, señalización, organización estructural de otras proteínas de la MEC, acoplamiento con receptores de membrana, eliminación de radicales libres, formación de geles 22

entre las articulaciones para la absorción de presiones, cascada de coagulación, entre otras más. Muchas de las funciones se presentan dadas las circunstancias, por ejemplo, cuando existe una herida en piel, el heparan sulfato que se encuentra unido a diferentes núcleos proteicos es liberado por endoglicosidasas al medio para cumplir funciones como la presentación de factores de crecimiento como FGF-2, regulación de los gradientes de citoquinas y quimiocinas, reclutamiento de leucocitos55. Los GAG tienen diferentes grados de sulfatación que los vuelve una amplia gama de diferentes núcleos y se ha observado que estas sulfataciones son los que ejercen las diferentes funciones56. La biosíntesis de estos compuestos comienza por la síntesis de los núcleos proteicos, a los cuales se les realiza adiciones sucesivas de los diferentes tipos de azucares; inicialmente todos los núcleos proteicos se les adiciona una cadena de cuatro residuos de azucares (GlcA β(1->3) Gal β(1->3) Gal β(1->4) Xil), de este iniciador y dependiendo de la necesidad del tejido se realiza la adición de los siguientes azucares con enzimas específicas, para CS/DS la GalNActransferasa I adiciona una GalNAc β(1->4) mientras que el complejo de enzimas GlcNAc-transferasa y GlcA-transferasa adicionan sucesivamente sus respectivos sustratos, finalmente ocurren pasos sucesivos de sulfatación de diferentes sustituyentes de los azucares. Para la síntesis de queratan sulfato se inicia con la adición N- u O- de los respectivos oligosacáridos, GlcNAc y Gal57. La degradación de GAG ocurre en los lisosomas, los cuales contienen las enzimas hidrolíticas que se activan a pH menor de 5. Se conoce que la vida media de los GAG son de 120 días para QS, 3 días para HA y 10 días para CS/DS. Estos son internalizados por endocitosis, inicialmente se degradan los núcleos proteicos por proteasas y luego se acortan las secuencias de GAG por endoglicosidasas. Los fragmentos cortados son degradados por una serie de exoglicosidasas y sulfatasas 57,58. -

Ácido hialurónico: este GAG requiere de cuatro hidrolasas.

- HS: inicialmente es degradado por una endoglucuronidasa, la degradación consta de tres sulfatas, cuatro hidrolasas y una transferasa. - CS/DS: estas cadenas comparten similitudes estructurales ya que entre los azucares que pueden estar presente en dermatan sulfato se encuentra el ácido idurónico o glucurónico. Condroitin sulfato tiene varias modificaciones en la unión de los monosacáridos, de los cuales se han derivado otras clasificaciones de este GAG, por ejemplo, la repetición del disacárido GlcA β (1->3) GalNAc4S corresponde a un GAG que se encuentra mayoritariamente en cartílago, 23

mientras que la repetición del disacárido IdoA α (1->3) GalNAc4S que corresponde al GAG dermatan se encuentra en piel y tendones. Sin embargo la degradación de estos GAG se realiza por las mismas enzimas entre las que están tres sulfatasas, y dos hidrolasas. - QS: este N- u O-glicano está altamente sulfatado, por lo que requiere de pasos sucesivos de la acción de tres exoglicosidasas y tres sulfatasas. Cuando alguna de las enzimas es inactiva o deficiente, entonces estos procesos sucesivos de degradación se ven interrumpidos entonces se genera lo que comúnmente se conoce como mucopolisacaridosis24. En la Figura 2 se presenta las diferentes rutas de degradación de los GAG.

Figura 2. Diferentes rutas de degradación de GAG. Tomado y modificado de Lawrence et al., 2014.

24

Tabla 2. Tipos de GAG. Existen 4 tipos de GAG que están unidos a diferentes tipos de proteínas extracelulares y de membrana: Heparan, condroitin, dermatan y queratan sulfato. El GAG que no se encuentra unido a proteínas es el ácido hialurónico. Tomada y modificada de Prydz et al., 2000.

4.1.4 Mucopolisacaridosis Las MPS son una familia de enfermedades hereditarias clasificadas dentro de los desórdenes de depósito lisosomal, producidas por la acumulación de GAG parcialmente degradados en el lisosoma. Esta acumulación es generada por la pérdida, total o parcial, de la actividad de una de las enzimas involucradas en la degradación de estos compuestos45. Hasta el momento se han identificado 11 subtipos de MPS que se diferencian por los GAG acumulados y la enzima defectuosa, en el apartado 1.1.5 se describe con más detalle los tipos de MPS. La caracterización de las bases bioquímicas y genéticas de las MPS ha permitido el desarrollo de herramientas diagnósticas así como de tratamientos específicos3. El diagnóstico y seguimiento terapéutico, tradicionalmente se ha realizado mediante la identificación y cuantificación de los GAG en muestras de orina o sangre, así como también mediante la determinación de la actividad enzimática de la enzima deficiente en cada MPS 59. Pero estas metodologías tienen muchas desventajas que se abordan en la sección 4.2. 25

Las MPS presentan una incidencia mundial de 1:22000 nacimientos vivos (n.v)60,61. En Colombia se cuentan con pocos datos sobre la incidencia de esta enfermedad, aunque recientemente se reportó una incidencia de 1.98:100.000 n.v34. Adicionalmente, en Colombia se han adelantado un número importante de investigaciones en diferentes temas relacionados con este grupo de enfermedades tales como: análisis del impacto socio-cultural de la enfermedad34,62,63, la identificación de casos de MPS62,63, identificación de mutaciones64, modelamiento de proteínas defectuosas65, producción de enzimas recombinantes66,67, y terapia génica68–70. 4.1.5 Tipos de mucopolisacaridosis A continuación se describen las características bioquímicas, clínicas, fisiopatológicas, diagnóstico, tratamiento e incidencia, en la tabla 3 se presenta el consolidado de las características de cada MPS: Mucopolisacaridosis tipo I: La MPS I, es producida por la deficiencia en la actividad hidrolasa de la enzima α-L-iduronidasa (IDUA - E.C. 3.2.1.76), lo cual puede generar tres fenotipos diferentes Hurler (OMIM #607014), Hurler-Scheie (OMIM #607015) y Scheie (OMIM #607016), esta deficiencia produce la acumulación de heparan y dermatan sulfato en el lisosoma. El gen IDUA, codificante para esta enzima, se encuentra ubicado en 4p16.3, y contiene 14 exones que codifican una enzima de 563 aminoacidos71. Las mutaciones que sufre este gen principalmente han sido asociados a splicing alternativos y deleciones/inserciones de nucleótidos72. Las mutaciones más comunes encontradas en caucásicos con W402X y Q70X73, L578Q y P533R se detectaron en pacientes tunecíes74. A pesar que no se logra relacionar plenamente el genotipo fenotipo de la enfermedad se conoce que las mutaciones sin sentido, inserciones/deleciones en ambos alelos desarrollan en su mayoría el síndrome de Hurler75. MPS I se ha subclasificado según su grado de severidad: el síndrome de Hurler es el fenotipo más frecuente y severo que se caracteriza por un deterioro progresivo del sistema nervioso central, además de severas manifestaciones músculo-esqueléticas, pulmonares y cardiacas, hernias umbilicales y opacidad corneal76. Los síntomas comienzan a desarrollarse desde los 6 a 24 meses de vida, observándose una alteración en el desarrollo, macrocefalia, faces gruesas, hernias, disostosis múltiple, rigidez y contracción de articulaciones, hepatoesplenomegalia, opacidad corneal sordera e inicia el deterioro mental77. El síndrome de Hurler/Scheie se ha clasificado como una forma moderada de la enfermedad, se diferencian de la forma severa porque tienen inteligencia normal o casi normal, de manera similar presentan algunas de las alteraciones que se observan en la forma severa pero más atenuada, a lo 26

que se le ha asimilado la deficiencia parcial de la enzima. Esta enfermedad puede limitar la vida hasta la segunda o tercera década de vida si no se ha realizado algún tipo de tratamiento78. Finalmente, el síndrome de Scheie es la forma leve de la enfermedad los síntomas suelen aparecer a partir de los cinco años, pero son tan leves que con frecuencia el diagnostico no se considera hasta la edad adulta24. Mucopolisacaridosis II: El síndrome de Hunter (OMIM #309900) es la única de las MPS que su transmisión se encuentra ligada al cromosoma X. La MPS II está es producida por la deficiencia de la enzima iduronato-2- sulfatasa (I2S - EC 3.1.6.13), favoreciendo la acumulación de dermatan y heparan sulfato24. El gen responsable de la enfermedad se localiza en I2S Xq28, el cual contiene 9 exones. Existe un seudogen I2S2 que contiene secuencias que son homologas a los exones 2 y 3, aunque en secuencia reversa, y de los intrones 2, 3 y 7 del gen I2S79. Hasta la fecha se conocen cerca de 300 mutaciones entre las que se presentan deleciones/inserciones, rearreglos gen/seudogen, las cuales se han relacionado con la forma severa de la enfermedad80. La enfermedad se ha clasificado en fenotipo severo y moderado, los cuales se diferencian por el grado de afectación del sistema nerviosos central y el tiempo de vida. Los síntomas comienzan a aparecer entre los dos y cuatro años de edad, con afectaciones respiratorias, hernias inguinales y umbilicales, corta estatura, macroglosia, hiperplasia gingival; apnea del sueño, disostosis múltiple, macrocefalia, primera o segunda vertebra anormales, y síndrome del túnel carpiano. La muerte es ocasionada normalmente por obstrucción respiratoria o falla cardiaca81,82. Mucopolisacaridosis III: La MPS III, o síndrome de Sanfilippo, es causado por la alteración en la degradación del heparan sulfato. Se han caracterizado 4 subtipos para esta enfermedad: 1. MPS IIIA (OMIM #252900): heparan N-sulfatasa (SGSH - E.C. 3.10.1.1). 2. MPS IIIB (OMIM #251920): α-Nacetilglucosaminidasa (NAGLU - E.C. 3.2.1.50). 3. MPS IIIC (OMIM #252930): Acetil-CoA: α-glucosaminida acetiltransferasa (HGSNAT -E.C. 2.3.1.78). 4. MPS IIID (OMIM #252940): N-acetilglucosamina-6-sulfatasa (GNS - E.C. 3.1.6.14). Este síndrome se caracteriza por una degeneración del sistema nervioso central severo con una alteración somática leve. Algunas características fenotípicas son hiperactividad, crecimiento lento, cabello grueso, hirsutismo, desordenes del 27

sueño, y hepatosplenomegalia leve. Las anormalidades esqueléticas, son mínimas con una leve disostosis múltiple, usualmente tienen una estatura promedio, y una rigidez articular leve83. Las MPS IIIA y IIIB son las más comunes. Esta patología afecta principalmente las neuronas de sistema nervioso central. Los pacientes mueren en la segunda década o al comienzo de la tercera década. Es por esto que los incentivos de abordaje clínico se centran en el conocimiento de la alteración de la barrera hemtoencefalica, ya que se han observado cambios morfológicos como dilatación del espacio perivascular en los capilares de la materia blanca, atrofia cortical e hinchazón neuronal. Adicional, se ha observado la acumulación de gangliosidos GM3. Por lo que entender la fisiopatología de esta MPS en particular ya que se intenta la administración de las terapias para las otras MPS84. Mucopolisacaridosis IV: La MPS IV, o enfermedad de Morquio, se clasifica en los subtipos A y B, diferenciadas por la enzima que esta deficiente y que afecta la degradación de queratan sulfato y condroitin-6-sulfato. En MPS IVA (OMIM #253000) la enzima deficiente es la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS - E.C.3.1.6.4)85, y se caracteriza por anormalidades esqueléticas, opacidad corneal, daño cardiaco y en articulaciones, baja estatura, con cuello y tronco cortos, displasia de cadera, alteraciones de la columna y tórax en quilla11,86. La enfermedad de Morquio B (OMIM #253010), es causada por la deficiencia de la enzima β-galactosidasa (GLB1 - EC 3.2.1.23) la cual es esencial para el catabolismo de glicoconjugados con residuos terminales de β-galactosil. Esta enzima también está involucrada en otra enfermedad de depósito lisosomal, conocida como gangliosidosis GM1, donde se acumulan gangliosidos, lactosilceramida87. Morquio B es característica por las deformidades óseas, la opacidad corneal y la alteración de la función cardiaca88. Estudios funcionales indicaron que la mutación de la proteína de Morquio B está asociada con la secreción alterada de tropoelastina y su incapacidad para ensamblarse en fibras elástica, lo que resulta en elastogenesis deficiente 89. Mucopolisacaridosis VI: conocida como síndrome de Maroteaux-Lamy (OMIM # 253200), es causada por la deficiencia en la actividad de la enzima Nacetilgalactosamina-4-sulfatasa (ARSB - E.C.3.1.6.12) la cual degrada el GAG dermatan sulfato90. La acumulación de este GAG resulta en problemas a nivel del tejido conectivo de la piel, válvulas cardiacas, respiratorias, y alteraciones óseas2. Se han reportado dos modos de avance de la enfermedad, uno rápido que se liga con un fenotipo severo y uno de avance lento que se asocia con el fenotipo moderado o leve24. Aunque en estos últimos tipos se puede llegar a presentar síntomas severos en un solo órgano, que a futuro requerirá de alguna 28

cirugía91. Se ha descrito formas rápidamente progresivas de la enfermedad, en el que la vía respiratoria se ve altamente afectada por la gran cantidad de GAG acumulado, produciendo otros síntomas como enfermedad pulmonar obstructiva, apnea del sueño entre otras. Diferentes análisis genéticos se han desarrollado en esta enfermedad caracterizando que la mayoría de mutaciones están relacionadas con mutaciones sin sentido y contrasentido92. Mucopolisacaridosis VII: también conocida como síndrome de Sly (OMIM # 253220) en la cual la enzima deficiente es la β-glucuronidasa (GUSB - EC 3.2.1.31), que conlleva a la acumulación de dermatan, heparan y condroitin sulfato en el lisosoma. Los acontecimientos fenotípicos que se presentan en este síndrome incluyen hepatosplenomegalia, opacidad corneal, retardo mental, disostosis múltiple, e hidrops fetalis93. En su mayoría las mutaciones son sin sentido o contrasentido, se han encontrado mutaciones por splicing94. Algunos estudios han mostrado como el efecto de la acumulación de estos GAG pueden alterar la actividad de proteínas como STAT3 o el factor inhibitorio de leucemia (LIF) que disminuyen la proliferación en condrocitos y por lo tanto en el desarrollo de huesos cortos95. Mucopolisacaridosis IX: es causada por la deficiencia en la hialuronidasa. Descrita en 1996 por Natowitcz en el que describió un paciente varón con baja estatura y múltiples masas de tejidos blandos periarticulares comprobando que correspondía a un almacenamiento de ácido hialurónico 24. Triggs-Raine et al, 1999 determinó que la mutación se encontraba sobre el gen HYAL1 que presentaba una mutación sin sentido para este paciente. Los síntomas descritos para estos pacientes han sido formación de masas modulares en las coyunturas, relacionándose con procesos inflamatorios, cambios faciales leves, inteligencia normal96. Tabla 3. Resumen de las características bioquímicas y genéticas de las MPS. Enfermedad

Subtipo

Deficiencia enzimática

MPS I

α-L-iduronidasa

MPS II MPS IIIA

Hurler – Hurler/Scheie – Scheie Hunter Sanfilippo A

MPS IIIB

Sanfilippo B

Iduronato-2-sulfatasa Hepara-N-sulfatasa α-NAcetilglucosaminidasa

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Gen (localización) IDUA 4p16.3

GAG acumulado DS + HS

IDS Xq28 SGSH 17q25.3 NAGLU 17q21

DS + HS HS HS

MPS IIIC

Sanfilippo C

MPS IIID

Sanfilippo D

MPS IVA

Morquio A

Heparan acetil-CoA:αglucosamina Nacetiltransferasa N-acetilglucosamina 6sulfatasa Galactosa 6-sulfatasa

MPS IVB

Morquio B

Β-galactosidasa

MPS VI

Maroteaux-Lamy

Arlsulfatasa B

MPS VII

Sly

Β-glucuronidasa

MPS IX

-

Hialuronidasa I

HGSNAT 8p11.1

HS

GNS 12q14

HS

GALNS 16q24.3 GLB1 3p21.33 ARSB 5q11q13 GUSB 7q21.11 HYAL 3p21.3

CS + QS QS DS DS + CS + QS AH

4.2 DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE MUCOPOLISACARIDOSIS El diagnóstico de las mucopolisacaridosis es uno de los pasos más importantes en el abordaje clínico de la enfermedad, ya que la realización de un correcto diagnóstico permite iniciar de forma oportuna el tratamiento paliativo o específico97. El diagnóstico diferencial de MPS se realiza con las primeras observaciones del médico pediatra o neonatologo, quien reconoce algunos signos y síntomas98, aunque la mayoría de los neonatos son asintomáticos a medida que el paciente va creciendo se van presentando signos y síntomas clínicos como hernias inguinales y umbilicales, faces toscas, hepatosplenomegalia, deformidades óseas y en articulaciones, también puede existir anormalidades en sistema nervioso central 97. Otros análisis que acompañan el diagnostico en MPS examinación oftalmológica, cardiaca para detectar opacidad corneal, glaucoma, enfermedad valvular, cardiomiopatía, y falla cardiaca99,100. La severidad de los síntomas varía según cada subtipo de la enfermedad dejando una esperanza de vida que no supera la primera o segunda década de vida101. Diferentes características fenotípicas, moleculares y bioquímicas pueden confirmar el diagnóstico de MPS, las cuales confirman la presencia de MPS y diferencian el tipo que presenta el paciente102; algunos algoritmos se han creado para correlacionar el tipo de mutación junto otras características clínicas para predecir el fenotipo en MPS I, con el cual se pretendió mejorar el proceso de diagnóstico para optar por el tratamiento adecuado así como también para ser empleado en el tamizaje neonatal78. El análisis fenotípico se realiza por varias características mencionadas anteriormente. El análisis molecular busca específicamente la mutación que pudo generar la deficiencia enzimática, puede ser útil en el pronóstico cuando la mutación está asociada a la severidad de la MPS. En los análisis 30

bioquímicos se empleó inicialmente la detección de GAG en orina, sin embargo la medición de la actividad enzimática que se realiza en tejidos (sangre y fibroblastos) permite confirmar realmente el tipo de MPS103. Los ensayos para cuantificación de GAG son: azul de 1,9-dimetilmetileno (DMB), cromatografías (TLC, HPLC, LC), pruebas de ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay), espectrometría masa en tándem (MS/MS). Estas técnicas se han refinado con el fin de confirmar y determinar otros tipos de biomarcadores como oligosacáridos específicos de cada MPS3,97,104. A partir de estos oligosacáridos otras técnicas se han desarrollado para detectar disacáridos característicos de cada MPS, mediante el procesamiento enzimático, marcaje con anilina y posterior identificación por glicanos marcados por isotopos-cromatografía liquida/espectrometría de masas (GRIL-LC/MS)59. Al igual que para otros errores innatos del metabolismo, para las MPS se ha comenzado a trabajar en pruebas de tamizaje neonatal que permita la detección temprana de los pacientes104. Algunos de estos métodos incluyen análisis moleculares de ADN, métodos de inmuno-captura de enzimas deficientes para MPS tipo I, II, IIIA y VI, métodos de análisis de actividad enzimática y detección en conjunto de dermatan, heparan y queratan sulfato por medio de cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas en tándem 104. Sin embargo, estos métodos tienen sus desventajas y ventajas respecto a costos, sensibilidad y detección de falsos positivos59. Lin et al., 2013 realizaron una prueba piloto en treinta y cinco mil recién nacidos aproximadamente empleando una prueba fluoremétrica para detectar mucopolisacaridosis tipo I, encontrándose 2 recién nacidos positivos con deficiencia enzimática que fueron corroborados con análisis moleculares de ADN. El tratamiento de MPS principalmente se dirige a reducir los cúmulos de GAG en los lisosomas mediante la administración de enzimas activas producidas de forma recombinante para ser internalizadas por la célula y direccionadas al lisosoma 1. Un diagnóstico temprano permite dar un inicio oportuno de la terapia para reducir el avance deletéreo de la enfermedad. Sin embargo, diferentes sucesos pueden alterar un correcto diagnóstico, algunos de estos son: -

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Se han reportado casos donde los padres detectan la enfermedad antes que los médicos especialistas, ya que realizan búsquedas de los síntomas de su hijo en internet106. Algunos países, como Colombia, que se encuentran en etapas de inicio de los programas de tamizaje neonatal no contemplan aun estas 31

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enfermedades, además no se disponen de los datos epidemiológicos adecuados y por lo tanto no se puede lograr una detección temprana107. En fenotipos leves los síntomas se llegan a detectar en edad adulta. Respecto a los GAG como biomarcadores existe poca evidencia de la relación con la severidad somática de la enfermedad, los GAG varían entre individuos, tejidos, edad, función renal, masa corporal3. También se ha observado la excreción de GAG diferentes a los implicados, en MPS I se han examinado los niveles de excreción de QS, que disminuyeron una vez se inició la terapia de reemplazo enzimático108. Las pruebas analíticas de GAG son insensibles, inespecíficas, costosas, y demandantes para el análisis101.

