PROCESOS COMBINADOS DE CONSERVACIÓN: Una estrategia para la implantación de tecnologías emergentes en la industria alimentaria Javier Raso Food Technology University of Zaragoza [email protected]

PROCESOS COMBINADOS DE CONSERVACIÓN: Una estrategia para la implantación de tecnologías emergentes en la industria alimentaria

 TECNOLOGÍAS EMERGENTES EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA o Aplicaciones

o Limitaciones

 PROCESOS COMBINADOS DE CONSERVACIÓN: FUNDAMENTOS  PROCESOS COMBINADOS CON TECNOLOGÍAS EMERGENTES oAltas Presiones Hidrostáticas oPulsos Eléctricos de Alto Voltaje

 CONCLUSIONES

Demandas de los consumidores que influyen en el desarrollo de tecnologías emergentes de procesado

•Elevada calidad sensorial y nutritiva •Más adecuados a sus nuevos hábitos •Frescos •Naturales •Saludables •Seguros

Buscando el “Método Ideal” de Conservación de los Alimentos

• Garantizar la estabilidad y seguridad de los alimentos mediante la inactivación enzimática y microbiana • Mantener las características nutritivas y sensoriales • No residuos ni generación de sustancias tóxicas • Barato y fácil de aplicar • No objeciones de los consumidores ni de los legisladores

Desnaturalización protéica Pardeamiento no enzimático Pérdida de vitaminas Pérdida de componetes aromáticos

Tecnologías no-térmicas de conservación de los alimentos

Irradiación (IR)  Luz Ultravioleta (UV) Altas Presiones Hidrostáticas(HHP)  Ultrasonidos (US) Pulsos Eléctricos Alto Voltaje (PEF) 

Mejora calidad de los alimentos

Reducción costes energéticos

Nuevos productos

Tecnologías no-térmicas de conservación de los alimentos

 Algunos agentes de alteración de los alimentos son bastante resistentes a estas tecnologías •Esporos bacterianos •Enzimas

 Tratamientos necesarios para garantizar la estabilidad y seguridad de los alimentos son demasiado intensos •No pueden aplicarse a escala industrial •Pueden modificar las propiedades de los alimentos

Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados

•

Aplicación de diferentes métodos de conservación con objeto de reducir su intensidad, manteniendo o mejorar el efecto conservador obtenido y evitando los efectos adversos sobre las propiedades de los alimentos Sucesivamente (Pasterización de la leche) Simultáneamente (Altas presiones y calor) Simultánea y sucesivamente (Acidificación de conservas vegetales)

Nonthermal Processing Technologies

Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados Homeostasis microbiana

Métodos de conser vación

Respuesta homeostática

Reducción de la actividad microbiana - Bajas temperaturas: Refrigeración Congelación

Síntesis de ácidos gr asos insatur ados Síntesis de pr oteínas Síntesis de solutos compatibles

- Descenso de la aw

Síntesis de solutos compatibles

- Fermentación/acidificación

Eliminación de pr otones

- Conservantes químicos

Síntesis de de pr oteínas del choque ácido

- Atmósferas modificadas

Inactivación de microorganismos - Calor

Síntesis de de pr oteínas del choque tér mico

Tecnologías no-térmicas de conservación de los alimentos Mecanismo de acción Disfunciones fisiológicas

Modificaciones estructurales Destrucción membrana

Altas Presiones Homogeneización Altas Presiones Ultrasonidos

  

Irradiation Pulsos eléctricos



Alteracion en el ADN

 

Alteración en Agregación Proteíca los ribosomas





Modifición permeabilidad membrana

Inactivación enzimas metabólicos







Tecnologías no-térmicas de conservación de los alimentos Daño subletal Celulas vivas

Se multiplican en medios de cultivo selectivos y no selectivos

Celulas muertas Celulas dañadas

No se multiplican en medios de cultivo selectivos y no selectivos Se multiplican en medios de cultivo no selectivos pero no en medios selectivos

