Prefacio El uso de los marcadores moleculares puede facilitar y hacer más eficaces el uso y la conservación de la diversidad biológica. Con ellos pueden determinarse relaciones filogenéticas, pueden identificarse redundancias en un banco de germoplasma, y es posible también descubrir genes nuevos. Aunque este módulo titulado Tecnologías de Marcadores Moleculares para Estudios de Diversidad Genética de Plantas: Módulo de Aprendizaje tiene la intención de promover el desarrollo de capacidades y estimular la investigación en recursos fitogenéticos en todo el mundo, está especialmente dirigido a los países cuyo acceso a la bibliografía científica actualizada y a las tecnologías de investigación es limitado. El uso de los marcadores moleculares es costoso y por tanto los recursos financieros deben usarse de la manera más sensata posible. En consecuencia, tiene una importancia crucial la actitud del investigador hacia el uso de la tecnología: no la adoptará simplemente porque puede hacerlo o porque es la de última moda, sino porque la eligió concienzudamente como la más apropiada para responder las preguntas biológicas que quiere resolver. Nuestra ilusión es que este módulo en línea le dé a usted, su usuario, el contexto, conocimiento y herramientas para tomar decisiones correctas al usar sus recursos.

Prólogo Los recursos fitogenéticos son un componente clave del desarrollo sostenible de la agricultura y la silvicultura. Su contribución al desarrollo viene dada por las posibilidades de aumentar la producción de alimentos, erradicar la pobreza y proteger el ambiente. La pérdida de los recursos genéticos y, en consecuencia, de la diversidad genética que representan, es una realidad generalizada. Es, por tanto, de vital importancia que desarrollemos estrategias adecuadas y eficaces para conservar estos recursos genéticos. Necesitamos primero ampliar nuestro conocimiento de la diversidad genética, e introducir enfoques nuevos y potentes que conduzcan, con el tiempo, a la identificación de genes útiles en el germoplasma. Asimismo, la efectividad en el uso de los recursos genéticos será un prerrequisito importante de su conservación sostenible. Las tecnologías de marcadores moleculares son el medio más avanzado y, posiblemente, el más eficaz para entender los fundamentos de la diversidad genética. Son herramientas eficientes y exactas con las cuales se puede identificar y evaluar la variación genética de manera rápida y minuciosa. Cuando se aplican tecnologías moleculares para responder a las preguntas biológicas que sirven de base a la comprensión de la diversidad genética, podemos hacer progresos notables en la velocidad y en la profundidad para lograr una conservación adecuada y, en consecuencia, la disponibilidad de los recursos genéticos para el mejoramiento de los cultivos. Ahora bien, dado que la investigación con marcadores moleculares es costosa y que los recursos financieros son limitados, éstos deben usarse tan razonablemente como sea posible. Este conjunto de módulos de entrenamiento pretende contribuir al desarrollo de capacidades en el uso de las tecnologías de marcadores moleculares, con el propósito de que los recursos humanos formados y las instituciones capaces de "seguirle el ritmo al progreso científico" sean la clave de la conservación de los recursos genéticos. Las autoras, muy conscientes de esta necesidad de capacitación, han desarrollado este conjunto de módulos, el primero de los cuales, titulado Tecnologías de Marcadores Moleculares para Estudios de Diversidad Genética de Plantas: Módulo de Aprendizaje, se concentra en el desarrollo de las habilidades de manejo de las tecnologías moleculares. Este módulo permitirá que, quienes trabajen en recursos fitogenéticos, tomen decisiones apoyados en información más sólida sobre los métodos que deben emplear para comprender mejor y, por tanto, proteger efizcamente los recursos genéticos que son la base de nuestra misma existencia.

Jan Engels Director Grupo de Ciencia y Tecnología de los Recursos Genéticos IPGRI

Lo que usted debe saber sobre este módulo Tenemos la firme convicción de que usted, como estudioso de la diversidad fitogenética, debe conocer sus objetivos, sus limitaciones y los resultados que quiere conseguir. Por consiguiente, hemos querido tratar los siguientes temas: • Los principios fundamentales de la diversidad genética. • Las cualidades de los marcadores empleados para medir esa diversidad. • Las tecnologías que más se usan, entre ellas las que se basan en el estudio de las proteínas, en el análisis del ADN y en la reacción en cadena de la polimerasa. Los procedimientos experimentales más importantes se explican con gráficos ilustrativos y fotografías, y se dan ejemplos reales de la aplicación de las tecnologías a casos concretos del estudio de la diversidad genética o del manejo del germoplasma. Con estos ejemplos esperamos contribuir a que el módulo se use como un elemento educativo, es decir, como una herramienta de autoayuda o como componente de un programa de estudios universitario. Comparamos también las diversas técnicas, es decir, evaluamos sus ventajas y sus inconvenientes, así como el costo relativo de cada procedimiento; de este modo ayudamos al investigador principiante a entender los componentes clave para que elija los procedimientos que más se adapten a su investigación. Puesto que el módulo fue diseñado como una ayuda en la capacitación o como herramienta de referencia, trae también listas de referencias clave, de referencias sobre aplicaciones adicionales a las presentadas, y del equipo necesario. Este módulo está dirigido a científicos que tengan no sólo una formación mínima en genética y en biología molecular de las plantas, sino también un conocimiento práctico de los recursos fitogenéticos y de los asuntos relacionados con su conservación y manejo. Esperamos que sea de especial utilidad para aquellos que trabajan en países en desarrollo, donde los materiales impresos o no están disponibles, o son costosos o están desactualizados. Deseamos también que sea útil para los profesores de ciencias que quieran acceder a una síntesis global de las tecnologías actuales del ADN y de la aplicación que pueden tener en la conservación y en el uso de la diversidad biológica. Para que los usuarios puedan seleccionar sólo aquellas secciones de su interés, el módulo está dividido en submódulos complementarios e independientes. Exceptuamos la Introducción, que tiene relevancia para todas las secciones y que siempre debe considerarse. Por tanto, el módulo en su conjunto puede usarse como referencia, como un instrumento de renovación o de actualización para el científico que necesita tomar nuevas decisiones en su investigación, o como una guía para desarrollar talleres técnicos de corta duración. La actualización y la información de retorno tienen una importancia crítica en campos que evolucionan rápidamente, como la genética molecular (y sus tecnologías asociadas) y los recursos fitogenéticos. Confiamos, por ello, que podremos actualizar este módulo a intervalos relativamente frecuentes.

Para dar una respuesta eficaz a nuestros colaboradores y atender las necesidades de otros usuarios, agradeceríamos mucho su opinión sobre la organización, el contenido y la utilidad del módulo. Puede escribirnos a: [email protected]; [email protected] o a las siguientes direcciones de correo postal: International Plant Genetic Resources Institute Via dei Tre Denari 472/a 00057 Maccarese (Fiumicino) Roma, Italia

Institute for Genomic Diversity 130 Biotechnology Building Cornell University Ithaca, NY 14583

Nuestro mayor deseo es que el módulo sea usado de muchas maneras y que, junto con un módulo acompañante sobre el análisis de datos moleculares para estudios de diversidad genética (que aparecerá a principios del 2004) sean para muchos lectores, especialmente los de los países en desarrollo cuyo acceso a la tecnología de vanguardia es limitado, una oportunidad de hacer investigación avanzada en el campo de la diversidad fitogenética. De este modo, esos módulos harán un aporte al conocimiento global de estos recursos tan valiosos.

