UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA

PROLIFERACION Y DIFERENCIACION CELULAR EN CULTIVOS PRIMARIOS DE ADIPOCITOS MARRONES

TESIS DOCTORAL

Angela María Martínez Valverde Junio 1991

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGíA MOLECULAR II FACULTAD DE FARMACIA UNiVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

PROLIFERACION Y DIFERENCIACION CELULAR EN CULTIVOS PRIMARIOS DE ADIPOCITOS MARRONES

Memoria presentada por la Licenciada ANGELA MARIA MAR77NEZ VAL VERDE, para aspirar al Grado de Doctor en Farmacia. Madrid 1991

Este trabajo ha sido realizado íntegramente en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, de la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid, bajo la dirección de los Doctores Dña. Margarita Lorenzo Balado y O. Manuel Benito de las Heras durante los cursos: 1988-89, 1989-90 y

1990-91.

Para la realización de este trabajo se concedió una Beca del Plan Nacional de Formación del Personal Investigador del C.S.I.C.

Deseo expresar mi más sincero y profundo agradecimiento a los Dres. Margarita Lorenzo Balado y Manuel Benito de las Heras, directores de ests Tesis por su constante estímulo, ayuda y dedicación, por su contribución a mi formación científica y por sus buenos consejos. A la Dra. Isabel Fabregat por su valiosa colaboración en el trabajo de las purificaciones enzimáticas, así como por todo el tiempo que me ha dedicado y la amistad que me ha brindado. A Almudena Porras, Cristina Molero, Carmen de Juán, Carmen Guerra, Margarita Fernandez y César Roncero por su ayuda, amistad y por los momentos tan agradables que hemos disfrutado juntos en el laboratorio. A Javier Arroyo Alfonso Mendoza y Alberto Alvarez del Departamento de Microbiología ,

y a Fernando de Jesús del Departamento de Química Inorgánica por su valiosa colaboración. A todo el resto de mis compañeros y amigos del Departamento, en especial a Teresa Lupiani y Julia Navarro por su ayuda y amistad durante todos estos anos. A mi familia y amigos por darme todo el ánimo y comprensión que he necesitado para la realización de este trabajo.

A Fernando A mis padres

ABREVIATURAS

ADP

adenosín difosfato actividad enzimática específica

ATP

adenosín trifosfato

ESA

albúmina bovina sérica

cAMP

3 5 adenosín monofosfato cíclico

cDNA

ácido desoxirribonucleico recombinante

D

daltons

DEPC

dietil pirocarbonato

DNA

-ácido desoxirribonucleico

DO

densidad óptica

DPM

desintegraciones por minuto

DTT

ditiotreitol

EDTA

ácido etilén-diamino-tetracético

EGTA

ácido etilén-glicol-bis-(R-aminoetileter> N,N’tetracético proteína G inhibidora

G6PD

glucosa 6-fosfato deshid rogenasa

GTP

guanosin 5trifosfato

Hepes

ácido N-2 hidroxi-met¡l-piperac¡na-N’2-etano-sulfónico

IBMX

isobutil-metil-xantina

Kb

kilobases

KD

kilodaltons

MOPS

ácido morfolino-propano-sulfónico

MOPS

ácido morfolino-propano-sulfánico

mANA

ácido ribonucleico mensajero

NADF’~

nicotín-aderjín-dinucleátido fosfato oxidado

NADPH

nicotín-adenín-dinucleátido fosfato reducido

32a-P dCTP

. Todas las células hijas producto de la división celular pueden volver a entrar en el ciclo y dividirse de nuevo. La duración del ciclo celular varía de unas células a otras. La mayoría de las lineas celulares mantenidas en cultivo a 370C emplean entre 18 y 24 horas. Las 1

fases G1, 5 y G2 se denominan en conjunto interfases. G1 y 5 suelen durar entre 8 y 10 horas, G2 dura aproximadamente 4-5 horas, mientras que las células experimentan la división celular en un tiempo muy corto, alrededor de una hora. Sin embargo, una célula hija también puede abandonar el ciclo celular y entrar en la fase G0 o quiescencia donde se diferencia hasta adquirir la capacidad para desempeñar la tarea que le corresponda en alguno de los tejidos del organismo. Recientes estudios sobre la regulación del ciclo celular indican que la fase de mitosis es inducida mediante la activación de un complejo denominado MPF que contiene la proteína

p34cdc2

y las ciclinas. La proteína

p34cdc2

presenta gran

analogía con proteínas kinasas conocidas. Su concentración no varía durante el ciclo celular aunque sí lo hace su actividad serina-treonina kinasa, capaz de fosforilar la histona Hl. Las ciclinas son las moléculas reguladoras del complejo MPF. Estas moléculas presentan pesos moleculares de 45-55 KD y se aislaron inicialmente de embriones procedentes de invertebrados marinos. Estas proteínas se sintetizan de manera continua durante la interfase, degradándose rápidamente al final de la mitosis (Draetta, 1990,; Glotzer y col., 1991; Freeman y Donoghue, 1991). En la fase G1 del ciclo celular, la proteína

~34cdc2

se encuentra defosforilada y

carece de actividad kinasa. Sin embargo, cuando las células pasan por las fases 5 y G2 se inicia una progresiva fosforilación de la molécula en residuos tirosina y treonina. Recientemente se ha descrito que en células humanas HeLa el producto del oncogén src, que posee actividad kinasa, es capaz de fosforilar los residuos tirosina de la proteína

Paralelamente, la ciclina 8 acumulada durante las Al final de G fases 5 y G2 forma un complejo con 2 el complejo se activa p340d02•

2

.

p340d0

defosforilándose en residuos tirosina la proteína

p34CdC2

y fosforilándose la ciclina,

de manera que presenta su máxima actividad en la fase M. Cuando la célula abandona la fase mitótica, se inicia una progresiva degradación de la ciclina B por mecanismos todavía poco claros que conduce a la inactivación del complejo MPF 2~ciclina A (Glotzer y col, 1991>. También se ha encontrado un complejo p34cdc activo en las fases G 2 y S pero ausente en la mitosis. De esta manera, se ha 2~ciclina A descrito en el ciclo celular humano una activación del complejo p34edc previa a la activación de p3t~2-ciclina B (Draetta, 1990; Freeman y Donoghue, 2

1991). Además del complejo MPF existen otras moléculas reguladoras del ciclo celular. Recientemente se ha descrito la proteína p105-RB de 105 KD, producto del gen supresor del tumor de retinoblastoma, como una proteína nuclear que actúa inhibiendo la proliferación celular (Buchkovich y col., 1989>. En la fase G1 la proteína p105-RB se encuentra defosforilada y activa impidiendo la progresión de las células en el ciclo celular. Sin embargo, cuando la proteína se fosforila en las fases 5 y G2 pierde su actividad inhibidora de la proliferación celular. En el esquema 1 se muestra el proceso global de regulación del ciclo celular. Cuando células quiescentes se someten a una serie de estímulos, conocidos globalmente como mitógenos, entran de nuevo en ciclo celular y se dividen. 2.1.2 Factores de crecimiento:estructura y función Los factores de crecimiento constituyen un amplio grupo de moléculas polipeptídicas cuyo peso molecular oscila entre 1000 y 40.000 D. Sus efectos fisiológicos “in vivo” están relacionados con la estimulación del crecimiento embrionario y fetal durante el desarrollo, la regulación de los procesos de proliferación-diferenciación de tejidos que regeneran continuamente y finalmente la estimulación de los procesos de reparación tisular . La aplicación de las técnicas de la Biología Molecular ha proporcionado una amplia información sobre la estructura tanto de los factores de crecimiento como de los receptores a los que estos se unen. Asimismo, se han podido relacionar factores de crecimiento y receptores con productos oncogénicos. Finalmente, se han podido conocer los mecanismos celulares que proporcionan la respuesta mitogénica.

2.1.2.1 Factor de crecimiento epidérmico El factor de crecimiento epidérmico (EGF) es un polipéptido constituido por una cadena sencilla de 53 residuos aminoacídicos con un peso molecular de alrededor 3

ESQUEMA celular

1

Esquema

del

proceso

de

recrulacián

del

p plo5-~;n

-~

¡

e, 9

p

NF Re

pi4 threonine phosphoryht~on

Tyr Thr

PM “4

cycrin

TyrTlr

pL~ •0~ p34/cydin (Y330CuJ1

DNA SYNTHESIS

nr,

MITOSIS

ciclo

de 6.000 D y punto isoeléctrico 4.6. En su estructura carece de alanina, tenilalanina y Usina y posee tres puentes disulfuro que deben estar intactos para mantener su actividad biológica. Por tanto, la presencia de mercaptoetanol y urea u otros agentes reductores transforman el EGE en un polipéptido carente de actividad biológica (Carpenter y Cohen, 1979>. El EGF suele aislarse de la glándula submaxilar del ratón adulto macho como un componente de una molécula compleja de 1 .200 residuos que posee en la región carboxilo terminal una secuencia hidrofóbica característica de una proteína de membrana

.

Sin embargo, los mecanismos por los cuales la molécula precursora

libera el EGF no se conocen todavía. Algunas células, como es el caso de ciertas células renales, acumulan la molécula precursora que es capaz de retener la actividad biológica del EGF (Carpenter y Cohen, 1990). El receptor de EGF se compone de una cadena polipeptídica sencilla de 1.186 aminoácidos y un peso molecular de 170.000 D. En su estructura (esquema 2) existen tres regiones o dominios. Un dominio extracelular por donde se une la molécula de EGF, un dominio hidrofóbico transmembranal y un dominio citoplasmático poseedor de una actividad tirosina kinasa que es común en numerosos productos oncogénicos (Ullrich y col., 1984). El dominio extracelular del receptor de EGE es el responsable de la unión al ligando y contiene 10-11 cadenas de oligosacáridos y un 10% de residuos cisteina. Se ha propuesto que la región imp(icada en la unión al ligando estaría comprendida entre la dos zonas ricas en residuos cisteina existentes en el dominio extracelular (Carpenter y Cohen, 1990>. El dominio citoplásmico del receptor del EGF presenta una alta homología con el producto del oncogén erbB del virus de la eritroblastosis de aves . La unión del EGF a su receptor produce una inmediata activación de la actividad tirosina kinasa fosforilándose el propio receptor además de otros sustratos exógenos. Se han descrito algunas moléculas que son sustratos exógenos de la actividad tirosina kinasa del receptor del EGF: la fosfolipasa C-yl, la fosfoinositol-3kinasa, la proteína CAP y las serina-treonina kinasas MAP-kinasa y raf-kinasa. De todas ellas la fosfolipasa C--yl ha sido la mejor caracterizada y constituye una de las isoenzimas que hidroliza el fosfatidilinositol 4,5-difosfato en inositol 3-fosfato y diacilglicerol (Rhee y col., 1989). Asimismo se ha descrito que el receptor de insulina, poseedor también de una actividad tirosina kinasa intrínseca, no es capaz de fosforilar la fosfolipasa C--yl (Meisenhelder y col., 1989). La proteína CAP se ha descrito como un activador de la actividad GTPásica del oncogén ras siendo su fosforilación por el receptor de EGF paralela a la traslocación de CAP a la membrana (Molloy y col.,1990>. Además de la activación de la tirosina kinasa producida como consequencia de la unión del ECF a sus receptores de membrana algunos autores como Pike y Eakes han descrito un rápido aumento de las concentraciones de inositol-3-fosfato en células A431s estimuladas por RSE. Las acciones biológicas ejercidas por el EGF han sido objeto de numerosas investigaciones. Mediante la utilización de los cultivos celulares se ha encontrado un aumento en la síntesis de DNA en presencia de ECF en: células epiteliales de la lente de conejo, células fibroblásticas humanas y de ratón, células epiteliales de mamíferos, células endoteliales humanas y bovinas, células renales de mono, hepatocitos de rata etc... En estas células blanco, el EGF aumenta la velocidad de crecimiento y de división celular. Como cabría esperar, hay un aumento generalizado en la biosíntesis de DNA, RNA y proteínas. También se producen cambios a nivel de membrana plasmática y aumentos en la síntesis y secrección de prostaglandinas. El ECE produce asimismo respuestas anabólicas rápidas similares a los efectos de la insulina. El transporte de glucosa, de aminoácidos y de precursores de ácidos nucleicos está aumentado así como la actividad Na~-K~ ATPasa ( Carpenter y Cohen, 1979) En células fetales se han descrito efectos del EGF como la estimulación de la 5

síntesis de surfactante en células fibroblásticas de pulmón de ratón (Nielsen, 1989) así como la proliferación de células hepáticas fetales de rata (Henderson y col., 1989).