106 supervivientes

Medio no selectivo Medio selectivo

105 104 103

Tiempo

Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados Tratamiento individual

Efecto aditivo

Tratamiento individual Tratamiento combinado

Tratamiento individual Tratamiento individual Tratamiento combinado

Efecto sinérgico

Tratamiento individual Tratamiento individual Tratamiento combinado

Efecto antagónico

Efecto conservante

Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados

•

Mejor conocimiento de los mecanismos de acción de los métodos de conservación

• Desarrollo experimentado por la microbiología predictiva •

Posibilidades que ofrece la conservación de los alimentos por procesos combinados para superar algunas de las limitaciones que presentan las tecnologías emergentes de conservación

Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados Mecanismos de acción Protein aggregation E. coli stationary phase 200 MPa 8 min

Fluorescent dye: Fluorescein isothiocyanate (FICT) Protein staining

DNA alterations E. coli stationary phase 200 MPa 8 min

Fluorescent dye: 4´,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) DNA staining Mañas and Mackey, 2004, AEM, 70: 1545.

Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados

•

Mejor conocimiento de los mecanismos de acción de los métodos de conservación

• Desarrollo experimentado por la microbiología predictiva •

Posibilidades que ofrece la conservación de los alimentos por procesos combinados para superar algunas de las limitaciones que presentan las tecnologías emergentes de conservación

Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados Microbiología Predictiva Inactivación de L. monocytogenes 5672 por PEF a distintas temperaturas en presencia de nisina

0 nisina

-EXPERT Plot

DESIGN-EXPERT Plot

Response 1 X = A: ph Y = B: T

Actual Factor C: nisina = 100.00

cycles of inactivation LogLog cycles of inactivation Response 1

3.43126

2.42034

1.40942

0.398504

-0 . 6 1 2 4 1 5

3.94957

Actual Factor C: nisina = 200.00

3.06273

2.17589

1.28904

0.402203

1 LogResponse cycles of inactivation

Response 1 X = A: ph Y = B: T

Logcycles cycles inactivation Response 1 Log ofofinactivation

200 ppm nisina

DESIGN-EXPERT Plot

se 1 h

actor a = 0.00

100 ppm nisina

4.16063

3.06159

1.96255

0.863516

-0 . 2 3 5 5 2 3

3.50 3.50 50.00 50.00

50.00

4.38

38.50 38.50

4.38 38.50

5.25 27.00

5.25

pH A: ph pH

3.50

4.38

27.00 6.13

15.50 7.00 4.00

Temperature B: T Temperature pH

A: ph pH pH

5.25 27.00

6.13

15.50 7.00 4.00

B: T Temperature Temperature

A: ph pH

6.13

15.50

B: T Temperature 7.00 4.00

Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados

•

Mejor conocimiento de los mecanismos de acción de los métodos de conservación

• Desarrollo experimentado por la microbiología predictiva •

Posibilidades que ofrece la conservación de los alimentos por procesos combinados para superar algunas de las limitaciones que presentan las tecnologías emergentes de conservación

Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados Altas Presiones Pulsos Eléctricos Temperaturas Moderadas Refrigeración

Simultáneamente

Simultáneamente

Sucesivamente

Sucesivamente

Simultáneamente

Ultrasonidos

Irradiación

Simultáneamente

Simultáneamente Sucesivamente

Sucesivamente

Sucesivamente

Sucesivamente

Atmósferas modificadas Acidificación Antimicrobianos

Sucesivamente

Sucesivamente

Simultáneamente

Simultáneamente

Sucesivamente

Sucesivamente

Simultáneamente

Simultáneamente

Simultáneamente

Sucesivamente

Irradiación Descenso aw Altas Presiones

Simultáneamente Sucesivamente Simultáneamente

Simultáneamente

Simultáneamente Sucesivamente

Simultáneamente

Simultáneamente

Combinaciones con Altas Presiones Hidrostáticas •Aplicación al alimento de presiones hidrostáticas comprendidas en el rango de 100 a 1000 MPa durante un periodo de tiempo (1-30 min) MPa 0,03