M. Carmen de Vicente IPGRI

Theresa Fulton IGD, Cornell University

Objetivos del módulo En relación con los usuarios del módulo, nuestras metas son las siguientes: •

Que comprendan tanto los conceptos científicos básicos en que se apoyan los marcadores moleculares y las tecnologías de secuenciación del ADN, como su uso en el área de los recursos fitogenéticos

•

Que desarrollen la habilidad de comparar y contrastar las ventajas y limitaciones de cada tecnología, y que esa información les permita tomar las decisiones más acertadas respecto a situaciones específicas de sus trabajos de investigación

•

Que tengan a mano una lista actualizada de recursos bibliográficos sobre cada tecnología

Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas: Módulo de aprendizaje

Introducción

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 1

Contenido Diversidad genética Recursos fitogenéticos Medición de la variación genética Marcadores genéticos: • Descripción • Tipos • Propiedades deseables

Comparación de las técnicas principales: • Tecnologías • Costos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 2

Diversidad genética La diversidad genética se refiere a la variación en: • la secuencia del ADN, • la cantidad de ADN por célula, o • el número y la estructura de los cromosomas

La diversidad genética es el resultado de la selección, la mutación, la migración, la deriva genética o la recombinación (solas o en conjunto). Estos fenómenos ocasionan cambios en las frecuencias génicas y genotípicas, lo que conduce a la evolución de las poblaciones Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 3

La diversidad genética se refiere a la variación de los genes de las especies, o sea, a la variación hereditaria dentro y entre poblaciones de organismos. En realidad, todas las variaciones provienen de la secuencia de los cuatro pares de bases que componen la molécula de ADN y que constituyen el código genético. Es posible encontrar otros tipos de diversidad genética en otros niveles de organización del núcleo celular, por ejemplo, en la cantidad de ADN por célula, en el número de cromosomas y en la estructura del ADN. La generación de nueva variación genética se produce continuamente en los individuos a causa de las mutaciones cromosómicas y génicas, las cuales se propagan, en los organismos de reproducción sexual, mediante la recombinación. La variación genética recibe también el influjo de la selección. Las consecuencias de estos fenómenos son los cambios en las frecuencias genotípicas y alélicas, que son los responsables de la evolución de las poblaciones. El fitomejoramiento y otros procesos de selección artificial pueden originar cambios similares en la variación genética.

Recursos fitogenéticos Entre los recursos fitogenéticos se incluye la variación genética actual, con utilidad potencial para el futuro de la humanidad Los recursos fitogenéticos comprenden: • • • •

Parientes silvestres de las especies cultivadas Especies silvestres Variedades tradicionales o razas locales Cultivares comerciales, híbridos o líneas de mejoramiento

Debemos conservar los recursos fitogenéticos para su uso eventual Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 4

Los recursos fitogenéticos comprenden la variación genética presente y potencialmente útil para el futuro de la humanidad. Estos recursos incluyen las variedades tradicionales y las razas locales; los cultivares comerciales, los híbridos y otros materiales desarrollados mediante el fitomejoramiento; los parientes silvestres de las especies cultivadas; otros materiales que podrían usarse en el futuro para la agricultura o en beneficio del ambiente. En consecuencia, los recursos fitogenéticos deben conservarse, siendo el motivo fundamental su posible utilización como fuente de variación genética potencialmente útil.

Medición de la variación genética La conservación y el uso eficaz de los recursos fitogenéticos requieren de una evaluación minuciosa de la variación genética que contienen La variación genética puede medirse en dos niveles: • En el fenotipo: es la combinación de los caracteres individuales que resultan de un genotipo y de su interacción con el ambiente • En el genotipo: es la constitución genética particular de un organismo Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 5

Para poder conservar y usar la variación genética, primero hay que evaluarla, es decir, es preciso determinar su extensión y distribución. La variación puede evaluarse a nivel tanto fenotípico como genotípico. La evaluación de la variación fenotípica se concentra en los rasgos morfológicos, o sea, en aquellas características que definen la forma y la apariencia de un conjunto de individuos. Algunos de estos caracteres pueden considerarse ‘genéticos’ si su presencia en individuos emparentados es hereditaria y no depende del ambiente. Esto quiere decir que esos caracteres están asociados con una secuencia específica de ADN. La evaluación de la variación genotípica se hace al nivel de la molécula de ADN, que es la responsable de la transmisión de la información genética. La molécula de ADN está compuesta por nucleótidos organizados en una configuración de doble hélice, cuyo nivel de complejidad aumenta hasta constituir los cromosomas.

Marcadores genéticos: Descripción Los marcadores genéticos identifican en un individuo las características del fenotipo, del genotipo o de ambos El seguimiento de la herencia de los marcadores puede realizarse de generación en generación

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 6

Un marcador genético es un carácter cuantificable que puede detectar variación ya sea en una proteína o en una secuencia de ADN. Una diferencia, bien sea fenotípica o genotípica, puede actuar como marcador genético si identifica en un individuo características del genotipo, del fenotipo, o de ambos y si, además, puede hacerse seguimiento a su herencia a través de varias generaciones. Es posible que un carácter genético no tenga efectos observables en el comportamiento de un individuo. A veces, sin embargo, este carácter puede estar ligado a otros caracteres (o correlacionado con ellos) que son más difíciles de medir y afectan, ciertamente, el comportamiento del individuo. En tales casos, estos caracteres genéticos no observables pueden usarse como marcadores genéticos de caracteres que están ligados a ellos, porque indican indirectamente la presencia de una característica de interés (o en estudio). Puede haber una correlación entre los dos tipos de caracteres, y ésta se conoce mediante un análisis de herencia, es decir el estudio de la distribución de la característica tanto en los progenitores como en su descendencia.

Marcadores genéticos: Tipos

Marcadores morfológicos Marcadores proteicos (o bioquímicos) Marcadores de ADN (o moleculares)

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 7

Marcadores morfológicos Ventajas: • Fácilmente disponibles • Su evaluación requiere, generalmente, de equipo sencillo • Constituyen la medida más directa del fenotipo

Desventajas: • Requieren un conocimiento práctico del cultivo o de la especie vegetal (o de ambos) • Están sujetos a influencias ambientales • Su número es limitado Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 8

Tradicionalmente, la diversidad que existe dentro y entre las poblaciones se ha determinado mediante la evaluación de sus diferencias morfológicas. Estas medidas tienen la ventaja de que son fácilmente realizables, no requieren de un equipo sofisticado y son la apreciación más directa de un fenotipo; por consiguiente, están al alcance para uso inmediato, lo que es un atributo importante. Sin embargo, las determinaciones morfológicas deben ser tomadas por un experto en la especie, están sujetas a cambios debidos a factores ambientales, pueden variar en las diferentes etapas del desarrollo de las plantas, y su número es limitado.