Cuando se ha diagnosticado se puede plantear algún tratamiento para esta enfermedad. Los tratamientos se han obtenido por métodos experimentales y clínicos. Actualmente se encuentran aprobados el trasplante de células madre hematopoyéticas y la terapia de reemplazo enzimático para MPS I (Larodinasa), MPS II (Idursulfasa), y MPS VI (Galsulfasa)1,109–111. Para MPS III A a D, IV B y VII las enzimas recombinantes se encuentran en desarrollo o en estudio 1. Recientemente, para MPS IV A se aprobó el tratamiento por ERT con elosulfasa112,113. Otras alternativas terapia génica, análogos a gentamicina, y moléculas chaperonas, las cuales se encuentran en etapas de estudio in vivo1. 4.2.1 Biomarcadores para el diagnóstico de mucopolisacaridosis Los biomarcadores son moléculas producto de alteraciones biológicas en un individuo, que pueden ser asociadas con alguna condición patológica 9 y son esenciales para el diagnóstico, pronóstico y monitoreo de la severidad de una enfermedad. Cuando ocurren alteraciones patológicas ocurren es necesario identificar y medir cambios significativos que identifiquen la patología con precisión, con el fin de que el abordaje clínico sea el adecuado, por lo que es importante contar con moléculas biológicas (biomarcadores) que sean únicas para cada patología13. En MPS se han identificado dos tipos de biomarcadores, primarios y secundarios al proceso bioquímico. Los biomarcadores primarios metabolitos que se acumulan por la deficiencia de las proteínas que las metabolizan o transportan. En el caso de las MPS los GAG son los biomarcadores primarios, como se mencionó anteriormente 3. Los biomarcadores secundarios son producto del proceso patológico primario y se debe a la alteración de los procesos biológicos normales., Para las MPS se han descrito alteraciones en respuesta a proteínas no plegadas, autofagia, disfunción mitocondrial, estrés oxidativo, homeostasis del calcio, inflamación, alteración del 32

trafico vesicular, fusión lisosoma-endosoma24,114–119. De los cuales se han obtenido biomarcadores secundarios como: -

-

-

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Complejo trombina-heparina II (MPS I, II y VI): el cofactor de heparina II, pertenece al grupo de proteasas llamadas serpinas (serina proteasa inhibitoria), estas cumplen funciones importantes en el control de la coagulación y la fibrinólisis120. Inicialmente se caracterizó este biomarcador por análisis proteómicos usando modelos murinos de MPS I121. La heparina y el heparan sulfato aumentan la tasa de inhibición de trombina por esta serpina. En pacientes con MPS este nivel se mide mediante ELISA y se encuentra aumentado debido a los altos niveles de GAG en sangre 122. Langford-Smith et al., 2011 demostraron que este biomarcador puede ser empleado para el seguimiento a corto plazo de pacientes recibiendo terapia de reemplazo enzimático, ya que las serpinas tienen alteraciones rápidas en su actividad por la presencia de HS y heparina. Relación condroitin/dermatan sulfato (MPS I, II, II y VI): se emplea para la evaluación a largo plazo de tratamientos de reemplazo enzimático4. Normalmente tiende a disminuir esta razón una vez los niveles de DS o CS bajan debido a la terapia por reemplazo enzimático. Dipeptidil peptidasa IV (MPS I y III): este biomarcador fue determinado en plasma de pacientes con MPS. Esta enzima está encargada de remover dipéptidos treonina-prolina del N-terminal de la apoliproteina CI, ubicada en las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Sin embargo, esta enzima tiene otros 36 sustratos más entre el que se encuentran la hormona liberadora de la hormona del crecimiento, por lo que podría ser uno de los causantes de la corta estatura en pacientes con MPS123. Gangliósidos GM2 y GM3 (MPS III): así como en Niemann-pick y las gangliosidosis GM1 y GM2 se acumulan gangliosidos, como procesos patológicos secundarios y primarios, respectivamente, se ha visto alterados en MPS III donde el GAG involucrado es heparan sulfato84. Existe también un aumento de GM1 y GM2 en células neuronales de GM1 y GM2, con el posterior secuestro de colesterol en los lisosomas5. Estas alteraciones inducen procesos inflamatorios como activación de la microglia y astrocitos reactivos. Inflamación: los GAG están involucrados en mecanismos de inicio y control de eventos asociados con inflamación. Entre los que se incluyen producción de citoquinas/quimiocinas, reclutamiento de leucocitos y maduración de células inflamatorias55. Uno de las cascadas más conocidas en las que intervienen los GAG es la activación del receptor Toll-like 4124. Se han 33

-

encontrado en modelos animales la producción de factor de necrosis tumoralα, ceramida e interlququina-1β125. Estos procesos se activan por el exceso de GAG en plasma y liquido senovial activando macrófagos que liberan diferentes moléculas inflamatorias55. Autofagia: a pesar de ser un proceso normal en la célula que ocurre en momentos de inanición, para la formación de autofagosomas se requiere de los lisosomas para que exista el ambiente adecuado para el procesamiento de organelos126. En MPS VI se ha observado como estos procesos normales de degradación como la autofagia o la poliubiquitinación de proteínas y otros organelos importantes para la viabilidad celular como las mitocondrias son alterados en los que se destaca la elevada producción de especies reactivas de oxigeno127, desencadenando patrones patológicos relacionados a inflamación y muerte celular. Se ha propuesto que MPS sean consideradas como una enfermedad de autofagia, ya que este proceso es altamente afectado, evitando que se degraden los organelos117.

Las aproximaciones por las cuales se han obtenido estos biomarcadores se han enfocado en la observación clínica, experimentación en modelos animales, experimentación en líneas celulares3,24,119. Sin embargo acercamientos computacionales y bioinformáticos han tenido éxito en la predicción de nuevos biomarcadores para diferentes patologías, ya que muchas aproximaciones como las ‘omicas’ permiten obtener perfiles de genes, RNA, proteínas y metabolitos alterados que pueden ser estudiados de manera sistémica, sin embargo ninguna aproximación existe para mucopolisacaridosis, algunos investigaciones se han centrado en datos de expresión genómica en modelos animales con MPS, pero el análisis se ha centrado en que genes se apagan o se encienden 13. Como se ha observado los múltiples caminos o rutas metabólicas de señalización que están alteradas en MPS permiten ver que el estudio global de la enfermedad permitirá entender y conectar los procesos que allí ocurren25. 4.3

APROXIMACIONES COMPUTACIONALES PARA LA PREDICCIÓN DE BIOMARCADORES. La bioinformática se ha convertido en un área que ha permitido el análisis e interpretación de la gran cantidad de datos de los que actualmente se disponen. La disponibilidad del genoma completo ha permitido que áreas como la genómica, la proteómica y la metabolómica se dirijan hacia la identificación de nuevas moléculas que sean únicas y características de patologías como cáncer o enfermedades neurodegenerativas. La implementación de estas herramientas bioinformáticas en los datos de expresión como minería de datos, visualización de datos o la integración de esta con bases de datos facilita la interpretación y la adaptación de 34

los resultados a campos de aplicación como el uso clínico. Chiassereni et al., 2014 realizaron una análisis proteómico en conjunto con técnicas bioinformáticas para determinar la composición de proteínas de las vesículas extracelulares presentes en el fluido cerebroespinal humano, entre los que lograron identificar 230 nuevas proteínas, de esta manera se propuso que conocer la composición de estas vesículas son importantes para la detección de nuevos biomarcadores en las enfermedades neurodegenerativas o desórdenes neurológicos128. Algunas revisiones de literatura ya abordan como la proteómica ha permitido encontrar varios biomarcadores para ciertas patologías, como por ejemplo, Liu et al., 2014 mencionan como SAA (serum amyloid A), plasminogeno y proteína C9 han sido biomarcadores para cáncer gástrico y que se han estudiado a partir de estas técnicas experimentales y bioinformáticas129. A partir de la información proporcionada por estas omicas durante los últimos 20 años, ahora se abordan de diferente manera el análisis de los datos genómicos, proteómicos o metabólicos, es decir, cada dato se maneja como un componente de un sistema, luego se estudian las propiedades emergentes que se observan por la interacción de componentes y no por sus estudio independiente130. 4.4

BIOLOGÍA DE SISTEMAS

4.4.1 Redes biológicas El modelo de estudio lineal o cartesiano ha sido parte de la investigación en las ciencias. Normalmente, se ha estudiado un problema mediante la separación de sus partes, para el estudio general de las mismas y la aproximación matemática sencilla que generalice un suceso para describirlo131. Esta forma de abordar las ciencias, como la biología, ha permitido comprender y entender cuáles son los componentes y cómo funcionan dentro de un sistema o célula. Sin embargo, debido a esta aproximación generalizada e individual comprender el funcionamiento celular total se convierte en un problema que requeriría de muchos años de investigación y recursos132. El dogma central de la biología es un ejemplo de esta visión, donde solo tres componentes son los principales del comportamiento del sistema, sin embargo es la interacción de estas con otras moléculas las que permiten realizar una función, llevar un mensaje, o mediar una catálisis133. En los últimos 10 años se ha fortalecido un nuevo enfoque que ha estudiado las asociaciones e interacciones entre estos componentes concibiéndolos como sistemas complejos, formando redes y conectados en múltiples niveles131. La biología de sistemas ha sido la denominación que se le ha dado al estudio de redes complejas biológicas por medio del análisis de las interacciones y/o asociaciones 35

de componentes entre componentes de esta red 15. De esta forma, la biología de sistemas estudia y reconstruye sistemas complejos los cuales describen el comportamiento biológico. Estos sistemas son abiertos, con jerarquías y finalidades comunes, autorganizados, alejados del equilibrio, y que se adaptan a equilibrios externos134. La integración de componentes cumple con el principio fundamental de sinergia, es decir, la interacción y/o asociación de algún componente con muchos más implica la aparición de propiedades emergentes, que muy difícilmente se podrían observar por estudiar componente por componente15. Su organización y jerarquía interna permite conocer de manera detallada que funciones y localizaciones cumplen ciertos componentes134. Una de las primeras redes en aparecer, en la cual se estudió la interacción entre proteínas fue para la levadura Saccharomyces cerevisiae, que permitió identificar que las redes biológicas no están organizadas de forma aleatoria, sino que algunas proteínas están conectadas con muchas otras proteínas, y que la eliminación o silenciamiento de algunas de estas proteínas se asocia con muerte del organismo135. De igual forma, otras proteínas no son letales, esto es debido a otra propiedad de las redes y es la robustez, ante el cambio y el colapso, mediado por mecanismos de sistemas de control (retroalimentación), redundancia (redundancia), y degeneración de sus componentes (asimilación facultativa de roles perdidos), desacoplamiento (tampones), y modularidad (creación de subsistemas)133,134. Las redes biológicas tienen unas características topológicas o estructurales que las hacen diferentes a cualquier otro tipo de red. Se han definido tres tipos de redes para cualquier sistema: aleatorias, libre de escala y jerárquicas. Las aleatorias son redes cuyas interacciones internan no tienen algún orden y por lo tanto es fácil desarmar estas redes131. Las redes biológicas se clasifican como de libre de escala debido a que no todos sus componentes están conectados igualmente entre ellos, sino que existen, unos pocos componentes que interactúan con muchos otros componentes más de la red136. Estos componentes se conocen como Hubs (Figura 3), son de alta importancia y normalmente son componentes que median procesos vitales para la célula131,136. Una característica común de todas estas redes biológicas es que dos componentes pueden estar conectados por un camino de muy pocos pasos a través de la red137. En las redes biológicas se ha observado un camino que esta entre 3 y 4 pasos, esta característica también es conocida como efecto del mundo pequeño, luego la información pasa rápidamente entre dos componentes en el momento de alguna perturbación exterior137,138. Otra propiedad de las redes biológicas está definida por un coeficiente de agrupamiento alto, es 36

decir, regiones de la red donde los componentes están altamente conectados entre ellos, lo que se ve en redes metabólicas o de interacción entre proteínas.

Figura 3. Esquema de una red metabólica. Donde se señala un nodo altamente conectado (Hub). La acetil-coenzima A es un metabolito empleado en diferentes rutas sintéticas. Tomado y modificado de http://bigg.ucsd.edu/

4.4.2 Tipos de redes biológicas Los componentes de la red se han definido como nodos y aristas. Los nodos pueden ser genes, factores de transcripción, mRNA, proteínas, macromoléculas, fármacos, entre otros. Las aristas son relaciones entre nodos y pueden ser interacciones físicas o asociaciones funcionales136. Estas aristas pueden ser directas o indirectas, las primeras especifican un nodo fuente y un nodo final, las segundas simplemente relacionan interacciones como proteína-proteína (Figura 4).

Figura 4. Diferentes representaciones de una red. (a) representación metabólica de la síntesis de urinilmonofosfato a citosiltrifosfato con los cofactores y productos correspondientes. (b) representación de asociación entre los componentes de la figura

37

(a). (c) asociación de metabolitos de la reacción (a). Los nodos son metabolitos, cofactores y/o productos. Tomado de Barabasi et al., 2004.

Las redes que relacionan genes, proteínas y mRNA, son producto de la generación de datos a través de las nuevas tecnologías como microarreglos, CHIPs, secuenciación, Y2H-espectometria de masas, que son tecnologías aplicadas a las omicas139. Estas herramientas han facilitado la recolección de gran cantidad de datos para diferentes sucesos biológicos o patológicos140. Las redes biológicas se pueden clasificar de diferentes maneras, sin embargo una de las clasificaciones útiles para este estudio se describen a continuación: redes proteína-proteína, genes, genes-factores de transcripción, metabólicas y de señalización. 4.4.3 Redes metabólicas y su análisis El conocimiento bioquímico del que se dispone de las transformaciones metabólicas ha hecho posible la reconstrucción, a una escala genómica, de redes metabólicas para diferentes individuos. Estas redes pueden convertirse en formatos matemáticos, permitiendo la formulación de modelos a escala genómica (GEMs). Los GEMs permiten el cálculo de rasgos fenotípicos basados en la composición genética del organismo. Los GEMs se componen de metabolitos y enzimas, donde los primeros son los nodos y los segundos las aristas134,141. Los modelos metabólicos o GEMs siguen unas reglas generales que permiten que las redes sigan un comportamiento fisiológico15: 1. Todas las funciones celulares se basan en reacciones químicas. 2. Toda la información debe ceñirse a los datos biológicos de los que se disponga para la especie. 3. Los datos experimentales pueden ser mapeados en los modelos para generar restricciones. 4. Las células funcionan bajo restricciones de tipo: fisicoquímico, ambiental, topológico y regulatorio. Estas restricciones no pueden ser violadas y permiten la estimación de todos los estados funcionales que el modelo o red puede alcanzar. Matemáticamente tales declaraciones son trasladadas dentro de subespacios asociados con la matriz estequiométrica (S). En esta matriz, las filas corresponden a metabolitos y las columnas a reacciones de la red. El coeficiente de los sustratos y productos de cada reacción se colocan en la celda de la matriz.

38

5. La masa y la energía se conservan. Como todas las reacciones se describen en la matriz estequiométrica junto con sus coeficientes y como un conjunto de ecuaciones pueden ser descritas por la matriz estequiométrica, esto significa que todos los estados de equilibrio (estados de homeostasis) de una red pueden ser descritos por la ecuación S*v=0, donde v es el vector de los flujos a través de una reacción. 6. Las células evolucionan bajo una presión dada por el ambiente. Esta presión es conocida como el cumplimiento de una función objetivo y determina el estado óptimo dedo por una red y gobernada por las restricciones. Para realizar un modelo metabólico adecuado se requieren de varios pasos sucesivos que lleven a un modelo que se comporte de manera similar a los procesos biológicos estudiados. Para reconstruir un modelo se requiere de varias herramientas bioinformáticas y bases de datos que se complementan, en general134,142,143: 1. Plantilla del modelo. Básicamente es disponer de todos la información bibliográfica y experimental del tipo de célula que se quiera modelar. 2. Reconstrucción detallada del modelo. En este se puede compartimentalizar entre organelos, generar la reacciones de intercambio entre organelos, reacciones de intercambio y demanda celular. 3. Representación matemática del modelo en ecuaciones diferenciales parciales u ordinarias. Los modelos son representados en matrices estequiométricas donde se relacionan los metabolitos y las reacciones, es decir: Para la reacción A -> B, el valor estequiométrico para A es -1 porque se consume y B es 1 porque se produce. Para un metabolito diferente que no participe en la reacción será cero. a. Relleno de gaps del modelo. Cuando se han introducido todas las reacciones en el modelo, existe la posibilidad que alguna de ellas sea huérfana o sea una reacción bloqueada, esto conlleva a metabolitos que no tienen una fuente de producción o se producen pero no se consumen. b. Simulación y visualización. Esto permite la manipulación del modelo para fines propuestos. Los análisis se pueden realizar por varios métodos de análisis como: análisis de balance de flujos (FBA), análisis de variabilidad de flujos (FVA), regulación para análisis de balance de 39

flujos (rFBA), minimización del ajuste metabólico (MOMA, por sus siglas en ingles de minimization of metabolic adjusment), minimización de regulación on-off (ROOM, por sus siglas en ingles de regulatory onoff minimization). Para los dos primeros pasos se emplean múltiples bases de datos que facilitan la información de diferentes organismos, y permiten realizar análisis metabólicos. Algunos estas bases de datos son KEGG, BioCyc, ENZYME, Biochemical Genetic and Genomic (BIGG), BRaunschweigENzymeDAtabase (BRENDA) y Reactome. Para los pasos 3 a 5, se requieren herramientas bioinformáticas que permitan la manipulación de la información. Entre estas se encuentran herramientas que pueden ser integradas a otros programas o que desde la web pueden generar diferentes tipos de manipulaciones y análisis como MetaFluxNet, FluxExplorer, OptFlux, SurreyFBA y Flux-balance Analysis based SIMUlations (FASIMU), COnstraint-based Reconstruction and Analysis Toolbox (COBRA), OpenFlux, FBA SimVis, Flux Analysis and Modeling Environment (FAME) estos análisis se encuentran referenciados y disponibles en web en http://cobramethods.wikidot.com/start. Los análisis que se pueden realizar a un modelo metabólico comprenden la solución de ecuaciones diferenciales las cuales deben cumplir un objetivo biológico fijado144. Las soluciones se obtienen por medio del análisis de balance de flujos (FBA), método que se basa en programación lineal144,145 (Figura 5). Estos resultados representan la distribución de flujos de las reacciones que aportan al cumplimiento de la función objetivo y que alcanzan un estado estacionario o de conservación de masa144. La producción de masa y consumo son restricciones que también son fijadas en el modelo, inclusive se pueden adicionar más restricciones de tipo fisicoquímicas, espaciales o topológicas, ambientales y/o regulatorias146. Las restricciones son fijadas por el investigador y tienen fines de adaptar el modelo para inicialmente simular el comportamiento del organismo que se esté estudiando (Figura 6)147. El análisis de variabilidad de flujos o FVA consiste en la optimización del valor vi mediante dos problemas de optimización separados. El primero consiste en la optimización de vi maximizando la función objetivo, y la segunda minimizando la función objetivo. Dado que FBA puede generar multiplicidad de cálculos, FVA permite conocer los limites dentro de los cuales están permitidos los flujos para una reacción146.

40

Figura 5. Esquema del procedimiento de análisis para un modelo metabólico. (1) Se definen las reacciones en el modelo metabólico, las cuales son descritas en un matriz estequiométrica que cumpla con los principios de conservación de masa. (2) Las reacciones tienen unas restricciones, inicialmente son flujos de masa, que definen un rango de producción y consumo. Se fija una reacción como función objetivo, la cual será optimizada. Y por programación lineal se obtienen los flujos que aportan para el cumplimiento de la función objetivo. Tomado y modificado de Raman et al., 2009.

Figura 6. Solución de la matriz estequiométrica. La red metabólica se representa en una matriz estequiométrica a la cual se le asignan valores negativos o positivos o cero, dependiendo si es consumido, producido o no interviene en la reacción, respectivamente. Las restricciones de masa que se aplican a cada reacción, es decir, los límites entre los cuales puede ser producido o consumido los metabolitos de una reacción, en conjunto forman un espacio convexo que entre el cual se va a optimizar la función objetivo. Tomado y modificado de Bordbar et al., 2014.

41

Algunas aplicaciones de los modelos metabólicos se han extendido logrando avances como: predicción de reacciones en rutas metabólicas, obtención de sistemas condicionados para la producción de ciertos metabolitos para uso biotecnológico, búsqueda de blancos terapéuticos para cáncer e infecciones. A continuación se describen algunos estudios empleando modelos metabólicos: -

-

-

García et al., 2012, emplearon la reconstrucción metabólica de Sacaromices cerevisiae para comparar los flujos obtenidos por FBA bajo una función objetivo compuesta y resultados experimentales obtenidos de datos bibliográficos 148. Ellos determinaron que la función objetivo que mejor se acopla a los resultados experimentales viene siendo la optimización de la reacción de biomasa, ya que esta reacción describe los requerimientos de una célula en crecimiento y ha sido descrita por otros autores para su correcta formulación149. Algunas modificaciones de FBA han permitido simular con más precisión modelos experimentales como por ejemplo modelos de levadura mediante el análisis de viabilidad para determinar la pertinencia de diferentes funciones objetivo o sus combinaciones150. Covert et al. 2003, empleando una reconstrucción de 20 reacciones que comprendían el metabolismo de glicolisis, pentosas fosfato, ciclo de Krebs, rutas de fermentación, biosíntesis de aminoácidos y crecimiento celular151. A parte de las restricciones de masa, se adicionaron restricciones de regulación génica mediante operadores booleanos, esto permitió que el espacio de soluciones se redujera con lo cual se logró adaptar el modelo a unas condiciones ambientales impuestas 151. Thiele et al en 2013, reconstruye la red de metabolismo humano a escala genómica que comprende todas las rutas conocidas en humano, esta fue una versión mejorada de recon 1 que había sido generada por Duarte et al en 2007. Ambas reconstrucciones comprenden una modelo bottom-up, determinístico, definido por ecuaciones diferenciales ordinarias, compartimentalizados, genes asociados para cada reacción, identificadores de reacciones, identificadores de metabolitos, confidencia de la reacción, escritos en formato SBML (System Biology Markup Lenguage). En la Tabla 4 se muestran las diferencias entre los dos modelos.

Tabla 4. Diferencias entre recon 1 y recon 2. Propiedad Total de reacciones Total de metabolitos

Recon 1 3744 2766 42

Recon 2 7440 5063

Número de metabolitos en: Espacio extracelular Citoplasma Mitocondria Núcleo Retículo endoplasmático Peroxisoma Lisosoma Aparato de Golgi Número de transcritos Número de genes Número de subsistemas Número de reacciones bloqueadas Número de metabolitos muertos Tamaño de la matriz estequiométrica EIMs mapeados Número de genes para EIMs

43

404 995 393 95 235 143 217 284 1905 1496 90 1270

642 1878 754 165 570 435 302 317 2194 1789 99 1603

339

1176

2766:3744 5063:7440 233 255

248 272

5 OBJETIVOS E HIPÓTESIS 5.1

OBJETIVO GENERAL

Analizar las alteraciones metabólicas para la predicción de biomarcadores a partir de la variación de flujos de reacción en modelos metabólicos humanos para los diferentes tipos de mucopolisacaridosis.