0.1

100

1000

36000

Objetivos •Incrementar el efecto inactivador de las altas presiones •Conseguir el mismo efecto inactivador con una menor presión o con un menor tiempo de tratamiento •Inhibir o retrasar la multiplicación de microorganismos supervivientes al tratamiento

los

Combinaciones con Altas Presiones Hidrostáticas Altas presiones hidrostáticas y calor

Log supervivientes

6 5 4 3 2 1

10

20

30

40

Temperatura (ºC)

50

60

Combinaciones con Altas Presiones Hidrostáticas Altas presiones hidrostáticas y calor Combinaciones de altas presiones hidrostáticas y calor que permiten obtener una inactivación de ≥ 6 ciclos logarítmicos

Microorganismo

Serratia liquefaciens

a

Leuconostocmesenteroides Lactobacillus sake

a a

Escherichia coli O157:H7

a

Medio

Presión ( MPa)

Temperatura Tiempo (ºC) (min)

0,l % peptona

207

50

5

0,l % peptona

138

50

5

0,l % peptona

345

50

15

0,l % peptona

207

50

10

Salmonella typhimurium

a

0,l % peptona

207

50

5

Listeria monocytogenes

a

0,l % peptona

207

50

5

Leche UHT

500

50

15

Carne de pollo

400

50

15

Staphylococcusaureus

b

Escherichia coli O157:H7 b

Combinaciones con Altas Presiones Hidrostáticas Altas presiones hidrostáticas y calor

8 7 6 5 4 3 2 1 0

•(Alpas et al. 1999. Appl. Environ. Microbiol.),

345 MPa, 5 min, 50ºC Ciclos logar ítmicos de inactivación

Ciclos logar ítmicos de inactivación

345 MPa, 5 min, 25ºC 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Combinaciones con Altas Presiones Hidrostáticas Altas presiones hidrostáticas y calor Mbr plamática y pared celular

Mbr externas

Germinación Protoplasto

Inactivación Esporo germinado

Cortex

Esporo latente

Esporo inactivado

Germinación 1x10 8 l 1x10 7 l l l 1x10 6 l 5 1x10

l

l

1x10 4 1x10 3 l 1x10 2 l 1x10

1

1x10 0

l

l 0

l

20 ºC

l

30 ºC

l l

2

4

l

6 8 10 12 14 16 Tiempo (min)

Inactivación

690 MPa

60 ºC

Supervivientes (UFC/ml)

Esporos sin germinar (UFC/ml)

Bacillus cereus 1x10 8 lllll l 1x10 7

l

l

l

l

1x10 6 1x10 5

l

1x10 4 l 1x10 3 l l 1x10 2 l 1x10 1 l 1x10 0

0

l

5

10 15 20 25 Tiempo (min)

30

Combinaciones con Altas Presiones Hidrostáticas Altas presiones hidrostáticas y antimicrobianos •Lisozima • Nisina

Peptidoglicano de la pared celular Membrana citoplasmática

Gram -

Gram +

Par ed celular

Membr ana exter na Par ed celular

Membr ana citoplasmática

Membr ana citoplasmática

Combinaciones con Altas Presiones Hidrostáticas Altas presiones hidrostáticas y antimicrobianos Escherichia coli AP: 270 MPa, 15 min, 25 °C N: Nisina (100 UI/ml) L: Lisozima (10 µg/ml)

7 6

Lisozima

5

Nisina

4 3

Membrana externa

2 Pared celular

1

Membrana citoplasmática

0

AP

AP+N

AP + L

AP+N+L

Combinaciones con Altas Presiones Hidrostáticas Altas presiones hidrostáticas y bajas temperaturas

Objetivos •Inhibir la actividad enzimática y el crecimiento de los microorganismos supervivientes al tratamiento •Mantener las propiedades sensoriales del alimento tras el tratamiento

Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje

citoplasma

Membrana citoplasmátia

Medio Externo

•Aplicación de pulsos de alto voltaje (kV) y corta duración (µs) a un material biológico colocado entre dos electrodos