Marcadores proteicos (o bioquímicos) Se basan en las propiedades de migración de las proteínas, las cuales permiten separarlas mediante electroforesis Se detectan mediante ensayos histoquímicos específicos Ventajas: • Requieren de un equipo de laboratorio relativamente sencillo • Son un valioso complemento de la evaluación morfológica

Desventajas: • Están sujetos a influencias ambientales • Su número es limitado Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 9

Para superar las limitaciones de los marcadores morfológicos, se han desarrollado otros tipos de marcadores, tanto a nivel proteico (del fenotipo) como a nivel del ADN (del genotipo). Los marcadores proteicos se conocen también como 'marcadores bioquímicos' aunque se les incluye equivocadamente, y cada vez con más frecuencia, en una clase común bajo la denominación de ‘marcadores moleculares’. Los marcadores proteicos (proteínas de almacenamiento de la semilla e isoenzimas) se obtienen mediante electroforesis, aprovechando las propiedades migratorias de las proteínas y de los enzimas, y se detectan mediante tinciones histoquímicas específicas de las enzimas que se quieren analizar. La detección de polimorfismos —o sea, las diferencias detectables para un marcador determinado en un grupo de individuos— en los marcadores proteicos es una técnica que comparte algunas de las ventajas de los marcadores morfológicos. Sin embargo, los marcadores proteicos están también limitados por la influencia del ambiente y de los cambios que ocurren en las diferentes etapas del desarrollo. Aun así, los isoenzimas son un complemento robusto del análisis morfométrico sencillo de la variación.

Marcadores de ADN (o moleculares) Son polimorfismos detectados en la secuencia del ADN del núcleo o de los organelos Ventajas: • Su número es, potencialmente, ilimitado • No están sujetos a influencias ambientales • Son una medida objetiva de la variación

Su desventaja principal es que necesitan de un equipo técnicamente más complejo Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 10

Los polimorfismos del ADN pueden detectarse en el ADN nuclear y en el ADN de los organelos; este último se encuentra en las mitocondrias y en los cloroplastos. Los marcadores moleculares afectan a la molécula de ADN como tal y se consideran, por ello, medidas objetivas de la variación. No están sujetos a las influencias ambientales, las pruebas con ellos pueden realizarse en cualquier momento del desarrollo de las plantas, y tienen el potencial de hallarse en número ilimitado porque abarcan todo el genoma, lo que representa su mejor atributo. Hay muchos tipos diferentes de marcadores moleculares y cada uno tiene propiedades diferentes, lo que explicaremos a continuación.

Marcadores genéticos: Propiedades deseables Altamente polimórficos Reproducibles Codominantes Distribuidos de manera uniforme en todo el genoma Discriminantes No sujetos a influencias ambientales Neutrales De bajo costo Fáciles de medir Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 11

Un buen marcador es: • Polimórfico, o sea, es variable en un grupo de individuos. El grado de polimorfismo detectado depende de la tecnología empleada para medirlo. • Reproducible en cualquier experimento de laboratorio, ya sea en experimentos hechos en el mismo laboratorio o en diferentes laboratorios que realicen experimentos idénticos. • Codominante. Según el tipo de aplicación del marcador, la tecnología elegida debe ser capaz de detectar las diferentes formas del marcador, es decir, distinguir entre un homocigoto y un heterocigoto (herencia codominante). Un individuo heterocigótico muestra simultáneamente la combinación de genotipos de los dos progenitores homocigóticos. • Distribuido de manera uniforme en todo el genoma. Cuanto mejores sean la distribución y la densidad de cobertura del genoma, mejor será la evaluación del polimorfismo. • Discriminante, o sea, capaz de detectar diferencias entre individuos estrechamente relacionados. • No sujeto a influencias ambientales. La inferencia del genotipo de un marcador debe ser independiente del ambiente en que vive el individuo o de su etapa de desarrollo. • Neutral. El alelo presente en el locus del marcador es independiente de la presión de selección que se ejerce sobre el individuo y no tiene ningún efecto sobre ella. Esta afirmación suele ser una suposición porque, generalmente, no hay datos disponibles que confirmen o nieguen esta propiedad. • De bajo costo. Su detección en numerosos individuos debe ser fácil, rápida y barata. En la medida de lo posible, el equipo de laboratorio debe ser útil para diversos experimentos.

Comparación de las técnicas principales Marcador

Número

Codominante

Polimorfismo

Específico de locus

Tecnicidad

Costo

Isoenzimas

< 90

Sí

Bajo

Sí

Bajo

Bajo

RFLP

Ilimitado

Sí

Medio

Sí

Alto

Medio

RAPD

Ilimitado

No

Medio

No

Bajo

Bajo

DAF

Ilimitado

No

Muy alto

No

Bajo

Bajo

AP-PCR

Ilimitado

No

Muy alto

No

Bajo

Bajo

Microsatélites

Ilimitado

Sí

Muy alto

Sí

Bajoa

Bajoa Bajo

b

SCAR

Ilimitado

Sí/No

Bajo/Medio

Sí

Medio

CAPS

Ilimitadob

Sí

Bajo/Medio

Sí

Medio

Bajo

ISSR

Ilimitado

No

Alto

Sí

Bajo/Medio

Bajo/Medio

AFLP

Ilimitado

No

Alto

No

Medio

Medio

Secuenciación

Ilimitado

Sí

Alto

Sí/No

Alto

Alto

EST

Ilimitado

Sí

Bajo/Medio

Sí

Medio

Medio

SNP

Ilimitado

Sí

Muy alto

Sí

Alto

Alto

Cuando ya se han identificado los microsatélites y se han diseñado los cebadores b Dependiendo de otros marcadores que ya estén disponibles a

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 12

En este cuadro se comparan las técnicas principales que involucran marcadores bioquímicos y moleculares para identificar la diversidad genética. Los criterios empleados para asignar el nivel dentro de cada columna (sí/no, bajo/medio/alto, etc.) se basan en la experiencia y en los resultados descritos en la literatura científica. No se puede asignar un número o un intervalo a cada marcador y a su tecnología porque los resultados dependen estrechamente de la especie vegetal en cuestión. Sin embargo, el cuadro presenta objetivamente la forma en que se pueden comparar las técnicas entre ellas con respecto a una especie dada y a los elementos contenidos en las columnas. RFLP RAPD DAF AP-PCR SCAR CAPS ISSR AFLP EST SNP

Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (Restriction fragment length polymorphism) Polimorfismo de ADN amplificado al azar (Random amplified polymorphic DNA) Amplificación de la huella de ADN (DNA amplification fingerprinting) Reacción en cadena de la polimerasa iniciada al azar (Arbitrarily primed polymerase chain reaction) Región amplificada caracterizada por una secuencia (Sequence-characterised amplified region) Secuencia de restricción amplificada y polimórfica (Cleaved amplifiedpolymorphic sequence) Secuencia entre repeticiones simples (Inter-simple sequence repeat) Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (Amplified fragment length polymorphism) Marcador de secuencia expresada (Expressed sequence tag) Polimorfismo de un solo nucleótido (Single nucleotide polymorphism)

Costos: Diferencias entre las principales tecnologías Procedimiento

Material

Costo aprox. para 96 muestras (USD,2002,est.)

Extracción de ADN Tubos de centrífuga o de microcentrífuga O, placa de 96-pocillos O, tubos de 50 ml (preparaciones grandes)

RFLP

SSR

RAPD

AFLP

5.40-101.40

5.40

5.40

5.40

96 micropreparaciones vs. 96 preparaciones grandes

2.40 3.50 24.00

Tampón de extracción

2.00-50.00

Insumos diversos (alcohol, tampón de lisis, puntas de pipeta, etc.)