2.1.2.2. Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) Es un mitógeno que se encuentra en dichas células liberándose durante la reacción de coagulación de la sangre y constituye el principal factor de crecimiento para células mesenquimáticas, de músculo liso y de células gliales (Ross y col., 1986>. Estructuralmente es un dímero de 30.000 Dde peso molecular compuesto por dos cadenas polipeptidicas A y E unidas entre sí por puentes disulfuro . Las subunidades A y 8 aunque son codificadas por distintos genes presentan un 56% de homología entre sí siendo la cadena Gun producto del gen c-sis del cual procede el oncogén denominado v-sis del virus del sarcoma de simios. Asimismo, la proteína producto de v-sis se ha denominado p

28s¡s,

tiene un

peso molecular de 28.000 0 y presenta un 95% de homología con la cadena B del PDCF (Hannik y Donoghue, 1989>. Se han encontrado las tres isoformas del PDGF: PDCF AA, PDCF 88 y PDGF AB tanto en plaquetas como en células transformadas. Estas tres isoformas difieren entre sí en su actividad biológica. Por ejemplo, a diferencia del PDCF AB, el PDGF AA tiene poca actividad mitogénica en fibroblastos humanos (Nistér y col., 1988> pero es un potente mitógeno para células Swiss 3T3 . Estas diferencias fundamentales entre las distintas moléculas de PDGF se deben a la existencia de dos tipos de receptores para este mitógeno. El receptor tipo A liga las tres isoformas con igual afinidad y el receptor tipo 8 liga solo PDGF BE con alta afinidad, mientras que la afinidad de este receptor por el PDGF AB es mucho menor y practicamente nula parael PDCFAA (Heldinycol., 1988; Hartycol.,1988>. Adiferenciaconel propio PDGF, solo se ha encontrado un gen que codifica para ambos tipos de receptores y todavía no se conocen las diferencias estructurales que podrían justificar las diferencias funcionales entre ambos tipos de receptores. Su estructura es semejante a la de otros receptores transmembranales conocidos y consiste en un 6

dominio extracelular de unión al ligando, una región hidrofóbica de transmembrana y un dominio intracelular con actividad tirosina Kinasa (esquema 2). Por tanto, se han encontrado fosforilaciones de proteínas como consecuencia de la estimulación de fibroblastos quiescentes con PDGF. Sin embargo, no se cpnoce todavía el mecanismo por el cual estas fosforilaciones están implicadas en el proceso mitogénico. Además de la activación de la tirosina kinasa del receptor del PDGF, se han encontrado otros mecanismos celulares tras la estimulación de células quiescentes con este factor tales como alteraciones en el transporte iónico, modificaciones en los elementos del citoesqueleto, activación de serina-treonina kinasas como la proteína kinasa C y la 56 kinasa así como la activación de la vía de los inositoles fosfato (Hannik y Donoghue, 1989>. En células Swiss 3T3 se ha descrito una rápida hidrólisis de los lípido inositoles de membrana en respuesta a PDGF . Sin embargo, recientemente Cattaneo y Vicentini (1989> han descrito que a diferencia del receptor de bombesina, la estimulación de la fosfolipasa C por PDGF no estaría mediada por proteínas G estimuladoras pudiendo estar implicada la actividad tirosina kinasa de su receptor. Estos autores proponen la necesidad de realizar nuevos estudios que relacionen la activación de la fosfolipasa C por factores que se unen a receptores tipo tirosina kinasa como es el caso del PDGF. La presencia de PDCF puede alterar los receptores de otros factores de crecimiento. En fibroblastos tratados con POCE se ha descrito un incremento en la expresión de los receptores de

IGF-1

. Por el contrario, la afinidad del ECF por su receptor disminuye en presencia de PDGF

,

probablemente como consecuencia de la

fosforilación por la proteína kinasa C del receptor de ECF (Hunter y col.,1984>. El PDGF también regula la expresión genética a nivel de transcripción. Así, la transcripción de algunos proto-oncogenes celulares como c-myc y c-fos se activa como consecuencia del tratamiento de células quiescentes con PDGF (Hannil< y Donoghue, 1989).

7

2.1.2.3 Factores de crecimiento insulínicos tipo ¡ y II Son dos polipéptidos aislados de la fracción Cohn del suero humano con efecto mitogénico “in vitro” a concentraciones del rango de nanomolaren muchos tipos celulares. Asimismo, presentan efectos tipo insulina en los tejidos adiposo y muscular ya que su estructura es muy semejante a la del precursor de esta hormona . En la estructura de estos factores de crecimiento cabe destacar la existencia de tres puentes disulfuro localizados en idénticas posiciones que las descritas para la insulina IGE-Il> ICF-l receptor de IGF-l: IGF-l> IGF-lI> > insulina receptor de IGF-ll: IGF-ll> IGF-l (no une insulina) Se ha encontrado que la manosa 6-fosfato se une al receptor del IGF-ll aunque lo hace en un lugar diferente a este factor (Waheed y col., 1988>. Sin embargo, no está todavía claro si la unión de ambos ligandos al mismo receptor es independiente o si la unión de uno de ellos altera la unión del otro. Experimentos realizados con células que sobreexpresan los receptores de insulina o del IGF-l han mostrado que ambos pueden mediar las respuestas metabólicas y mitogénicas tanto de la insulina como del IGF-l (Humbel, 1990>. Sin embargo, “in vivo” la insulina regula principalmente los efectos metabólicos y el IGF-l los mitogénicos. Resultaría difícil establecer las diferencias fisiológicas entre ambos 9

teniendo en cuenta las similitudes entre sus receptores y mecanismos de transmisión de señales. Así, son necesarios anticuerpos específicos contra estos receptores para poder establecer cuales podrían mediar los efectos de cada uno de los ligandos. Estudios realizados por Kadowaki y col. (1986> en células KB de citoesqueleto que poseen receptores de insulina e IGF-l y carecen de receptores de IGF-ll, muestran que IGF-l e insulina actúan a través de sus propios receptores mientras que el KW-II lo haría indistintamente con ambos. Sin embargo, estos autores señalan la necesidad de realizar experimentos con nuevos tipos celulares con el fin de poder establecer los efectos mediados por los distintos receptores. La unión del ligando al receptor del IGF-l origina la autofosforilación en tirosina de las subunidades lA además de las fosforilaciones en tirosina de otras proteínas. También se han descrito fosforilaciones en residuos serina-treonina y se ha postulado la existencia de fosforilaciones cruzadas entre las cadenas ¡A de los receptores de lGF-l e insulina (Beguinot y col., 1988>. Por el contrario, no se conoce todavía la cascada de eventos posteriores a la unión de IGF-ll/manosa 6fosfato al receptor tipo II. Recientemente se ha postulado la posible implicación de proteínas G en la transmisión de la señal (Rraulke y col., 1989). El 95% de los IGFs circulantes se encuentran ligados a unas proteínas especificas conocidas con el nombre de proteínas de unión a IGFs cuyos pesos moleculares oscilan entre 24-150 KD. Se han descrito tres proteínas distintas que se unen a estos factores. Las proteínas tipo 1 y II presentan en su estructura un 40% de homología y son ricas en residuos cisteina. El tipo 1 presenta mayor afinidad por IGF-l mientras que el tipo II liga preferentemente el IGF-lt. Por el contrario, la proteína tipo III presenta la misma afinidad por ambos lGFs. Las proteínas de unión a IGFs son capaces de estimular o inhibir los efectos del IGF-l en distintas células en cultivo. Se han descrito efectos inhibitorios en el endometrio, células foliculares del tiroides de rata, células hiperestimuladas de la granulosa humana y células cartilaginosas de la pelvis de embrión de poílo (Koistíen y col., 1990). Estos mismos autores han purificado la proteína tipo 1 de fluido amniótico humano y han observado que aunque es capaz de inhibir la unión del 1251 IGF-l a sus receptores, amplifica la incorporación de 3H-Timidina en estas células. Asimismo, Liu y col. (1991> han descrito una inhibición de la síntesis de DNA 10

producida por el IGF-l en presencia de la proteína de unión a IGF tipo 3 en cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo. Por tanto, se puede decir que dependiendo de los distintos tipos celulares, una misma proteína puede estimular o inhibir la síntesis de DNA. Los efectos “in vivo” de estos factores de crecimiento se han descrito como efectos a corto plazo tipo insulina como la estimulación del transporte de glucosa y la síntesis lipídica en tejido adiposo y efectos mítogénicos a largo plazo entre los que se encuentran la estimulación de la síntesis de DNA, RNA, proteínas y la proliferación celular. Sin embargo, hay que recordar que la insulina es 5-10 veces mas potente que (os USEs en la estimulación de los parámetros metabólicos, mientras que estos últimos son 100 veces mas potentes como mitógenos (Humbel, 1 990>. Los efectos mitogénicos de los IGFs han sido descritos en una gran variedad de sistemas. En algunos, como por ejemplo en cultivos celulares de células tiroideas porcinas, el IGE-l induce la proliferación por sí solo, no siendo necesaria la presencia de otros mitógenos (Takasu y col., 1989). Asimismo, estos autores han descrito en estas mismas células un aumento en los niveles de inositoles fosfato y calcio intracelulares tras añadir IGF-l al medio de cultivo. Otro efecto de gran importancia descrito para el IGF-l es su papel en la diferenciación celular. Se han realizado numerosos estudios utilizando la linea celular preadipocítica 313-Li donde se produce la conversión de estas células fibroblásticas a adipocitos totalmente diferenciados donde enzimas marcadoras lipogénicas se expresan en respuesta a IGE-l (Smith y col., 1988; Schmidt y col., 1990>. Resulta interesante destacar el papel desempeñado por los USEs como reguladores del crecimiento en la transición fetal-neonatal. Las concentraciones séricas de IGF-l e lOE-II varían según la especie en estudio. Así, en rata

la

expresión genética del lOE-II es alta en una gran variedad de tejidos fetales encontrándose altos niveles de este factor en suero fetal. Sin embargo, tras el nacimiento se produce un rápido descenso en la expresión del gen del lOE-II en todos los tejidos exceptuando el cerebro encontrándose muy bajos niveles de este factor, lo que sugiere que el IGF-ll podría desempeñar un importante papel como 11

factor de crecimiento embrionario y fetal (Straus y col., 1991). El gen del ICF-I se expresa en embrión de pollo durante la organogénesis temprana siendo los tejidos extrahepáticos la principal fuente de este factor antes del nacimiento (Serrano y col., 1990). En la rata, el gen del ICF-I se ha encontrado también expresado en una gran variedad de tejidos fetales y se ha relacionado un retardo en el crecimiento fetal con bajas concentraciones séricas de IGF-l (Straus y col.,1991>. Asimismo, a diferencia de IGF-ll, los niveles séricos de IGF-l en ratas adultas son elevados (Humbel, 1990>. En humanos ambos factores son bajos en suero fetal mientras que los niveles de ICE-lí se mantienen elevados en estado adulto. Durante la pubertad se ha descrito un aumento de 2-3 veces en los niveles de ICF-l probablemente debido a un aumento en la secreción de CH . Ambos constituyen el prototipo de factores que actúan

de manera autocrina. Aunque su denominación es

practicamente la misma ya que ambos se expresan en células transformadas, su estructura y funciones biológicas presentan grandes diferencias. 2.1.2.4.1. TGF-« Es un polipéptido descubierto en el medio de cultivo de células fibroblásticas transformadas por ciertos retrovirus que presenta un peso molecular de 5-20 KD 12

dependiendo de las diferentes especies que lo secretan. La forma mas pequeña que contiene 50 aminoácidos posee un 30% de homología estructural con el EGF y conserva los tres puentes disulfuro característicos de esta molécula lo que le permite ejercer sus funciones biológicas a través del mismo receptor (esquema 2> . Se ha descrito quela molécula precursora posee actividad biológica y se sintetiza como una proteína transmembranal. Dependiendo de la acción proteolitica sobre el precursor, se obtienen las diferentes moléculas del TCE-a . El descubrimiento de la producción de TGF-a y respuesta al mismo por células adultas no transformadas parece indicar que la proliferación celular puede también regularse de manera autocrina. Sin embargo, no puede excluirse la posibilidad de que la producción no controlada de este factor tenga un papel importante en la transformación neoplásica . 2.1.2.4.2 TGF-R Es un polipéptido compuesto por dos subunidades idénticas de 112 aminoácidos unidas entre sí por puentes disulfuro. El dímero presenta 25 KD de peso molecular 13

y es la molécula biológicamente activa. El TGF-l6 se sintetiza a partir de un precursor de 390 aminoácidos de los cuales los 112 del extremo C-terminal son los correspondientes a este factor. También se han descrito glicosilaciones en la región N-terminal del precursor (Lyons y Moses, 1990). Recientemente se han descrito diversas moléculas dentro de la familia de factores conocidos como TCF-R

.