Electroporación

Reversible -

Transformación de células Introducción de sondas moleculares Introducción de medicamentos

Irreversible -

Inactivación microbiana Mejora transferencia de masa

Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Mecanismo de inactivación -Captación colorantes fluorescentes

-Salida de material intracelular (260-280 nm)

-Pérdida de la capacidad de plasmólisis en medio hipertónico -Liberación de ATP

E

Electroporación

Outer membrane

Cell wall

Gr am + bacter ia

Cytoplasmatic membrane

Gr am - bacter ia

Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje

Microorganismo vivo

Microorganismo inactivado REVERSIBLE

Microorganismo dañado

Membrana citoplasmática

Microorganismo vivo reparación

Microorganismo inactivado No reparación Membrana externa Cortex

Esporo bacter iano

PERMANENTE

Microorganismo inactivado

Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Pasteurización por PEF: definición

Tratamiento de pulsos electricos de alto voltaje que aplicado a un alimento reduce las células vegetativas de los microroganismos patógenos hasta un nivel que no presenta riesgo para la salud del consumidor durante la distribución y almacenamiento del producto

Requerimientos 

Identificar los microorganismos patógenos más resistentes a los PEF



Establecer las condiciones de tratamiento por PEF que reduzcan la población de los microorganimos patógenos a un nivel que no supongan un riesgo para la salud

Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Factores que afectan la inactivación microbiana por PEF

Parámetros de procesado

Características del medio de tratamiento

Características de los microorganismos •Especie y cepa

•Intensidad campo eléctrico

•pH

•Tamaño y morfología

•Tiempo de tratamiento

•Actividad de agua

•Temperatura

•Composición

•Forma del pulso

•Conductividad

•Condiciones de crecimiento •Fase de crecimiento •Temperatura de crecimiento •Medio de crecimiento

•Frecuencia •Energía específica

•Condiciones de recuperación •Medio de recuperación •Temperatura de recuperación •Tiempo de recuperación

Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Identificación de las cepas más resistentes a los PEF pH 4,0 5

4465

BJ4L1 471

4466

E. coli O157:H7 443 3

BJ4L1

932

976

4459 4032 5366 4031 4630

4465

722

976

878 4590 880

4

30 kV/cm, 100 µs

pH7,0

880

443 BJ4

4466 878 L. monocytogenes 5672 4590 4630

722

Salmonella Typhimurium 878

4459

W3110

S. aureus 4459

2 O 157:H 7 BJ4

1

5672

932 5366

471 4032 O157:H7

0

W3110

5672 4031

Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Identificación de las cepas más resistentes a los PEF

-4 -6

-2 -4 -6

S. typhimurium -2 -4 -6

500 100015002000

Time (µs)

0

500 1000 1500 Time (µs)

-2 -3 -4 -5 -6

0

0

250 500 750 1000

500 100015002000

Time (µs)

Time (µs)

S. senftenberg

Y. enterocolitica 0

0

-2 -4 -6

-2 -4 -6

0

500

1000 1500

Time (µs)

-2 -4 -6 -8

-8

-8

-8

-8

-4

0

Log10 Nt/N0

Log10 Nt/N0

Log10 Nt/N0

-6

-3

S. enteritidis

0

-4

-2

Time (µs)

0 -2

-1

500 100015002000

Time (µs)

E. coli

-1

-6 0

500 100015002000

0

Log10 Nt/N0

0

0

-5

-8

-8

S. cerevisiae 11034 Log10 Nt/N0

Log10 Nt/N0

Log10 Nt/N0

-2

Log10 Nt/N0

0

0

0

S. cerevisiae 1172

L. monocytogenes

Log10 Nt/N0

E. faecium

0

500 100015002000

0

500 100015002000

Time (µs)

2.5 kV/cm (), 4 kV/cm (), 5.5 kV/cm (), 9 kV/cm (), 12 kV/cm (), 15 kV/cm (▲), 19 kV/cm (), 22 kV/cm (), 25 kV/cm () y 28 kV/cm ()