1.00-25.00

Electroforesis en geles de agarosa

96 micropreparaciones vs. 96 preparaciones grandes

23.00 Agarosa

10.00 (2 geles)

Tampón

13.00 (2 geles)

Electroforesis en geles de acrilamida Acrilamida

0.75 (1 gel)

Urea

0.75 (1 gel)

Tampón

Comentarios

[23.00]

23.00

1.50

1.50

[23.00]

[ ] = opcional, sólo para control de calidad

a

Electroforesis en geles de secuenciación

4.06 Cebadores marcados con fluorescencia

2.56

Gel (ver electroforesis en geles de acrilamida)

1.50

Método de visualización con bromuro de etidio

0.20-2.00

0.20-2.00

4.06

0.20-2.00

Bromuro de etidio Fotografía del gel a

0.20-2.00 (2 geles)

= costo despreciable

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Papel de alta densidad vs. polaroid (continúa en la siguiente)

Introducción 13

Costos: Diferencias entre las principales tecnologías (continuación) Procedimiento

Material

Costo aprox. para 96 muestras (USD,2002,est.)

RFLPa

PCR Taq polimerasa

dNTP Cebadores

SSR

RAPD

AFLP

74.30

74.30

74.30

Comentarios

1.5 U/reacción. El costo se reducirá considerablemente cuando expire la patente

50

24 0.30-0.40

Tampón con MgCl2 para PCR Digestión con enzimas de restricción

0.30-30.00 Enzimas

0.30-30.00

Transferencia por “Southern” Tampones (HCl, NaOH) Membrana de nilón Papel secante

4 (2 geles) 24 (2 geles)

3.35 Tampón

b

El costo se reduce con cada reutilización del filtro

2.50 (2 geles)

Hibridación

a

~10 unidades/muestra, precios muy variables 30.50

Sonda de hibridación para 96 muestras

b

ST ADN (u otro bloqueador)

0.30

Mezcla LS para marcaje

0.30

Radioisótopo (32P)

2.50

Otros reactivos, tubos

0.25

TOTAL

62.75-190.25

(para 96 muestras)

(MAS vs. mapeo)

85.16-110.26

104.40-106.20

83.76-106.76

= No se necesita PCR en el procedimiento de RFLP. Sin embargo, se pueden amplificar las sondas mediante PCR para ahorrar tiempo con un costo mínimo = costo despreciable

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 14

Costos: Estimación de costos generales Procedimiento

Material

Costo (USD,2002,est.)

Costo aprox. por muestra (USD,2002,est.)

$25/1000

0.075

Comentarios

Extracción de ADN Tubos de centrífuga o de microcentrífuga O, placa de 96-pocillos

$3.50

0.04

Tampón de extracción

($2/litro)

0.02-0.50

Tris

Micropreparación vs. preparación grande

$270/5 kg

Sorbitol

$70/5 kg

Varios (EDTA, etc.) Insumos varios (alcohol, tampón de lisis, puntas, etc.)

0.01-0.25

Taladro y maza de mortero (opcional)

$100

“Genogrinder” (opcional)

$8000

Machacador de hojas (opcional)

$500

Electroforesis en geles de agarosa Agarosa Tampón (Tris, EDTA, NaAc) Unidad de gel horizontal Fuente de energía eléctrica

$365/500 g

0.11

$6.50/litro

0.05

6 g/gel, ~40 muestras/gel

$400 $400 (2 enchufes) ~96 muestras/gel

Electroforesis en geles de acrilamida Acrilamida

$30/100 ml

Urea

$42/500 g

Unidad de gel vertical Fuente de energía eléctrica

$1000 $400 (2 enchufes)

Secador de geles

$1500

Electroforesis en geles de secuenciación Cebadores marcados con fluorescencia

$40/1500 muestras

Gel Patrones de tamaño Programa informático para analizar geles Equipo de secuenciación

0.03

$3 $12/gel < $100,000 $100,000

(continúa en la siguiente)

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 15

Los costos presentados aquí asumen la existencia de un laboratorio básico equipado con cristalería, contenedores de plástico, calentadores con agitador, medidores de pH, balanza, refrigerador, congelador, agua destilada, pipetas y puntas, y centrífuga. Estos costos varían de un país a otro y se han calculado basándose en los precios de los Estados Unidos. Debido a que en muchos países estos costos serán más altos, deben tomarse como un indicativo y usarse para comparar las diferentes tecnologías y el equipo alternativo.

Costos: Estimación de costos generales (continuación) Procedimiento

Material

Costo (USD,2002, est.)

Costo aprox. por muestra (USD,2002,est.)

$100/10 g

a

Comentarios

Método de visualización con bromuro de etidio Bromuro de etidio Transiluminador Equipo de fotografía Foto del gel

Se puede reusar por mucho tiempo

$1000-$2000 $3000-$12,000 $0.10-$1.00

Tipos altamente variables 0.0025-0.025

Papel de alta densidad vs. polaroid; ~40 muestras/gel

PCR Termociclador Taq polimerasa dNTP Cebadores

$7000-$23,000

Tétrada de 96-pocillos (cuatro placas de 96-pocillos)

$170/500 unidades

0.51

$250/grupo de 4

0.25

$15-$25

0.0025-0.0042

1.5 U/reacción. El costo se reducirá drásticamente cuando expire la patente

Tampón de PCR con MgCl2 Digestión con enzimas de restricción Enzimas Incubador

$0.003-$0.30/unidad

0.03-3.00

~10 unidades/muestra, precios muy variables

$500-$1000

Transferencia por "Southern" Tampones (HCl, NaOH) Membrana de nilón Papel secante Unidad de transferencia (esponjas, cubeta)

$1.00/litro (promedio) $180/rollo

6.00/membrana (20x10 cm)

$124/paquete de 100 láminas grandes $15

Hibridación Tampón ADN ST (u otro bloqueador) Mezcla de marcaje LS Incubador con agitación Radioisótopo (32P)

$306/10 g

0.30

$125/50 unidad

0.30

0.15/ml. 1 ml usado/50 ml tampón de hibridación

$2500 $120/100 l

2.40

Reactivos varios Gastos ambientales Recogida de la basura Protección a

$500/mes $300/estación

= costo despreciable

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 16

En resumen La definición de estrategias de conservación y de uso adecuado de los recursos genéticos requiere la evaluación de su variación La diversidad fitogenética se puede medir empleando marcadores genéticos de tres tipos: morfológico, bioquímico o molecular Un solo marcador no reúne todas las propiedades deseadas La elección de la técnica depende de la naturaleza del problema biológico que se maneja Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 17

Hasta el momento usted debería saber Qué es la variación genética y cómo puede medirse Las principales ventajas y desventajas de los diferentes tipos de marcadores genéticos Cuáles son las propiedades deseables de los marcadores genéticos

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 18

Referencias básicas Ayad, W.G., T. Hodgkin, A. Jaradat y V. Ramanatha Rao. 1997. Molecular genetic techniques for plant genetic resources. Reporte de un taller del IPGRI, octubre 9-11 de 1995, Roma. IPGRI, Roma. Brown, S.M. y S. Kresovich. 1996. Molecular characterization for plant genetic resources conservation. p. 85-93 en Genome Mapping in Plants (H. Paterson, ed.). R.G. Landes Company, Georgetown, TX. Karp, A., K.J. Edwards, M. Bruford, S. Funk, B. Vosman, M. Morgante, O. Seberg, A. Kremer, P. Boursot, P. Arctander, D. Tautz y G.M. Hewitt. 1997. Molecular technologies for biodiversity evaluation: opportunities and challenges. Nature Biotechnol. 15:625-628. Karp, A., S. Kresovich, K.V. Bhat, W.G. Ayad y T. Hodgkin. 1997. Molecular tools in plant genetics resources conservation: a guide to the technologies. Boletín técnico No. 2. IPGRI, Roma.