5.2

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Describir las reacciones metabólicas alteradas en los diferentes tipos de mucopolisacaridosis. 2. Determinar biomarcadores potenciales para el diagnóstico o seguimiento de mucopolisacaridosis.

5.3

HIPÓTESIS

El empleo de redes metabólicas humanas permite predecir cambios metabólicos en los diferentes tipos de mucopolisacaridosis.

44

6 MÉTODOS La metodología se realizó teniendo en cuenta el siguiente Figura: Figura 7. Diagrama de flujo de la metodología seguida para la obtención y análisis de los modelos. Recon 2 Depuración de modelo Reacción inútil

¿Está el modelo depurado?

Generación de modelos MPS Se introduce una reacción Revisión de enzimas asociadas a MPS

¿Se encuentra la enzima?

Silenciar las enzimas

Comprobar silenciamiento

Fijar una función objetivo (FO)

Comprobar FO

Análisis de balance de flujo

Análisis de variabilidad de flujo

Comparación de flujos

Comparación de rangos de flujos

Análisis de enriquecimiento de genes

45

6.1 RECONOCIMIENTO DEL MODELO RECON 2. En el presente trabajo se empleó la reconstrucción metabólica humana recon 221, y disponible en http://humanmetabolism.org/. Esta red es una actualización de su antecesora recon1. Estas redes se desarrollaron a partir de toda la información proveniente de otras redes metabólicas como EHMN (Edinburgh Human Metabolic Network), HepatoNet1, y de otras reconstrucciones tejido-específicos como de macrófagos, hepatocitos y células renales. El modelo de recon 2 consta de 7440 reacciones correspondientes a 100 rutas, entre las que se encuentran desde metabolismo básico (glicolisis, ciclo de Krebs, pentosas fosfato, síntesis y degradación de nucleótidos, metabolismo de lípidos entre otras más), cuenta con rutas especiales como reacciones de detoxificación de fármacos, reacción de biomasa. El modelo consta de 642 metabolitos extracelulares los cuales se encuentran en biofluidos tales como plasma y orina, estos metabolitos cuentan con sus identificadores en bases de datos específicas como Human Metabolic Database (HMDB). Para la depuración del modelo, se descargó de los archivos suplementarios del articulo oficial de Thiele et al., 2013, en formato xls, el cual contiene toda la información del modelo. Los campos con los que se contaban fueron: abreviación de la reacción, nombre de la reacción, formula estequiométrica, ruta metabólica, límite inferior, límite superior, genes asociados a la reacción, grado de confidencia, termino SBO (system biology ontology), EC number, notas del creador del modelo y referencias. La depuración se realizó teniendo en cuenta reacciones que no enriquecieran el modelo y que pudieran generar reacciones de bloqueo, es decir, producir metabolitos (fármacos y xenobióticos) que no son parte del metabolismo basal. Cuando las reacciones son reversibles se tiene un flujo tanto hacia la derecha (valores positivos) como hacia la izquierda (valores negativos), los cuales tienen unidades de milimol/gramos de peso seco/hora. Los análisis sobre el modelo se realizaron empleando las herramientas Constraints Based Reconstruction and Analysis (COBRA)142 y SBML en MATLAB The MathWorks, Inc., Natick, Massachusetts, United States. 6.2 IDENTIFICACIÓN ENZIMÁTICA Y GENERACIÓN DE MODELOS. La identificación de las enzimas de degradación de MPS se realizó mediante una búsqueda bibliográfica; las diferentes reacciones se mapearon en el modelo teniendo en cuenta: a) los diferentes nombres que puede recibir una enzima, b) los identificadores de las enzimas como el número EC, y c) la ruta involucrada de la enzima. Para generar los modelos knock-out, los límites de flujo superior e inferior 46

para las enzimas asociadas con las diferentes MPS fueron fijados a cero, independientemente. 6.3

DEFINICIÓN DE LA FUNCIÓN OBJETIVO Y ANÁLISIS DE BALANCE DE FLUJOS. Recon 2 proporciona la información necesaria para el desarrollo de un modelo estequiométrico, el cual toma la forma S.v = 0, donde S es la matriz estequiométrica y v los valores de los flujos (Figura 5). Para cada reacción se tiene establecido unos límites permitidos de flujo, que están definidos para fijar la reversibilidad o irreversibilidad de una reacción. Cuando el flujo es positivo la reacción planteada se dirige hacia la derecha, mientras que un flujo negativo se interpreta como una reacción reversible cuya dirección es hacia la izquierda. Estos límites son las restricciones que se usaron para la optimización de los modelos144. Al fijar estas restricciones el modelo puede ser optimizado linealmente para cumplir cierta función objetivo. La función objetivo evaluada fue síntesis de ATP, la cual se escogió por una búsqueda exhaustiva en bases de datos. Cada modelo de MPS fue optimizado empleando COBRA toolbox y con Gurobi5 (Gurobi Optimization, Inc.) como solucionador del problema de optimización. Los flujos de reacción obtenidos para los diferentes modelos de MPS se compararon contra los obtenidos por recon 2 bajo las mismas condiciones. Para una comprobación que los flujos obtenidos de los modelos MPS eran propios de estos modelos, se realizó el mismo procedimiento de silenciamiento y optimización para otras enfermedades de depósito lisosomal, estas fueron la enfermedad de Pompe, Gaucher y Fabry, cuyas enzimas silenciadas fueron Glucosiltransferasa α(1->4), glucosilcerebrosidasa y α-galactosidasa, respectivamente.

6.4 ANÁLISIS DE ENRIQUECIMIENTO GÉNICO Se realizó un análisis de enriquecimiento para los genes asociados a las reacciones que se vieron alteradas al comparar los flujos entre recon 2 y los diferentes modelos MPS. Para esto se empleó la base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado DAVID v6.7152 con el cual se formaron grupos de genes alterados. Cada grupo tiene un coeficiente de enriquecimiento que hace referencia a la relación según su clasificación funcional. 6.5

ANÁLISIS DE VARIABILIDAD DE FLUJOS Y DETERMINACIÓN DE BIOMARCADORES. Bajo la evaluación de la función objetivo (síntesis de ATP) se obtuvieron los nuevos límites para cada reacción de acuerdo al análisis de variabilidad de flujo. Los limites 47

o restricciones de masa para cada reacción se compararon contra el estándar de recon 2 de la siguiente manera: Para dos reacciones de diferentes modelos (A y A’) A ϵ MPSx, donde x puede ser cualquier subtipo de MPS y A’ ϵ recon 2. Teniendo que A=[a1,a2] y A’=[a’1,a’2], 1 es el límite superior de la reacción y 2 es el límite inferior de la reacción, si (a1≤a’1 o a1≥a’1) y (a2≤a’2 o a2≥a’2), entonces los limites o restricciones de masa de la reacción A no se superpone sobre el rango de la reacción A’, y esta reacción/metabolito podrá ser considerado como un biomarcador 23. Dos tipos de biomarcadores que pueden ser distinguidos bajo esta definición: 1) en los que los límites que no se solapan, y 2) en los que existe algún solapamiento al compararlos contra los límites de cada reacción de recon 2 (Figura 8). El diagrama de la metodología se presenta en la Figura 7.

Figura 8. Definición de rangos para determinación de biomarcadores. Parte superior: se muestra el límite superior e inferior para una reacción cualquiera, cuando se ha modificado o alterado la red como en el caso de MPS entonces se pueden presentar diferentes casos de comportamiento de los limites, cuando se eleva o disminuyen, a tal punto que no se pueden sobrelapar entonces se habla de biomarcadores de alta confidencia. En la parte inferior: se ejemplifican cuatro sucesos para los límites de los modelos de MPS, donde los límites se siguen sobrelapando con los de recon 2.

6.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO. Los modelos se sometieron a análisis de componentes principales (PCA) empleando los resultados de FBA. El PCA fue realizado con las herramientas estadísticas incluidas en el software matemático de MATLAB.

48

6.7 VALIDACIÓN DE RESULTADOS. Los cambios metabólicos observados en los modelos fueron comparados contra reportes de literatura mediante una revisión bibliográfica extensa en bases de datos como OMIN, HMDB, literatura en NCBI y GoPubmed.

49

7 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7.1 CONSIDERACIONES INICIALES. La mucopolisacaridosis son patologías que comprometen múltiples vías bioquímicas, de señalización y metabolismo, se ha reportado que la acumulación de GAG afecta múltiples procesos normales de la célula, entre ellos: alteraciones en respuesta a proteínas no plegadas, autofagia, disfunción mitocondrial, estrés oxidativo, homeostasis del calcio, inflamación, alteración del trafico vesicular, fusión lisosoma-endosoma24,34,115–118,153. Estos cambios se han descrito como eventos que ocurren progresiva y consecutivamente, siendo denominados como secundarios y terciarios, y que se han considerado para MPS y otras EDL, en general algunos de estos eventos son: 1.

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Acumulación de otros sustratos como gangliósidos GM1 y GM2, colesterol, esfingolípidos, lo que lleva a alteración de la concentración de la membrana lisosomal153,154. Alteración en el tráfico vesicular que pueden contener macromoléculas y receptores de membrana unidos a sus ligandos155. Alteración de la permeabilidad de la membrana lisosomal liberando proteasas al citosol, por ejemplo captepsina D156. Alteración en la fusión de lisosomas con otras vesículas156. Incapacidad de fusionar lisosomas con autofagosomas117. Requerimientos metabólicos altos, debido a la deficiencia de los metabolitos de reciclaje provenientes del lisosoma157. Mitocondrias que deben ser degradadas en autofagosomas, aumentan debido al deficiente acople entre lisosomas y organelos117. Aumento de especies de oxigeno reactivas por mitocondrias. Alteraciones en señalización, incremento de procesos inflamatorios y muerte celular25.

Estas modificaciones han sido estudiadas en diferentes modelos animales, celulares y datos clínicos3,25. Sin embargo un estudio que estudie los procesos patológicos en conjunto de MPS no se ha realizado, ya que se han estudiado mecanismos independientemente tanto para MPS como para las EDL, por lo que los mecanismos patológicos se han obtenido por asociación de estos estudios5,6,25,37. Por lo tanto dentro de los varios procesos celulares, moleculares y bioquímicos que están desbalanceados en MPS se escogió el estudio del metabolismo por varias razones: 1) el lisosoma tiene un rol importante en el metabolismo, luego su alteración induce cambios en todos los niveles158, 2) la 50

alteración metabólica de MPS no se ha estudiado completamente por lo que una aproximación computacional puede generar hipótesis para evaluar experimentalmente159, 3) las alteraciones metabólicas en MPS desencadenan diferentes cambio en diferentes vías de señalización, luego predicciones computacionales pueden generar nuevas hipótesis25, 3) existen diferentes aproximaciones computacionales que permiten predecir el comportamiento metabólico de un organismo, 4) el estudio en conjunto del metabolismo puede generar propiedades emergentes y 5) los metabolitos obtenidos como posibles biomarcadores podrían ser empleados por métodos analíticos ya existentes 160. En este trabajo se empleó la reconstrucción a escala genómica del metabolismo humano (recon 2) desarrollada por Thiele y colaboradores21. Esta se modificó y analizó mediante las herramientas bioinformáticas COBRA Toolbox142, SBML Toolbox161, Libsbml Toolbox161, con el propósito de modelar los cambios metabólicos que ocurren tras el silenciamiento de las reacciones involucradas en la degradación de GAG y asociadas con la generación de MPS. Estos cambios metabólicos fueron empleados para predecir biomarcadores potenciales para el diagnóstico y seguimiento de este grupo de enfermedades. Además como se mencionó, el análisis se basó teniendo en cuenta la deficiencia total de la actividad enzimática, y que el modelo simulado no se encuentra bajo ningún tipo de tratamiento farmacológico. 7.2 DEPURACIÓN DEL MODELO Durante el proceso de reconstrucción y validación de recon 2 realizado por Thiele et al 2013, el modelo se evaluó para determinar la capacidad de que cumpliera ciertas tareas metabólicas, con el fin de determinar si el modelo podía sintetizar ciertos metabolitos o de degradar otros, como por ejemplo sintetizar ATP bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas, y empleando sustratos como alcohol, glicina, lactato, y prolina, entre otros21. Bajo estas características del modelo, el modelo es útil para la búsqueda de nuevas moléculas biológicas como potenciales biomarcadores. A partir de esta información se quiso evaluar el comportamiento metabólico de recon 2 una vez existía una alteración en la ruta de degradación de GAG y así determinar cambios propios de cada MPS. Los modelos simulados se depuraron con el fin de cumplir con ciertos criterios metabólicos, estos fueron: 1) los modelos no estaban bajo ningún tratamiento farmacológico, 2) los modelos no estaba en proceso de crecimiento y 3) los procesos catabólicos y anabólicos no se limitaron, es decir, los modelos simularon un escenario de supervivencia162. La modificación del modelo constó de un proceso de filtro y depuración de las reacciones que pudieran causar 51

alteraciones por la producción de metabolitos que contribuyeran a resultados erróneos (cofactores, fármacos y xenobióticos, iones), ya que la presencia de estos pueden activar reacciones que empleen como sustratos los productos de degradación de estas reacciones de xenobióticos, por ejemplo iones hidronio, agua o radicales libres. En este sentido, se eliminaron reacciones que: 1) interrumpieran el balance metabólico celular, por ejemplo la reacción de biomasa, 2) no fueran propias del estudio; por ejemplo reacciones de degradación de fármacos por citocromos y 3) reacciones que puedan causar una cascada de bloqueo. Esta depuración llevo a la eliminación de 57 reacciones, que correspondían a reacciones involucradas en metabolismo de xenobióticos (25 reacciones), transporte de fármacos (31 reacciones) y producción de biomasa (1 reacción) (Tabla 5). Finalmente, se obtuvo un modelo de 7383 reacciones que adicional estaban agrupadas a 98 rutas metabólicas clasificadas dentro del mismo modelo. Tabla 5. Reacciones eliminadas durante la depuración de recon 2. Las reacciones corresponden a procesos de transporte y metabolismo de xenobióticos y reacción de biomasa.

Abreviación de formula 'EBASTINEOHtr'

Nombre de reacción

Formula de la reacción 'ebastineoh[r] ebastineoh[c] ' 'ebastine[r] ebastine[c] '

'24NPHte'

'24nph[e] 24nph[c] '

'4HDEBRISOQUINEte'

'4hdebrisoquine[e] 4hdebrisoquine[c] '

'4MTOLBUTAMIDEte'

'4mtolbutamide[e] 4mtolbutamide[c] '

'4NPHSFte'

'4nphsf[e] 4nphsf[c] '

'4NPHte'

'4nph[e] 4nph[c] '

'5HOMEPRAZOLEte'

'5homeprazole[e] 5homeprazole[c] '

'AFLATOXINte'

'aflatoxin[e] aflatoxin[c] '

'ANTIPYRENEte' 'APNNOXte' 'APPNNte' 'CARVEOLte' 'COUMARINte' 'DMANTIPYRINEte' 'EAFLATOXINte'

Transpore de Xenobióticos

'EBASTINEtr'

'antipyrene[e] antipyrene[c] ' 'apnnox[e] apnnox[c] ' 'appnn[e] appnn[c] ' 'carveol[e] carveol[c] ' 'coumarin[e] coumarin[c] ' 'dmantipyrine[e] dmantipyrine[c] ' 'eaflatoxin[e] eaflatoxin[c] '

'EBASTINEOHte'

'ebastineoh[e] ebastineoh[c] '

'EBASTINEte'

'ebastine[e] ebastine[c] '

'HCOUMARINte'

'hcoumarin[e] hcoumarin[c] '

'HTAXOLte'

'htaxol[e] htaxol[c] '

'LIMNENte'

'limnen[e] limnen[c] '

'NIFEDIPINEte'

'nifedipine[e] nifedipine[c] '

'NPTHLte'

'npthl[e] npthl[c] '

'OMEPRAZOLEte'

'omeprazole[e] omeprazole[c] '

52

'ONPTHLte'

'onpthl[e] onpthl[c] '

'PERILLYLte'

'perillyl[e] perillyl[c] '

'TAXOLte'

'taxol[e] taxol[c] '

'TOLBUTAMIDEte'

'tolbutamide[e] tolbutamide[c] '

'WHDDCAte'

'whddca[e] whddca[c] '

'WHHDCAte'

'whhdca[e] whhdca[c] ' 'whttdca[e] whttdca[c] '

'RN0020R' 'o2[r] + h[r] + nadph[r] + C07535[r] 'h2o[c] + CN0012[c] CN0009[c] '

'RN0021R'

'h2o[r] + CN0012[r] 2 h[r] + CN0009[r] '

'RN0021X'

'h2o[x] + CN0012[x] 2 h[x] + CN0009[x] '

'RN0022C'

'h2o[c] + C14851[c] CN0010[c] '

'RN0022R'

'h2o[r] + C14851[r] 2 h[r] + CN0010[r] '

'RN0022X'

'h2o[x] + C14851[x] 2 h[x] + CN0010[x] '

'RN0023C'

'h2o[c] + C14849[c] CN0011[c] '

'RN0023R'

'h2o[r] + C14849[r] 2 h[r] + CN0011[r] '

'RN0023X'

'h2o[x] + C14849[x] 2 h[x] + CN0011[x] '

'RN0027C' 'RN0027R' 'RN0028C' 'RN0028R' 'RN0028X' 'RN0029C'

Metabolismo de xenobióticos

'RN0021C'

'o2[c] + 3 h[c] + nadph[c] + CN0020[c] => h2o[c] + nadp[c] + CN0021[c] ' 'o2[r] + 3 h[r] + nadph[r] + CN0020[r] => h2o[r] + nadp[r] + CN0021[r] ' 'h2o[c] + CN0021[c] CN0022[c] ' 'h2o[r] + CN0021[r] CN0022[r] ' 'h2o[x] + CN0021[x] CN0022[x] '

'RN0031C'

'o2[c] + nadph[c] + CN0022[c] => h2o[c] + h[c] + nadp[c] + CN0023[c] ' 'o2[r] + nadph[r] + CN0022[r] => h2o[r] + h[r] + nadp[r] + CN0023[r] ' 'o2[c] + 3 h[c] + nadph[c] + CN0016[c] => h2o[c] + nadp[c] + CN0017[c] ' 'o2[r] + 3 h[r] + nadph[r] + CN0016[r] => h2o[r] + nadp[r] + CN0017[r] ' 'h2o[c] + CN0017[c] CN0018[c] '

'RN0031R'

'h2o[r] + CN0017[r] CN0018[r] '

'RN0031X'

'h2o[x] + CN0017[x] CN0018[x] '

'RN0032C'

'o2[c] + nadph[c] + CN0018[c] => h2o[c] + h[c] + nadp[c] + CN0019[c] ' 'o2[r] + nadph[r] + CN0018[r] => h2o[r] + h[r] + nadp[r] + CN0019[r] '

'RN0029R' 'RN0030C' 'RN0030R'

'RN0032R'

53

Reacción genérica de biomasa

'biomass_reaction'

20.650823 h2o[c] + 20.704451 atp[c] + 0.385872 glu_L[c] + 0.352607 asp_L[c] + 0.036117 gtp[c] + 0.279425 asn_L[c] + 0.505626 ala_L[c] + 0.046571 cys_L[c] + 0.325996 gln_L[c] + 0.538891 gly[c] + 0.392525 ser_L[c] + 0.312690 thr_L[c] + 0.592114 lys_L[c] + 0.359260 arg_L[c] + 0.153018 met_L[c] + 0.023315 pail_hs[c] + 0.039036 ctp[c] + 0.154463 pchol_hs[c] + 0.055374 pe_hs[c] + 0.020401 chsterol[c] + 0.002914 pglyc_hs[c] + 0.011658 clpn_hs[c] + 0.053446 utp[c] + 0.009898 dgtp[n] + 0.009442 dctp[n] + 0.013183 datp[n] + 0.013091 dttp[n] + 0.275194 g6p[c] + 0.126406 his_L[c] + 0.159671 tyr_L[c] + 0.286078 ile_L[c] + 0.545544 leu_L[c] + 0.013306 trp_L[c] + 0.259466 phe_L[c] + 0.412484 pro_L[c] + 0.005829 ps_hs[c] + 0.017486 sphmyln_hs[c] + 0.352607 val_L[c] => 20.650823 adp[c] + 20.650823 h[c] + 20.650823 pi[c] '

7.3

IDENTIFICACIÓN DE REACCIONES ASOCIADAS CON MPS Y GENERACIÓN DE MODELOS. Una vez depurado el modelo se fijó una función objetivo, se tuvo en cuenta que en las MPS existen diferentes alteraciones metabólicas producto de la deficiencia lisosomal que afecta en el reciclaje de macromoléculas y procesos celulares, tales como la alteración de canales de calcio, interacción ligando receptor, y alteración de fusión de endosomas procesos que requieren de energía y metabolitos para su funcionamiento 25,157,162. En este sentido, se definió como función objetivo la síntesis de adenosin trifosfato (ATP), la cual correspondía a la síntesis de ATP por la ATP sintasa localizada en la membrana interna mitocondrial y cuya reacción catalizada es: 4 h[c] + adp[m] + pi[m] => 3 h[m] + h2o[m] + atp[m] donde [c]: metabolito ubicado en citosol, [m]: metabolito ubicado en mitocondria, adp: adenosian de difosfato, pi: pirofosfato, h: ion hidronio, h2o: agua y atp: adenosin trifosfato Con el modelo recon 2 depurado y con la función objetivo fijada, se identificaron las enzimas que se encuentran deficientes en cada una de las diferentes MPS. En total se identificaron 10 enzimas 24, que se encuentran en diferentes multi-complejos en el lisosoma degradando consecutivamente los polisacaridos, por lo que estas enzimas se encontraban relacionadas a varias reacciones de los prototipos de GAG que se encuentran en recon 2 (Tabla 6). El prototipo de HS consta de 24 moléculas de aminoazúcares y un núcleo proteico, existen 5 ejemplos de CS (entre las cuales se encuentra DS) cada uno de 5 moléculas de aminoazúcares y para QS consta de 40 moléculas entre aminoazúcares y galactosa con un núcleo proteico. Identificadas estas reacciones se continuó con la generación de cada modelo de MPS.

