SUMARIO EUROPEAN JOURNAL OF

obstetrics & GYNECOLOGY AND REPRODUCTIVE BIOLOGY

European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology (Ed. Española) 2002; 2: 95-100

Producción de radicales oxigenados en los neutrófilos de mujeres con preeclampsia y síndrome HELLP Petra L.M. Zusterzeela, Geert J.A. Wantenb, Wilbert H.M. Petersb, Hans M.W.M. Merkusa, Eric A.P. Steegersa Departamentos de Obstetricia y Ginecología, Centro Médico de la Universidad de Nijmegen, Apartado de Correos 9101, 6500 HB Nijmegen, Holanda

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Departamentos de Gastroenterología, Centro Médico de la Universidad de Nijmegen, Nijmegen, Holanda

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Aceptado: 15 marzo 2001

Resumen Objetivo: Determinar si la preeclampsia grave complicada por hemólisis, elevación de las enzimas hepáticas y descenso de las plaquetas síndrome HELLP- altera la producción de radicales oxigenados en los neutrófilos. Materiales y métodos: Se obtuvieron neutrófilos de 10 mujeres no gestantes sanas, de 9 gestantes sanas y 9 mujeres con preeclampsia grave y síndrome HELLP simultáneaneamente. La producción de radicales oxigenados se evaluó usando quimioluminiscencia potenciada por luminol y medida por reducción del citocromo C. Además, incubamos suero de casos y controles con neutrófilos sanos aislados y medimos su capacidad de generar radicales oxigenados. Resultados: La producción no estimulada de radicales oxigenados por los neutrófilos fue significativamente más baja en mujeres con preeclampsia grave que en mujeres sanas no gestantes y gestantes, aunque la producción de radicales oxigenados inducida por éster forbol fue similar en todos los grupos. La reducción del citocromo C en los neutrófilos no estimulados mostró resultados similares. En neutrófilos sanos incubados con suero de mujeres preeclámpsicas aumentó la producción de radicales oxigenados significativamente más que en neutrófilos incubados con suero de sujetos sanos. Conclusiones: La preeclampsia grave se caracteriza por un descenso de la producción de radicales oxigenados en los neutrófilos no estimulados. Esto puede ser el resultado de un agotamiento de la respuesta celular, debido a la estimulación por un factor presente en el suero de estas pacientes. © 2001 Elsevier Science Ireland Ltd. Reservados todos los derechos. Palabras clave: Quimioluminiscencia; Neutrófilos; Radicales oxigenados; Preeclampsia; HELLP.

Introducción Aunque la preeclampsia complica el 5% de las gestaciones y es una de las causas principales de morbilidad y mortalidad materna y perinatal, la etiología de esta enfermedad permanece sin establecerse. La lesión y la disfunción endotelial pueden desempeñar un papel importante en la fisiopatología de la preeclampsia [1]. La activación de los neutrófilos puede producir lesión vascular por su capacidad para generar sustancias oxigenadas reactivas [2]. Los neutrófilos activados se adhieren al endotelio y posteriormente liberan contenidos de sus gránulos, como elastasa y otras proteasas, que son capaces de destruir la integridad de las células endoteliales. Los radicales oxigenados generados por los neutrófilos activados pueden producir peroxidación de los lípidos de la membrana y posteriores aumentos de la

permeabilidad y de la reactividad vascular [2]. No está claro qué es lo que desencadena la alteración del endotelio en la preeclampsia, pero la actividad de los neutrófilos puede desempeñar algún papel en la lesión endotelial típica de este trastorno. La adhesión de los neutrófilos al endotelio vascular depende de la asociación entre las moléculas de adhesión presentes en la superficie de las células endoteliales. En la preeclampsia se produce un aumento de la expresión de dichas moléculas de adhesión [3,4], además de un aumento de las concentraciones plasmáticas de algunos componentes granulares, como elastasa, lactoferrina, endotelina 1 y gravidina [5-7]. En la mayoría de los estudios, sin embargo, se han usado técnicas indirectas para demostrar la activación de los neutrófilos. Los neutrófilos producen radicales oxigenados en respuesta a la estimulación, y la

Zusterzeel PLM, Wanten GJA, Peters WHM, Merkus HMWM, Steegers EAP. Neutrophil oxygen radical production in pre-eclampsia with HELLP syndrome. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology 2001; 99: 213-218 (usen esta cita al referirse al artículo).