A continuación Tecnologías basadas en las proteínas Nociones básicas sobre las proteínas Tecnologías basadas en las proteínas • Isoenzimas

Tecnologías basadas en el ADN Tecnologías complementarias Consideraciones finales Glosario Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Introducción 20

Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas: Módulo de aprendizaje

Tecnologías basadas en las proteínas Nociones básicas sobre las proteínas

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Proteínas 1

Contenido Nociones básicas sobre las proteínas Estructura de las proteínas: • • • •

Primaria Secundaria Terciaria Cuaternaria

Funciones de las proteínas Enzimas: • Descripción • Aloenzimas e isoenzimas

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Proteínas 2

Nociones básicas sobre las proteínas La secuencia de bases del ADN instruye a la célula sobre el modo de hacer las distintas proteínas que necesita para funcionar como parte del organismo en que esa célula existe Las proteínas pueden tener distintas funciones: unas son estructurales y otras funcionales Las proteínas son moléculas complejas hechas por el ensamblaje de bloques simples (los aminoácidos) en una cadena (la cadena polipeptídica) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Proteínas 3

La información que llevan las bases del ADN se traduce en proteínas. La molécula del ADN se copia en un tipo distinto de ácido nucleico –el ARN o ácido ribonucleico. El ARN se mueve en el ribosoma, un organelo que tiene a su cargo la elaboración de las proteínas. Cada grupo de tres bases del ARN determina el aminoácido que se añade a la molécula proteica en progreso. La cadena de ARN pasa a través del ribosoma hasta que se complete la molécula de proteína. Este proceso se ha llamado el 'dogma central', puesto que es la base de la vida biológica. Los aminoácidos son compuestos orgánicos bi-funcionales que contienen un grupo básico amino (-NH2) y un grupo ácido carboxilo (-COOH). En las proteínas se encuentran comúnmente 20 aminoácidos distintos, con funciones y propiedades variables según la naturaleza del grupo –R. Por ejemplo, en la alanina el grupo R es (-CH3), mientras que en la cisteína es (-CH2-SH).

Estructura primaria de las proteínas La estructura primaria de una proteína es el orden de los aminoácidos en la cadena polipeptídica AA = Aminoácido H2O R NH2

AA

H2O R

COOH

NH2

AA

COOH NH2

AA

COOH

+ 2 H2O

AA

AA

AA

Adaptado de Griffiths y col. 1996

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Proteínas 4

En las proteínas, los aminoácidos se unen en cadena mediante enlaces peptídicos (de tipo amido) que forman el pilar de la molécula. Un enlace peptídico se crea entre un grupo básico amino (-NH2) de un aminoácido y un grupo ácido carboxilo (-COOH) de otro. La fórmula general de un aminoácido es H2N –CHR –COOH. El grupo R puede ser muy diverso: desde un átomo a una molécula compleja. El término ‘polipéptido’ indica, simplemente, a una cadena larga de aminoácidos. Una vez que la cadena de proteínas se ha terminado, debe plegarse adecuadamente para poder funcionar. La estructura y el plegamiento de cada proteína son específicos. Todavía no se comprende plenamente el modo en que la secuencia de los aminoácidos causa el plegamiento de la proteína. Una proteína puede conformarse con uno o varios polipéptidos independientes; y puede estar hecha también de láminas (es decir, cadenas de aminoácidos que se juntan ordenadamente) que contienen estructuras en espiral. Claramente, las propiedades de los polipéptidos y de las proteínas dependen de la composición de sus aminoácidos.

Estructura secundaria de las proteínas La estructura secundaria es el resultado de los enlaces de hidrógeno locales creados a lo largo de la base polipeptídica

Adaptado de Griffiths y col. 1996

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Proteínas 5

La estructura secundaria es el resultado de los enlaces de hidrógeno locales que se crean a lo largo de la cadena polipeptídica. Estos enlaces dan solidez y flexibilidad a la proteína. Las estructuras secundarias más comunes son: •

Hélice alfa, causada por enlaces de hidrógeno dentro de la cadena polipeptídica; por ejemplo, proteínas musculares.

•

Lámina plegada beta, causada por enlaces de hidrógeno entre cadenas polipeptídicas adyacentes; por ejemplo, la fibra de la seda.

Estructura terciaria de las proteínas La estructura terciaria resulta de las interacciones entre los grupos R de un polipéptido, es decir, de los enlaces covalentes y no covalentes

Adaptado de Griffiths y col. 1996

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Proteínas 6

La estructura terciaria resulta de las interacciones entre los grupos R de un polipéptido, tales como los enlaces no covalentes (enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, interacciones hidrofóbicas) y los enlaces covalentes débiles (enlaces de tipo disulfuro entre residuos de cisteína).

Estructura cuartenaria de las proteínas La estructura cuaternaria resulta de las interacciones entre dos o más cadenas polipeptídicas para formar dímeros, trímeros, tetrámeros, etc.

Adaptado de Griffiths y col. 1996

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Proteínas 7

A veces un solo polipéptido es suficiente para que una proteína actúe, y entonces decimos que la proteína actúa como un monómero. Sin embargo, es necesario a menudo que interactúen dos polipéptidos para que la proteína ejerza su función particular. Si éste es el caso, hablamos de un dímero; si interactúan más de dos polipéptidos, decimos que son trímeros, tetrámeros, etc. La estructura cuaternaria resulta de interacciones entre dos o más cadenas polipeptídicas para formar dímeros, trímeros, tetrámeros, etc. Estas cadenas se mantienen juntas mediante enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos y, menos comúnmente, interfases hidrofóbicas y enlaces de tipo disulfuro entre cadenas.

Funciones de las proteínas La estructura tridimensional de las proteínas es un resultado directo de las interacciones que ocurren en su medio interno La diversidad en las funciones de las proteínas es el resultado de la complejidad de su estructura

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Proteínas 8

La estructura tridimensional de las proteínas es el resultado directo de las interacciones que ocurren en su medio interno. En consecuencia, el conocimiento de la estructura de las proteínas nos da mucha información sobre el modo en que realizan sus tareas en la célula. Por ejemplo, en ambientes acuosos, los grupos R hidrofóbicos se colocan hacia el interior de las proteínas. Los cambios de temperatura o de pH pueden afectar los enlaces no covalentes causando roturas de la estructura tridimensional y pérdida de actividad en la proteína. Este proceso se llama 'desnaturalización'. Las proteínas desnaturalizadas pueden unirse para volverse insolubles en un proceso llamado coagulación. Entre las diversas funciones de las proteínas, facilitadas por la complejidad de la estructura de éstas, están las siguientes; se incluyen ejemplos: • • • • • • •

Estructura (colágeno, fibras musculares) Almacenamiento (gliadinas del trigo, hordeínas de la cebada) Enzimas (hidrolasas, transferasas, isomerasas, polimerasas, ligasas) Transporte (transferencia de oxígeno mediante la hemoglobina) Mensajería (insulina y ciertas hormonas) Anticuerpos (proteínas que se adhieren a partículas foráneas específicas) Regulación (proteínas involucradas en la regulación de la síntesis del ADN)

Enzimas: Descripción Los enzimas son un tipo particular de proteínas que actúan como catalizadores Cada enzima es altamente específica respecto al tipo de reacción química que cataliza y a las sustancias (llamadas sustratos) sobre los que actúa

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Proteínas 9

Enzimas: Aloenzimas e isoenzimas Las múltiples formas que toman los enzimas permiten agruparlos en dos clases principales según el modo en que estén codificados: • •

Aloenzimas: enzimas codificados por alelos diferentes en un solo locus Isoenzimas: enzimas codificados por alelos diferentes en más de un locus

Generalmente, el término isoenzimas se aplica a ambas clases.