54

Como se ha mencionado el modelo tiene dos restricciones, una estequiometrica y otra de límites (máximo y mínimo) permitidos de flujo o masa que pasa a través de cada reacción, entonces el silenciamiento se realizó ajustando a cero los límites máximos y mínimos de flujo para las reacciones asociadas con las enzimas deficientes en MPS. Este silenciamiento total de la enzima correspondió a un fenotipo severo de la enfermedad, donde la mutación genética lleva a una pérdida total de la actividad enzimática de la enzima 163. En este sentido, para MPS I se simuló el fenotipo Hurler, y no los de Hurler-Scheie y Scheie, los cuales corresponden a las formas intermedias y atenuadas, respectivamente, de la MPS tipo I75. Tabla 6. Número de reacciones asociadas a cada enzima de MPS y presentes en el modelo recon 2. Enfermedad MPS I MPS II MPS III A MPS III B MPS III C MPS III D MPS IV A MPS IV B MPS VI MPS VII

Enzima deficiente alfa-L-Iduronidasa Iduronato sulfatsa Heparan N-sulfatasa alfa-N-Acetil-glucosaminidasa Acetil-CoA:alfa-glucosaminida acetiltransferasa N-Acetilglucosamina 6-Sulfatasa Galactosa 6-sulfatasa beta-Galactosidasa N-Acetilgalactosamina 4-sulfatasa beta-Glucoronidasa

Número de reacciones asociadas con la enzima 4 3 4 5 4 17 9 18 5 7

De acuerdo a esto, la degradación de QS requiere de 75 reacciones entre las que interviene las enzimas α-fucosidasa, β-galactosidasa, β-N-acetilhexosaminidasa, βN-acetilglucosaminidasa, glicosilasparaginasa, iduronidasa, Nacetilgalactosaminidasa, N-acetilglucosamina-6-sulfatasa, N-acetilglucosaminidasa y sialidasa (Figura 9, no se muestra toda la ruta). La degradación de CS/DS de 44 reacciones, interviene las enzimas α-L-iduronidasa, la iduronato-2-sulfatasa, βglucuronidasa, β-N-acetilhexosaminidasa, glucurunato-2-sulfatasa y la Nacetilgalactosamina -4 y -6-sulfatasa. La degradación de HS requiere de 27 reacciones en las que interviene α-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, heparan-Nsulfatasa, α-N-acetilglucosaminidasa, heparan-glucosaminida N-acetiltransferasa, N-acetilglucosamina-6-sulfatasa y beta-glucuronidasa. De esta manera se explica porque para modelar las diferentes MPS, fue necesario silenciar más de una reacción en el modelo depurado de recon 2. En el Anexo 1 se relacionan las reacciones que fueron silenciadas para modelar los diferentes tipos de MPS. 55

Figura 9. Degradación de queratan sulfato. Recon 2 presenta la formación de un esqueleto de GAG, luego en la parte superior se observa el producto de biosíntesis de QS que por pasos sucesivos se degrada hasta el núcleo proteico serina/treonina. Los nodos representan los metabolitos y las aristas representan las enzimas que catalizan dicha reacción. Tomado de BIGG Database (http://bigg.ucsd.edu/).

56

7.4 VERIFICACIÓN SILENCIAMIENTO DE REACCIONES EN MODELOS MPS. Para cada uno de los 11 modelos generados se verificó que las reacciones se hubiesen silenciado mediante la optimización por análisis de balance de flujos. En este caso se definió como función objetivo la maximización de la reacción silenciada, como esta se encontraba apagada se esperaba no encontrar flujo final para estas reacciones. A pesar que se encontraron soluciones factibles a la optimización, ningún modelo logro maximizar las reacciones, ya que estas estaban silenciadas. A continuación se presenta la solución de optimización obtenida para todos de MPS analizados: Sol = x: [7383x1 double] f: 0 y: [5063x1 double] stat: 1 solver: ‘gurobi5’ time: 0.3870 >> donde ‘f’ corresponde al flujo resultado de la función objetivo, en este caso, es cero;, x: valores para cada reacción, y: metabolitos, stat: indicador de si la respuesta es factible (1) o no (0) y time: tiempo requerido para el cálculo. La solución factible de flujos se debió a que existe un espacio definido por las restricciones de las reacciones no silenciadas (estequiométricas y de flujo), por donde pasaban los diferentes flujos, esto quiere decir que existen algunas reacciones que se emplearon para cumplir la función objetivo, pero no era posible obtener flujo en la función objetivo, igualmente esto valida el modelo porque a pesar que se dirija el flujo hacia estas reacciones silenciadas no es posible la degradación del GAG correspondiente y por lo tanto los modelos simulaban correctamente el fenotipo severo de MPS. 7.5

OPTIMIZACIÓN POR ANÁLISIS DE BALANCE DE FLUJOS PARA LOS MODELOS RECON 2 Y TIPOS DE MPS. Con el fin de determinar los cambios en los flujos metabólicos para diferenciarlos con respecto a los observados en un modelo no alterado (recon 2), se sometieron a un análisis de balance de flujos (FBA, se optimizaron) los 11 modelos (recon 2 y 10 de MPS), empleando la reacción de síntesis de ATP como función objetivo. De esta forma se obtuvieron los valores de flujo para cada una de las reacciones que componen el modelo (Anexo 2). 57

Tres tipos de valores de flujo se pueden obtener para una determinada reacción: negativos, positivos o nulos. Los primeros hacen referencia a reacciones que se desplazan hacia la izquierda, los segundos pertenecen a reacciones que se desplazan hacia la derecha, y los últimos corresponden a las reacciones que no se requirieron para el cumplimiento de la función objetivo. Cada modelo empleó una serie de reacciones para cumplir la función objetivo teniendo en cuenta las restricciones estequiométricas y de masa que son propias del modelo. Estas restricciones se presentan como límites entre -1000 y 1000 mmol/gdw/h, (gdw =gramos de peso seco de célula). Cada modelo logró optimizar la función objetivo de maximizar la reacción correspondiente a síntesis de ATP, lo que indica que a pesar de presentar la alteración en una de sus rutas metabólicas, se encontró una solución viable al problema, sugiriendo que la deficiencia en las enzimas encargadas del metabolismo lisosomal de los GAG en estos modelos no es letal para estos ya que existen otros metabolitos que son fuentes energéticas (lípidos, aminoácidos y azucares) que provienen del medio extracelular como de la degradación de otras macromoléculas (glicógeno o núcleos proteicos). A pesar de ser un modelo estático, es decir, no se estudia el progreso en el tiempo de la enfermedad sino que se detalla un momento especifico de la enfermedad, se observa que el silenciamiento que simula un fenotipo severo concuerda con lo evidenciado para MPS donde a pesar de existir una insuficiencia enzimática total, el organismo sobrevive por un tiempo que estos casos severos es menor de la primera década de vida2. Sin embargo es por los diferentes mecanismos patológicos secundarios y terciarios, que la célula finalmente muere, es decir, mecanismos de señalización apaptóticos, es por esto que es importante resaltar que este modelo no comprende otros actores de la patología como mRNA, señalización, factores de transcripción, proteínas estructurales entre otras moléculas2,164, sin embargo los modelos metabólicos que se basan en métodos de optimización se fundamentan en que los sistemas vivos se organizan para optimizar tareas vitales o basales 165. Para el análisis de estos datos se compararon los flujos metabólicos obtenidos para las MPS con los observados en el modelo depurado de recon 2. Este análisis permitió identificar las reacciones que cambiaron tras el silenciamiento de las reacciones lisosomales. Las comparaciones se realizaron tomando a recon 2 como el metabolismo de un individuo sano mientras que el proceso de enfermedad correspondía a los modelos MPS. 7.6 VALIDACIÓN DE LOS FLUJOS PARA LOS MODELOS MPS Y EDL. Para determinar que los flujos obtenidos previamente en los modelos MPS eran propios de la simulación del silenciamiento de rutas de degradación de GAG. Se sometieron a optimización o a FBA bajo la misma función objetivo (síntesis de ATP) 58

los modelos de otras enfermedades lisosomales, estas fueron Fabry (Globotriaosilceramida/α-galactosidasa), Pompe (Glucógeno/glucosil transferasa α(1->4)) y Gaucher (Glucosilceramida /Glucocerebrosidasa). Las cuales se escogieron por su alteración en el metabolismo de gangliósidos y esfingolípidos los cuales corresponden a moléculas que pueden llegar a acumularse en MPS. Pompe se escogió porque al existir una depleción en el uso del glucógeno, se esperaba encontrar una similitud de la alteración energética que se presenta en todas las EDL incluyendo MPS5,157. La comparación se realizó entre los flujos obtenidos entre cada modelo. Se encontró que la similitud entre modelos era bastante baja, para 20 de las 100 rutas metabólicas definidas por Thiele et al para recon 2, menos del 6% total de las reacciones en cada ruta metabólica era igual para todos los modelos, sin embargo para el metabolismo de tetrahidrobiopterina se encontró un 37% de similitud entre los flujos obtenidos. En detalle estas reacciones corresponden a reacciones gap, es decir, sus metabolitos no se producen por alguna otra reacción, es decir, estas reacciones no estaban conectadas dentro del modelo (Tabla 7). Por esta comparación y análisis, se concluyó que los flujos obtenidos son propios de cada modelo debido a cada deficiencia enzimática que desencadena flujos diferentes en el metabolismo, además los cambios no se presentan en conjunto, es decir los flujos no existen cambios propios de EDL. Tabla 7. Comparación de flujos entre los 14 modelos (recon2, MPS y EDL).

'Transport, lysosomal' 'Transport, mitochondrial' 'Transport, endoplasmic reticular' 'Transport, extracellular' 'Glycine, serine, alanine and threonine metabolism' 'Tryptophan metabolism' 'Arginine and Proline Metabolism' 'Transport, peroxisomal' 'Phosphatidylinositol phosphate metabolism' 'Pyruvate metabolism' 'Bile acid synthesis' 'Nucleotide interconversion' 'Eicosanoid metabolism' 'Glutathione metabolism' 'Starch and sucrose metabolism' 'Unassigned' 'Fatty acid synthesis' 'Tetrahydrobiopterin metabolism' 'Exchange/demand reaction' 'NAD metabolism'

59

No. rxns Reacciones % Rxnigual/ con igual en recon 2 Rxn total flujo 107 1 1% 310 6 2% 161 5 3% 1550 30 2% 37 1 3% 70 3 4% 41 1 2% 126 4 3% 63 4 6% 32 1 3% 128 2 2% 177 2 1% 257 3 1% 16 1 6% 33 1 3% 173 2 1% 126 1 1% 27 10 37% 742 13 2% 23 2 9%

7.7

COMPARACIÓN POR GRUPOS Y RUTAS METABÓLICAS DE LOS MODELOS MPS CONTRA RECON2. Con el fin de determinar diferencias entre los modelos que se relacionan con los mismos GAG se realizó un análisis comparativo entre los flujo obtenidos, por ejemplo, MPS III tiene tres subtipos que están relacionados con la degradación heparan sulfato, luego se esperaba que los modelos metabólicos presentaran diferencias entre estos subtipos, para generar hipótesis independientes de cada modelo. El primer análisis realizado fue un análisis de componentes principales (PCA), con el que se obtuvieron 4 grupos de modelos: Grupo 1 recon 2, MPS IIID y MPS VII; Grupo 2 MPS IIIA, IIIB y IIIC; Grupo 3 MPS IVA, IVB y MPS VI; y Grupo 4 MPS I y MPS II (Figura 10). Estos resultados muestran que exceptuando los modelos del Grupo 1, los modelos se encuentran agrupados de acuerdo con la ruta metabólica afectada, lo cual sugiere que dependiendo del GAG acumulado el modelo presenta una alteración característica en su metabolismo. Por ejemplo, en las MPS I y II (Grupo 4) se encuentra alterado el catabolismo del DS y HS; mientras que las MPS IIIA, B y C (Grupo 2) tienen en común la alteración exclusiva del metabolismo del HS. Sin embargo, el análisis de FBA no permitió diferenciar entre las MPS que comparten el mismo GAG alterado, y adicionalmente las MPS VII y IIID, quedaron agrupadas con el modelo recon 2 (Grupo 1), en las siguientes secciones se discute de las posibles causas de este agrupamiento. Los valores de flujo de los modelos del grupo 2 eran iguales, de manera similar paso con los modelos del grupo 4. Estos aspectos indican que es necesario continuar trabajando en la construcción de estos modelos empleando un modelo dinámico o regulado por descriptores booleano o probabilístico que permita reducir más el espacio de optimización y por lo tanto tener resultados diferenciales. A partir de estos agrupamientos se realizaron los análisis posteriores de los resultados.

7.8 DESCRIPCIÓN METABÓLICA DE LOS FLUJOS. Todos los modelos fueron capaces de sintetizar ATP, las reacciones y sus respectivos flujos en los modelos de MPS variaron respecto a los empleados y obtenidos en recon 2. Este cambio en los flujos metabólicos puede ser debido a que los metabolitos de la degradación de GAG [D_glucuronato (glcur), ion sulfato (SO 4), galactosa (gal), xilosa (xyl), N-acetilgalactosamina (acgal), N-acetilglucosamina (acgam), coenzima A (coa), iduronato (iduor), L_fucosa (fuc_L), y Nacetilneuraminato (acnam)] no pueden ser empleados en otros procesos metabólicos en los modelos, por lo que el sistema cambia el flujo de otras reacciones para poder lograr la maximización de la función objetivo (síntesis de ATP). 60

MPS_IIIB MPS_IIIC MPS_IIIA Recon 2

MPS_VII

MPS_IIID MPS_IVB MPS_VI

MPS_IVA

MPS_I MPS_II

Figura 10. Análisis de componentes principales de los modelos de MPS y recon 2. Se observa la conformación de cuatro grupos entre MPS y recon 2.

De las 7383 reacciones de recon 2 depurado, un total de 1942 reacciones fueron empleadas para cumplir la función objetivo, mientras que en los modelos de MPS se emplearon en promedio 2286 ± 249 reacciones para cumplir dicha función (Figura 11, barras azules). Los modelos de los Grupos 2 (MPS III A, B y C, 2468 reacciones) y los del Grupo 1 (MPS IIID y VII con, 1929 y 1923 reacciones, respectivamente) fueron los que mayor y menor número de reacciones requirieron, respectivamente. A pesar que se emplearon una igual cantidad de reacciones en el Grupo 1, en promedio los flujos obtenidos para 1272 reacciones de los modelos MPS (IIID y VII) eran diferentes a los obtenidos para recon 2, por lo que las demás reacciones con flujo igual los asociaron dentro de este grupo en el PCA, esto significa que el silenciamiento de las enzimas en estas MPS también tuvieron un impacto sobre el metabolismo del modelo. De las 98 rutas metabólicas descritas en recon 2, se encontró flujo en 87 de ellas para los 11 modelos. Las rutas que no presentaron flujo en alguno de los modelos MPS fueron: lipoato, linoleato, acido araquidónico, vitamina E, vitamina B12, 61

selenoaminoácidos, síntesis de CS, estilbeno y alcaloides, y degradación de limoneno. Como consecuencia a esto último, en estas rutas no se iba a encontrar biomarcadores o cambios metabólicos. Esto implico que las rutas inflamatorias en la que están relacionada el ácido araquidónico no se pudieran evaluar166. Así como lo efectos protectores o antioxidantes de la vitamina E167 y los efectos sobre el ADN de la vitamina B12168. Exactamente estas rutas presentaban reacciones que no estaban conectadas con la red, también se denomina reacciones gap. La comparación de los flujos metabólicos de cada modelo MPS contra los de recon 2 permitió observar que en promedio 1983 ± 475 reacciones se alteraron en MPS (Figura 11, barras rojas). Estas alteraciones representaban reacciones que presentaban cambios en los flujos, así como también reacciones que no se emplearon en recon 2 y que se activaron en los modelos MPS o viceversa. Para tener un panorama global de grupos metabólicos alterados, se realizó un agrupamiento de las 100 rutas metabólicas descritas en recon 2 con base a la caracterización por grupos que se tiene establecida en la base de datos de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes KEGG pathway (Anexo 3). Esta clasificación permitió ver la relación de la alteración de los modelos en los diferentes grupos metabólicos (Tabla 8). De acuerdo a este agrupamiento, las reacciones de transporte (21.8% del total de reacciones), carbohidratos (19.3% del total de reacciones), glicanos (16.5% del total de reacciones), aminoácidos (13.2% del total de reacciones) y nucleótidos (26.5% del total de reacciones) tuvieron una mayor cantidad de reacciones que aumentaron su flujo comparadas contra recon 2; la cantidad de reacciones que disminuyeron su flujo correspondían a metabolismo de grupos sanguíneo (12.3% del total de reacciones), metabolismo de otros aminoácidos (14.6% del total de reacciones), reacciones de intercambio (16.5% del total de reacciones) y metabolismo de nucleótidos (18.3% del total de reacciones). Esto significó un cambio importante por el hecho que en recon 2 no se presentó un cambio tan marcado en el metabolismo teniendo en cuenta que también debía cumplir con la función objetivo de síntesis de ATP. Esto también quiso decir que con estas restricciones adicionales (silenciamiento) a los modelos se logró alterar completamente todo el sistema de reacciones metabólicas. Los cambios detallados por ruta metabólica se presentan en el Anexo 4. De los cambios detallados en el Anexo 4 y para los metabolismos que presentaron reacciones con aumento de flujo fueron: -

En metabolismo de carbohidratos, las rutas de pentosa fosfato, glicolisis, ciclo de Krebs, aminoazúcares, piruvato y dicarboxilato. 62

5000

Número de reacciones

4000 2201

2278

2276

2301

2248

3000 1330

1250

2000

1000

1942

2356

2468 1929

2455

2465

2409

1923

0 recon 2

MPSI -II MPSIII A to MPSIIID B

MPSIVA

MPSIVB

MPSVI

MPSVII

Figura 11. Número de reacciones empleadas y alteradas por modelos MPS y recon 2. Número de reacciones empleadas para el cumplimiento de la función objetivo (barras azules).Número de reacciones de las utilizadas para cumplir la función objetivo que cambiaron respecto a los flujos obtenidos en recon 2 (barras rojas). En esta última, se incluyen reacciones que se apagaron y se prendieron, reacciones que aumentaron y disminuyeron en los modelos de MPS.

-

En el metabolismo de aminoácidos, el metabolismo de valina, leucina, isoleucina, glicina, serina, alanina, arginina, prolina, glutamato. En el metabolismo de glicanos, síntesis y degradación de N-glicanos, síntesis y degradación de QS. En el metabolismo de nucleótidos, catabolismo de purinas e interconversión de nucleótidos. En las reacciones de transporte, transporte extracelular y mitocondrial.

Adicional, en el metabolismo de lípidos se observó que a pesar que no contaba con una alteración importante dentro de este grupo, se encontró que en su mayoría las reacciones que aumentaron su flujo fueron las de β-oxidación. En este sentido los resultados mostraban una activación metabólica, donde la falta de los metabolitos de degradación de GAG y la síntesis de ATP, aumentaba reacciones sintéticas y de obtención de energía, así como el intercambio de metabolitos, los que mayor intercambio presentaron fue con el espacio extracelular, mitocondria y retículo endoplasmático (Tabla 8), con lo cual se incito al modelo a utilizar nuevas reacciones como por ejemplo sintetizar nuevas estructuras (glucógeno, QS, 63

productos finales e intermediarios de N-glicanos), que correspondía al aumento de consumo de ATP. Evidencia experimental se ha realizado para estudiar las alteraciones metabólicas cuando la función lisosomal se ha visto afectada, estos estudios se han centrado tanto por la acumulación de GAG como de otros metabolitos. En un estudio realizado por Woloszynek et al., 2009 empleando ratones MPS I, se estudiaron las anormalidades metabólicas y bioquímicas con respecto a lo observado en ratones silvestres. Los resultados de dicho estudio mostraron que existe una disminución en la concentración de algunos carbohidratos y ácidos grasos, así como también un aumento en la degradación de proteínas169. Según los resultados de Woloszynek et al., 2009 debido a la deficiencia de reciclaje de metabolitos por parte del lisosoma, se activan mecanismos de biogénesis de autofagia, mecanismo regulados por un complejo de cinasas presente en la membrana del lisosoma, conocido como blanco de la rapamicina en mamíferos (mTOR) que es activado por factores de crecimiento, hormonas, aminoácidos, glucosa oxígeno y estrés162. La activación de este factor permite la translocación de TFEB al nucleó (factor de transcripción que activa genes ligados a biogénesis de autofagosomas, oxidación lipídica entre otros), esto es debido a procesos relativos a periodos de inanición donde las células deben obtener fuentes de energías alternas38,170. En general los modelos MPS concordaron con algunos de estos sucesos, la activación de nuevas fuentes de energía como β-oxidación, o el empleo de aminoácidos, así como la síntesis de GAG (QS) y glicanos (intermediario y moléculas finales de N-glicanos), también el uso de moléculas que se emplearían para la síntesis de estos GAG y glicanos como 3’-fosfoadenosina5’-fosfosulfato (PAPS) y de UDP-glucosa que se internalizó al retículo endoplasmático57, y la salida de algunos intermediarios del ciclo de Krebs como citrato, α-cetoglutarato y oxalacetato, entre los metabolitos que se transportaron de mitocondria a citosol y viceversa estaban carnitina, panteteina, dTMP, 2-oxobutanoato, lisina, arginina entre los más importantes. El citrato puede iniciar la síntesis de ácidos grasos, que también presenció un aumento de las reacciones de esta ruta en los modelos MPS en comparación a recon 2. La β-oxidación aumentada en los modelos corresponde a algunas observaciones realizadas en diferentes EDL donde el tejido adiposo se reduce en varios tejidos169. La síntesis de glicanos en MPS igualmente se ha observado que aumenta debido a que muchos de los GAG degradados en lisosomas se reutilizan nuevamente en la síntesis de nuevos GAG, debido a que le permite a las células reservar energía y recursos171. También, debido a su importancia funcional y estructural 46, la deficiencia de estos GAG en la MEC induce a que la célula deba sintetizar y normalizar las cantidades normales en el medio 64

extracelular, lo que consume mayor cantidad de energía para internalizar y sintetizar nuevas estructuras de novo157,169,171. En este orden de ideas, los modelos MPS lograron diferenciarse de recon 2 y mostraron un posible momento metabólico donde se buscaban nuevas formas de obtención de energía, degradación y síntesis de GAG que simulaban el proceso metabólico donde los lisosomas ya no pueden fusionarse o no reciclan los diferentes sustratos, mientras que la célula en un intento por preservar las funciones y comunicación con el medio extracelular sintetiza diferentes macromoléculas. De igual forma, Woloszynek et al, reportaron una elevación en la concentración de aminoácidos, lo cual se puede explicar por la necesidad de obtener precursores de energía, como los aminoácidos, para suplir las necesidades celulares por la inanición inducida por la deficiencia lisosomal. En los modelos MPS, se activó el metabolismo y la biosíntesis, no hubo diferencia de si el metabolismo catabólico o anabólico, las reacciones se emplearon por los diferentes metabolitos disponibles en citosol, siendo el compartimento de mayor cantidad reacciones (Anexo 4). Por otro lado, el aumento de la síntesis de lípidos fue consecuente con la ruta de pentosas fosfato, esta última ruta sintetizaba NADPH a partir de la xilulosa reductasa y fosfogluconato reductasa. Estas enzimas permitieron entonces la síntesis de moléculas como acetoacetilo, oxodecanoilo, oxooctanoilo, oxotetradecanoilo, entre otras más. Estas estructuras fueron empleadas posteriormente empleadas en -oxidación. Los modelos MPS pasaron por un ciclo de síntesis y degradación por la activación de rutas metabólicas. Estudios han demostrado que en EDL y MPS el aumento del consumo de energía es mayor que en individuos sanos además que el tejido adiposo marrón y blanco se ve disminuido172,173. Aunque no se observaron para todas las MPS la activación de los mismos procesos, en promedio las restricciones aplicadas eran adecuadas para la simulación de los procesos metabólicos en MPS. Sin embargo, se requieren de restricciones adicionales que permitan simular características propias de cada MPS. Tabla 8. T end en cia d e las r eaccion es en lo s dif er entes g rupos m etabó licos para lo s m odelos MPS comp ar ado s contra lo s obt enido s en r econ2. Las barras en c ol umnas c orres ponden a l a c ompar ación entre los val ores tomando como r ango el may or y el menor val or.