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medida directa de la producción de radicales oxigenados es un marcador de la activación de los neutrófilos [8]. Para estudiar el papel de los neutrófilos en la patogenia de la preeclampsia y del síndrome HELLP (hemólisis, enzimas hepáticas elevadas, plaquetas bajas) [9], medimos la producción de radicales oxigenados en los neutrófilos de mujeres no gestantes y gestantes normotensas y de mujeres con preeclampsia grave complicada por el síndrome HELLP, usando quimioluminiscencia potenciada por luminol con y sin estímulo externo de PMA (éster forbol 12-miristato 13-acetato) [10]. Además, medimos la producción del anión superóxido con un ensayo de reducción del citocromo C. Para determinar si hay un factor humoral en el suero de las mujeres con preeclampsia, que altera la producción de radicales oxigenados en los neutrófilos, también estudiamos la activación de los neutrófilos de la sangre de una donante sana en respuesta al suero (10% v/v) de todos los sujetos.

Materiales y métodos Sujetos Los sujetos fueron mujeres holandesas asistidas en el Centro Médico de la Universidad Nijmegen, Holanda, desde septiembre de 1998 a febrero de 1999. La población del estudio se compuso de nueve primigrávidas con preeclampsia grave complicada por síndrome HELLP. La preeclampsia grave se definió como presión arterial diastólica persistente > 110 mm Hg (fase V de Korotkoff) en dos o más medidas consecutivas en una mujer previamente normotensa, después de las 20 semanas de gestación, con proteinuria mayor de 3 g a las 24 horas. El síndrome HELLP se definió como la incidencia simultánea de recuento plaquetario < 10 x 109/l, concentraciones séricas de lactato deshidrogenasa (LDH) > 600 UI/l y de aspartato aminotransferasa (AST) y alanino aminotransferasa (ALT) > 70 UI/litro [11]. Todas las mujeres preeclámpsicas estaban muy enfermas, por lo que se ingresaron en la unidad de cuidados intensivos. Seis de las pacientes preeclámpsicas se trataron con metildopa (Aldomet©; Merck Sharp & Dohme BV, Haarlem, Holanda) y sulfato de magnesio por vía intravenosa, una con hidrogenotartrato de ketanserina (Ketensin©; Pharmacia y Upjohn, Woorden, Holanda) y sulfato de magnesio intravenoso, y dos con metildopa sólo. Nueve primigrávidas sanas normotensas, seleccionadas aleatoriamente en la clínica ambulatoria, formaron el grupo de control; eran mujeres normotensas sin proteinuria. Los sujetos se equipararon en cuanto a edad materna y gestacional. Además, se extrajo sangre de 10 mujeres no gestantes sanas de edad similar con antecedentes obstétricos no complicados. Los sujetos con antecedentes de enfermedad vascular renal, diabetes o cualquier trastorno autoinmune, o que recibían cualquier tipo de medicación distinta de vitaminas o suplementos de hierro, se excluyeron del estudio. Se obtuvo el consentimiento por escrito de los

casos y controles antes de la inclusión en el estudio y fue aprobado por el comité de ética local. Se recogieron muestras de sangre en estado avanzado de la gestación de las pacientes con preeclampsia y de los controles gestantes durante una visita prenatal sistemática. Ni las pacientes ni los controles gestantes no estaban de parto en el momento del muestreo de la sangre.