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Proteínas 10

A veces, cambios en los aminoácidos resultan en cambios de la estructura primaria del enzima. Estos cambios generan polimorfismos.

En resumen Las proteínas son los productos primarios de los genes Las proteínas pueden tener diversas estructuras, que están estrechamente relacionadas con las tareas que realizan en la célula Los enzimas son un tipo particular de proteína, es decir, los que actúan como catalizadores Los enzimas pueden tener formas múltiples y se clasifican como aloenzimas o isoenzimas Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Proteínas 11

Hasta el momento usted debería saber La naturaleza de una proteína Los mecanismos que intervienen para dar a las proteínas diferentes estructuras La naturaleza de un enzima La diferencia entre aloenzimas e isoenzimas

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Proteínas 12

Referencia básica Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M. Gelbart. 1996. The nature of the gene. p. 345-358 en: An Introduction to Genetic Analysis (6a. ed.). W.H. Freeman., NY.

A continuación Tecnologías basadas en las proteínas Isoenzimas Tecnologías basadas en el ADN Tecnologías complementarias Consideraciones finales Glosario

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Proteínas 13

Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas: Módulo de aprendizaje

Tecnologías basadas en las proteínas Isoenzimas

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Isoenzimas 1

Contenido Detección de isoenzimas • Metodología • Electroforesis

Equipo Tecnología de los isoenzimas en imágenes Interpretación de las combinaciones de bandas Ventajas y desventajas Ejemplos de aplicaciones • Lysimachia sp. • Fríjol Lima • Cebolla Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 2

Detección de los isoenzimas: Metodología Tratamiento del material vegetal Electroforesis en geles de almidón o de acrilamida Tinción histoquímica Análisis de los patrones de bandas

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Isoenzimas 3

Los extractos crudos se someten a electroforesis en geles de almidón o de acrilamida y se tratan con tinciones específicas del enzima. El resultado es un patrón de bandas relativamente sencillo. La variación observada en los patrones de bandas entre los individuos analizados puede interpretarse genéticamente, tal como se haría con cualquier otro marcador fenotípico.

Detección de isoenzimas: Electroforesis (1) En este proceso se aplica una corriente eléctrica que favorece la separación de moléculas por su carga y por su tamaño La corriente hace que las moléculas se muevan a través de los poros del gel La sustancia que constituye el gel se escoge de modo que sus poros sean de un tamaño apropiado para poder separar moléculas de tamaños y formas específicos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 4

La electroforesis es una técnica cromatográfica que permite separar mezclas de compuestos iónicos. Se ha adoptado como una herramienta común para el análisis bioquímico.

Detección de isoenzimas: Electroforesis (2)

Cargando las muestras

Corriente eléctrica

+

Gel

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Isoenzimas 5

Las proteínas son el producto primario de los genes. Cuando cambia la secuencia de nucleótidos del ADN, también cambian los patrones de bandas de las proteínas. La electroforesis de los enzimas puede revelar directamente el polimorfismo genético puesto que exhibe las formas múltiples de un enzima específico.

Equipo Recursos: • Agua destilada o desionizada (o ambas) • Reactivos

Equipo: • Refrigerador y congelador • Fuente de energía eléctrica • Hornillo o microondas • Guantes gruesos de algodón

• Medidor de pH • Balanzas • Moldes para solidificar el gel • Matraces volumétricos y de succión

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Isoenzimas 6

La tecnología de isoenzimas en imágenes

Las siguientes fotografías ilustran las etapas de laboratorio necesarias para detectar isoenzimas

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 7

Cortesía del Dr. Pere Arús, IRTA, España

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Isoenzimas 8

El técnico de laboratorio está pipeteando la solución tampón de extracción sobre una sección de hoja. Cada muestra se coloca en una bandejita plástica, de las que suelen usarse para pesar productos químicos. Se pueden usar otros utensilios como placas de vidrio, siempre y cuando estén muy limpios y no permitan la absorción del tejido macerado.

Cortesía del Dr. Pere Arús, IRTA, España

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 9

Una vez el tampón de extracción se ha colocado sobre la muestra, ésta se machaca con una varilla de metacrilato para lograr la rotura completa del tejido y su homogeneización con la solución tampón. Esta operación debe hacerse lo más rápidamente posible para evitar un aumento de temperatura. Mientras se machacan todas las muestras, las bandejitas plásticas se van colocando sobre una capa de hielo.

Cortesía del Dr. Pere Arús, IRTA, España

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 10

Se corta un pequeño trozo rectangular de papel poroso y se mete en la bandejita en contacto con la solución, hasta que el papel absorba la muestra.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 11

Se vierte la solución caliente de almidón en el molde para el gel. A medida que el gel se enfríe, adquirirá una consistencia gelatinosa. En ese momento ya estará listo para recibir las muestras. El gel puede almacenarse en un refrigerador hasta el momento de su uso.

Cortesía del Dr. Pere Arús, IRTA, España

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 12

Un gel de almidón, preparado con antelación, se ha cortado con un bisturí, aproximadamente a un tercio desde el extremo del molde. Luego se colocan verticalmente, con ayuda de unas pinzas, los trozos de papel contra uno de los lados del corte hecho en el gel.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 13

Un aparato generador de energía eléctrica debe controlar el voltaje y la intensidad de la corriente que requiere la electroforesis. Hay muchos modelos comercialmente disponibles, que son equivalentes tanto en sus propiedades como en su capacidad. En el aparato de nuestra foto pueden enchufarse simultáneamente dos unidades de electroforesis. El generador de energía puede incluir un cronómetro para detener el proceso de electroforesis en un momento dado.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 14

El gel se coloca en una unidad de electroforesis y ésta dentro de una cámara frigorífica o de un refrigerador. La unidad tiene un recipiente de solución reguladora en dos lados opuestos (cátodo y ánodo) y el contacto entre la solución reguladora y el gel se logra con un trozo de esponjilla delgada o de gasa. Sobre la unidad se coloca una envoltura de plástico para evitar que la superficie del gel se seque durante el proceso y para garantizar una buena transferencia entre los recipientes de solución reguladora. El recorrido de las muestras puede seguirse observando un colorante azul que actúa como control o marcador.

Cortesía del Dr. Pere Arús, IRTA, España

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 15

Cuando el proceso de electroforesis termina (se observa entonces, generalmente, una sombra parduzca en el extremo opuesto a aquél en que se colocaron las muestras en el gel), el gel se corta en tajadas. En la parte frontal de la foto vemos un gel listo para ser cortado, el cual debe transferirse a un soporte de metacrilato (centro de la foto). Al fondo puede verse el recipiente en que se colocarán las tajadas para teñirlas.