7.9 REACCIONES ENCENDIDAS Y APAGADAS. A partir de las reacciones que variaron en los modelos MPS con respecto al modelo depurado de recon 2, se indagó las reacciones que se activaron o inactivaron en el cumplimiento de la función objetivo tras el silenciamiento de las respectivas reacciones de degradación de GAG. En general 608 ± 243 reacciones activaron (Figura 12, barras amarillas) y 136 ± 32 reacciones se inactivaron (Figura 12, barras 65

verdes) en los modelos MPS. En el Anexo 5 se presenta en forma detallada el comportamiento de las diferentes rutas metabólicas que presentaron estas reacciones que se encendieron o se apagaron. Igualmente se indagó cuales habían sido los metabolismos alterados en estas reacciones, donde se encontró que en su mayoría se activaron reacciones que en recon 2 no habían sido empleadas, estas fueron: transporte de metabolitos, metabolismo de lípidos, carbohidratos, aminoácidos y glicanos También es de resaltar que de las 10 reacciones de fosforilación oxidativa se aumentaron dos que correspondían a NADH deshidrogenasa y el complejo citocromo c oxidasa, ambos relacionados con el aumento de especies reactivas de oxígeno 174. A pesar que en recon 2 no se empleó toda la cadena respiratoria, posiblemente porque algunos metabolitos que entran a la mitocondria son sustratos (por ejemplo adenosin difosfato o adp) a los diferentes complejos de la cadena respiratoria, por lo que se saltan pasos. Pero en los modelos MPS a pesar que también cumplen con la misma función objetivo se emplearon otras reacciones que aportaron ubiquinol que se empleó tanto en la reacción mediada por la enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa para obtener ubiquinona, el cual se emplearía por la NADH deshidrogenasa; mientras que el aumento en consumo de oxigeno desplazo la reacción de la citocromo c oxidasa hacia la derecha, que dentro del modelo uno de sus productos son los iones superóxido. A pesar que se conocen otros eventos que ocasionan el estrés oxidativo en MPS, como permeabilización de membrana lisosomal 156, deficiente fusión lisosoma-autofagosoma 117, liberación de calcio citoplasmático156, o citoquinas proinflamatorias 118, los modelos MPS aquí estudiados presentan un evento metabólico que contribuye al estrés oxidativo que es ocasionado por la activación metabólica debido a la deficiencia en una de las rutas de degradación lisosomal y a la carga energética por la síntesis de ATP. Para el análisis de las rutas alteradas de la Tabla 9, y teniendo en cuenta que recon 2 es una red tri-partita que relaciona genes-enzimas-metabolitos, se extrajeron los genes asociados a las reacciones que se apagaron y las que se encendieron en común para los modelos MPS. Empleando las herramientas bioinformáticas de la base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado (DAVID v6.7) se realizó una clasificación funcional empleando los genes que se encuentran asociados a cada reacción dentro de los modelos MPS (Anexo 6).

66

67

MPSVII MPSVI MPSIVB MPSIVA MPSIIID MPSIIIA-C MPSI-II No. Rxn Disminuyo Aumento Disminuyo Aumento Disminuyo Aumento Disminuyo Aumento Disminuyo Aumento Disminuyo Aumento Disminuyo Aumento * Path 91 88 189 120 234 129 231 124 115 90 201 126 170 124 1916 Metabolismo de lípidos 85 87 49 7 75 93 400 Metab glicanos 1 8 1 8 3 8 7 8 1 8 9 8 2 8 65 Metab grupo sanguíneo 43 33 90 49 80 50 75 46 42 37 82 48 71 44 524 Metab aminoácidos 32 30 37 36 39 37 56 41 31 36 37 30 37 33 Metab cofactores y vitaminas 314 4 6 4 8 5 9 9 8 5 5 3 8 3 8 51 Metab otros aminoácidos 34 34 74 43 73 41 73 39 45 32 79 38 58 51 349 Otros 33 38 77 41 95 37 82 47 39 39 93 38 82 44 370 Metab carbohidratos 88 82 149 140 138 132 150 138 86 89 150 135 143 140 741 Intercambio 234 251 595 332 621 319 620 313 259 257 625 328 607 306 2333 Transporte de metabolitos 62 54 103 60 96 60 87 66 51 52 97 61 106 63 325 Metab nucelótidos 4 4 3 4 3 5 1 1 3 3 3 4 3 10 Fosforilación oxidativa

Las barras en columnas corresponden a la comparación entre los valores tomando como rango el mayor y el menor valor.

Tabla 8. Tendencia de las reacciones en los diferentes grupos metabólicos para los modelos MPS comparados contra los obtenidos en recon2.

1000 900

Número de reacciones

800

155

161

161

770

762

773

140

153

700 600 500 400 709 300

737

93

89

259

250

200 100 0 MPSI - II

MPSIII A - C

MPSIIID

MPSIVA

MPSIVB

MPSVI

MPSVII

Figura 12. Numero de reacciones que se silenciaron y se activaron en los modelos de MPS comparando los flujos contra los obtenidos en recon 2. Las barras verdes corresponden a las reacciones que se activaron. Las barras naranjas corresponden a las reacciones que se silenciaron.

Se obtuvieron diferentes grupos de relaciones funcionales, por lo que para el análisis se consideraron los primeros 20 grupos (con valores mayores a 1,5) realizados por DAVID, los cuales principalmente se encontraban asociados con procesos y componentes estructurales asociados a mitocondria. Para los genes que se activaron se encontró actividad sobre la cadena respiratoria, transporte de electrones, metabolismo de ácidos grasos, biosíntesis de cofactores, biosíntesis de lípidos de membrana, procesos de glicosilación, biosíntesis de nucleótidos (Figura 13). Con respecto a los genes de reacciones silenciadas se observó que estos se encuentran asociados con el metabolismo de fármacos y xenobióticos por citocromos, β-oxidación, degradación de aminoácidos (lisina, arginina, prolina, fenilalanina y tirosina), transporte de aminoácidos, elongación de ácidos grasos (Figura 13). De esta manera se confirmó una vez más que estos procesos metabólicos se encontraban alterados y que se presentaron en conjunto para los modelos de MPS. La alteración metabólica estaba favoreciendo diferentes procesos relacionados a mitocondria, es decir, existía una mitocondria activada en comparación con recon 2. 68

No. Rxn Ruta metabólica * Ruta Metabolismo aminoácidos 524 Metab carbohidratos 370 Fosforilación oxidativa 10 Intercambio 741 Metab glicanos 400 Metab lipidos 1916 Metab cofactores y vitaminas 314 Metab otros aminoácidos 51 Metab nucleotidos 325 Metabolitos de transporte 2333 Otros 349 OFF

69 10 6 1 12 42 11

47

4 7

ON

MPSI-II

40 54 2 49 93 101 25 1 45 269 28

OFF

13 5 1 12 55 8

47

7 7

ON 47 58 2 62 75 132 24 1 40 284 43

MPSIIIA-C OFF

5 32 6

8 7

21

8 6

ON

MPSIIID

20 7 45 20 3 19 85 18

19 23

OFF

15 9 1 15 50 8

46

6 11

ON

MPSIVA

42 52 2 60 49 144 41 6 28 291 40

OFF

16 10 1 12 57 5

43

8 9

ON

MPSIVB

45 56 2 56 86 148 22 2 36 276 41

OFF

10 10 1 8 50 10

47

9 8

ON

MPSVI

55 45 3 54 85 116 24 3 37 279 36

OFF

7 32 5

7 7

19

8 4

ON

MPSVII

55 15 3 23 72 12

25

25 20

Tabla 9. Reacciones que se silenciaron o activaron en los modelos MPS.

Las barras en columnas corresponden a la comparación entre los valores tomando como rango el mayor y el menor valor.

Esta activación se ha observado en MPS VI donde la alteración de otros procesos secundarios como la acumulación de proteínas marcadas con ubiquitina, inflamación, deterioro de la autofagia están asociados con la disminución del potencial de membrana de la mitocondria, la fragmentación de esta, el gasto energético y la producción de radicales libres117. Para probar la relación de estos genes con la hipótesis de las alteraciones en mitocondria, se estudiaron los genes que estaban en el grupo relacionados con la mitocondria. 12,72 12,76 13,47 13,81 14,14 14,39

Transporte iónico Metabolismo de purinas Glicoproteínas y proteínas transmembranales Unión a aminoácidos Biosíntesis de ácidos grasos Componentes del peroxisoma Componentes aparato de golgi Glicolisis/gluconeogénesis Biosíntesis de N-glicanos Membrana retico endoplasmático Señalización de Fosfatidil inositol Biosíntesis de GPI Transporte aa neutros Microsomas - fracción vesicular Biosíntesis de ácidos orgánicos Catabolismo y modificación de lípidos Biosíntesis y metabolismo de cofactores Transito de péptidos - lumen mitocondrial Metabolismo de ácidos grasos Mitocondria - OxFos

17,16 19,58 20,57 21,76 22,1 23,18 23,36 24,07 25,31 26,34 27,27 28,67 30,1 36,21 10

15

20

25

30

35

40

Valor de enriquecimiento

Figura 13. Análisis de enriquecimiento génico para los genes que se encendieron en los diferentes modelos de MPS. El valor de enriquecimiento significa el valor de importancia que tiene este grupo de acuerdo a diferentes características como ruta metabólica, términos ontológicos o funcionalidad.

Los genes que se encontraron alterados y que se obtuvieron a partir de las reacciones que se apagaron o encendieron en los modelos MPS, se relacionaron con diferentes acontecimientos celulares después de la acumulación de los GAG en el lisosoma. En un estudio realizado por Jegga et al 2011, se empleó una metodología por biología de sistemas para la integración de los genes y factores de transcripción asociados en las rutas lisosomales y de autofagia. Ellos identificaron 70

que para autofagia las rutas de señalización de mTOR y de insulina regulan altamente la autofagia. Mientras que la regulación de genes lisosomales están regulados por las rutas de GAG y glicosfingolípidos, es decir, la biogénesis y funcionamiento lisosomal se encontraba altamente regulado por estas macromoléculas. Los genes aquí encontrados correspondían a enzimas lisosomales de degradación de GAG, de tal manera que en los modelos MPS se había encendido las reacciones de degradación simulando exactamente la activación lisosomal. 3,69 3,7 3,87 4,03 4,8 4,83 5,13 5,18 5,98 6,07 6,12 6,29 7,31 7,72 7,86 8,15

Actividad simporte Elongación de ácidos grasos en mitocondria Transporte de nucleósidos Unión a flavo proteínas Actividad esteroide deshidrogenasa Unión a nucleótidos Metabolismo de fármacos Metabolismo de cofactores Unión a magnesio Transporte aa catatónicos Proteína de desacoplamiento tejido adiposo pardo Glucosa/ribitol deshidrogenasa Transporte de aminoácidos neutro Metabolismo de piruvato Glicolisis/gluconeogenesis Metabolismo de propanoato, valina, isoleucina, leucina,… Componentes peroxisoma Componentes membrana mitocondrial Catabolismo de ácidos grasos y lípidos Metabolismo de xenobióticos por CYP450

0

10,59 12,21 14,47 2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Valor de enriquecimiento

Figura 14. Análisis de enriquecimiento génico para los genes que se apagaron en los diferentes modelos de MPS. Otro grupo de genes encendidos estaban relacionados con mitocondria y fosforilación oxidativa, algunos de estos se relacionaban con procesos patológicos de muerte celular presentes en otras enfermedades como Parkinson, Huntington y Alzheimer, exactamente en rutas de señalización como fosfolipasa C (PLC) que está relacionada con la liberación de calcio del retículo endoplasmático 175, en este mismo proceso por la alteración de calcio se observó que también la elevación de la óxido nítrico sintasa 1 se encontraba activada que en exceso de óxido nítrico se pueden formar especies reactivas derivadas de este como el peroxinitrito que como 71

los otros radicales libres pueden causar daño celular causado por estrés nitrosativo, en MPS se ha evidenciado la alteración de calcio y la alteración de la membrana plasmática, así como procesos inflamatorios124, sin embargo la medición de estrés nitrosativo no se ha asociado, siendo este un factor importante asociado con enfermedades como hipertensión, artritis colitis, y diversas complicaciones cardiacas y renales 176; otro proceso alterado es la disfunción mitocondrial que involucra la enzima Abeta vinculante de la alcohol deshidrogenasa (ABAD) que está relacionada con toxicidad neuronal por inducción de radicales libres que facilitan la apoptosis 177. A pesar que algunos autores han observado la relación entre las enfermedades neurodegenerativas con las EDL porque en ambas el lisosoma se ve afectado, no se ha realizado una relación exhaustiva178, por ejemplo, ABAD no se ha estudiado en MPS. Este tipo de análisis permite extender los usos de las redes metabólicas ya que facilitan la identificación de rutas de señalización alteradas. Además, es importante la identificación de estas similitudes con otras enfermedades como son las neurodegenerativas ya que se comparten bastantes procesos alterados como la autofagia o la acumulación de proteínas, de esta manera se pueden correlacionar diferentes sucesos que aún no se conocen entre estas patologías179. Por lo que otras rutas alteradas que serían de interés estudiar serian señalización por p53, proteasoma y adhesión celular, ya que estas rutas se encontraron alteradas. Los genes que se apagaron correspondieron a metabolismo de xenobióticos (Figura 14), en la actualidad no se dispone de estudios de farmacocinética o farmacodinamia que relacionen el metabolismo alterado de la depuración de fármacos, sin embargo algunos reportes de efectos adversos con medicamentos se han evidenciado en estos pacientes180, estos resultados requerirían nuevas restricciones que simularan los efectos metabólicos de algún fármaco en específico para estudiar los posibles efectos tóxicos146. 7.10 DIFERENCIACIÓN ENTRE MODELOS MPS. Los flujos obtenidos entre los diferentes modelos de MPS fueron comparados entre sí con el objetivo de identificar reacciones características de cada MPS. Para realizar esta comparación, se consideró como flujo diferente cualquier valor inferior o superior al 95 o 105%, respectivamente, del flujo observado en el modelo de referencia. Por ejemplo, si en un MPS I una reacción determinada tenía un valor de flujo de 100 mmol/gdw/h, un valor de 90 0 110 mmol/gdw/h en otro de los modelos de MPS sería considerado como elevado o disminuido, respectivamente. La selección de este rango se estableció teniendo en cuenta que hay cambios de los flujos entre los modelos bastante pequeños luego cualquier comparación podría llevar a falsos positivos. 72

Según lo anterior, se compararon los modelos MPS entre ellos para diferenciar los cambios únicos de cada enfermedad. En el Anexo 7 se presenta la totalidad de los cambios observados entre los diferentes modelos. En la Tabla 10 se presentan los cambios por grupos metabólicos. Los resultados mostraron una vez más alteraciones en los flujos de reacciones involucradas en el metabolismo de aminoácidos, lípidos y carbohidratos y transporte de metabolitos. Sin embargo, los flujos de ciertas reacciones dentro de cada modelo son diferentes para cada una de las MPS. Estas reacciones siguen características de alteración en todas las MPS, tanto para flujos elevados como para aquellos que presentan disminución (Tabla 10 a y b).Por ejemplo, para las reacciones que presentaron aumento en sus valores de flujo (Anexo 7) se observa que para las MPS III A-C se presentó un mayor número de reacciones en la degradación de QS, mientras que en MPS I y II se presentó un mayor número de reacciones en la síntesis de QS. Por su parte, en la MPS IVA se presentó un aumento en la síntesis de ubiquinona y en la MPS VII se observó alteración en toda la ruta de degradación del HS. Es importante destacar que para la MPS VII no se observaron aumentos de los flujos frente a las demás MPS. Con respecto a las reacciones que se disminuyeron (Anexo 8), no se encontró diferencia entre los diferentes modelos de MPS, pero se observaron algunas características en MPS IIID que presentaba 30 reacciones en el metabolismo de lípidos menores en comparación que todas las demás MPS, así como también en el metabolismo de nucleótidos. Otras rutas alteradas en las demás MPS estaban relacionadas con transporte de metabolitos entre organelos (mitocondria, extracelular, lisosoma, peroxisoma) y reacciones de intercambio o demanda. 7.11 ANÁLISIS DE VARIABILIDAD DE FLUJOS. La identificación de posibles biomarcadores para las MPS se realizó empleando el análisis de variabilidad de flujos bajo la función objetivo de síntesis de ATP. Como se describió este tipo de análisis permite encontrar los límites de flujo inferior y superior para cada reacción, para que puedan cumplir con la función objetivo. Cuando existe una alteración dentro de la red metabólica, como el silenciamiento de una o más reacciones esto conlleva a la modificación de estos límites de flujo dentro de reacciones alteradas directamente. Los flujos se presentan en el Anexo 2. A partir del análisis de variabilidad de flujos se obtuvieron los valores de consumo y/o producción para cada reacción en cada uno de los modelos. En general se encontraron 4 biomarcadores para MPS IVA, 111 para MPS IVB, 15 para MPS VI 73

y 130 para MPS VII (Anexo 9). Que correspondían a diferentes sucesos descritos en la Figura 8 (ver sección de métodos), estos se presentan en la Tabla 11. Tabla 10. Comparación metabólica entre los modelos de MPS. En las tablas se presenta la cantidad de reacciones que presentaron un flujo único respecto a las otras MPS, es decir, alguna reacción de uno de los modelos MPS con flujo mayor (a) o menor (b) respecto al flujo de reacción en los demás modelos MPS. (a) MPSI-II MPSIIIA-C MPSIIID MPSIVA MPSIVB MPSVI MPSVII Metabolismo de aminoácidos 31 32 20 16 17 25 2 Metab grupo sanguineo 8 4 Metab carbohidratos 25 26 12 18 19 11 2 Fosforilación oxidativa 1 1 1 1 Intercambio 41 26 26 27 21 18 2 Metab glicanos 79 61 7 10 3 68 Metab lipidos 86 82 41 87 96 44 1 Metab cofactores y vitaminas 12 9 11 22 6 2 Metab otros aminoácidos 4 2 2 Metab nucleotidos 27 16 9 10 13 13 Otros 22 22 20 12 17 10 Transporte de mtabolitos 145 106 70 100 82 76 1 (b) MPSI-II MPSIIIA-C MPSIIID MPSIVA MPSIVB MPSVI MPSVII Metabolismo de aminoácidos 3 7 2 5 3 3 Metab grupo sanguineo 1 Metab carbohidratos 5 1 3 2 2 4 Fosforilación oxidativa 1 Intercambio 15 10 17 17 15 21 14 Metab glicanos 2 Metab lipidos 4 1 30 10 9 5 5 Metab cofactores y vitaminas 2 4 2 2 1 2 Metab otros aminoácidos 2 Metab nucleotidos 2 13 8 11 3 6 Otros 5 1 4 1 1 5 Transporte de mtabolitos 15 14 35 21 38 40 34

Tabla 11. Tipos de rangos obtenidos para los diferentes modelos MPS. Los biomarcadores de alta confidencia corresponden a los rangos tipo 3 y 6. Los intermedios corresponden al tipo 2 y 4. Los demás son de baja confidencia.