La molécula que inicialmente se aisló de

plaquetas humanas se ha denominado TGF-1A1. A partir de plaquetas porcinas y células óseas bovinas se ha aislado el TGF-R2. Mediante técnicas de clonaje se han identificado las moléculas de TGF-¡A3 y TCF-R4 de las cuales la última no ha sido purificada todavía . Aunque todas estas moléculas presentan una estructura semejante, recientemente se han encontrado diferencias en sus actividades biológicas. Así, el TGF-B3 es mas potente que TGF-¡A1 y TCF-¡A2 como inhibidor del crecimiento en la linea de células epiteliales de pulmón Mvi Lu. Sin embargo, en una linea de células endoteliales de corazón bovino (EBHE). TGF¡Al y TGF-1A3 son 50 veces mas potentes que el TCF-S2 como inhibidores del crecimiento celular (Cheifetz y col., 1990>. Existen receptores que ligan 1GW-lA tanto en células normales como neoplásicas. Todavía no está claro si estas proteínas son receptores de membrana o simplemente proteínas de unión. Se han descrito tres tipos de receptores con pesos moleculares de 50-80 KO (Tipo 1), 115-140 KO (Tipo II) y 280-330 KO (Tipolíl). Este último es un proteoglicano con un 50% de restos de heparin-sulfato y condroitín-sulfato. Las moléculas de IGE-IAl, TGF-¡A2 y TGF-1A3 se unen a los tres tipos de receptores. Sin embargo, las afinidades de las distintas moléculas-de TCF(A

por estos receptores varian en los distintos tipos celulares han descrito una proteína G que podría estar relacionada con la transmisión de la señal en la linea celular AKR-2B de células fibroblásticas de embrión de ratón. Asimismo, recientemente se ha descrito la fosforilación de proteínas nucleares por TCF-131 en células pulmonares CCL 64 (Krarner y col., 14

1991).

Los efectos biológicos descritos para el TGF-B son numerosos y diversos. Se han encontrado los mRNAs de TCE-B1, TCF-132 y TCF-l&3 en una gran variedad de tejidos del ratón adulto: bazo, testículos, riñón, hígado, pulmón, cerebro, corazón, tejido adiposo, glándula submaxilar y placenta Asimismo, la familia de los TGE-IA presenta un importante papel en el desarrollo embrionario. Por ejemplo, se han encontrado los mRNAs de los TCF-IA1 y TGF-R2 en embriones de ratón en la región 5’ de c-rnvc inhibiendo el inicio de la transcripción de este gen. Se ha propuesto que la proteína nuclear p105-RB, producto del gen supresor del tumor de retinoblastoma, podría ser la molécula en este proceso (Moses y col., 1990>. TCE-B también puede alterar la respuesta a otros factores de crecimiento como ECF o PDCF a nivel de interacción ligandoreceptor. Asimismo, se ha empleado otra linea celular de queratinocitos de ratón transformados con el virus del sarcoma de Kirstein para el estudio de los efectos de TCF-B en células transformadas. En estas células el TCF-IA actúa inhibiendo el crecimiento

.

Sin embargo, en otras lineas celulares transformadas el TGF-R no

ejerce efecto inhibitorio probablemente por una alteración en el receptor tipo 1 que impide la transmisión de la señal negativa de crecimiento {Lyons y Mases 19901. ,

También se ha especulado la posibilidad de la pérdida del control de la proliferación celular como consecuencia de la pérdida de elementos reguladores negativos por 15

mutación o delección del gen que codifica para el TGF-B Este polipéptido también es capaz de inhibir el crecimiento celular “in vivo”. Así, la inyección intravenosa de TCF-B1 o TGF-¡A2 inhibe la proliferación de hepatocitos de rata tras una hepatectomía parcial . Estudios realizados en el laboratorio del Dr Rozengurt apuntan la existencia de una proteína G, insensible a toxina pertusis, ligada al receptor de bombesina implicada en la transmisión de la señal ya que el derivado no hidroxilable GTP-yS aumenta la velocidad de disociación del complejo receptor 1251-CRP de manera específica y -

dosis dependiente . Los procesos intracelulares que acontecen tras la unión ligando-receptor han sido objeto de recientes estudios. Se sabe que una de las primeras respuestas que se producen tras la interacción bombesina o GRP con su receptor es un incremento de los flujos jónicos de Ca~4, Nat, K~ e

a través de la membrana plasmática.

Estos péptidos estimulan la entrada de Na~ al interior celular vía antiporte Na~/H~ sensible a amilorido con lo que se alcaliniza el citoplasma y se activa la bomba Na~/K~ que incrementa los niveles de K~ intracelulares restaurando el gradiente electroquímico. Asimismo, como consecuencia de la activación de la vía de los inositoles fosfato se produce la salida de Ca~~ del retículo endoplásmico al citoplasma celular. Por último, Rozengurt y col. también han estudiado la activación de la proteína kinasa C por estos factores y han descrito una proteína de peso molecular 80 KD como sustrato específico de la proteína kinasa C en estas células (Rodriguez-Peña y col., 1986>. Asimismo, la proteína kinasa C está implicada en la regulación de la afinidad del EGF por su receptor. De esta manera, la unión del “51-EGF a sus receptores específicos de membrana en células Svviss 3T3 disminuye en presencia de bombesina. Zachary y Rozengurt . Por último, se han encontrado altos niveles de moléculas pertenecientes a esta familia en carcinomas de células pequeñas de pulmón lo cual podría implicar a estas 19

moléculas en mecanismos autocrinos de estimulación de la proliferación celular (Rozengurt, 1988; Woll y Rozengurt, 1989>. 2.1.2.7 Vasopresina Se trata de un nonapéptido cíclico secretado por el hipotálamo, conducido a la hipófisis posterior y finalmente vertido a la circulación sanguínea. La vasopresina actúa en el organismo como hormona antidiurética, tiene efecto vasoconstrictor sobre la musculatura lisa de las arterias y estimula la gluconeogénesis hepática. ln vitro’, es un potente mitógeno para células Swiss 3T3 actuando sinergísticamente con la insulina. “In vivo” facilita la respuesta proliferativa de los vasos sanguíneos ante una hemorragia, así como del hígado después de una hepatectomía parcial. También se ha relacionado con el control del desarrollo cerebral en fetos de rata. Los efectos mitogénicos producidos por esta molécula son el resultado de su unión a receptores específicos de membrana. Se han descrito dos tipos de receptores de vasopresina. Los receptores y1 son responsables de los efectos hepáticos y vasculares mediante la activación de la vía de los inositoles fosfato. Por el contrario, los receptores V2 median la acción antidiurética y se encuentran acoplados al sistema de la adenilato ciclasa. En la linea celular Swiss 3T3 la vasopresina ejerce su efecto mitogénico mediante la interacción con los receptores V1. Sin embargo, la estructura molecular de los mismos no ha sido todavía establecida (Woll y Rozengurt, 1989>. La adición de vasopresina a cultivos quiescentes de fibroblastos Swiss 3T3 origina un aumento significativo en la síntesis de DNA que se encuentra potenciado por insulina, EGE y/o EGF. Sin embargo, no se han observado efectos sinergísticos con esteres de forbol o diacilgliceroles, lo que sugiere que estas moléculas presentan mecanismos semejantes de transmisión de señales (Rodriguez-Peña y Rozengurt, 1986). Sin embargo, se sabe que como consecuencia de la interacción t al interior de la vasopresina con su receptor tipo VI, se estimula la entrada de Na celular, así como la bomba Na~/K~ y en consecuencia se produce alcalinización del citoplasma (Mendoza y col., 1980). Además también se ha descrito una inducción del relevo de fosfatidil inositoles de membrana y una movilización de los depósitos 20

de Ca~~ intracelulares (Lopez-Rivas y Rozengurt, 1984) Además de estos mecanismos también se ha descrito la activación de la proteína kinasa C en respuesta a vasopresina. Ya hemos señalado la falta de efecto sinergístico entre vasopresina, esteres de forbol y diacilgílceroles sintéticos y la posibilidad de que todas estas moléculas pudieran compartir una misma vía de transmisión de señales. Tanto los ésteres de forbol como los diacilgliceroles son potentes activadores de la proteína kinasa C. En efecto, Rodriguez-Peña y col. el efecto máximo se obtiene con la concentración de vasopresina de 20 ng/ml. Esta fosforilación es rápidamente revertida retirando la vasopresina del medio de cultivo . Recientemente se ha descrito la pérdida del efecto mitogénico de la bombesina como consecuencia del tratamiento prolongado de fibroblastos Swiss 3T3 con vasopresina (Miliar y Rozengurt, 1989>. Estos autores han atribuido este fenómeno a una desensibilización heteróloga mediada por el receptor de vasopresina ya que este efecto revierte en presencia de inhibidores de esta hormona. Además no se encuentran afectados el número, afinidad y capacidad de internalización de los receptores por lo que la inhibición del efecto mitogénico de la bombesina ocurre a nivel de transmisión de señales tempranas, concretamente impidiendo la liberación de ácido araquidónico . Posee una potente actividad vasoconstrictora y se ha descrito como mitógeno en células de la musculatura lisa de los vasos sanguíneos y células gliales de rata. En cultivos 21

celulares de fibroblastos quiescentes Swiss 3T3 la endotelina potencia el efecto mitogénico de bombesina, vasopresina y esteres de forbol. Asimismo se han descrito efectos sinergisticos entre endotelina y EGF. Sin embargo, este péptido no potencia significativamente los efectos mitogénicos de insulina e ICF-l (Brown y Littlewood, 1989>. Estos autores han descrito un aumento en la concentración intracelular de inositoles fosfato en respuesta a endotelina. Asimismo, Takuwa y col. han observado un aumento en la fosforilación de la proteína de 80 KD, sustrato de la proteína kinasa O. Aunque la endotelina comparte con la vasopresina y bombesina la capacidad de estimular la hidrólisis de fosfatidil inositoles de membrana, presenta diferencias con estas moléculas como el sinergismo con ésteres de forbol y la falta de sinergismo con insulina. Estos resultados apuntarían la posibilidad de la activación de distintas vías de transmisión de señales por estas moléculas (Brown y Littlewood, 1989). Recientemente Fabregat y Rozengurt (1990) han descrito una inhibición tanto de la movilización de calcio como de los efectos mitogénicos producidos por la endotelina en presencia del derivado ( D-Arg1, D-Phe5, D-Trp79, Leu11) del neuropéptido conocido como sustancia P, un potente antagonista de la bombesina. 2.1.2.9 Papel del cAMP en la proliferación celular El papel del cAMP en la regulación de la proliferación en las células de mamíferos no esté completamente claro en el momento presente. En la década de los 70 prevalecía la teoría del cAME’ como inhibidor de la proliferación -celular. Actualmente se ha ampliado el estudio con numerosos sistemas celulares, en algunos de los cuales los agentes que elevan los niveles de cAME’ son potentes mitógenos. Por ejemplo, agentes que promueven la acumulación de cAMP en células Swiss 3T3 tales como la toxina del cólera o la prostaglandina E

1 estimulan

la síntesis de DNA actuando sinergísticamente con otros mitógenos. Resulta importante evaluar si los factores de crecimiento fisiológicos añadidos a un medio libre en suero pueden afectar al metabolismo del cAMP en estas células. La adición de PDCE induce la acumulación de cAMP en cultivos confluentes y quiescentes incubados en presencia de inhibidores de la degradación de nucleótidos cíclicos. 22