Cortesía del Dr. Pere Arús, IRTA, España

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 16

El gel está ahora sobre el soporte y unas guías delgadas (en la foto, de color negro) se colocan en cada lado para definir el espesor de las tajadas. En la esquina superior derecha del gel se hace un corte en diagonal que sirve de guía para determinar el orden de las muestras una vez que las tajadas se hayan teñido.

Cortesía del Dr. Pere Arús, IRTA, España

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 17

Se coloca una placa de vidrio sobre el gel para ejercer presión mientras se hace el corte, lo que garantiza que las tajadas sean semejantes. El gel se corta empleando una sierra de marquetería equipada con una cuerda de guitarra.

Cortesía del Dr. Pere Arús, IRTA, España

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 18

Los enzimas diferentes requieren, para ser visualizados, de distintas soluciones de tinción. En la foto, una solución de tinción amarillenta se vierte en un recipiente de metacrilato antes de transferir una tajada del gel.

Cortesía del Dr. Pere Arús, IRTA, España

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 19

Una tajada de gel se está transfiriendo al recipiente que contiene la solución de tinción deseada. Dada la fragilidad de las tajadas, se debe tener cuidado al transferirlas al recipiente. Si una tajada se rompe, es frecuente que los pedazos rotos puedan reorganizarse y que los enzimas puedan aún visualizarse en el gel.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 20

Después de cierto período de incubación, una tajada de gel teñida se ve como en la fotografía, la cual muestra la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) de la hoja de esparceta (Onobrychis viciaefolia), un cultivo forrajero.

Interpretación de los patrones de bandas Los principales aspectos relacionados con la interpretación son: La estructura cuaternaria de los enzimas (si es monomérico, dimérico, etc.) La condición homocigota o heterocigota de la planta en cada locus El número exacto de loci (isoenzimas) El número de alelos por locus El tipo de herencia de los genes Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 21

Los aloenzimas están controlados por alelos codominantes, lo que significa que los homocigotos (en que todos los alelos en el locus son similares) pueden distinguirse de los heterocigotos (en que los progenitores del individuo han contribuido con diferentes alelos a este locus). En el caso de enzimas monoméricos (los que constan de un solo polipéptido), las plantas homocigóticas para un locus dado producirán una banda, mientras que las heterocigóticas producirán dos bandas. En el caso de enzimas diméricos (los que constan de dos polipéptidos), las plantas homocigóticas para ese locus producirán una banda, mientras que las heterocigóticas producirán tres bandas en razón de la asociación aleatoria de los polipéptidos. Hay también enzimas multiméricos en los que los polipéptidos son producidos por diferentes loci. La formación de heterómeros isoenzimáticos puede complicar considerablemente los patrones de bandas. Estas relaciones complejas y la importancia de interpretar los patrones de bandas correctamente, hacen deseable a veces, e incluso necesario, un análisis genético en que se haga, a su vez, un análisis de descendencias (F1, F2 y retrocruzamiento) de cruzamientos artificiales entre individuos cuyo patrón de bandas es conocido.

Ejemplo 1: Formación de homómeros Aloenzima monomérico: Homocigoto

F1

Aloenzima monomérico: Heterocigoto

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

F1

Isoenzimas 22

Este ejemplo muestra el comportamiento de los enzimas monoméricos en los cruzamientos. Los progenitores son homocigotos para el mismo alelo en el mismo locus o heterocigotos. En el primer caso, toda la descendencia F1 será homocigótica y, en consecuencia, resultará una sola banda. Si los progenitores son heterocigóticos, resultarán tres posibles fenotipos F1.

Ejemplo 2: Formación de heterómeros Aloenzima dimérico: un gen con dos alelos Monómeros •

Homocigoto

•

Heterocigoto

•

Homocigoto

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Enzima dimérico activo

Isoenzimas 23

En un cruzamiento, los enzimas diméricos pueden comportarse de tres maneras posibles. Si ambos progenitores son homocigotos para diferentes alelos en el mismo locus, toda la descendencia será heterocigota, pero a causa de la asociación aleatoria de los polipéptidos, tres combinaciones son posibles; por consiguiente, tras los procesos de electroforesis y tinción aparecerán tres bandas.

Ejemplo 3: Formación de heterómeros (continuación) Aloenzima dimérico: dos genes con dos alelos Monómeros Gen 1

Enzimas diméricos activos

Gen 2

Dímeros intragénicos

Dímeros intergénicos

Dímeros intragénicos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 24

En este segundo ejemplo con aloenzimas diméricos, los dos polipéptidos son codificados por loci separados. Los progenitores no comparten ningún alelo. La asociación aleatoria de los polipéptidos puede conducir a la formación de un total de 10 dímeros, porque se forman tanto dímeros intragénicos (entre alelos en el mismo locus) como dímeros intergénicos (entre alelos de diferentes loci).

Ejemplo 4: Formación de heterómeros (continuación) Tetraploide heterocigótico (un locus, cuatro alelos) •

Monómeros

•

Enzimas diméricos activos

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 25

En el ejemplo del diagrama, un tetraploide heterocigótico, que tiene cuatro alelos en un locus, forma diez enzimas diméricos activos gracias a la asociación aleatoria entre los cuatro monómeros.

Ventajas y desventajas Ventajas • La tecnología es sólida y sumamente reproducible • Los marcadores son codominantes, es decir, apropiados para calcular una amplia variedad de parámetros poblacionales y para construir mapas genéticos

Desventajas • Hay relativamente pocas tinciones disponibles para la detección de enzimas • El análisis está basado en el fenotipo

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 26

El análisis de isoenzimas es, en principio, un método sólido y reproducible. Además, los isoenzimas son marcadores codominantes y, por tanto, apropiados para calcular todos los parámetros poblacionales y para construir mapas genéticos. En las plantas se han empleado hasta 90 sistemas isoenzimáticos, y en muchos casos esos loci se han localizado en mapas genéticos. La mayor limitación del análisis con isoenzimas es que suministra un bajo número de marcadores, puesto que el número de ensayos histoquímicos disponibles para detectarlos es relativamente bajo. Por tanto, a menudo, el porcentaje de cobertura del genoma es inadecuado para hacer un estudio comprehensivo de la diversidad genética. Otra desventaja del análisis con isoenzimas está en que los marcadores se basan en el fenotipo. Por tal razón, los marcadores pueden estar influenciados por factores ambientales, y las diferencias de expresión causar confusión en la interpretación de los resultados. Puesto que la diferente expresión de los genes ocurre en distintos estados del desarrollo o en diferentes tejidos, es importante usar el mismo tipo de material en todos los experimentos que estén relacionados.