RANGOS MAX MIN TIPO DE RANGO AUMENTO 1 AUMENTO 2 AUMENTO AUMENTO 3 DISMINUYO 4 DISMINUYO 5 DISMINUYO DISMINUYO 6 DISMINUYO AUMENTO 7 74

Las reacciones que se presentan como biomarcadores de alta confidencia corresponden a las rutas de esfingolípidos, esteroides y degradación de GAG, que corresponden a rutas altamente alteradas en MPS, donde se ha observado precisamente cambios importantes en las MPS que tienen asociado heparan sulfato como GAG acumulado5 (Figura 15). Transporte, lisosoma Transporte, aparato de golgi Transporte, extracelular Transporte, reticulo endoplasmico Metabolismo de esteroides Metabolismo de sucrosa y almidón Metabolismo esfingolipidos

MPS_VII

Ruta pentosa fosfato

MPS_VI

Degradación de QS Metabolismo de Inositol

MPS_IVA

Degradacion de grupo heme

MPS_IVB

Metabolismo de galactosa Rxn de intercambio Degradación de CS Metab aminoazucares 0

5

10

15

20

25

30

35

Número de reacciones como biomarcador

Figura 15. Número de reacciones que se identificaron como biomarcadores por ruta metabólica para los modelos MPS tipo IVA, IVB, VI y VII. Rxn: reacción. QS: queratan sulfato. CS: condroitin sulfato. De los modelos de MPS IVB y VII se identificaron biomarcadores de alta confidencia, mientras que los MPS de tipo IVA y VI presentaron de baja confidencia (Tabla 12). Moléculas como aminoácidos o aminoazúcares se encontraron como posibles biomarcadores de MPS VII, a pesar que no existe evidencia de las concentraciones de estos con las MPS, podrían considerarse como aminoácidos consecuencia de la degradación de proteínas debido a la búsqueda de otras fuentes energéticas40,169. Tabla 12. Biomarcadores de alta y baja confidencia predichos por FVA. En la parte superior se encuentran los biomarcadores de alta confidencia, en la parte inferior los de baja confidencia. A: aumento, D: disminuyo, QS: queratan sulfato, UDP: uridildifosfato, AcGal: acetilgalactosamina.

75

Ruta metabólica Intercambio/demanda Degradación de QS Metabolismo de esfingolípidos Transporte aparato de Golgi

Transporte lisosomal

Ruta metabólica Metabolismo de GAG

Nombre de reacción MPSIVB Intercambio de xilosa Intercambio de iduronato Intercambio de globósido A Sialidasa, Lisosoma β-1,3-glactosiltransferasa III A Lactosilceramida 4-α -galactosiltransferasa

A

β-N-acetilgalactosaminidasa Transporte de ceramida Transporte intracelular N-acetil-galactosamina Transporte de glutamate, lisosoma Transporte de glicina (simporte), lisosoma Transporte de iduronato al lisosoma Transporte de alanina (simporte), lisosoma Transporte de prolina (simporte), lisosoma Transporte de N-acetilneuraminato al lisosoma Transporte de histidina por peptidos trasnp. hPT3 o hPT4 Transporte de UDP Trasnporte de UDP-AcGal

A A D

Nombre de reacción MPSIVA D β-N-acetilhexosaminidasa, lisosoma β-glucuronidasa, lisosoma

MPSVII D A A

A A D A A D A A D MPSIVB MPSVI MPSVII A D A D D

La observación detallada de estos biomarcadores (enzimas y metabolitos) permitió determinar que la ruta principal que se alteró en estas cuatro MPS fue el metabolismo de esfingolípidos, los metabolitos principalmente fueron ceramida y un derivado de este, globósido. Dos enzimas relacionadas a la obtención de este ultimó fueron lactosilceramida 4-α-galactosiltransferasa y la β-N-acetilgalactosaminidasa. Otra enzima fue la β-1,3-galactosiltransferasa, la cual transfiere galactosa a residuos terminados en β-N-acetilglucosamina, está involucrado con la biosíntesis de motivos de carbohidratos de glicolípidos y glicoproteínas181. Varios reportes de la acumulación secundaria de lípidos en MPS se han estudiado, en específico se han reportado glicolípidos (GM3 y GM2), colesterol, fosfolípidos y esfingolípidos182, estos tienen diferentes mecanismos propuestos y desconocidos del porque la acumulación, algunos son la inactivación de otras enzimas lisosomales por los GAG acumulados25, así como también la acumulación de colesterol en la membrana del lisosoma lo cual imposibilita la fusión vesicular6. Similitudes en las alteraciones del metabolismo de esfingolípidos en enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, en la cual estas favorecen las alteraciones neuropatológicas de esta enfermedad. Diferentes asociaciones se han realizado entre la acumulación de proteínas β-amiloide con las ceramidas. Luego así como en Alzheimer se podría emplear este biomarcador en diagnóstico de deterioro cognitivo, en MPS podría usarse como biomarcador en la progresión de la 76

enfermedad en los estadios pre-sintomáticos del deterioro cognitivo. En la gangliósidosis donde se encuentra alterada la -galactosidasa, se acumulan diferentes esfingolípidos, luego en MPS IVB que también implica esta enzima estos biomarcadores podrían ser de uso en la enfermedad, a pesar que en este tipo de MPS han sido pocos los casos en que se presenta el retardo o deterioro mental183, es posible que se pueda estudiar estos biomarcadores en otras MPS ya que en conjunto los modelos MPS siguieron un patrón en el comportamiento metabólico. En asociación con los resultados obtenidos en la identificación de reacciones que se encendieron y apagaron, otro gen que se encendió estaba asociado con lipoproteína lipasa que hidroliza triglicéridos de los quilomicrones y las lipoproteínas de baja densidad (VLDL), además que participa en la unión de varias estructuras como GAG en las partículas de lipoproteínas184, por lo que recientemente se ha asociado esta lipasa con la unión de la proteína -amiloide que es internalizada y degradada vía lisosoma, también se ha observado que esta unión es mediada por los GAG, luego si en MPS se encuentra alterada el lisosoma es posible que la acumulación de la proteína -amiloide también se encuentre elevada185. LPL está distribuido en corazón, musculo esquelético tejido adiposo marrón y blanco, así como en cerebro, y a pesar que no se conoce que función cumple allí se ha relacionado con la acumulación de ovillos neurofibrilares y placas seniles. Luego la alteración de esta enzima en cerebro podría alterar la regulación del balance energético, en estudios en ratones se ha observado que existe una disminución en los niveles de ácidos grasos esenciales186. Luego es posible que en MPS se encuentre alterada esta enzima acumulada en placas seniles conllevando a la alteración metabólica de ácidos grasos que se han observado reducidos en algunos animales con MPS I169. La activación metabólica posiblemente favorece la activación de otras rutas, entre las que esta estrés oxidativo, y alteraciones en metabolismo de esfingolípidos en los cuales se alteró ceramidas que se encuentra relacionado con las reacciones que se activaron y que están involucradas en muerte celular con otras patologías como enfermedades neurodegenerativas, esto lleva a pensar qué podría existir una relación más profunda entre el daño neuronal que ocurre en MPS y Alzheimer, esto por los mecanismos relacionados aquí; también, cabe preguntarse si se podrían emplear biomarcadores de Alzheimer en MPS y viceversa. Adicional, el comportamiento metabólico en los modelos MPS puede ser comparado con futuros aproximaciones experimentales para la validación.

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8 CONCLUSIONES Los modelos de MPS obtenidos por silenciamiento selectivo de las enzimas de degradación de GAG y debido al cumplimiento de la función objetivo (síntesis de ATP) cuando son optimizados los modelos, generaron importantes cambios metabólicos, algunos evidenciados en MPS, tanto experimental como en clínica. Los cambios metabólicos más sobresalientes fueron la activación de fuentes energéticas alternas como β-oxidación, la síntesis de macromoléculas y la alteración mitocondrial relacionada con especies reactivas de oxígeno. A su vez, la obtención de biomarcadores una vez validado los modelos, logró identificar 14 metabolitos y 4 enzimas las cuales correspondían a metabolismo de esfingolípidos y a transporte de aminoácidos (histidina, glutamato, alanina, prolina) y de aminoazúcares. A pesar que los resultados obtenidos por los modelos deben ser validados experimentalmente, este primer acercamiento hecho para 10 subtipos de mucopolisacaridosis por biología de sistemas permite iniciar un campo de acción para el entendimiento de lo complejo que son estas enfermedades, sin embargo esta primera aproximación queda como un nuevo recurso para futuras investigaciones en el área.

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9 PERSPECTIVAS Y APLICACIONES Los resultados aquí obtenidos deben ser validados experimentalmente, luego se propone acercamientos que permitan cuantificar las variaciones de varios metabolitos. El trabajo desarrollado permitió realizar nuevas preguntas de las bases que se deben tener para enfocar futuras aproximaciones computacionales para esta enfermedad, estas son: Acoplamiento del modelo con nuevos organelos, por ejemplo autofagosoma, lo cual permitirá entender otros procesos que ocurren allí. Relleno de huecos metabólicos presentes en la red, inserción de constantes cinéticas y reguladores booleanos, lo cual permitirá reducir el espacio de optimización para soluciones más certeras. Empalme con datos ‘omicos’ de literatura y experimentales. Esto permitirá hacer más robustez los análisis. Debido a que se puede estudiar diferentes redes (genes, proteínas, metabolitos) en diferentes momentos de la enfermedad. Diferenciación entre los diferentes modelos celulares en los cuales se ha estudiado MPS y que presentan una amplia variedad en resultados, por lo que emplear estos modelos permitirán realizar una aproximación para encontrar diferencias. Por ejemplo, diferenciar metabólicamente los sucesos que pasan en células gliales y neuronales. Análisis diferenciales de flujos de redes para redes metabólicas, y descripción topológica para encontrar nodos importantes alterados en las distintas MPS. Análisis de diferentes sustratos para una aproximación dietaría en pacientes con MPS. Las aplicaciones de este proyecto es útil para la predicción in silico de no solo cambios metabólicos, sino génicos y de regulación génica. Por lo que alimentar más el modelo permitirá realizar aproximaciones más certeras y facilitara la validación in vivo. La detección de estos vacíos en el conocimiento por esta vía es importante para la disminución de recursos como animales de experimentación y materiales de laboratorio. Actualmente se discute de la interacción entre farmacogenética y biología de sistemas como terapia individualizada, por lo que el desarrollo de estos sistemas abre las puertas a nuevos campos de la investigación.

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95

11 ANEXOS Anexo 1. Reacciones específicas para recon 2 que estaban asociadas a las enzimas lisosomales deficientes en MPS.

MPS I Abreviación de la reacción

Nombre de la reacción

'IDOAASE1ly'

'h2o[l] + hs_deg4[l] => hs_deg5[l] + idour[l] '

'IDOAASE2ly' 'IDOAASE3ly'

Formula de la reacción

h2o[l] + hs_deg16[l] => idour[l] + hs_deg17[l] ' α-L-iduronidasa

'IDOAASE4ly'

h2o[l] + hs_deg22[l] => idour[l] + hs_deg23[l] ' 'h2o[l] + cs_b_deg3[l] => cs_a_deg3[l] + idour[l] '

MPS II Abreviación de la reacción

Nombre de la reacción

'S2TASE1ly' 'S2TASE2ly'

Iduronato-2-sulfatasa

'S2TASE3ly'

Formula de la reacción 'h2o[l] + hs_deg15[l] => h[l] + so4[l] + hs_deg16[l] ' 'h2o[l] + hs_deg21[l] => h[l] + so4[l] + hs_deg22[l] ' 'h2o[l] + cs_b_deg2[l] => h[l] + so4[l] + cs_b_deg3[l] '

MPS IIIA Abreviación de la reacción

Nombre de la reacción

'HS1ly' 'HS2ly' 'HS3ly'

Heparan-N-sulfatasa

'HS4ly'

Formula de la reacción 'h2o[l] + hs_deg1[l] => h[l] + so4[l] + hs_deg2[l] ' 'h2o[l] + hs_deg6[l] => h[l] + so4[l] + hs_deg7[l] ' 'h2o[l] + hs_deg12[l] => h[l] + so4[l] + hs_deg13[l] ' 'h2o[l] + hs_deg18[l] => h[l] + so4[l] + hs_deg19[l] '

MPS IIIB Abreviación de la reacción

Nombre de la reacción

Formula de la reacción

'GLCNACASE1ly'

'h2o[l] + hs_deg3[l] => acgam[l] + hs_deg4[l] '

'GLCNACASE2ly'

'h2o[l] + hs_deg8[l] => acgam[l] + hs_deg9[l] '

'GLCNACASE3ly'

α-N-acetilglucosaminidasa

'GLCNACASE4ly' 'GLCNACASE5ly'

'h2o[l] + hs_deg14[l] => acgam[l] + hs_deg15[l] ' 'h2o[l] + hs_deg20[l] => acgam[l] + hs_deg21[l] ' 'h2o[l] + hs_deg24[l] => acgam[l] + hs_deg25[l] '

MPS IIIC Abreviación de la reacción

Nombre de la reacción

Formula de la reacción

Heparan-glucosaminida N-acetiltransferasa

'accoa[c] + hs_deg2[l] => coa[c] + h[l] + hs_deg3[l] ' 'accoa[c] + hs_deg7[l] => coa[c] + h[l] + hs_deg8[l] ' 'accoa[c] + hs_deg13[l] => coa[c] + h[l] + hs_deg14[l] ' 'accoa[c] + hs_deg19[l] => coa[c] + h[l] + hs_deg20[l] '

'HSAT1ly' 'HSAT2ly' 'HSAT3ly' 'HSAT4ly' MPS IIID Abreviación de la reacción

Nombre de la reacción

96

Formula de la reacción

'S6TASE11ly' 'S6TASE12ly' 'S6TASE13ly' 'S6TASE14ly' 'S6TASE15ly' 'S6TASE16ly' 'S6TASE17ly' 'S6TASE18ly' 'S6TASE19ly'

N-acetylglucosamina-6-sulfatasa

'S6TASE1ly' 'S6TASE20ly'

'h2o[l] + ksi_deg6[l] h[l] + so4[l] + ksi_deg7[l] ' 'h2o[l] + ksi_deg9[l] h[l] + so4[l] + ksi_deg10[l] ' 'h2o[l] + ksi_deg12[l] h[l] + so4[l] + ksi_deg13[l] ' 'h2o[l] + ksi_deg15[l] h[l] + so4[l] + ksi_deg16[l] ' 'h2o[l] + ksi_deg18[l] h[l] + so4[l] + ksi_deg19[l] ' 'h2o[l] + ksi_deg21[l] h[l] + so4[l] + ksi_deg22[l] ' 'h2o[l] + ksi_deg24[l] h[l] + so4[l] + ksi_deg25[l] ' 'h2o[l] + ksi_deg27[l] h[l] + so4[l] + ksi_deg28[l] ' 'h2o[l] + ksi_deg30[l] h[l] + so4[l] + ksi_deg31[l] ' 'h2o[l] + hs[l] h[l] + so4[l] + hs_deg1[l] ' 'h2o[l] + ksi_deg33[l] h[l] + so4[l] + ksi_deg34[l] ' 'h2o[l] + ksi_deg36[l] h[l] + so4[l] + ksi_deg37[l] ' 'h2o[l] + ksii_core2_deg3[l] h[l] + so4[l] + ksii_core2_deg4[l] ' 'h2o[l] + ksii_core2_deg6[l] h[l] + so4[l] + ksii_core2_deg7[l] ' 'h2o[l] + ksii_core4_deg3[l] h[l] + so4[l] + ksii_core4_deg4[l] ' 'h2o[l] + hs_deg5[l] h[l] + so4[l] + hs_deg6[l] ' 'h2o[l] + hs_deg11[l] h[l] + so4[l] + hs_deg12[l] '

'S6TASE21ly' 'S6TASE23ly' 'S6TASE24ly' 'S6TASE26ly' 'S6TASE2ly' 'S6TASE3ly' MPS IVA Abreviación de la reacción

Nombre de la reacción

'S6TASE10ly' 'S6TASE22ly' 'S6TASE25ly' 'S6TASE4ly' 'S6TASE5ly'

Galactosa-6-sulfato sulfatasa

'S6TASE6ly' 'S6TASE7ly' 'S6TASE8ly' 'S6TASE9ly'

Formula de la reacción 'h2o[l] + ksi_deg4[l] h[l] + so4[l] + ksi_deg5[l] ' 'h2o[l] + ksii_core2_deg1[l] h[l] + so4[l] + ksii_core2_deg2[l] ' 'h2o[l] + ksii_core4_deg1[l] h[l] + so4[l] + ksii_core4_deg2[l] ' 'h2o[l] + cs_c[l] h[l] + so4[l] + cs_c_deg1[l] ' 'h2o[l] + cs_c_deg3[l] h[l] + so4[l] + cs_c_deg4[l] ' 'h2o[l] + cs_d[l] h[l] + so4[l] + cs_d_deg1[l] ' 'h2o[l] + cs_d_deg4[l] h[l] + so4[l] + cs_d_deg5[l] ' 'h2o[l] + cs_e_deg1[l] h[l] + so4[l] + cs_e_deg2[l] ' 'h2o[l] + cs_e_deg5[l] h[l] + so4[l] + cs_e_deg6[l] '

MPS IVB Abreviación de la reacción

Nombre de la reacción

Formula de la reacción

'GALASE11ly'

'h2o[l] + ksi_deg29[l] => gal[l] + ksi_deg30[l] '

'GALASE12ly'

'h2o[l] + ksi_deg32[l] => gal[l] + ksi_deg33[l] '

'GALASE13ly'

'h2o[l] + ksi_deg35[l] => gal[l] + ksi_deg36[l] '

'GALASE14ly'

'h2o[l] + ksi_deg38[l] => gal[l] + ksi_deg39[l] '

'GALASE15ly'

β-galactosidasa

'GALASE16ly'

'h2o[l] + ksi_deg40[l] => gal[l] + ksi_deg41[l] ' '2 h2o[l] + ksii_core2_deg2[l] => 2 gal[l] + ksii_core2_deg3[l] ' 'h2o[l] + ksii_core2_deg5[l] => gal[l] + ksii_core2_deg6[l] ' 'h2o[l] + ksii_core2_deg8[l] => gal[l] + ksii_core2_deg9[l] '

'GALASE17ly' 'GALASE18ly'

97

'GALASE19ly'

'h2o[l] + f1a[l] => gal[l] + core6[l] '

'GALASE1ly'

'GALASE3ly'

'2 h2o[l] + l2n2m2mn[l] => n2m2mn[l] + 2 gal[l] ' '2 h2o[l] + ksii_core4_deg2[l] => 2 gal[l] + ksii_core4_deg3[l] ' '2 h2o[l] + ksi_deg5[l] => 2 gal[l] + ksi_deg6[l] '

'GALASE4ly'

'h2o[l] + ksi_deg8[l] => gal[l] + ksi_deg9[l] '

'GALASE5ly'

'h2o[l] + ksi_deg11[l] => gal[l] + ksi_deg12[l] '

'GALASE6ly'

'h2o[l] + ksi_deg14[l] => gal[l] + ksi_deg15[l] '

'GALASE7ly'

'h2o[l] + ksi_deg17[l] => gal[l] + ksi_deg18[l] '

'GALASE8ly'

'h2o[l] + ksi_deg20[l] => gal[l] + ksi_deg21[l] '

'GALASE9ly'

'h2o[l] + ksi_deg23[l] => gal[l] + ksi_deg24[l] '

'GALASE20ly'

MPS VI Abreviación de la reacción

Nombre de la reacción

'S4TASE1ly' 'S4TASE2ly' 'S4TASE3ly'

N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa

'S4TASE4ly' 'S4TASE5ly'

Formula de la reacción 'h2o[l] + cs_a[l] h[l] + so4[l] + cs_a_deg1[l] ' 'h2o[l] + cs_a_deg3[l] h[l] + so4[l] + cs_a_deg4[l] ' 'h2o[l] + cs_b[l] h[l] + so4[l] + cs_b_deg1[l] ' 'h2o[l] + cs_e[l] h[l] + so4[l] + cs_e_deg1[l] ' 'h2o[l] + cs_e_deg4[l] h[l] + so4[l] + cs_e_deg5[l] '

MPS VII Abreviación de la reacción

Nombre de la reacción

'GLCAASE4ly'

Formula de la reacción

'GLCAASE1ly'

'h2o[l] + cs_a_deg2[l] => glcur[l] + cs_a_deg3[l] ' 'h2o[l] + cs_c_deg2[l] => glcur[l] + cs_c_deg3[l] ' 'h2o[l] + cs_d_deg3[l] => glcur[l] + cs_d_deg4[l] ' 'h2o[l] + cs_e_deg3[l] => glcur[l] + cs_e_deg4[l] ' 'h2o[l] + hs_deg9[l] => glcur[l] + hs_deg10[l] '

'GLCAASE8ly'

'h2o[l] + ha[l] => glcur[l] + ha_deg1[l] '

'GLCAASE9ly'

'2 h2o[l] + ha_pre1[l] => acgam[l] + glcur[l] '

'GLCAASE5ly' 'GLCAASE6ly' 'GLCAASE7ly'

β-glucuronidasa

Anexo 2. Valores de flujos (FBA Y FVA) de cada modelo MPS y recon 2. Resultados de optimización de cada modelo MPS y recon 2 cumpliendo la función objetivo de síntesis de ATP. En el siguiente link e encuentra compartido: https://www.dropbox.com/s/oqw1za5vhsptder/ANEXO%202.xlsx?dl=0

Anexo 3. Categorización de rutas metabólicas detalladas en recon 2 en base a la clasificación realizada en la base de datos KEGG pathway (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html). METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS Glicolisis/gluconeogénesis

98

Ciclo del ácido cítrico Ruta de las pentosas fosfato Metabolismo de fructosa y manosa Metabolismo de galactosa Metabolismo de sacarosa y almidon Metabolismo de aminoazúcares Metabolismo de piruvato Metabolismo de carboxilato y dicarboxilato Metabolismo de propanoato Metabolismo de butanoato Metabolismo de nucleósidos Metabolismo de ácidos dibásicos C5 Metabolismo de inositol fosfato METABOLISMO ENERGETICO Fosforilación oxidativa METABOLISMO DE LIPIDOS Oxidación de ácidos grasos Síntesis de ácidos grasos Metabolismo de esteroides Síntesis de ácidos biliares Metabolismo de glicerofosfolípidos Metabolismo de glicoesfingolípidos Metabolismo de lipoato Metabolismo de linoleato Síntesis de triacilglicerol Metabolismo de esfingolípidos Metabolismo de ácido araquidónico Metabolismo de ecosanoides Síntesis y metabolismo de andrógenos y estrógenos Metabolismo de colesterol Síntesis de colesterol y escualeno Metabolismo de fosfatidilinositol fosfato METABOLISMO DE NUCLEOTIDOS Síntesis de pirimidinas Catabolismo de pirimidinas Síntesis de purinas Catabolismo de purinas Interconversión de nucleótidos Ruta de salvamento de nucleótidos METABOLISMO DE AMINOACIDOS