Time (µs)

Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Modelos Predictivos

Y = α X1 + β X2+ δ X3 + λ X4 +.......... •Establecer las condiciones de tratamiento que permitan obtener alimentos seguros y estables. •Establecer los requerimientos de los equipos para poder aplicar los tratamientos a escala comercial •Realizar análisis de costes

Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Definición de las condiciones de tratamiento

Ciclos logarítmicos inactivación

100 µs; tª 20-30ºC

pH 3,5 4 3 2 1

E. coli O157:H7 L. monocytogenes 5672

0 15

25 30 20 Intensida de campo eléctrico (kV/cm)

35

pH 4,5 4 3 2 1 0 15

Salmonella Typhimurium 878

25 30 20 Intensidad de campo eléctrico (kV/cm)

35

5 S. aureus 4459

5

pH 5,5

pH 7,0 Ciclos logarítmicos inactivación

Ciclos logarítmicos inactivación

Ciclos logarítmicos inactivación

5

5

4 3 2 1

4 3 2 1

0

0

15 15

25 30 20 Intensidad de campo eléctrico (kV/cm)

35

25 30 20 Intensidad de campo eléctrico (kV/cm)

35

Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Definición de las condiciones de tratamiento 100 µs; tª 20-30ºC

pH 3,5 Log cycles of inactivation

4 3 2 1 0

E. coli O157:H7

pH 4,5 4 3 2 1

Applicación de PEF a temperaturas moderadas L. monocytogenes 5672

15

25 30 20 Electric Field Strength (kV/cm)

35

15 Salmonella Typhimurium 878

25 30 20 Electric Field Strength (kV/cm)

35

5

pH 7,0 Ciclos logarítmicos inactivación

pH 5,5 4 3

0

S. aureus 4459

5 Log cycles of inactivation

Ciclos logarítmicos inactivación

5

5

4

Combinación de PEF con antimicrobianos

2 1

3

2 1

0

0

15 15

25 30 20 Electric Field Strength (kV/cm)

35

25 30 20 Electric Field Strenght (kV/cm)

35

Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Combinaciones con temperaturas moderadas Escherichia coli O157:H7 ZumoApple de manzana juice

-2

30ºC

-3

35ºC

-4

40ºC 45ºC

-5 -6 0

25

50

Time (µs) Tiempo (µs)

75

100

20ºC 30ºC 35ºC

-1 -2 -3 -4

40ºC

-5

45ºC

10

20ºC

-1

Log cycles inactivation Ciclos logarítmicos inactivación

0

0

10

CiclosLog logarítmicos inactivación cycles inactivation

pH 3.5

30 kV/cm

-6 0

25

50

Time (µs) Tiempo (µs)

75

100

Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Combinaciones con antimicrobianos

PEF: 30 kV/cm, 100 µs Nisina: 100 ppm Temperatura: 4-50ºC

Nisina

30 kV/cm, 100 μs

Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Combinaciones con antimicrobianos

PEF: 30 kV/cm, 100 µs LAE: 50 ppm Temperatura: 4-50ºC

Etil lauroil arginato (LAE)

Combinaciones con Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje Tratamiento en flujo continuo

Cámara de tratamiento estática

E. coli O157:H7 en zumo de naranja

Intensidad de campo eléctrico: 20, 25, 30 kV/cm Tiempo de tratamiento: 0-140 µs Anchura de pulso: 3 μs Energía específica: 80-180 KJ/kg Temperatura de entrada: 20, 30, 40ºC Temperatura de salida: 50, 55, 60ºC Tiempo de residencia: 0.8 sec

Combinaciones con Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje Tratamiento en flujo continuo

20 kV/cm 25 kV/cm 30 kV/cm

-1 -2 -3 -4

55ºC (163 kJ/kg)

54 ºC (180 kJ/kg) 56ºC (179 kJ/kg )

-5 -6 -7 0

100

50

150

Tin 30ºC

0 -1 -2 -3

55 ºC (134 kJ/kg) 56ºC (131kJ/kg) 55ºC (126 kJ/kg)