Esta acumulación de cAMP producida por este factor puede estar mediada por un aumento en la síntesis de prostaglandina E, que estimula la producción de cAME’ ya que la indometazina impide el aumento de los niveles de cAMP inducidos en presencia de PDGF. En contraste, otros factores de crecimiento como la vasopresina, EGE, ésteres de forbol o insulina, no aumentan los niveles de cAME’ en estas células (Rozengurt, 1986). Recientemente se ha descrito un aumento en la fosforilación de una proteína de peso molecular 58.000 D denominada vimentina, presente en los filamentos intermedios de las células mesenquimáticas,

en

respuesta al aumento de los niveles de cAME’ . A continuación se produciría una redistribución de dichos filamentos, y finalmente la síntesis de DNA. Se ha descrito la existencia de una relación directa entre la estimulación de la proteína kinasa C y la acumulación de cAME’ en células expuestas a forscolina o toxina del cólera. Este efecto ha sido descrito para la bombesina en el apartado . El papel del cAMP en la síntesis de DNA se ha estudiado también en adipocitos marrones de ratón y rata. Géloen y col. (1988> realizando estudios “in vivo” han descrito un aumento en la incorporación de metil-3H-Timidina tras la exposición de ratas al frío en las células precursoras de los adipocitos marrones . Estos autores han sugerido una estimulación del crecimiento dei tejido adiposo marrón tras la exposición de los animales al frío de manera que ,

se incrementa la liberación de noradrenalina de los terminales simpáticos activándose la mitosis de las células precursoras de los adipocitos marrones por un mecanismo IS-adrenérgico que implica el aumento de los niveles de cAME’ intracelulares. Asimismo, la inyección de noradrenalina mimetiza los efectos de la exposición al frío sobre el tejido adiposo marrón al igual que el agonista

¡A-

adrenérgico isoproterenol. Por el contrario, el a-agonista fenilefrina no induce mitosis en este tejido. Sin embargo, con los agonistas ¡A-adrenérgicos ensayados no se obtiene el efecto proliferativo máximo producido por la exposición al frío. Esto parece indicar que las catecolaminas requieren la presencia de otros factores de crecimiento para estimular máximamente el crecimiento celular del tejido. Rehnmark y Nedergaard han realizado estudios de síntesis de DNA “in 23

vivo” en ratones adultos expuestos al frío encontrando un máximo aumento en la síntesis de DNA tras 8 días de exposición de los animales a la temperatura de 40C. Asimismo, han conseguido aumentar la incorporación de 3H-Timidina inyectando a los animales dosis sucesivas de noradrenalina no observando ningún efecto al inyectar la noradrenalina con el (A-antagonista propanolol. La interpretación de los resultados obtenidos “in vivo” es difícil, debido a la posibilidad de aparición de efectos secundarios en los tratamientos hormonales. Por ello, resulta necesario realizar experimentos “in vitro” en sistemas de cultivos celulares para poder observar los efectos hormonales aislados sin las interferencias que pueden producirse en los experimentos “in vivo”.

24

2.2 CARACTERíSTICAS GENERALES DEL TEJIDO ADIPOSO MARRON

El tejido adiposo marrón es un tejido altamente diferenciado y especializado en todos los mamíferos en la producción de calor mediante un mecanismo denominado “termogénesis sin tiriteo” que permite al recién nacido compensar la pérdida de calor que sufre al abandonar el seno materno (Nedergaard y col., 1986). En la mayoría de las especies, el tejido adiposo marrón se diferencia durante la etapa fetal y es identificable en el momento del nacimiento. Sin embargo, el desarrollo perinatal de este tejido varia dependiendo del grado de madurez que presenten al nacer (Néchad, 1983>. La morfología del tejido adiposo marrón es común en todos los mamíferos examinados. Resulta característico su color marrón debido al alto contenido en pigmentos respiratorios, y sobre todo, a la gran irrigación sanguínea (Girardier, 1983). Con el microscopio óptico se aprecia que la mayor parte del volumen del tejido se encuentra ocupada por adipocitos marrones. Estas células son generalmente poligonales con depósitos lipídicos multiloculares ocupando en el tejido adiposo marrón de rata recién nacida un volumen aproximado del 70%. El resto del tejido está constituido por diferentes tipos de células: células endoteliales, mesenquimatosas, perivasculares, preadipocitos, mastocitos, fibroblastos, células de Schwann y otros tipos. El análisis de la estructura del adípocito marrón mediante microscopia electrónica muestra la presencia de depósitos multiloculares de grasa en el citoplasma, así como una elevada cantidad de mitocondrias con un alto contenido en membrana interna, que aparece formando crestas paralelas y empaquetadas, características de este tejido . Otra característica observada es el sistema de uniones entre las células que permite el intercambio de nutrientes y/o señales moleculares como pueden ser azúcares, aminoácidos, nucleótidos, cAME’, hormonas esteroidicas, etc... (Girardier, 1983>. 25

La localización anatómica del tejido adiposo marrón indica que se desarrolla al mismo tiempo en lugares específicos. Se encuentra presente en las regiones interescapular. cervical y axilar, alrededor del timo y de la glándula tiroides, asociado a la caja torácica y dentro de esta (sobre el corazón, rodeando a la aorta, a lo largo de la traquea y el esófago y en ambos lados de la espina dorsal> También aparece en la cavidad abdominal ( a lo largo de la aorta y de los vasos sanguíneos renales>, rodeando a las cápsulas suprarrenales y en la región inguinal. Esta distribución anatómica aparentemente dispersa es estratégica, encontrándose el tejido en contacto con los vasos sanguíneos mas importantes. De esta forma, el calor producido se transfiere a las estructuras vitales por contacto directo y através de la sangre (Néchad, 1986).

2.2.1 Desarrollo y diferenciación del tejido adiposo marrón en la rata

En el caso de la rata, la maduración del tejido adiposo marrón es perinatal, produciéndose un rápido proceso de maduración morfológica y funcional de los adipocitos marrones. Se alcanza un pico en su diferenciación y capacidad para producir calor entre la primera y segunda semana de vida, involucionando hacia la cuarta semana si el animal permanece a temperatura termoneutra, adquiriendo un aspecto semejante el del tejido adiposo blanco (Skala, 1984). Esta involución postnatal puede evitarse o revertirse cuando se mantiene una estimulación simpática, o bien por exposición de los animales al frío o por efecto de la sobrealimentación (Nicholís y Locke, 1984>. La posibilidad de esta rediferenciación del tejido en el adulto hace pensar que se mantiene alguna diferencia genética con respecto al tejido adiposo blanco . El desarrollo morfológico y bioquímico del tejido adiposo marrón se conoce bien en la región interescapular de la rata aunque todavía no se conocen con exactitud las señales que determinan su diferenciación. Los adipocitos marrones fetales se 26

originan a partir de las células mesenquimatosas que se encuentran asociadas a los vasos sanguíneos, y empiezan a proliferar rápidamente al mismo tiempo que se desarrollan los vasos en el interior del tejido. Pequeñas inclusiones lipídicas crecen progresivamente en el citoplasma de estas células que se conocen como preadipocitos. Sus mitocondrias simultáneamente aumentan en número y tamaño y su membrana interna se desarrolla muy activamente formando numerosas crestas. Paralelamente se produce un aumento en la actividad respiratoria del tejido.

A

medida

que se

produce

la diferenciación, los

preadipocitos

progresivamente pierden su capacidad de división, pero el tejido sigue creciendo gracias a la presencia de células mesenquimatosas perivasculares con actividad proliferativa. Al final del proceso, el tejido presenta una inervación simpática plenamente funcional (Néchad, 1986). Después de esta fase formativa, el tejido adiposo marrón se desarrolla aumentando su peso húmedo y contenido proteico. La masa mitocondrial del tejido continua creciendo así como la concentración de los componentes de la cadena respiratoria. Todos estos cambios mitocondriales dan lugar a un aumento en la capacidad termogénica del tejido. Así, el nivel de desarrollo mitocondrial y funcional del tejido adiposo marrón alcanza su máximo al final de esta fase. De hecho, la reestímulación del tejido por el frío o la dieta, tras la fase de involución que se produce en la etapa adulta, produce un nuevo aumento de los parámetros mitocondriales que habían declinado, alcanzándose el mismo nivel máximo observado en el periodo postnatal (Nicholís y Locke, 1984). Además de los cambios mitocondriales, la exposición crónica al frío o la sobrealimentación inducen en el tejido adiposo marrón un aumento en la capacidad proliferativa de sus células (Skala, 1984).

2.2.2 Función termogénica del tejido adiposo marrón

El adipocito marrón constituye la unidad funcional del tejido adiposo marrón y en sus mitocondrias radica el mecanismo molecular de la 27

“

termogénesis sin

tiriteo”. Dichas mitocondrias presentan unas características bioenergéticas particulares que las diferencian de las mitocondrias del resto de los tejidos. Estas características viene dadas por la presencia de una proteína de peso molecular 32 KD localizada en la membrana interna mitocondrial merced a la cual se produce un desacoplamiento de la fosforilación oxidativa y la cadena de transporte electrónico, liberándose la energía procedente del gradiente electroquímico de protones en forma de calor, en lugar de sintetizarse ATE’ (Nicholís y Locke, 1984>. El efector fisiológico de la termogénesis del tejido adiposo marrón es la noradrenalina que se libera en las terminales nerviosas simpáticas que inervan el tejido. De esta manera se activa el enzima triglicérido lipasa sensible a hormonas liberándose los ácidos grasos que actúan como sustratos activadores de la proteína desacoplante, dando lugar a la disipación de energía en forma de calor (Nicholís y Locke, 1984>. La termogénesis del tejido adiposo marrón es especialmente importante durante el periodo perinatal debido a la necesidad del recién nacido de hacer frente a una temperatura ambiente inferior a la del útero materno. De esta manera, en los últimos años se han realizado estudios interesantes de la regulación de la expresión genética de la proteína desacoplante en el periodo perinatal de la rata tanto “in vivo” como “in vitro”. Se han realizado estudios “in vivo” detectándose niveles significativos del mRNA de la proteína desacoplante en fetos de rata de 19 días de gestación (Ciralt y col., 1990>. Asimismo, estos autores han descrito un aumento en la expresión de la proteína desacoplante con respecto a los niveles fetales durante las primeras horas de vida postnatal cuando los neonatos eran mantenidos a la temperatura de 210C, mientras que en neonatos mantenidos a 370C los niveles del mensajero de la proteína desacoplante experimentaban un descenso gradual en las primeras 12 horas de vida postnatal. La cantidad de proteína desacoplante en el tejido adiposo marrón experimente un aumento progresivo a partir del día 21 de gestación alcanzando niveles máximos en ratas lactantes de 10 días de vida postnatal (Porras y col., 1990a). Estos resultados se correlacionan con el aumento de los niveles del mRNA de esta proteína en el desarrollo postnatal de la rata . Sin embargo, 28

mientras que estos autores detectan un descenso en los niveles de mensajero en neonatos de 20 días, Porras y col. (1990a> continúan detectando altos niveles de proteína en este momento del desarrollo. El cultivo primario de adipocitos marrones fetales de rata es un sistema que permite el estudio de la regulación de la expresión genética de proteínas por factores que actúan de manera individual o sinergística (Porras y col., 1990b>. En cultivos quiescentes de adipocitos marrones de fetos de rata de 22 días de gestación la proteína desacoplante se induce en presencia de isoproterenol (lAagonista> y las combinaciones de noradrenalina (cx-¡A-agonista> y yohimbina (a2antagonista> así como isoproterenol y T3. Por tanto, se puede decir que en estas condiciones experimentales la expresión genética de la proteína desacoplante se encuentra modulada por agentes adrenérgicos y T~ (Porras y col., 1989>. 2.2.3 Función lipogénica del tejido adiposo marrón El tejido adiposo marrón es cuantitativamente junto con el hígado el principal tejido lipogénico durante el periodo perinatal . Tras el nacimiento se inhibe drásticamente la capacidad lipogénica del tejido adiposo marrón (Pillay y Bailey, 1982a; Benito y col., 1984>. Dicha inhibición se corresponde con un aumento previsible de la capacidad termogénica del tejido. Este hecho se explica teniendo en cuenta que el elevado contenido en grasa de la leche y la elevada actividad lipoprotein lipasa del tejido en el periodo de lactancia, son los responsables del aporte de ácidos grasos como sustratos oxidables en la mitocondria para la producción de calor por parte de este tejido (Pillay y Bailey, 29