99

Metabolismo de valina, leucina e isoleucina Ciclo de la urea Metabolismo de triptofano Metabolismo de tirosina Metabolismo de fenilalanina Metabolismo de metionina y cisteína Metabolismo de lisina Metabolismo de glicina, serina, alanina y treonina Metabolismo de glutamato Metabolismo de D-alanina Metabolismo de histidina Metabolismo de cisteína Metabolismo de alanina y aspartato Metabolismo de prolina y arginina METABOLSIMO DE3 OTROS AMINOACIDOS Metabolismo de beta-alanina Metabolismo de glutatión Metabolismo de taurina e hipotaurina Metabolismo de seleno-aminoácidos METABOLISMO Y SINTESIS DE GLICANOS Degradación de N-glicanos Síntesis de N-glicanos Síntesis de O-glicanos Síntesis de queratan sulfato Síntesis de condroitin sulfato Degradación de heparan sulfato Metabolismo de hiualuronato Degradación de queratan sulfato Degradación de condroitin sulfato METABOLISMO DE COFACTORES Y VITAMINAS Metabolismo de vitamina A Metabolismo de vitamina B2 Metabolismo de vitamina B6 Metabolismo de vitamina B12 Metabolismo de vitamina E Síntesis de ubiquinona Metabolismo de tiamina Metabolismo de vitamina C Metabolismo de vitamina D Metabolismo de folato

100

Metabolismo de biotina Catabolismo de acetilcoA Síntesis de acetilcoA Metabolismo de tetrahidrobiopterina TRANSPORTE DE METABOLITOS Trans. Reticulo endoplasmatico Trans. Extracelular Trans. Aparato de Golgi Trans. Lisosomal Trans. Mitocondrial Trans. Nuclear Trans. Peroxisomal INTERCAMBIO Reacción de intercambio/demanda MMETABOLISMO DE GRUPO SANGUINEO Síntesis de grupo sanguíneo Degradación de heme Síntesis de heme OTROS Síntesis de alcaloides Unión a fibra dietaría Degradación de pineno y limoneno Reacciones Misceláneas Metabolismo de NAD Síntesis grupo R Detoxificación de ROS No asignadas

101

Anexo 4. Comportamiento de los flujos de reacción para los diferentes modelos MPS comparados contra los obtenidos en recon 2. MAA: metabolismo de aminoácidos, MGS: metabolismo de grupo sanguíneo, MC: metabolismo de carbohidratos, Ox: fosforilación oxidativa, Ex: reacciones de intercambio y demanda, MBG: metabolismo y biosíntesis de glicanos, ML: metabolismo de lípidos, MCV: metabolismo de cofactores y vitaminas, MOA: metabolismo de otros aminoácidos, MN: metabolismo de nucleótidos, TM: transporte de metabolitos. MPSI-II Ruta metabolica 'Valine, leucine, and isoleucine metabolism' 'Urea cycle' 'Tyrosine metabolism' 'Tryptophan metabolism' 'Phenylalanine metabolism' 'Methionine and cysteine metabolism' 'Lysine metabolism' 'Histidine metabolism' 'Glycine, serine, alanine and threonine metabolism' 'Glutamate metabolism' 'D-alanine metabolism' 'Cysteine Metabolism' 'Arginine and Proline Metabolism' 'Alanine and aspartate metabolism' 'Heme degradation' 'Heme synthesis' 'Blood group synthesis' 'Starch and sucrose metabolism' 'Pyruvate metabolism' 'Propanoate metabolism' 'Pentose phosphate pathway' 'Inositol phosphate metabolism' 'Glyoxylate and dicarboxylate metabolism' 'Glycolysis/gluconeogenesis' 'Galactose metabolism' 'Fructose and mannose metabolism' 'Citric acid cycle' 'C5-branched dibasic acid metabolism' 'Butanoate metabolism' 'Aminosugar metabolism'

Grupo Metab

MAA

MGS

No. Rxn * Ruta 43 69 121 70 12 54 24 16 37 15 3 3 41 16 3 14 48 33 60 13 39 64 14 47 12 24 20 8 3 28

'Oxidative phosphorylation'

Ox

10

'Exchange/demand reaction' 'O-glycan synthesis' 'N-glycan synthesis' 'N-glycan degradation' 'Keratan sulfate synthesis' 'Keratan sulfate degradation' 'Hyaluronan metabolism' 'Heparan sulfate degradation' 'Chondroitin sulfate degradation' 'Triacylglycerol synthesis' 'Steroid metabolism' 'Squalene and cholesterol synthesis' 'Sphingolipid metabolism' 'Phosphatidylinositol phosphate metabolism' 'Glycosphingolipid metabolism' 'Glycerophospholipid metabolism' 'Fatty acid synthesis' 'Fatty acid oxidation' 'Eicosanoid metabolism' 'Cholesterol metabolism' 'Bile acid synthesis' 'Androgen and estrogen synthesis and metabolism' 'Vitamin D metabolism' 'Vitamin C metabolism' 'Vitamin B6 metabolism' 'Vitamin B2 metabolism' 'Vitamin A metabolism' 'Ubiquinone synthesis' 'Thiamine metabolism' 'Tetrahydrobiopterin metabolism' 'Folate metabolism' 'CoA synthesis' 'CoA catabolism' 'Biotin metabolism' 'Taurine and hypotaurine metabolism' 'Glutathione metabolism' 'beta-Alanine metabolism' 'Pyrimidine synthesis' 'Pyrimidine catabolism' 'Purine synthesis' 'Purine catabolism' 'Nucleotide salvage pathway' 'Nucleotide interconversion' 'Unassigned' 'ROS detoxification' 'R group synthesis' 'NAD metabolism' 'Miscellaneous' 'Dietary fiber binding' 'Transport, peroxisomal' 'Transport, nuclear' 'Transport, mitochondrial' 'Transport, lysosomal' 'Transport, golgi apparatus' 'Transport, extracellular' 'Transport, endoplasmic reticular'

Ex

741 15 108 41 66 70 2 35 18 13 77 5 75 63 14 74 126 866 258 62 127 57 29 16 11 7 80 14 6 27 59 22 4 12 8 16 12 19 34 10 77 3 182 158 7 50 23 86 12 105 64 276 67 65 1626 130

MBG

ML

MCV

MOA

MN

Otros

TM

MPSIIIA-C

MPSIIID

MPSIVA

MPSIVB

MPSVI

MPSVII

disminuyo AUMENTO disminuyo AUMENTO disminuyo AUMENTO disminuyo AUMENTO disminuyo AUMENTO disminuyo AUMENTO disminuyo AUMENTO 2 16 4 14 5 5 4 10 5 15 4 15 5 5 5 3 5 5 5 3 5 7 7 9 7 3 5 4 5 9 5 12 2 3 5 6 5 4 5 6 2 4 2 4 4 5 1 1 2 5 3 6 4 11 2 4 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 5 4 2 4 5 7 3 5 12 5 6 4 6 5 4 2 2 3 9 1 1 2 5 3 4 3 5 3 1 3 3 2 3 3 3 2 15 1 10 5 2 12 1 12 2 16 7 3 6 3 6 3 5 3 5 2 8 3 7 2 7 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 2 1 1 10 9 9 12 5 9 10 9 11 9 10 10 9 6 4 1 5 1 3 4 3 1 3 3 3 2 3 2 8

2

8

6 9

6 18 3 14 3 5 14 2 3 4 2

2 9 2 2 1

8

1

2 7 8 17 3 17 8 3 12 2 5 6 1 2 9

4

10 2 6 5 1 1 2

3

4

3

3

3

1

1

5

3

4

3

4

4

140

143

135

150 3 9 14 11 38

89

86

138

150

132

138

140

149 1 38 5 11 6

82

88

2 4

2 2

2 3

3 9

2 1

1 3

9 13 1 13 27 97 8 7 19 1 1 2 1 3 9

8

1 2

7 13 1 8 31 71 10 15 20 1

6 3 1 8 4 48 3 1 11

2 7 1 7 4 48 7 3 7 1

1

1 2 1 9

2

3

9 3 4 5 2 1 2

7 3 5 5 1

38 7 37 11

2 2 1 8 3 1 8 18 54 5 4 18

6 6 6 13 1 10 22 65 10 11 19 1

4 2 1 5

3

1 1 2 5 2 10 3 5

2 2 15 3

4 7 1 7

4 10 1 34 1 56 26 3 11 2 14 2 21 10 69 15 14 437 41

44 37 5 3 6 12 10 37 6 3 221 17

3 9

3

2 2 1 8 3 1 8 18 60 4 4 15

1 3 1 7 2 1 3 5 2 5 3 5

1 16 4

3 5 7 2 31

38 26

52 40 4 13 6 14 2 20 14 75 15 14 448 39

17 6 46 6 4 233 16

1

8

3 5 1 6

5 7 1 4 1 3 8 1 1 3 1

7 9 2 2

9 3 4 5 1 1 1

2

1 7 17 43 4 6

4 2 8

4 21 63 8 3 8

2 2 1 7 4 1 9 17 61 5 3 12

1 2 1 11

1 3 1 12

102

3 5 2 10 3 2

12 4

1 5

2 2

10

5 4 6

13 1 33 30 2 5 1 7

12 4 40 6 1 183 11

11 7 36 5 2 184 14

36 17

3 2

2 5 5 10 2 19 6

8

14 2 4 6 1 1 12

7 2 6 5 2

2 7 2 2 1

1

37 5

5

2

4 6 1 12

3 3 6

8

2 1 4 5 2 10 3 5 4 6 1 11 44 26 4 4 5 19 7 36 5 3 227 16

3 1 2 1 5 6 6 16 1 10 34 115 9 12 16 1 2 3 4 14 13 1 11 6 1 1 8 1 4 3 1 32 1 46 33 4 14 7 13 2 22 16 81 16 13 433 39

2 1 12 17 1 15 10 1 11 3 4 8 2 1 10

8

1

8

1

2 9 2 3 1

10 10 3 16 5 1 11 3 5 5 2 1 5

6 4 1 5 1

1 4 2 5 3

8 2 5 4 1 1

4 1 2 5 1 1 4

7 3 6 4 2 1 1

43 5 39

24 1 3 1 6 4 1 9 17 61 4 5 17 2 1 3 11

1 3 4 2 10 3 6 4 7 1 13 35 28 4 4 5 13 12 43 4 6 220 21

3 8 3 10 13 2 10 30 101 9 17 27 1 1 2 1 5 10

1 3 1 6 3 1 7 18 55 5 2 18

4 1 10 4 1

2 1 4 5 2 5 3 5

4 1 5 9 2 27 53 40 3 17 1 10 2 21 10 81 10 16 452 31

2 2 2 11

4 5 1 8 42 30 2 5 6 14 7 45 7 2 233 24

5 11

1 15 3

2 1 4 8 2

1 2 2 5 9 2 36 51 34 3 14 5 16 2 20 10 78 14 11 427 35

3 3 2 4 10 38 22 4 5 3 13 7 33 4 1 183 10

9

3 7 6 5 3 1 1 3 1 20 1 36 21 1 4 3 5 10 8 34 1 169 12

Anexo 5. Comportamiento de los flujos en los modelos MPS comparados contra recon 2. MAA: metab de aminoácidos, MGS: metab de grupo sanguíneo, MC: metab de carbohidratos, Ox: fosforilación oxidativa, Ex: reacciones de intercambio y demanda, MBG: metab y biosíntesis de glicanos, ML: metab de lípidos, MCV: metabolismo de cofactores y vitaminas, MOA: metab de otros aminoácidos, MN: metab de nucleótidos, TM: transporte de metabolitos. MPSI-II MPSIIIA-C MPSIIID MPSIVA MPSIVB MPSVI MPSVII Grupo No. Rxn OFF ON OFF ON OFF ON OFF ON OFF ON OFF ON OFF ON Ruta Metabólica Metab * ruta 'Alanine and aspartate metabolism' 16 1 3 2 1 1 'Arginine and Proline Metabolism' 41 4 7 2 4 1 4 5 2 'Cysteine Metabolism' 3 1 'D-alanine metabolism' 3 1 1 1 1 1 3 'Glutamate metabolism' 15 1 2 1 2 1 2 1 2 3 1 2 1 2 'Glycine, serine, alanine and threonine metabolism' 37 13 7 4 10 9 14 6 'Histidine metabolism' 16 1 MAA 'Lysine metabolism' 24 1 1 1 6 1 3 1 1 1 2 'Methionine and cysteine metabolism' 54 3 2 3 2 9 1 4 4 2 3 'Phenylalanine metabolism' 12 1 4 'Tryptophan metabolism' 70 1 2 2 3 1 1 1 3 2 4 4 9 1 2 'Tyrosine metabolism' 121 6 9 1 2 3 1 1 2 4 'Urea cycle' 69 2 4 8 2 1 'Valine, leucine, and isoleucine metabolism' 43 1 9 3 6 2 2 1 3 3 7 3 8 2 4 'Blood group synthesis' 48 5 1 MGS 'Heme synthesis' 14 1 1 1 1 'Aminosugar metabolism' 28 2 8 1 9 1 4 2 12 1 10 1 5 4 'Butanoate metabolism' 3 1 'Citric acid cycle' 20 1 2 2 1 1 2 'Fructose and mannose metabolism' 24 1 2 1 4 1 2 3 3 3 2 4 2 'Galactose metabolism' 12 1 2 1 2 1 1 1 2 1 3 1 3 1 1 'Glycolysis/gluconeogenesis' 47 1 8 2 5 1 5 1 9 1 5 1 5 1 MC 'Glyoxylate and dicarboxylate metabolism' 14 5 3 3 1 1 'Inositol phosphate metabolism' 64 2 7 5 9 4 2 'Pentose phosphate pathway' 39 1 4 6 1 3 1 8 1 3 8 3 'Propanoate metabolism' 13 2 2 2 1 1 2 1 2 1 2 2 1 1 'Pyruvate metabolism' 60 1 15 14 4 1 8 14 1 8 1 3 'Starch and sucrose metabolism' 33 5 3 1 1 1 2 6 4 1 1 'Oxidative phosphorylation' Ox 10 2 2 2 2 3 'Exchange/demand reaction' Ex 741 47 49 47 62 21 20 46 60 43 56 47 54 19 25 'Chondroitin sulfate degradation' 18 1 'Chondroitin synthesis' 45 'Heparan sulfate degradation' 35 2 24 'Hyaluronan metabolism' 2 1 MBG 'Keratan sulfate degradation' 70 11 38 2 3 6 'Keratan sulfate synthesis' 66 37 11 39 11 'N-glycan degradation' 41 7 14 5 5 5 5 'N-glycan synthesis' 108 38 9 37 42 38 'O-glycan synthesis' 15 3 1 'Bile acid synthesis' 127 5 9 3 7 1 3 6 4 16 5 8 2 'Cholesterol metabolism' 62 7 3 1 8 1 13 10 2 'Eicosanoid metabolism' 258 7 5 1 4 6 6 6 3 'Fatty acid oxidation' 866 2 46 9 77 4 27 9 74 9 65 4 53 3 36 'Fatty acid synthesis' 126 1 2 1 8 1 7 1 15 10 1 12 1 4 'Glycerophospholipid metabolism' 74 2 3 9 1 2 1 5 1 5 3 1 2 ML 'Glycosphingolipid metabolism' 14 1 1 1 2 1 1 'Phosphatidylinositol phosphate metabolism' 63 10 10 1 15 1 12 10 2 3 'Sphingolipid metabolism' 75 6 8 1 5 8 5 'Squalene and cholesterol synthesis' 5 3 'Steroid metabolism' 77 4 2 1 4 5 5 1 'Triacylglycerol synthesis' 13 6 2 2 5 3 3 1 'Biotin metabolism' 12 1 1 'CoA catabolism' 4 1 1 'CoA synthesis' 22 1 1 2 2 'Folate metabolism' 59 1 12 1 12 2 9 2 8 1 6 2 11 2 5 'Tetrahydrobiopterin metabolism' 27 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 'Thiamine metabolism' 6 1 2 MCV 'Ubiquinone synthesis' 14 13 'Vitamin A metabolism' 80 2 6 2 6 3 7 5 9 5 7 5 7 4 6 'Vitamin B2 metabolism' 7 3 3 4 4 4 'Vitamin B6 metabolism' 11 1 2 1 2 1 'Vitamin C metabolism' 16 2 2 2 1 'Vitamin D metabolism' 29 1 2 1 2 'beta-Alanine metabolism' 12 1 1 2 MOA 'Glutathione metabolism' 16 1 1 1 1 1 5 1 1 1 1 'Taurine and hypotaurine metabolism' 8 3 3 'Nucleotide interconversion' 182 8 23 6 20 2 13 8 16 6 19 5 16 4 12 'Nucleotide salvage pathway' 3 1 1 1 1 'Purine catabolism' 77 1 14 3 14 2 5 4 10 3 10 2 14 2 8 MN 'Purine synthesis' 10 1 1 1 1 'Pyrimidine catabolism' 34 1 6 1 4 1 1 2 5 5 1 1 'Pyrimidine synthesis' 19 2 1 2 1 2 1 1 1 1 1 'Dietary fiber binding' 12 2 2 2 2 2 'Miscellaneous' 86 1 4 1 4 1 1 5 2 1 5 2 'NAD metabolism' 23 2 1 3 2 OTHERS 'R group synthesis' 50 10 1 10 5 12 15 11 3 'ROS detoxification' 7 3 4 2 4 3 3 1 'Unassigned' 158 10 9 6 21 5 10 7 14 5 19 9 13 5 6 'Transport, endoplasmic reticular' 130 7 26 5 21 3 6 5 22 9 15 9 18 2 5 'Transport, extracellular' 1626 16 178 25 188 21 52 28 184 20 189 25 184 25 48 'Transport, golgi apparatus' 65 2 12 3 12 1 2 12 5 14 1 10 TM 'Transport, lysosomal' 67 3 15 3 15 2 5 2 16 1 10 4 14 'Transport, mitochondrial' 276 9 27 11 33 4 17 7 38 11 39 6 43 2 15 'Transport, nuclear' 64 3 2 1 5 1 8 5 2 2 3 3 2 'Transport, peroxisomal' 105 2 9 7 10 2 4 5 11 6 7 3 7 2