-4 -5 -6 -7 0

50

100

150

Ciclos logarítmicos de inactivación

Tin 20ºC

0

Ciclos logarítmicos de inactivación

Ciclos logarítmicos de inactivación

E. coli O157:H7 en zumo de manzana Tin 40ºC

0 -1 -2

54ºC (90 kJ/kg)

-3

56ºC (94 kJ/kg) 55ºC (88 kJ/kg)

-4 -5 -6 -7 0

Tiempo de tratamiento (µs)

Tiempo de tratamiento (µs)

50

100

150

Tiempo de tratamiento (µs)

E. coli O157:H7 en zumo de manzana + 50 ppm LAE

Tin 20ºC

-1 -2 -3 -4 -5

188 kJ/kg

-6

170 kJ/kg

180 kJ/kg

-7 0

100 150 50 Tiempo de tratamiento (µs)

0 -1

Tin 30ºC

-2 -3 -4 -5 142 kJ/kg

-6 -7

130kJ/kg

150 100 0 133 kJ/kg50 Tiempo de tratamiento (µs)

Ciclos logarítmicos de inactivación

0

Ciclos logarítmicos de inactivación

Ciclos logarítmicos de inactivación

in

20 kV/cm 25 kV/cm 30 kV/cm

0

Tin 35ºC

-1 -2 -3 -4 -5

85 kJ/kg

-6

72 kJ/kg 83 kJ/kg

-7 0

50 100 Tiempo de tratamiento (µs)

150

Combinaciones con Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje Optimización

Tiempo de tratamiento (µs)

5 log10 ciclos de inactivacíón E. coli O157:H7 in zumo de manzana + 50 ppm LAE

100 80 60 20 kV/cm, 50 µs 20ºC 25ºC 30ºC 35ºC

40 20 25 kV/cm, 30 µs 0 20

22

24

Energía específica (kJ/kg)

120

30 kV/cm, 20 µs 26

28

30

Intensidad de campo eléctrico (kV/cm)

Intensidad de campo eléctrico (kV/cm)

Combinaciones con Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje Validación

25 kV/cm; Temperatura de entrada 35ºC Zumo de manzana + 50 ppm LAE

Temperatura de salida: 50ºC

25 kV/cm, 38 µs

8 7 Log 10 inactivación

Log 10 inactivación

5 4 3 2 1 0 EC

ST

SA

LM

EC

ST

SA

LM

Temperatura de salida: 65ºC

Temperatura de salida: 60ºC

Temperatura de salida: 55ºC

6

25 kV/cm, 63 µs

25 kV/cm, 50 µs 8

8

7

7

6

6 Log 10 inactivación

25 kV/cm, 30 µs

Zumo de manzana

5 4 3

5 4 3

2

2

1

1

0

0 EC

ST

SA

LM

EC: E. coli O157:H7

SA: S. aureus 4459

ST: Salmonella Typhimurium 878

LM: L. monocytogenes 5672

EC

ST

SA

LM

Combinaciones con Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje Condiciones de tratamiento para pasteurización por PEF

Zumo de manzana

Zumo de manzana + LAE

Intensidad campo eléctrico

25 kV/cm

25 kV/cm

Temperatura entrada

35ºC

35ºC

Tiempo de tratamiento

63 µs

38 µs

Temperatura de salida

65ºC

Energía específica

125 kJ/kg

55ºC 83 kJ/kg

Tiempo de residencia

0.8 sec

0.8 sec

Combinaciones con Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje

CONCLUSIONES PROCESOS COMBINADOS DE CONSERVACIÓN: Una estrategia para la implantación de tecnologías emergentes en la industria alimentaria

•Prolongar el tiempo de conservación y la calidad sanitaria de los alimentos refrigerados

•Desarrollo de nuevos productos

1st World Congress on Electroporation and Pulsed Electric Fields in Biology, Medicine and Food and Environmental Technologies September 6-10, 2015 Portoroz, Slovenia

...we will all be there.