1982b>. Dicha inhibición se revierte en el momento del destete, cuando los animales comienzan a alimentarse con una dieta sólida fundamentalmente hidrocarbonada y la lipogénesis vuelve a alcanzar los niveles existentes en el momento del nacimiento (Pillay y Bailey, 1982a, 1982b>. De esta manera, las actividades enzimáticas lipogénicas ácido graso sintasa y enzima málica revelan este perfil de desarrollo perinatal (Martínez Valverde, 1988>. La lipogénesis del tejido adiposo marrón durante el periodo perinatal se muestra muy sensible a insulina. Esta hormona activa rápidamente las enzimas lipogénicas estimulando la síntesis lipídica del tejido adiposo marrón (Pillay y Bailey, 1983>. El feto presenta unos altos niveles de insulina circulantes frente a niveles crecientes, pero aun bajos de glucagón (Lorenzo y col., 1982; Pillay y Bailey, 1983>. Tras el nacimiento la razón insulina/glucagóñ cae drásticamente al igual que la lipogénesis del tejido adiposo marrón . Estos resultados concuerdan con la estimulación adrenérgica de la termogénesis en el momento del nacimiento. El papel de las hormonas tiroideas en la regulación de la síntesis lipídica del tejido adiposo marrón no es del todo conocido. Sin embargo, Hahn y Hasanali (1982> han apuntado que la administración precoz de hormonas tiroideas induce las enzimas lipogénicas de este tejido antes del destete. Estos autores sugieren que las hormonas tiroideas no actuarían directamente sobre el tejido sino que podrían aumentar el número de receptores de insulina o bien actuar directamente sobre el transporte de glucosa al tejido. La regulación hormonal de la síntesis lipídica fetal del tejido adiposo marrón se ha estudiado “in vitro” en un sistema de cultivo primario de adipocitos marrones de fetos de rata de 22 días de gestación . En estas 30

condiciones, la insulina a concentraciones comprendidas entre 0.4 y 40 nM incrementa el flujo lipogénico tanto a corto (5 horas > como a largo plazo (24 horas>. Estos efectos son mucho mayores que los observados en células aisladas tratadas con la hormona durante una hora (Roncero y col., 1987), lo que parece indicar que a lo largo del cultivo se reparan los receptores de insulina que han sido dañados en el proceso de aislamiento de la células. Asimismo, esta hormona activa las enzimas lipogénicas acetil-CoA-carboxilasa a corto plazo y ácido graso sintasa y enzima mélica a largo plazo . El tratamiento del cultivo con glucagón no modifica el flujo lipogénico del tejido adiposo marrón con lo cual esta hormona no parece estar implicada en la regulación de la síntesis lipídica de este tejido. Estos resultados concuerdan con los descritos por Roncero y col. . La dexametasona inhibe un 50% el flujo lipogénico en cultivos primarios de adipocitos marrones fetales de rata. Sin embargo, en presencia de insulina no se ha observado este efecto inhibitorio. Estos resultados concuerdan con los descritos “in vivo” por Roncero y col. (1987>. Asimismo, se ha sugerido que la dexametesona podría inhibir la utilización de glucosa por tejidos extra-hepáticos (Benito y col., 1982>. De esta manera, la insulina podría incrementar el transporte de glucosa en cultivos primarios de adipocitos marrones fetales de rata, revirtiendo el efecto inhibitorio de la dexametasona en su ausencia (Lorenzo y col., 1988>. Por último, la presencia de progesterona incrementa la lipogénesis del cultivo un 10%, así como un 18% cuando actúa conjuntamente con la insulina. Estos efectos son menores que los observados “in vivo” . La proteína activa se sintetiza mediante la traducción de su correspondiente mRNA de 2.300 pares de bases . Sin embargo, ahora nos ocuparemos de la regulación hormonal “in vitro” de la expresión genética de esta proteína. En cultivos primarios de hepatocitos de rata adulta la actividad G6PD se induce en presencia de insulina

.

Este aumento en actividad es paralelo a un aumento en

la velocidad de síntesis de la proteína ,así como en la cantidad de mRNA detectada mediante hibridación su cDNA correspondiente en presencia de la hormona

.

Sin

embargo, la presencia de dexametasona en el cultivo aunque aumenta significativamente los niveles de mRNA, no modifica los valores de actividad enzimática específica y velocidad de síntesis. Estos resultados se han explicado como consecuencia de una menor eficiencia traduccional del mRNA inducido en presencia de dexametasona (Fritz y col., 1986>. La presencia conjunta de ambas hormonas en el medio de cultivo produce aumentos en la actividad, cantidad de proteína y niveles de mRNA mayores que los observados en presencia de insulina sola. De esta manera parece que la insulina no solo actúa incrementando los niveles del mRNA del enzima, sino que también actúa a nivel de traducción, ya que el mRNA inducido en presencia de dexametasona solo se traduce a proteína activa estando presentes ambas hormonas ( Fritz y col., 1986>. El papel de las hormonas tiroideas en la regulación de la expresión genética de la G6PD se ha estudiado “in vivo” y en cultivos primarios de hepatocitos de rata adulta. Se ha descrito un aumento de dos veces en los niveles del mRNA de la GGPD determinados mediante un sistema de traducción “in vitro” tras la administración de T3 a ratas eutiroideas, así como en animales hipertiroideos, que se correlacionan perfectamente con cambios paralelos en la velocidad de síntesis 33

del enzima (Miksicek y Tovvle, 1982>. Estos resultados indicarían una regulación pre-traduccional de la C6PD por T3 como consecuencia de los aumentos descritos en los niveles del mRNA en respuesta a la hormona. Otros autores indican que la administración de T3 a ratas hipotiroideas no produce aumentos significativos en los

niveles

del

mRNA

detectados

mediante

hibridación

con el

cDNA

correspondiente. Sin embargo, en este caso se observa un incremento significativo en la actividad enzimática . Sin embargo, estos estudios se han realizado midiendo los niveles del mRNA en un sistema de traducción “in vitro” y no mediante hibridación con sondas específicas. 2.2.3.2 Regulación de la expresión genética de la enzima mélica La enzima mélica es otra enzima generadora de NADPH que contribuye a mantener activo el flujo lipogénico. Se trata de un homotetrámero cuyas subunidades tienen un peso molecular de 62.000 D que individualmente carecen de actividad biológica. Esta proteína se sintetiza como resultado de la traducción de dos mRNAs de 4.5 y 2.7 Kb respectivamente que son transcritos de un único gen con mas de un lugar de poliadenilación . La dehidroepiandrosterona está implicada en procesos hipolipidémicos en la rata mediante la inhibición de la actividad ácido graso sintasa hepática y disminución de la concentración de triglicéridos en suero. Por tanto, el significado metabólico de la inducción de la enzima málica por esta molécula es desconocido. Se ha sugerido que el NADPH originado por la activación del enzima en presencia de dehidroepiandrosterona estaría implicado en otros procesos metabólicos que requieren poder reductor y no en la ruta lipogénica . En cultivos primarios de adipocitos marrones fetales de rata se ha estudiado la regulación hormonal de la expresión de la enzima málica a nivel de proteína. En células cultivadas durante 42 horas en presencia de la hormona la insulina incrementa tanto la actividad enzimática específica como la cantidad de proteína citosólica. Estos parámetros no se modifican al añadir conjuntamente T3 al medio de cultivo. Además, la noradrenalina produce una reversión total del efecto inductivo de la insulina sobre la expresión de la enzima málica. Mientras que el efecto inductivo de la insulina se explica como resultado de un aumento en la velocidad de síntesis de la proteína, la noradrenalina acelera la velocidad de 36

degradación de la enzima málica inducida en presencia de insulina (Lorenzo y col.,

1989).

37

¡It-MATERIAL Y METODOS

3.1 Animales de experimentación

Para los cultivos celulares se han utilizado fetos de 22 días de gestación de ratas de la raza Wistar administradas por el animalario del Instituto de Bioquímica de la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense. En la purificación enzimática se emplearon ratas machos de la raza Wistar de pesos comprendidos entre 200 y 300 g que habían sido previamente ayunadas durante 48 horas y posteriormente realimentadas otras 48 horas con una dieta sólida de laboratorio fundamentalmente hidrocarbonada. 3.2 Medios instrumentales Las pesadas se realizaron en balanzas modelo Sartorius 1405 (Sartorius Werke CMBH, Alemania) y modelo ER-120A (A y B Co, Tokyo). Para las determinaciones de pH se utilizó un pHímetro tipo Crison D-501 (Crison, España). Las centrifugaciones han sido realizadas en una microcentrífuga Eppendorf modelo 5414 (Eppendorf, Alemania), en una centrífuga de mesa modelo GLC-1 (Sorvalí, Dupont lnst. U.S.A.> y en una centrífuga Kontron modelo Centrikon H-401 . Las ultracentrifugaciones se han realizado en una ultracentrifuga Kontron modelo Centrikon T-2080 (Kontron, Suiza>. Las centrifugaciones a vacio se realizaron en una centrífuga Speed-Vac Concentrator modelo RH40-1 1 de la firma Savant lnst. . Las medidas espectrofotómétricas se realizaron en un espectrofotómetro Schimazdu modelo UV-60 . Para la agitación de los tubos se empleó un agitador Heidolph, modelo REAX 200 (Selecta, España> y para las distintas soluciones un agitador magnético (Selecta, España>. Las incubaciones se realizaron en un baño Grant (Grant lnst., Inglaterra> dotado con sistema de agitación lineal. El manejo de las muestras para el cultivo de células se realizó en una campana de flujo laminar vertical Assab, modelo V4 (Assab, Suecia). El mantenimiento de los cultivos se realizó en un incubador termostatizado con gaseo de CO2 de la firma Assab

,

modelo T-304 GF .

Las células se incubaron en placas de 6 cm de diámetro procedentes de la firma Costar . El microscopio de luz directa era de la firma Will y el microscopio de luz invertida era de la firma Nikon, (Japon>. El manejo de las muestras y productos líquidos se realizó con pipetas automáticas Gilson . Las electroforesis de proteínas se han realizado con un equipo Mini Protean II de 39

los laboratorios Bio-Rad, (Richmond, U.S.A>. Todos los reactivos utilizados en los experimentos de inmunoelectroforesis así como la cubeta de transferencia, modelo Trans-Blot Celí y la membrana de nitrocelulosa fueron suministrados por Bio-Rad. Las electroforesis de ácidos nucleicos se han realizado en cubetas de la firma BioRad y E-C Aparatus Corporation (Florida, U.S.A). Asimismo, la fuente de alimentación utilizada en el desarrollo de las electroforesis fue el modelo 200/2.0 de la firma Bio-Rad. Las medidas densitométricas se realizaron en un densitómetro de la firma E-C Aparatus Corporation (Florida, U SA). Para la purificación enzimática se utilizó un equipo completo de purificación compuesto por columnas de vidrio, colector de fracciones modelo r-ioo y la bomba peristáltica modelo P-1 de la firma Pharmacia (Suecia). La concentración de las enzimas purificadas se realizó con un sistema de ultrafiltración de la firma Sartorius (Sartorius Werke GMBH, Alemania). Los estudios de citometria de flujo se realizaron en un citómetro de la firma Reckton-Dickinson (U.S.A) Las fotografías se realizaron en un equipo Polaroid modelo MP 4-LAND dotado de transiluminador con películas fotográficas modelo 667 de la misma firma. Las películas utilizadas en autorradiografia eran de la casa Kodak modelo Omat X-AR. 3.3 Productos Los tampones, soluciones salinas y reactivos en general se han preparado con productos de las casas Sigma Chemical CO (U.S.A> y Merk (Alemania>. Los sustratos, enzimas y coenzimas empleados han sido suministrados por la firma Boéhringer Manheim (Alemania>. El Medio Esencial Mínimo (MEM>, las soluciones salinas de lavado y recogida de células, el bicarbonato sódico estéril, la glutamina y el suero fetal de ternera fueron suministrados por Flow (U.S.A>. La albúmina bovina libre en ácidos grasos fue suministrada por Sigma Chemical 40