103

Anexo 6. Conjunto de genes obtenidos del silenciamiento o activación de reacciones en los modelos MPS. Conjunto de genes ON/OFF (ENTREZ GENE ID) ON 26; 30; 31; 32; 34; 35; 36; 37; 38; 48; 50; 51; 52; 53; 54; 55; 100; 107; 108; 109; 111; 112; 113; 114; 115; 124; 125; 126; 127; 128; 130; 131; 158; 159; 175; 189; 215; 216; 217; 218; 219; 220; 221; 222; 223; 224; 225; 226; 229; 230; 231; 240; 248; 249; 250; 251; 270; 271; 272; 275; 276; 277; 278; 279; 280; 290; 291; 292; 293; 353; 366; 383; 411; 412; 427; 440; 443; 495; 496; 501; 523; 523,1; 525; 526; 527; 528; 529; 533; 534; 535; 570; 586; 593; 594; 622; 669; 686; 763; 788; 790; 847; 873; 875; 952; 953; 954; 955; 956; 957; 1103; 1109; 1118; 1119; 1152; 1158; 1374; 1375; 1376; 1384; 1431; 1468; 1491; 1503; 1548; 1553; 1565; 1571; 1576; 1577; 1579; 1582; 1586; 1589; 1593; 1603; 1606; 1607; 1608; 1609; 1621; 1622; 1629; 1632; 1644; 1645; 1650; 1666; 1717; 1718; 1719; 1738; 1743; 1757; 1798; 1806; 1811; 1836; 1891; 1892; 1962; 2030; 2108; 2109; 2168; 2180; 2181; 2182; 2194; 2222; 2224; 2235; 2356; 2517; 2519; 2544; 2548; 2571; 2582; 2584; 2585; 2588; 2593; 2595; 2618; 2628; 2632; 2643; 2645; 2650; 2653; 2678; 2683; 2686; 2687; 2694; 2720; 2731; 2752; 2799; 2805; 2806; 2819; 2936; 2937; 2974; 2977; 2982; 2983; 2984; 2986; 2990; 3000; 3028; 3030; 3032; 3033; 3034; 3073; 3074; 3081; 3098; 3099; 3101; 3155; 3156; 3157; 3158; 3162; 3163; 3177; 3251; 3284; 3293; 3295; 3340; 3417; 3418; 3419; 3420; 3421; 3423; 3425; 3612; 3613; 3620; 3632; 3633; 3635; 3636; 3712; 3795; 3939; 3945; 3948; 3990; 4023; 4051; 4121; 4122; 4124; 4125; 4128; 4129; 4166; 4249; 4329; 4522; 4535; 4536; 4537; 4538; 4539; 4540; 4541; 4548; 4597; 4598; 4645; 4668; 4669; 4694; 4695; 4696; 4697; 4698; 4700; 4701; 4702; 4704; 4705; 4706; 4707; 4708; 4709; 4710; 4711; 4712; 4713; 4714; 4715; 4716; 4717; 4718; 4719; 4720; 4722; 4723; 4724; 4725; 4726; 4728; 4729; 4731; 4758; 4759; 4830; 4831; 4833; 4837; 4842; 4843; 4846; 4860; 4881; 4882; 4891; 4942; 4967; 5009; 5019; 5033; 5034; 5048; 5049; 5050; 5051; 5053; 5092; 5105; 5130; 5167; 5168; 5169; 5172; 5184; 5207; 5208; 5209; 5210; 5223; 5224; 5226; 5238; 5244; 5281; 5286; 5287; 5288; 5290; 5291; 5293; 5294; 5295; 5296; 5297; 5298; 5305; 5313; 5315; 5330; 5331; 5332; 5333; 5334; 5335; 5336; 5337; 5351; 5352; 5372; 5373; 5406; 5407; 5408; 5464; 5476; 5538; 5728; 5742; 5743; 5825; 5831; 5832; 5860; 5959; 5973; 6184; 6185; 6240; 6241; 6303; 6307; 6309; 6319; 6342; 6448; 6470; 6476; 6482; 6483; 6484; 6487; 6489; 6505; 6506; 6507; 6509; 6510; 6511; 6512; 6513; 6514; 6515; 6517; 6519; 6520; 6523; 6524; 6526; 6528; 6533; 6534; 6539; 6541; 6542; 6543; 6546; 6547; 6554; 6555; 6566; 6567; 6572; 6573; 6576; 6578; 6579; 6581; 6582; 6583; 6584; 6646; 6647; 6648; 6649; 6652; 6697; 6715; 6716; 6718; 6723; 6783; 6785; 6817; 6822; 6839; 7083; 7084; 7167; 7173; 7264; 7296; 7299; 7306; 7350; 7351; 7352; 7355; 7357; 7359; 7360; 7363; 7364; 7365; 7366; 7367; 7372; 7389; 7498; 7841; 7915; 7941; 7991; 8029; 8034; 8050; 8140; 8288; 8309; 8310; 8394; 8395; 8396; 8402; 8424; 8435; 8501; 8503; 8509; 8513; 8525; 8526; 8527; 8529; 8534; 8560; 8574; 8639; 8647; 8659; 8703; 8704; 8714; 8733; 8760; 8790; 8801; 8802; 8803; 8813; 8818; 8824; 8833; 8836; 8854; 8867; 8871; 8875; 8876; 8879; 8884; 8897; 8974; 8985; 8992; 9016; 9056; 9057; 9060; 9061; 9114; 9153; 9154; 9162; 9187; 9197; 9227; 9245; 9296; 9334; 9348; 9365; 9374; 9388; 9394; 9415; 9435; 9453; 9468; 9469; 9481; 9487; 9488; 9517; 9550; 9563; 9583; 9615; 9651; 9653; 9843; 9869; 9951; 9953; 9955; 9962; 9963; 10005; 10020; 10026; 10057; 10087; 10157; 10164; 10195; 10229; 10257; 10312; 10327; 10331; 10390; 10396; 10400; 10449; 10455; 10554; 10555; 10558; 10560; 10588; 10599; 10637; 10654; 10678; 10682; 10690; 10720; 10797; 10841; 10861; 10870; 10901; 10905; 10919; 10965; 10993; 10999; 11001; 11041; 11046; 11136; 11164; 11238; 11253; 11254; 11282; 11283; 11320; 11332; 11343; 22305; 22856; 22978; 23007; 23169; 23236; 23305; 23396; 23417; 23428; 23475; 23483; 23498; 23533; 23545; 23556; 23563; 23657; 23761; 25769; 25796; 25841; 25902; 26002; 26061; 26062; 26063; 26229; 26266; 27034; 27068; 27087; 27124; 27159; 27349; 28234; 28976; 29880; 29920; 29929; 29958; 30061; 30833; 50484; 50617; 50814; 51004; 51005; 51079; 51102; 51109; 51179; 51196; 51205; 51251; 51301; 51382; 51557; 51604; 51606; 51703; 51727; 51733; 51805; 54187; 54344; 54363; 54407; 54490; 54511; 54575; 54576; 54577; 54578; 54579; 54600; 54657; 54658; 54659; 54675; 54677; 54682; 54716; 54872; 54965; 54995; 55089; 55163; 55191; 55224; 55268; 55276; 55293; 55315; 55326; 55350; 55361; 55454; 55500; 55512; 55577; 55650; 55748; 55753; 55790; 55811; 55825; 55902; 55967; 56052; 56301; 56474; 56548; 56623; 56848; 56894; 56895; 56922; 56953; 56954; 56994; 57026; 57030; 57084; 57134; 57171; 57194; 57379; 57393; 57665; 58508; 58510; 60386; 64064; 64077; 64078; 64080; 64087; 64131; 64132; 64579; 64711; 64772; 64834; 64841; 64850; 64870; 64871; 64902; 65010; 65263; 65985; 79053; 79087; 79369; 79586; 79717; 79723; 79813; 79837; 79896; 79901; 79966; 80025; 80055; 80150; 80201; 80235; 80270; 80308; 80704; 80724; 80854; 80864; 81539; 81693; 83715; 83852; 84002; 84129; 84444; 84532; 84720; 84735; 84812; 84889; 84920; 85365; 89869; 90161; 90423; 91703; 92483; 92745; 93010; 93034; 93183; 94005; 112483; 112724; 113026; 113235; 115019; 115111; 116285; 116369; 117247; 122622; 122970; 124583; 124935; 125206; 126129; 126328; 126410; 127124; 128869; 129807; 132158; 135152; 137872; 137964; 140679; 145226; 146712; 159963; 160287; 160851; 162466; 192134; 195814; 196883; 196951; 197257; 200010; 200576; 201288; 206358; 245972; 245973; 246213; 253430; 257068; 259230; 266722; 284129; 284273; 286016; 337876; 347734; 349565; 374291; 374907; 387893; 400410; 441024; 645740; 728226; 728441; 728637; 100287639; AA081045.1; AA177072.1; AA278423.1; AA502753.1; AA526438.1; AA664770.1; AA676725.1; AA788780.1; AA977580.1; AF116616.1; AI090874.1; AI191472.1; AI222095.1; AI435857.1; AI493054.1; AI539321.1; AI620219.1; AI684467.1; AI694761.1; AI697028.1; AI915649.1; AI926493.1; AI934540.1; AI971036.1; AI990637.1; AL048840.1; AL525798.1; AU149534.1; AV727634.1; BE966236.1; BG035985.1;

104

OFF

D87002.1; H17063.1; H77542.1; HG2846-HT2983.1; LOC728997.1; NM_013421.1; PRO1933.1; R33828.1; R39999.1; T83654.1; U37519.1; U52111.1; W74642.1 19; 30; 33; 51; 217; 218; 219; 220; 221; 222; 223; 224; 501; 570; 586; 755; 788; 1103; 1374; 1375; 1468; 1543; 1544; 1545; 1548; 1549; 1551; 1553; 1555; 1558; 1559; 1562; 1565; 1571; 1572; 1573; 1576; 1577; 1580; 1588; 1593; 1594; 1666; 1717; 1719; 1723; 1892; 1962; 2030; 2180; 2181; 2194; 2222; 2643; 2687; 2879; 2936; 3028; 3030; 3032; 3033; 3156; 3177; 3283; 3284; 3295; 3425; 3628; 3939; 3945; 3948; 4139; 4522; 4830; 4831; 4832; 4860; 5211; 5213; 5214; 5286; 5287; 5288; 5313; 5315; 5831; 5833; 5834; 5836; 5837; 5959; 5973; 6240; 6241; 6510; 6520; 6524; 6526; 6541; 6542; 6561; 6566; 6573; 6576; 6675; 6783; 6822; 7350; 7351; 7352; 7371; 8034; 8140; 8310; 8394; 8395; 8501; 8525; 8659; 8879; 9016; 9154; 9162; 9365; 9380; 9481; 9789; 9791; 9942; 10005; 10020; 10087; 10201; 10249; 10257; 10449; 10455; 10588; 10935; 11046; 11136; 11254; 11283; 22305; 23396; 23464; 23478; 23600; 26503; 28972; 29785; 29922; 50484; 51109; 51179; 51703; 51727; 51733; 54363; 55089; 55163; 55293; 55315; 55343; 57194; 57379; 57665; 57834; 60490; 60559; 64078; 64080; 64802; 64816; 64834; 66002; 81539; 83549; 84889; 90701; 91373; 92483; 112724; 122970; 124935; 125206; 126129; 145226; 159963; 160287; 195814; 199974; 200010; 206358; 260293; 400410; 441024; 100287639; AA081045.1; AA532636.1; AI620219.1; AI824319.1; AI934540.1; AU149534.1; BE966236.1; H77542.1; LOC374569.1; T83654.1; W74642.1

105

Anexo 7. Número de reacciones cuyo flujo aumento en un modelo MPS especifico comparado contra los flujos de las demás MPS. 'Alanine and aspartate metabolism' 'Aminosugar metabolism' 'Arginine and Proline Metabolism' 'Bile acid synthesis' 'Cholesterol metabolism' 'Citric acid cycle' 'Cytochrome metabolism' 'Eicosanoid metabolism' 'Exchange/demand reaction' 'Fatty acid oxidation' 'Fatty acid synthesis' 'Folate metabolism' 'Galactose metabolism' 'Glutamate metabolism' 'Glycerophospholipid metabolism' 'Glycine, serine, alanine and threonine metabolism' 'Glycolysis/gluconeogenesis' 'Glyoxylate and dicarboxylate metabolism' 'Histidine metabolism' 'Inositol phosphate metabolism' 'Keratan sulfate degradation' 'Keratan sulfate synthesis' 'Methionine and cysteine metabolism' 'Miscellaneous' 'N-glycan synthesis' 'Nucleotide interconversion' 'Nucleotide salvage pathway' 'Oxidative phosphorylation' 'Pentose phosphate pathway' 'Phenylalanine metabolism' 'Phosphatidylinositol phosphate metabolism' 'Propanoate metabolism' 'Purine catabolism' 'Pyrimidine catabolism' 'Pyrimidine synthesis' 'Pyruvate metabolism' 'R group synthesis' 'ROS detoxification' 'Sphingolipid metabolism' 'Starch and sucrose metabolism' 'Steroid metabolism' 'Transport, endoplasmic reticular' 'Transport, extracellular' 'Transport, golgi apparatus' 'Transport, lysosomal' 'Transport, mitochondrial' 'Transport, nuclear' 'Transport, peroxisomal' 'Triacylglycerol synthesis' 'Tryptophan metabolism' 'Tyrosine metabolism' 'Unassigned' 'Urea cycle' 'Valine, leucine, and isoleucine metabolism' 'Vitamin A metabolism' 'Vitamin B2 metabolism' 'Vitamin C metabolism' 'Butanoate metabolism' 'Fructose and mannose metabolism' 'Lysine metabolism' 'N-glycan degradation' 'O-glycan synthesis' 'Vitamin D metabolism' 'Androgen and estrogen synthesis and metabolism' 'D-alanine metabolism' 'Glycosphingolipid metabolism' 'Heme synthesis' 'Tetrahydrobiopterin metabolism' 'Vitamin B6 metabolism' 'Biotin metabolism' 'Blood group synthesis' 'C5-branched dibasic acid metabolism' 'Chondroitin sulfate degradation' 'CoA catabolism' 'Cysteine Metabolism' 'Dietary fiber binding' 'Glutathione metabolism' 'Hyaluronan metabolism' 'NAD metabolism' 'Ubiquinone synthesis' 'beta-Alanine metabolism' 'CoA synthesis' 'Squalene and cholesterol synthesis' 'Thiamine metabolism' 'Heparan sulfate degradation' 'Purine synthesis'

No Rxn * ruta 16 31 41 128 62 20 15 257 742 869 126 59 12 15 74 37 40 15 16 64 75 59 37 88 108 177 3 10 39 10 63 13 38 35 19 32 50 7 83 33 76 161 1550 78 107 309 65 126 13 70 121 173 69 42 81 7 16 3 27 25 16 15 29 57 3 14 14 27 11 12 46 8 44 6 3 12 16 5 23 14 12 20 6 6 27 13

MPSI-II MPSIIIA-C MPSIIID MPSIVA MPSIVB MPSVI MPSVII 1 1 4 1 1 1 6 1 5 3 6 3 6 2 2 4 1 2 9 8 7 3 2 3 11 2 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 41 26 26 27 21 18 2 40 55 27 46 52 21 1 16 6 3 20 1 4 7 6 5 4 2 1 2 3 1 2 5 5 3 3 1 1 5 5 3 1 5 4 2 6 3 2 2 3 3 3 1 5 1 4 2 4 2 12 43 37 11 11 1 1 5 2 5 2 2 2 1 4 30 3 1 3 29 20 12 9 7 10 6 1 1 1 1 1 1 4 2 1 2 3 1 1 4 10 5 3 4 7 3 1 1 1 2 3 2 1 4 3 1 2 1 1 1 2 3 3 1 5 6 2 7 6 3 1 1 1 2 4 8 8 2 1 4 1 3 3 1 1 1 3 3 17 13 6 3 5 3 70 59 38 65 54 50 5 1 4 1 1 22 4 2 6 3 1 20 17 20 12 9 18 1 2 2 1 3 2 1 9 10 3 7 8 2 2 2 1 2 6 4 8 1 2 2 11 14 16 10 2 2 1 1 7 1 6 2 1 4 3 2 3 1 1 1 1 1 2 1 3 1 2 7 3 1 7 3 3 1 1 2 1 8 1 2

2 1 4 1 5 1 1 1 4 1 1 13

2 1 1

1 2 3 2

2 1

1

27 1

106

Anexo 8. Número de reacciones cuyo flujo disminuyó en un modelo MPS especifico comparado contra los flujos de las demás MPS.

'Alanine and aspartate metabolism' 'Aminosugar metabolism' 'Arginine and Proline Metabolism' 'Bile acid synthesis' 'Cholesterol metabolism' 'Citric acid cycle' 'Eicosanoid metabolism' 'Exchange/demand reaction' 'Fatty acid oxidation' 'Fatty acid synthesis' 'Folate metabolism' 'Galactose metabolism' 'Glutamate metabolism' 'Glycerophospholipid metabolism' 'Glycine, serine, alanine and threonine metabolism' 'Glycolysis/gluconeogenesis' 'Methionine and cysteine metabolism' 'Miscellaneous' 'Nucleotide interconversion' 'Oxidative phosphorylation' 'Pentose phosphate pathway' 'Phenylalanine metabolism' 'Purine catabolism' 'Pyrimidine catabolism' 'Pyrimidine synthesis' 'Pyruvate metabolism' 'R group synthesis' 'ROS detoxification' 'Starch and sucrose metabolism' 'Steroid metabolism' 'Transport, endoplasmic reticular' 'Transport, extracellular' 'Transport, golgi apparatus' 'Transport, lysosomal' 'Transport, mitochondrial' 'Transport, nuclear' 'Transport, peroxisomal' 'Triacylglycerol synthesis' 'Tryptophan metabolism' 'Unassigned' 'Urea cycle' 'Valine, leucine, and isoleucine metabolism' 'Vitamin A metabolism' 'Vitamin C metabolism' 'Fructose and mannose metabolism' 'N-glycan degradation' 'Androgen and estrogen synthesis and metabolism' 'D-alanine metabolism' 'Glycosphingolipid metabolism' 'Heme synthesis' 'Tetrahydrobiopterin metabolism' 'Vitamin B6 metabolism' 'CoA catabolism' 'Glutathione metabolism' 'NAD metabolism' 'CoA synthesis' 'Purine synthesis'

No Rxn * ruta MPSI-II MPSIIIA-C MPSIIID MPSIVA MPSIVB MPSVI MPSVII 16 2 31 1 1 41 3 1 1 128 1 2 1 62 2 1 20 1 257 2 1 742 15 10 17 17 15 21 14 869 3 15 6 7 2 126 10 4 59 1 12 1 1 15 1 74 1 37 1 40 1 1 37 1 1 88 1 1 1 177 1 7 4 8 1 5 10 1 39 2 2 10 1 38 4 2 1 1 35 1 1 19 1 1 1 2 1 32 1 50 1 1 1 1 7 1 33 4 76 1 1 161 2 9 6 6 3 1550 12 2 16 11 16 21 23 78 1 1 2 107 2 1 3 1 4 309 2 5 5 4 4 6 3 65 1 1 1 4 2 126 1 3 2 3 3 4 1 13 2 70 1 1 2 173 3 3 2 69 3 42 1 1 1 81 2 1 1 1 1 16 2 27 1 16 2 57 1 3 1 14 1 14 1 27 1 11 1 6 1 16 2 23 1 20 1 13 1

107

Anexo 9. Reacciones que presentaron un cambio de límites de flujo en los modelos de MPS IVA, IVB, VI y VII. Los tipos de rango fueron para los flujos obtenidos en los modelos de MPS que comparados contra los de recon 2 se obtenía alguno de los siguientes sucesos: 1- el mínimo aumentaba, 2- el máximo aumentaba, 3- mínimo y máximo aumentaban, 4- mínimo disminuía, 5- máximo disminuía, 6- mínimo y máximo disminuían y 7- máximo disminuía y mínimo aumentaba. Nombre de reacción '1,4-alpha-glucan branching enzyme (glygn1 -> glygn2)' 'amylo-1,6-glucosidase, 4-alpha-glucanotransferase EC:2.4.1.25' 'amylo-1,6-glucosidase, 4-alpha-glucanotransferase EC:3.2.1.33' 'Antichymotrypsin exchange' 'Antitrypsin exchange' 'ApoA1 exchange' Apo-CIB Protein assembly' 'Apo-CII Protein assembly' 'Apo-CIII Protein assembly' 'ApoTransferin exchange' 'Beta-1,3-galactosyltransferase 3' 'beta-glucuronidase, lysosomal' 'beta-N-acetylhexosaminidase, lysosomal' 'Bilirubin beta-diglucuronide exchange' 'bilirubin di-glucuronide production' 'Bilirubin exchange' 'Ceramide 1-phosphate exchange' 'Ceramide glucosyltransferase' 'Ceramide kinase' 'ceramide transport protein' 'dehydro-L-gulonate decarboxylase' 'dihydrosphingosine N-acyltransferase' 'D-Xylose exchange' 'D-xylose reversible transport' 'Exchange of L-iduronate' 'exchange reaction for blirubin mono-glucuronide' 'galactose efflux from lysosome' 'galactose-1-phosphate uridylyltransferase' 'globoside (homo sapiens) exchange' 'globoside intracellular transport' 'globoside transport' 'Glucosylceramidase' 'Glucuronate 1-phosphate phosphatase' 'glucuronate transport into lysososme' 'glucuronidated compound transport' 'glucuronidated compound transport' Glutamate transport, lysosomal' 'glycine reversible transport via proton symport (lysosome)' 'glycogen debranching enzyme' 'glycogen phosphorylase (amyls -> glc-D)' 'glycogen phosphorylase (glygn2 -> dxtrn)' 'glycogen synthase (ggn -> glygn1)' 'glycogenin self-glucosylation' 'Haptoglobin exchange' 'hyaluronan exchange' 'hyaluronan transport, extracellular to lysosome' 'iduronate transport into lysososme' 'inositol oxygenase' 'Lactosylceramide 4-alpha-galactosyltransferase' 'L-alanine reversible transport via proton symport (lysosome)' 'L-gulonate 3-dehydrogenase' 'L-iduronate transport, extracellular' 'L-proline reversible transport via proton symport (lysosome)' 'L-Tryptophan exchange' 'myo-Inositol exchange'

MPS IVA

MPS IVB 5 5 5

MPS VI

1 1 1 5 5 5 7

2 2 2

5

3 2 2 5 5 1 5 1 5 3 1 1 6 5 6 1 3 6 3 5 5 6 1 1

MPS VII

5

5 5

4 6 3 3 3

2 3

3 3 5 5 5 5 5 6 3 5 3 1

2 1

108

1 3 6 6 2 3 4 6 3 5 4

RANGOS MAX MIN TIPO DE RANGO AUMENTO 1 AUMENTO 2 AUMENTO AUMENTO 3 DISMINUYO 4 DISMINUYO 5 DISMINUYO DISMINUYO 6 DISMINUYO AUMENTO 7

'N-acetyl-D-mannosamine kinase' 'N-acetyl-galactosamine intracellular transport' 'N-acetylgalactosamine kinase' 'N-acetylgalactosamine kinase (ITP)' 'N-acetylgalactosaminidase, alpha-' 'N-acetylgalactosaminidase, beta-' 'N-acetylglucosamine 2-epimerase' N-acetylglucosamine kinase' 'N-acetylglucosaminidase, lysosomal' 'N-Acetylneuraminate 9-phosphate phosphohydrolase' N-Acetylneuraminate 9-phosphate pyruvate-lyase' 'N-Acetylneuraminate lyase (reversible)' 'N-acetylneuraminate transport into lysososme' 'NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1, alpha/beta subcomplex' 'Plasminogen exchange' 'Protein degradation' 'Protein degradation' 'Protein degradation' 'Protein degradation' 'Protein degradation' 'Protein degradation' 'Protein degradation' 'Protein degradation' 'Protein degradation' 'Protein degradation' 'Prothrombin exchange' 'RE0383' 'RE2404' 'RE2405' 'RE2541' 'RE3381' 'sialidase, lysosomal' 'sphingomyelin deacylase' 'Sphingomyelin synthase (homo sapiens)' 'sphingosylphosphorylcholine (homo sapiens) exchange' 'sphingosylphosphorylcholine transport (diffusion)' 'Sulfate transport (lysosome)' 'Transport of L-Histidine by hPT3 or hPT4 peptide transporters' 'udp intracellular transport' 'udpacgal intracellular transport' 'UDPglucose 4-epimerase' 'UDPglucuronate uridine-diphosphohydrolase' 'UDPglucuronate uridine-monophosphohydrolase' 'UDP-glucuronosyltransferase 1-10 precursor, microsomal' 'UDP-glucuronosyltransferase 1-10 precursor, microsomal' 'UDP-N-acetyl-D-glucosamine 2-epimerase (Hydrolysis)' 'UDP-N-acetylgalactosamine diphosphorylase' 'UDP-N-acetylglucosamine 4-epimerase' 'UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase' 'Xylose efflux from lysosome'

5 6 5 5 6 3 4 4 6

2 4 2 2 2 2 2

4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 3

2 5 5 5 5 2 6 3 1 3

109

5 5 3 7 1 3 5 5 1 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2 2 2 2 2 3

6 3 3 6 2 2

5 6 3 6