Procedimientos y ensayos Se recogieron muestras de sangre anticoagulada con heparina- litio (para el aislamiento celular) o sin anticoagulantes (para la preparación del suero) de todos los sujetos. Se hicieron medidas de quimioluminiscencia en sangre heparinizada diluida simultáneamente de las gestantes preeclámpsicas, normotensas y no gestantes. La sangre fue recogida en tubos "vacutainer corvac" y se centrifugó a 3000 g durante 10 minutos y el suero se almacenó a –20ºC hasta su análisis. El suero se diluyó en solución salina con tampón fosfato (PBS) y se añadió a los neutrófilos en una concentración final del 10% (v/v). Todos los productos químicos se adquirieron en Laboratorios Sigma (San Luis, MO, Estados Unidos), a menos que se especifique lo contrario.

Aislamiento de los neutrófilos El aislamiento de los neutrófilos se realizó de la forma descrita en otros trabajos [12,13]. La sangre diluida al 1:1 con PBS que contenía citrato trisódico al 0,4% (a/v) (pH 7,4) se diluyó en Percoll (densidad específica 1.076 g/ml; Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y se centrifugó (700 g durante 20 minutos a 25°C). El sedimento se suspendió en 50 ml de solución de lisis isotónica en hielo (que contenía 155 mmol/l de NH4Cl, 10 mmol/l de KHCO3 y 0,1 mmol/l de EDTA, pH 7,4) durante 10 minutos. Después de la centrifugación (400 g durante 5 minutos a 4°C), los eritrocitos restantes se lisaron en la solución reciente de lisis en hielo durante otros 5 minutos. Después se lavaron las células y se resuspendieron en una concentración final de 2 x 106 células/ml y se mantuvieron a temperatura ambiente. Las preparaciones mostraron más del 97% de granulocitos y una viabilidad mayor del 99%.

Quimioluminiscencia La quimioluminiscencia potenciada por luminol se midió a 37°C durante 120 minutos en microplacas de 96 pocillos con un luminómetro automático LB96V Microlumat Plus (EG & G Berthold, Bad Wildberg, Alemania), como se describió en otro artículo [13]. Se añadieron a cada pocillo, que contenía 200 µl de suspensión de neutrófilos (2 x 106 células/ml), 20 µl de una dilución 1:20 de luminol en solución de sal equilibrada de Hank (HBSS) (Life Technology, Breda, Holanda) complementada con albúmina sérica humana

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al 0,5% (a/v) (Behring, Westwood, MA, Estados Unidos). Además de realizar medidas basales, también se añadieron como estímulo 20 µl de PMA; 0,1 mg/ml. La cantidad de quimioluminiscencia se midió cada 60 segundos durante 2 horas y el valor máximo (que representaba el porcentaje máximo de producción de radicales) y completo durante este período (medida de la producción global de radicales) se expresaron como unidades relativas de luz (URL). Para controlar también el efecto de la producción de radicales oxigenados en la fase precoz de activación, los porcentajes de producción de radicales se midieron inmediatamente después de la inducción con luminol y de la estimulación con un estímulo permeable a la membrana (PMA), en presencia o ausencia de suero (10% v/v). Los datos analizaron con la aplicación informática Winglow (EG & G Berthold). La activación de los neutrófilos de la sangre de una mujer sana en respuesta a los sueros de pacientes y controles se midió de la forma siguiente: a 100 ml de suspensión de neutrófilos (2 x 106 células/ml) se añadieron 100 µl de suero (10% v/v), seguido de 20 µl de una dilución al 1:20 de luminol en medio HBSS.

Producción de superóxido La producción de superóxido se determinó a 37°C en función de la reducción de citocromo C inhibible por la superóxido dismutasa en un espectrofotómetro con termostato (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, Estados Unidos), como se describió previamente [14]. Las medidas se expresaron como el porcentaje máximo de reducción de citocromo C en en nmol/1 por 106 neutrófilos a 550 nanómetros, usando 21,1 mmol/l cm como coeficiente de extinción molar del citocromo C [13].

Análisis estadístico Las variaciones entre los grupos se indicaron usando ANOVA de una vía de Kruskal-Wallis y el test de rangos

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de señales de Wilcoxon. Se consideró significativamente estadístico un nivel de probabilidad de p