CO (U.S.A>. La penicilina O y la estreptomicina eran de Sigma Chemical CO (U.S.A>. La gentamicina fue cedida por Antibióticos 5.4 . La insulina. noradrenalina y T3 eran de la casa Sigma Chemical CO (U.S.A>. El factor de crecimiento epidérmico, la bombesina, la vasopresina, la forscolina el IBMX y el dibutirato de forbol procedían de Sigma Chemical CO (U.S.A). El PDGF procedía de Colloaborative Res., Inc. (Bedford, U.S.A>. El IGF-l fue suministrado por Amgen Biologicais (Thousand Oaks, U.S.A>. t agarosa eran de la casa El Sephacryl 0-200, la Q-Sepharosa y la NADP Pharmacia (Suecia). Todos los productos utilizados en la preparación de geles de agarosa y poliacrilamida proceden de los laboratorios Bio-Rad . Los patrones de proteínas utilizados en las electroforesis de poliacrilamida eran también de Bio-Rad. Los marcadores de peso molecular de DNA fueron suministrados por Boéhringer Manheim (Alemania>. Los productos utilizados en los estudios de citometría de flujo eran de la firma Beckton-Dickinson (U.S.A). La solución de extracción de RNA era de la firma Cinna/Biotex Lab. lnt. (Texas, U.S.A). El formaldehido empleado en los geles de agarosa era de la firma Fluka (Suiza) y la formamida de la firma Clontech Lab. Inc. . El reactivo de determinación de proteínas fué suministrado por Bio-Rad así como el patrón de -globulina. Los isótopos empleados 3H-Timidina y 3%x-P dCTP

proceden de Amersham

Internacional. Como líquido de centelleo se empleó el Cocktail-22-Normascint de la firma Sharlau Ferosa (España>. 3.4 Condiciones del animalario y control de la edad gestacional Los animales, ubicados en una habitación cerrada, sin ventanas y dotada de aire 41

acondicionado y de estufas, se mantenían a un ritmo de luz-oscuridad de 12 h-12 h, con la fase de oscuridad entre las 20 h y las 8 h, humedad de 45-55%, temperatura de 22±20C y alimentación y bebida “ad libitum”. La edad gestacional se controló limitándose a una noche el tiempo de cohabitación de ratas virgenes con machos de conocida fertilidad, apartándose las que presentaban espermatozoides en el frotis vaginal realizado a la mañana siguiente al posible coito, considerándose como día primero de la gestación. El 80% de las ratas gestantes así obtenidas, cuando se les permitía llegar al parto, lo hacían entre las 14-16 h del día 22 de gestación. 3.5 Obtención del tejido adiposo marron Las ratas gestantes de 22 días fueron sacrificadas por dislocación cervical a primera hora del día 22 de gestación extrayéndose los fetos por cesárea. A continuación, se cortaba el cordón umbilical y posteriormente se sacrificaban por decapitación para extraer el tejido adiposo marrón interescapular con unas pinzas curvas estériles en cabina de flujo laminar. 3.6 Cultivo primario de adipocitos marrones fetales de rata El desarrollo de los métodos de cultivo de adipocitos marrones ha sido tardío, las primeras referencias en la literatura han aparecido en 1983 tanto para adipocitos marrones procedentes de ratas adultas (Néchad, 1983, Néchad y col., 1983> como de fetos de rata . Las medidas se realizaban a 370C de temperatura y 340 nm de longitud de onda, en cubetas de plástico de 1 ml de capacidad y 1 cm de paso de luz. La mezcla de reacción contenía MnCI

2 1 mM,

NADP~ 0.25 M, Tris/CIH 0.1 M pH 7.4 y la muestra en un volumen final de 1 ml. La reacción se iniciaba añadiendo malato 1.5 mM a la cubeta y se leía frente a un blanco donde el malato era omitido 3.7.2 Determinación de la actividad G6PD Las muestras de células se preparaban tal como se ha descrito para la enzima mélica. La actividad GSPD se ha determinado espectrofotométricamente según el 0C método descrito por Sapag-Hagar y col. . Las medidas se realizaban a 37 y 340 nm de longitud de onda en cubetas de plástico de 1 ml de capacidad y 1 cm de paso de luz. La mezcla de reacción contenía CI

2Mg 5 mM, NADP+ 0.25 mM,

46

6-fosfogluconato deshidrogenasa 0.3 U y Tris/CIH 50 mM pH 7.5 y la muestra en un volumen final de 1 ml. La reacción se iniciaba añadiendo glucosa 6-fosfato a la cubeta y se leía frente a un blanco donde esta última era omitida. De esta manera se determinaban conjuntamente las actividades G6PD y 6-fosfogluconato deshidrogenasa que había sido añadida en exceso a las cubetas, siendo la actividad G6PD la mitad del valor obtenido por este procedimiento, puesto que un 50% del NADPH originado por reducción del NADP~ corresponde a la primera reacción de la ruta de las pentosas fosfato y el otro 50% a la segunda. 3.7.3 Determinación de proteínas Las proteínas se determinaron según el método de Bradford (1976).

Los

reactivos utilizados fueron: -

yglobulina 1.4 mg/ml

-reactivo Bradford (Bio-Rad) Se construía una curva patrón de proteínas con cantidades crecientes de y-globulina comprendidas entre 1.52 y 15.2 ¡tg de proteína, completándose con agua hasta 800 ~ añadiendo posteriormente 200 ¡tI de reactivo. Las muestras se preparaban con reactivo y agua de manera análoga. A continuación se dejaban transcurrir 5 minutos y se leían en el espectrofotómetro a 595 nm y temperatura ambiente obteniéndose los valores correspondientes a las absorbancias. Finalmente se construía una gráfica patrón donde se representaban en ordenadas las absorbancias y en abcisas los pg de proteína. Las absorbancias correspondientes a las muestras eran interpoladas y así se obtenían los mg de proteína de las mismas. 3.7.4 Expresión de reultados y tratamiento estadístico de los mismos Las actividades enzimáticas específicas se expresaron en todos los casos como nanomoles de sustrato consumido, o producto aparecido, por minuto y por mg de proteína, a la temperatura de la reacción y han sido calculadas por la siguiente fórmula: 47

Vx INDO lO3xexdxvxc

mU

n moles minxmgprot

mgprot

donde volumen final de la cubeta en ml INDO — variaciones de la densidad óptica por minuto e

coeficiente de extinción molar

d

espesor de la cubeta

concentración de proteínas en la muestra El coeficiente de extinción molar para el NADPH a 340 nm es 6.22 x 106 cm2

mo[1. Para la G6PD y la enzima málica se define una miliunidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que forma un nanomol de NADPH por minuto a 370C. Las tablas de actividades enzimáticas específicas se han elaborado utilizando los valores medios

± los

errores estandard de las medias

± (S.E.M>.

Asimismo, se ha

realizado el análisis de significatividad de la “t de Student”. 3.8 Purificación de la enzima mélica y G6PD La enzima málica y la O6PD se purificaron a partir de hígado de ratas adultas que tras un periodo de ayuno de 48 horas, se realimentaron otras 48 horas con una dieta de laboratorio rica en hidratos de carbono. En cada purificación se partía de 60-100 g de tejido hepático que se homogenizaron en 2 volúmenes de tampón que contenía EDTA 1 mM

,

DTT 1 mM, sacarosa 0.25M y Tris /HCI 25 mM pH 7.5. A

continuación, el homogenado se sometía a ultracentrifugación a 105.000 x g durante 1 hora a 40C con objeto de aislar la fracción citosólica del tejido. Precipitación fraccionada con sulfato de amonio

48

El primer paso de la purificación consistía en una precipitación fraccionada con sulfato de amonio. La sal se añadía lentamente al sobrenadante previamente obtenido hasta alcanzar una saturación del 30%. Seguidamente se agitaba durante 30 minutos en hielo y se centrifugaba a 27.000 x g durante 30 minutos a 40C. El sobrenadante obtenido se volvía a precipitar hasta alcanzar el 50% de saturación y se agitaba y centrifugaba como antes. El precipitado resultante < precipitado 3050% de saturación> contenía la G6PD activa y se guardó a -200C. Por último, el sobrenadante resultante se llevó al 80% de saturación. Después de agitar y centrifugar se obtuvo un precipitado . y se dializaba en 2 x 1 litros del mismo tampón durante 18 horas. Después de centrifugar a 27.000 x g durante 30 minutos a 4W, la preparación dializada se aplicaba a una columna de Sephacryl G-200 que había sido previamente equilibrada con Tampón 2 a la velocidad de flujo de 1 ml/minuto. Las fracciones con actividad G6PD se reunían y concentraban mediante la adición de sulfato amónico al 55% de saturación. El precipitado obtenido mediante centrifugación se disolvió y dializó en tampón 2 como antes. Cromatografía de intercambio iónico El sobrenadante obtenido después de centrifugar el dializado a 27.000 x g durante 30 minutos a 4W se aplicó a una columna de Q-Sepharosa, previamente equilibrada con tampón fosfato potásico 0.02M pH 7 que contenía 2 mM 2mercaptoetanol. En estas condiciones la enzima permaneció unida a la columna y se eluyó con un gradiente lineal de tampón fosfato potásico 0.02-0.4M.

Cromatografía de afinidad Las fracciones que se habían seleccionado del paso anterior por poseer mayor relación actividad G6PD/absorbancia a 280 nm se añadían a una columna-de 5 ml de NADPt agarosa equilibrada con tampón 2 al que se añadía 5% de glicerol y EDTA 5 mM. La velocidad de flujo fue en todo momento de 12 ml/hora. Un pico inactivo de proteínas se eluyó con el tampón de equilibrio hasta que la absorbancia a 280 nm de las fracciones fue menor que 0.02. La enzima unida a la columna se eluyó con un gradiente lineal de 0-0.05 mM de NADP~ en tampón de equilibrio. Por último, las muestras seleccionadas por su mayor actividad se ¡untaron y concentraron por ultrafiltración para finalmente obtener la G6PD purificada que se alicuoteaba y conservaba a -20W. En la figura 2 se muestran las distintas etapas de la purificación de la G6PD en un gel de poliacrilamida-SDS. En el carril 6 aparece 51

la banda de 58 KD correspondiente a la G6PD purificada de hígado de rata. El proceso global de purificación queda resumido en la tabla 2. 3.9 Electroforesis en geles de poliacrilamida

La visualización del proceso de purificación se ha realizado mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes en presencia de SDS (Maizel, 1971). Los geles se montaban entre cristales de 7-10 cm con espaciadores de 0.75 mm de sección. El gel concentradorse preparaba con acrilamida al 5% y bisacrilamida al 0.13% en tampón Tris/CIH 50 mM pH 6.7, SDS 0.1%, Urea 4M, persulfato amónico 0.01 %(p/v> y TEMED 0.243%



SDS 1 % 2 mM 2-mercaptoetanol urea 4M Posteriormente se hirvieron a 100W durante 5 minutos y se cargaron en el gel. Generalmente se utilizaban 10-80 pg de proteína por muestra. El tampón utilizado en el desarrollo de la electroforesis tenía la siguiente composición Tris/CIH 0.025M pH 8.3 glicina 0.192M SDS 0.1% (p/v) Las electroforesis se realizaron utilizándose una fuente de alimentación de BioRad, aplicándose primero 125 voltios para permitir la entrada de las muestras y a los 20 minutos se aplicaban 100 voltios durante 45-60 minutos. La electroforesis 52

TABLA 2 Purificación de la glucosa 6—fosfato deshidrocsenasa La G6PD se ha purificado como se describe en la sección de Material y Métodos. En la tabla queda resumido el proceso global de purificación -

Nl por placa. Este reactivo era una mezcla de tiocianato de guanidina, fenol y 2-mercaptoetanol. El RNA se solubilizaba en el medio con una pipeta con punta de plástico estéril y se pasaba a tubos eppendorf estériles (imí/tubo> que se mantenían constantemente en hielo. A continuación se añadía 0.1 ml de cloroformo < cloroformo: alcohol isoamílico, 24:1> por cada tubo eppendorf, se agitaban las muestras durante 30 segundos y se mantenían en hielo durante otros 15 minutos. Entonces, se centrifugaban los tubos a 12.000 x g durante 15 minutos a 4W visualizándose dos fases en cada tubo. La fase inferior fenol-cloroformo contenía el DNA mientras que el RNA se encontraba en la fase superior acuosa. Asimismo, se apreciaba una interfase opaca que contenía la fracción proteica. La fase superior, donde se encontraba el RNA, se separaba y se pasaba a otro tubo donde isopropilico

se precipitaba con un volumen igual de alcohol

durante 30 minutos a -20W. Transcurrido este tiempo, se

centrifugaban las muestras a 12.000 x g durante 15 minutos a 4W observándose un precipitado blanco de RNA en el fondo del tubo. El precipitado de RNA se lavaba retirando el sobrenadante de los tubos y añadiendo 1 ml de alcohol etílico 64

al 75%

y Tris/HCI 50 mM pH 7.5 estéril. Una vez cargada la muestra en la columna, esta se centrifugaba a 3.200 rpm durante 4 minutos. La muestra eluida contenía los cONAs marcados quedando retenida en ,

la columna la radiactividad no incorporada. Finalmente, una alícuota del eluido se contaba en el contador de centelleo. 3.26 Prehibridación e hibridación de los filtros de nitrocelulosa Los filtros de nitrocelulosa que contenían los RNAs transferidos se introducían cada uno en una bolsa de plástico a la que se añadían 0.1 ml/cm2 de solución de prehibridación que contenía: solución Denhardt’s 2x, tampón SSC 5x, SDS 0.1 % , formamida deshionizada 50%

,

DNA de esperma de salmón 100 ¡tg/ml

y Na

3PO4 50 mM pH 6.5. La solución Denhardt’s se preparaba a partir de una

solución 50 veces concentrada que contenía 0.5 g de Ficolí, 0.5 g de polivinilpirrolidona, 0.5 g de albúmina bovina sérica completándose con agua estéril hasta 50 ml. A continuación se filtraba y se conservaba a -20W. Una vez introducida la solución en la bolsa de plástico, esta se sellaba con una selladora eléctrica y a su vez se introducía en una segunda bolsa de plástico que también quedaba completamente sellada. A continuación se introducía en un baño de agua a 42W durante 4-6 horas. Una vez concluido el periodo de prehibridación se abrían las bolsas retirándose la solución de prehibridación y se volvía añadir un volumen igual de la misma 6 DPM/ml de cDNA marcado por el solución fresca adicionada de 2x10 procedimiento previamente descrito. Este cDNA marcado se había tratado

67

previamente durante 10

minutos a 95-100W con objeto de producir la

desnaturalización. Las bolsas se volvían a sellar y se llevaban al baño a 420C durante 40 horas. Transcurrido este tiempo se abrían las bolsas y se eliminaba el liquido radiactivo. Entonces, el filtro de sometía a 3 lavados consecutivos de 5 minutos cada uno a temperatura ambiente con una solución que contenía SSC 2x y SDS al 0.1% (p/v>. A continuación se realizaban 2 lavados consecutivos de 30 minutos cada uno a 420C con una solución que contenía SSC O.lx

y SDS al

0.1% (p/v>. Después el filtro se colocaba entre dos láminas de plástico fino para ser expuesto sobre un film de rayos X de la marca Kodak X-AR Omat a -70W. 3.27 Revelado de las autorradiografías

El primer revelado de las autorradiografías se realizaba transcurridas 12 horas de exposición. El film se trataba durante 3 minutos con solución reveladora. A continuación se sumergía 15 segundos en agua y finalmente se trataba durante 5 minutos con solución fijadora. En el caso de observar una señal muy tenue los filtros se volvían a exponer por periodos de 2, 4 y 6 días para ser posteriormente revelados. 3.28 Rehibridación de los filtros de nitrocelulosa

Una vez realizada la hibridación y el revelado de un filtro de nitrocelulosa, dicho filtro podía volver a hibridarse con otro cDNA diferente eliminando previamente la marca radiactiva existente en el filtro. Para ello, se preparaba una solución que contenía EDIA 2 mM, pirofosfato 0.5% por ser un conocido mitógeno de células mesenquimáticas, el factor de crecimiento epidérmico (EGF> ya que ciertas células fetales como los hepatocitos proliferan en presencia de este factor, y el factor de crecimiento insulFnico tipo 1 (IGF-l> dado que el tejido adiposo marrón se muestra muy sensible a insulina, particularmenteen la etapa fetal. Asimismo, combinamosestos factores individuales con otros mitógenos conocidos en muchos sistemas o lineas celulares tales como bombesina, vasopresina o ésteres de forbol y agentes que elevan los niveles de cAMP intracelulares como forscolina e IBMX con objeto de potenciar la estimulación de la proliferación que podrían producir los factores de crecimiento individuales. La incorporación de 3H-Timidina en adipocitos marrones cultivados durante 64 horas en presencia de diversos mitógenos se muestra en la Tabla 3. Dicha incorporación se ha determinado en las 4 últimas horas de cultivo. Como se observa en la tabla 3 la presencia en el medio de cultivo del 10% de suero fetal bovino durante 64 horas incrementó 3 veces la incorporación de3H-Timidina con respecto a las células controles quiescentes cultivadas durante este mismo tiempo en medio de cultivo libre en suero. A continuación, se estimularon las células con factores de crecimiento individuales de los cuales solo el IGF-l superó los valores de incorporación obtenidos en presencia del 10% de suero fetal. Asimismo, se alcanzaron, aunque no se superaron, los valores de incorporación obtenidos en presencia del 10% de suero fetal al cultivar las células durante 64 horas con EGF . Otros factores individuales ensayados fueron bombesina (6 nM), vasopresina (18 nM> y PDGF ( 5 unid max/2/ml). Sin embargo, en presencia de estos factores individuales la incorporación de3H-Timidina fue significativamente menor que la obtenida 71

TABLA 3 Incorporación de ~H—Timidina en adipocitos marrones fetales en cultivo en resvuesta a factores de proliferación

Los adipocitos marrones quiescentes se cultivaron durante 64 horas en presencia de diversos factores de crecimiento. La incorporación de 3H—Timidina se midió en las 4 últimas horas de cultivo. Los resultados son las medias ± SEM (n=l0—l5) y se expresaron en porcentaje con respecto a las células controles

quiescentes

Factores de crecimiento

100 EGE (3.3 nM)

PDGF

EGF

TGF-T

(5 U/ml/2)

(3.3nM)

(1.4nM)

199±24

286±25

240±24

360±42 339±24

Bombesina (6nM)

228±18

150±35

270±24

376±21

Vasopresina (lSnM)

246±19

226±12

320±27

311±20

Bonbesina+Vasopresina

278±12

211±13

400±28

324±12

Forscolina

. Sin embargo, en nuestro sistema celular no existían referencias sobre una posible relación entre la estimulación de la proliferación celular y la inducción de este enzima. En experimentos previos realizados en nuestro laboratorio observabamos un descenso gradual en la actividad G6PD al cultivar los adipocitos marrones fetales en condiciones de quiescencia experimental . Por tanto, ante la posibilidad de la existencia de un paralelismo entre proliferación e inducción de la G6PD, estudiamos el efecto de los factores de crecimiento que estimulaban significativamente la incorporación de 3H-Timidina sobre la actividad G6PD. Asimismo, ensayamos esta actividad enzimática en presencia de aquellas combinaciones que resultaron no mitogénicas para los adipocitos marrones fetales en cultivo. Para ello utilizamos las mismas condiciones experimentales de cultivo que describiamos en el apartado 4.1 .1 para la determinación de la incorporación de 3H-Timidina y otros parámetros celulares relacionados. 76

Paralelamente determinamos la actividad enzima málica, otro enzima generador de NADPH que participa en la ruta lipogénica, en las mismas condiciones experimentales

con objeto de probar si la relación proliferación-inducción enzimática era específica de la G6PD. Este estudio lo realizamos a 3 niveles: -

medida de la actividad enzimática espécifica de la G6PD en respuesta a los diversos

factores de crecimiento. - determinación de los cambios en la cantidad de proteína inmunorreactiva en respuesta

a estos factores mediante inmunoprecipitación con el anticuerpo especifico anti-G6PD. -

medida de los cambios en los niveles del mRNA de la G6PD al estimular las células

con las combinaciones de factores previamente seleccionadas. El efecto de los distintos factores de crecimiento sobre las actividades G6PD y enzima málica se muestra en la tabla 5. La actividad G6PD en adipocito~ marrones recién aislados era 61.9±1.5nmoles/min/mg de proteína. Sin embargo, al cultivar las células en un medio libre en suero se produjo una caída gradual de la actividad enzimática específica hasta alcanzar valores de 30.3±1 .3 tras 64 horas de cultivo. A continuación estudiamos el efecto de las combinaciones mitogénicas seleccionadas en los estudios anteriores sobre la actividad G6PD. Las condiciones de cultivo en estos experimentos se detallan en la sección de Material y Métodos. Así, al cultivar los adipocitos marrones fetales quiescentes durante 64 horas en presencia del 10% de suero fetal bovino se duplicó la actividad G6PD con respecto a la obtenida en las células controles quiescentes. Asimismo, tanto el IGF-l como la combinación de EGF, bombesina y vasopresina produjeron un efecto semejante sobre la actividad G6PD. Al ensayar en el medio de cultivo la combinación no mitogénica de EGF, bombesina, vasopresina y forscolina, no se observó la inducción de la actividad G6PD, manteniéndose esta en los niveles correspondientes a las células controles quiescentes. También la presencia de forscolina e IBMX revirtió el efecto estimulador del IGF-l sobre la actividad GGPD . Por otra parte, la inducción de la síntesis de DNA y la expresión genética de la G6PD observada en presencia de EGF, bombesina y vasopresina en el medio de cultivo resultan inhibidas por forskolina. De esta manera, estos resultados refuerzan el papel de la G6PD como donador de ribosas 5’-fosfato para la síntesis de ácidos nucleicos, mientras que la enzima mélica no se encuentra implicada en el crecimiento celular. 79

En resumen, los adipocitos marrones fetales en cultivo constituyen un sistema adecuado para la realización de estudios de proliferación celular. Tanto la síntesis de DNA como el número de células y contenido en DNA, RNA y proteínas se inducen en presencia del 10% de suero fetal bovino, IGF-l y la combinación de EGF, bombesina y vasopresina en comparación con las células controles quiescentes. En nuestro sistema celular, el IGF-l ha resultado ser el principal factor de crecimiento individual ya que el EGF requiere la presencia de los péptidos vasopresina y bombesina para ejercer el máximo efecto mitogénico. Estos factores de crecimiento inducen la expresión genética de la G6PD, enzima generadora de NADPH. que también participa en el aporte de ribosas fosfato para la síntesis de ácidos nucleicos en nuestras células proliferantes. Tanto la cantidad de proteína inmunorreactiva como los niveles del mRNA de la G6PD aumentan en respuesta al suero fetal, IGF-l y la combinación de EGE, bombesina y vasopresina. De esta manera, la G6PD puede ser un marcador de proliferación celular en adipocitos marrones fetales en cultivo. Sin embargo, la enzima málica, también implicada en la generación de NADPH, no parece regular la proliferación de los adipocitos marrones fetales en cultivo. Finalmente, los agentes que elevan los niveles de cAMP intracelulares han resultado ser en nuestro sistema inhibidores de la proliferación celular. En este sentido, la presencia de forscolina revierte el efecto estimulador de la combinación de EGF, bombesina y vasopresina sobre la síntesis de DNA, número de células, contenido global de DNA, RNA y proteínas, así como sobre la inducción de la G6PD.

80

4.2 Regulación hormonal de la exoresión genética de la enzima málica y la alucosa

6-fosfato deshidrogenasa en cultivos primarias de adipocitos marrones fetales de rata en condiciones no oroliferativas

La enzima mélica y la G6PD son dos enzimas que participan en la síntesis lipidica mediante el aporte de poder reductor en forma de NADPH. Debido a que en la etapa fetal el tejido adiposo marrón es el principal tejido lipogénico en la rata, realizando una síntesis “de novo” muy intensa a partir de sustratos nb lipídicos que recibe del compartimento materno, nos proponemos estudiar la regulación hormonal de la expresión genética de estas dos enzimas lipogénicas en nuestro sistema “in vitro” de cultivo primario de adipocitos marrones fetales en condiciones no proliferativas. La regulación hormonal de la expresión genética de la enzima mélica y la G6PD se ha estudiado cultivando los adipocitos marrones por periodos de 6 y 10 días en MEM suplementado con el 2% de suero fetal bovino como se indica en la sección de Material y Métodos. En estas condiciones las células se mantenían viables y quiescentes a lo largo del tiempo de cultivo. De esta manera hemos estudiado los efectos de la insulina, como hormona típicamente lipogénica, puesto que el tejido adiposo marrón se muestra muy sensible a esta hormona, particularmente durante la etapa fetal (Benito y col., 1984). Asimismo hemos estudiado el efecto de la T3 sobre el cultivo por estar implicada tanto en el metabolismo lipidico como en la termogénesis del tejido adiposo marrón . Como agente lipolítico, dado que el glucagón no ejerce efecto ni en adipocitos marrones aislados . De esta manera se podría decir que la G6PD no parece ser el donador principal de NADPH en adipocitos marrones, cuyo requerimiento aumenta progresivamente debido a la lipogénesis inducida por la insulina a lo largo del tiempo de cultivo. La presencia conjunta de insulina y T3 durante 6 días en el medio de cultivo aumenta ligeramente tanto los niveles del mRNA de la G6PD como la cantidad de proteína en comparación con los niveles observados en presencia de insulina sola (figuras 16, y 20, tabla 9>. Sin embargo, no se observan diferencias en la actividad enzimática específica (tablas 8 y 9>. Tras 10 días de cultivo en presencia de ambas hormonas la inducción del mRNA de la G6PD es significativamente mayor que la observada en presencia de insulina sola (figura 17, tabla 9>. Como hemos descrito anteriormente, la T3 no parece tener un efecto directo sobre la expresión genética 86

TABLA fi Efectos hormonales sobre la actividad específica de la G6PD en cultivos primarios de adipocitos marrones fetales de rata en condiciones no proliferativas Los adipocitos marrones se han cultivado en MEM suplementado con

el 2% de suero fetal bovino en presencia de insulina (40 nM) (10 gM) y noradrenalina (10 gM) como se indica en la tabla. La actividad enzimática específica se ha determinado tras 6 y 10 días de cultivo y se expresa en nmoles/min/mg de proteína. Los resultados obtenidos son las Medias ± S.E.M. (n= 8—10). La actividad G6P0 en células recién aisladas era 60.5 ± 1.9. ,

6

control

DIAS

10 DíAS

52.5 ± 2.7

61.8 ± 3.7

48.0 ±4.3

71.1 ± 1.7

Insulina

82.0 ±5.6

94.8 ± 3.2

Insul ina+T3

83.8 ± 7.1

118.0 ±7.5

Insulina+TQnoradrenalina

84.1

120.0 ±9.4

± 9.7

TABLA 9 Efectos hormonales sobre la actividad enzimática. cantidad de proteína y concentración del mRNA de la G6PD en cultivos primarios de adipocitos marrones fetales de rata en condiciones no proliferativas Los adipocitos marrones se han cultivado en las condiciones descritas

en la tabla 6. Los resultados de actividad enzimática específica (tabla 8) se expresan en número de veces con respecto de los controles. La cantidad de proteína y concentración de mLRNA se ha cuantificado mediante análisis densitométrico de las figuras 16, 17 y 20 expresándose los resultados en número de veces con respecto de los controles.

(proteína)

As

Días de cultivo Control

6

10

6

(mRNA)

10

6

10

1-o

1.0

1.0

1.0

1.0

0.9

1.1

0.7

0.8

0.8

Insulina

1.6

1.5

2.2

1.8

2.5

Insulina+T3

1.6

1.9

2.9

2.2

3.5

Insulina+T 1~ + noradrenalína

1.6

1.9

3.0

2.3

3.4

de la G6PD con lo cual, estos resultados podrían explicarse como resultado de la ,

estabilización por T3 de los niveles del mensajero inducidos por la insulina. Además hemos observado la aparición de un segundo mensajero de 3 Kb para la G6PD tras 10 días de cultivo (figura 17, panel 2>. probablemente una forma precursora del mensajero, con lo que se refuerza el papel estabilizador de la T3 sobre la expresión de la G6PD inducida en presencia de insulina. La noradrenalina (10 gM> presente en el medio de cultivo conjuntamente con insulina y T3 no modificó los niveles del mRNA de la G6PD, cantidad de proteína y actividad enzimática específica en comparación con las células cultivadas con insulina y T3 tanto a 6 como a 10 días de cultivo (figuras 16, 17 y 20, tablas 8 y 9). Estos resultados contrastan con los descritos anteriormente para la enzima málica pero concuerdan con los descritos para la G6PD en cultivos primarios de

hepatocitos de rata adulta donde la noradrenalina y el isoproterenol no modifican la inducción de la G6PD por insulina (Nakamura y col., 1982>. En resumen, nuestros resultados muestran una diferente regulación hormonal de la expresión genética de la enzima málica y la G6PD a 6 y 10 días de cultivo de adipocitos marrones fetales de rata en condiciones no proliferativas. La presencia prolongada de T~ en el medio de cultivo induce la expresión genética de la enzima málica a nivel transcripcional lo que parece indicar la presencia de elementos reguladores de respuesta a T3 en el gen de la enzima málica tal como se ha descrito recientemente en el hígado

.

Sin embargo, la G6PD del tejido

adiposo marrón no es un enzima inducible por T3 al igual que se ha descrito en el hígado (Nakamura y col., 1982, Yoshimoto y col., 1983a). La insulina aumenta la expresión genética de ambas enzimas a 6 y 10 días de cultivo a nivel transcripcional. La inducción es máxima sobre la enzima málica tras 10 días de cultivo. Sin embargo, el efecto inductivo de esta hormona sobre la G6PD es menor que sobre la enzima málica, no observándose diferencias entre la inducción a 6 y 10 días de cultivo. Esto parece indicar que es la enzima málica la principal enzima generadora de NADPH para la síntesis lipídica inducida por la continua presencia de insulina en el medio de cultivo, estando la G6PD implicada en otras funciones como el aporte de ribosas 5’fosfato para la síntesis de ácidos nucleicos y supervivencia celular. Asimismo, el efecto aditivo de insulina y T3 sobre la 87

inducción de la expresión genética de la enzima málica indica la existencia de distintos elementos reguladores de respuesta hormonal en el gen de esta enzima.

En las máximas condiciones de inducción, tras 10 días de cultivo, aparece una segunda isoforma del mensajero de la G6PD de mayor tamaño Ip que refuerza el papel estabilizador de la T2 sobre la expresión genética del enzima. La noradrenalina revierte el efecto estimulador de la insulina y T3 tanto sobre la actividad enzima málica como sobre la cantidad de proteína

,

no modificando los niveles del

mensajero de esta enzima tras 6 días de cultivo. Estos resultados indican un efecto de la noradrenalina a nivel postraduccional, acelerando la degradación de la proteína enzima málica (Lorenzo y col., 1989> Sin embargo, tras 10 días de cultivo la enzima málica pierde su respuesta adrenérgica en cultivo primario de adipocitos marrones fetales de rata. Finalmente, la expresión de la enzima G6PD no está regulada por la presencia de noradrenalina en el medio de cultivo.

88

y-CONCLUSIONES

1- Los adipocitos marrones fetales en cultivo constituyen un sistema adecuado para la realización de estudios de proliferación celular. Tanto la síntesis de DNA, como el número de células y contenido en DNA, RNA y proteínas se inducen en presencia del 10% de suero fetal bovino, IGF-l y de la combinación de EGF, bombesina y vasopresina en comparación con las células controles quiescentes.

2- El IGF-l ha resultado ser el principal factor de crecimiento individual en nuestro sistema celular, ya que el EGF requiere la presencia de los péptidos vasopresina y bombesina para ejercer el máximo efecto mitogénico.

3-Tanto el IGF-l, como el 10% de suero fetal y la combinación de EGF, bombesina y vasopresina inducen la actividad específica, cantidad de proteína y concentración de mRNA de la G6PD, por lo que esta enzima tiene un papel como marcador de la proliferación en nuestro sistema celular.

4- Los agentes que elevan los niveles de cAMP intracelulares han resultado ser en nuestro sistema inhibidores de la proliferación celular, ya que la presencia de forscolina revierte el efecto estimulador de la combinación de EGF, bombesina y vasopresina sobre la síntesis de DNA, RNA y proteínas, así como sobre la inducción de la G6PD.

5- Nuestros resultados demuestran una diferente regulación hormonal de la expresión genética de la enzima málica y de la G6PD a los 6 y 10 días de cultivo de los adipocitos marrones fetales de rata en condiciones no proliferativas. La 89

presencia prolongada de T3 en el medio de cultivo induce la expresión genética de la enzima málica a nivel transcripcional, lo que parece indicar la presencia de

elementos reguladores de respuesta a T3 en el gen de la enzima málica. Sin embargo, la G6PD del tejido adiposo marrón no es un enzima inducible por T3.

6- La insulina aumenta la expresión genética de la enzima málica y de la G6PD a los 6 y 10 días de cultivo, a nivel transcripcional. La inducción de la enzima málica es máxima tras 10 días de cultivo, lo que sugiere que este enzima contribuye fundamentalmente a la síntesis lipídica creciente en los cultivos primarios de adipocitos marrones fetales de rata.

7- La insulina y T., ejercen un efecto aditivo sobre la expresión genética de la enzima málica a 6 y 10 días de cultivo, lo que sugiere la existencia de distintos elementos

reguladores de respuesta hormonal en el gen de esta enzima. La presencia de T3 produce una estabilización de los niveles del mRNA de la G6PD inducidos en presencia de insulina, observándose la aparición de una isoforma precursora del

mensajero de este enzima tras 10 días de cultivo.

8- La noradrenalina revierte el efecto estimulador de la insulina y T3 sobre la actividad enzima málica y cantidad de proteína, no modificando los niveles de los mRNAs tras 6 días de cultivo. A los 10 días de cultivo la enzima málica pierde su respuesta adrenérgica. Sin embargo, la expresión genética de la G6PD no está regulada por la presencia de noradrenalina en el medio de cultivo.

90

CONCLUSION FINAL

Las células primarias fetales de mamíferos han demostrado ser un buen modelo experimental tanto para estudios de proliferación, como de diferenciación celular. Nuestros resultados han dejado bién establecido que los adipocitos marrones fetales de rata presentan esta dualidad de funciones, habiendo sido inducidos a un programa de proliferación e igualmente, previa su quiescencia, reinducidos a un programa de diferenciación que conduce a la amplificación de su perfil de expresión génica en relación con la síntesis lipídica.

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108

FE DE ERRATAS

En

a pág¡na de los objetivos de la Tesis Doctoral, linee 9, donde dice

‘el

efecto de las hormonas, debe decir ‘el efecto que las hormonas”. Página 15, lineas 22—23, donde dice “molécula en este proceso”, debe decir ‘molécula mediadora de este proceso”. Página 18, linea 32, donde dice “expuesta” debe decir ‘expuestas’. Página 30, linea 11, donde dice

Lorenzo y col. (1982)’, debe decir “Senito y

col.O 982) Página 41, linea 24, donde dice

“

-globulina”, debe decir

‘

y—globulina”.

Página 44, linee 28, donde dice “1—LS xl& células por placa de cultivo”, debe decir ‘2 x10~ células por placa de cultivo Página 53, linea 3, donde dice “15 g de DNA”, dece decir “15pg de DNA”. Figura 12, donde dice “quiescrentes’, debe decir “quiescentes”. Figuras 14 y 15, donde dice “torskolina”, debe decir “forscolina”. Tabla 3, donde dice “9055 (5 U/mIl?)”, debe decir “20SF (5 U,~>/2/ml)”. Página 99, lineas 4—5, el título correcto es

“

flormonal regulation of rat foetal

ipogenesis in brown adipocyte primary cultures”. Páginas 95, 102 y 103 donde dice la página 95, donde dice

“

uncopling”, debe decir “uncoupling”, en

“precocius”, debe decir ‘precocicus’ y en la página

94, donde dice “enzime”, debe decir “enzyme”.