Ejemplos de aplicaciones Flujo de genes o introgresión (o en ambos casos) Genética de poblaciones Estrategias para la conservación ex situ de germoplasma Evolución de especies cultivadas Evaluación y caracterización del germoplasma Erosión genética Estabilidad genética del material conservado Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 27

Las referencias en color púrpura se explican en detalle en las diapositivas que vienen a continuación. Bartsch, D., M. Lehnen, J. Clegg, M. Pohl-Orf, I. Schuphan y N.C. Ellstrand. 1999. Impact of gene flow from cultivated beet on genetic diversity of wild sea beet populations. Mol. Ecol. 8:1733-1741. Finkeldey, R. y O. Murillo. 1999. Contributions of subpopulations to total gene diversity. Theor. Appl. Genet. 98:664-668. Ibáñez, O., C. Calero, M. Mayol y A. Rosello. 1999. Isozyme uniformity in a wild extinct insular plant, Lysimachia minoricensis J.J. Rodr. (Primulaceae). Mol. Ecol. 8:813-817. Ledig, F.T. 2000. Founder effects and the genetic structure of Coulter pine. J. Hered. 91(4): 307-315. Li, Z. y J.N. Rutger. 2000. Geographic distribution and multilocus organization of isozyme variation of rice (Oryza sativa L.). Theor. Appl. Genet. 101:379-387. Liu, F., R. Von Bothmer y B. Salomon. 1999. Genetic diversity among East Asian accessions of the barley core collection as revealed by six isozyme loci. Theor. Appl. Genet. 98:1226-1233. Maquet, A., I. Zoro Bi, M. Delvaux, B. Wathelet y J.P. Baudoin. 1997. Genetic structure of a Lima bean base collection using allozyme markers. Theor. Appl. Genet. 95:980-991. Ortiz, R. y Z. Huaman. 2001. Allozyme polymorphisms in tetraploid potato gene pools and the effect on human selection. Theor. Appl. Genet. 103:792-796. Rouamba, A., M. Sandmeier, A. Sarr y A. Ricroch. 2001. Allozyme variation within and among populations of onion (Allium cepa L.) from West Africa. Theor. Appl. Genet. 103:855-861. Shapcott, A. 1998. The patterns of genetic diversity in Carpentaria acuminata (Arecaceae) and rainforest history in northern Australia. Mol. Ecol. 7:833-847.

Ejemplo: Lysimachia sp. Título: Isozyme uniformity in a wild extinct insular plant, Lysimachia minoricensis J.J. Rodr. (Primulaceae). Mol. Ecol. 1999. 8:813-817

Objetivo: Evaluar la diversidad genética de las entradas de semilla de Lysimachia minoricensis, conservadas y suministradas por 10 jardines botánicos europeos

Materiales y métodos: Se analizaron, en total, 158 plantas respecto a 13 enzimas (22 loci) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 28

(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Lysimachia sp. (continuación) Resultados: No se detectó ninguna variación electroforética en ninguno de los 22 loci enzimáticos analizados

Discusión sobre la falta de variación: • Las técnicas electroforéticas resuelven sólo una porción pequeña de la variación genética • ¿La muestra era de tamaño pequeño? La muestra ofrece un 95.6% de probabilidad de detectar la existencia de cualquier variante alélica cuya frecuencia global fuera, por lo menos, de 1% • ¿Es inesperada esta ausencia de variación? Los resultados se refieren más a la pregunta de la cantidad de variación genética preservada ex situ que al nivel de variación que había antes de la extinción Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 29

(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Lysimachia sp. (continuación) Conclusiones: El sistema de intercambio entre jardines botánicos no es adecuado para la conservación eficaz del germoplasma si la variación genética dentro de una especie está subrepresentada en las colecciones

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 30

Ejemplo: Fríjol lima Título: Genetic structure of a Lima bean base collection using allozyme markers. Theor. Appl. Genet 1997. 95:980-991

Objetivo: Evaluar la diversidad genética y la estructura de una colección de base de fríjol lima (Phaseolus lunatus L.), que contenía varias entradas silvestres y razas locales, ampliamente distribuidas

Materiales y métodos: Se usaron diez sistemas enzimáticos para analizar 235 entradas de fríjol lima (1-5 semillas cada una) recogidas en América Latina y en el Caribe Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 31

(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Fríjol lima (continuación) Resultados y discusión: • •

Los 10 sistemas enzimáticos analizados detectaron 13 loci (32 alelos) Se identificaron alelos específicos en cada acervo genético. El dendrograma mostró claramente dos conglomerados principales: • Entradas de los Andes con un modelo andino de proteína de semilla • Entradas mesoamericanas y andinas con un modelo mesoamericano de proteína de semilla

• •

Tanto las razas locales andinas como mesoamericanas se agruparon con sus familiares respectivos Por término medio, el fríjol lima mostró un 76% de diversidad entre las entradas y un 24% dentro de ellas. Las razones de este resultado son la autofecundación, la presencia de poblaciones pequeñas y el escaso flujo de genes

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 32

(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Fríjol lima (continuación) Conclusiones: • Un programa de conservación de P. lunatus debe incluir formas silvestres y formas cultivadas de ambos acervos genéticos • Como la diversidad genética se distribuye principalmente entre las entradas, deberían preservarse más poblaciones o entradas para asegurarse de que se retiene la diversidad alélica y genotípica tanto de los acervos genéticos como de las formas botánicas

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 33

Ejemplo: Cebolla Título: Allozyme variation within and among populations of onion (Allium cepa L.) from West Africa. Theor. Appl. Genet. 2001. 103:855-861

Objetivo: Evaluar la diversidad genética de las poblaciones locales de cebolla, usando isoenzimas

Materiales y métodos: • Se estudiaron 16 poblaciones locales cultivadas, muestreadas en cinco países de África Occidental • Se analizaron nueve sistemas enzimáticos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 34

(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Cebolla (continuación) Resultados: • Cuatro sistemas fueron polimórficos (ADH, MDH, 6-PGDH, PGI) y hubo, en total, nueve alelos • La media de alelos encontrados por locus polimórfico fue de 2.25. Además, 67% de los alelos estaban presentes en todas las poblaciones • El alelo adh-a2 estaba ausente en las cinco poblaciones de Burkina Faso. El alelo 6-pgdh-a2 estaba presente sólo en dos poblaciones, una del sur de Níger y la otra de Nigeria del norte

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 35

(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Cebolla (continuación) Discusión: • La débil diferenciación geográfica entre poblaciones puede haber resultado del intercambio comercial entre países del mismo idioma • En general los heterocigotos fueron pocos, quizás por la autogamia de las poblaciones muestreadas o por la deriva genética resultante de la producción de semilla a partir de cantidades pequeñas de bulbos usados como progenitores

Conclusiones: Para comprender mejor la variabilidad de esta especie, sería aconsejable que se hicieran estudios similares a nivel del continente africano Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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En resumen La tecnología de los isoenzimas se basa en la extracción de las proteínas, en su separación mediante electroforesis y en su tinción histoquímica El equipo requerido es sencillo La interpretación de los patrones de bandas es típicamente codominante y, debido a su complejidad, puede necesitar un análisis genético Los isoenzimas usados como marcadores genéticos son sumamente reproducibles Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 37

Hasta el momento usted debería saber Los pasos principales que requiere la tecnología de los isoenzimas Los puntos principales que deben considerarse al interpretar los patrones de bandas Las ventajas y desventajas de los isoenzimas, como marcadores genéticos, en los estudios de diversidad

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 38

Referencias básicas Hamrick, J.L. y M.J. Godt. 1989. Allozyme diversity in plant species. p. 43-63 en Plant population genetics, breeding, and genetic resources (A.H.D. Brown, M.T. Cleg, A.L. Kahler y B.S. Weir, eds.). Sinauer Associates, Sunderland, MA, E.U. Manchenko, G.P. 1994. Handbook of detection of enzymes on electrophoretic gels. CRC Press, Boca Raton, FL, E.U. Murphy, R.W., J.W. Sites, D.G. Buth y C.H. Haufler. 1996. Proteins: isozyme electrophoresis. p. 51-20 en Molecular Systematics (2a. ed.). (D.M. Hillis, C. Moritz y B.K. Mable, eds.). Sinauer Associates, Sunderland, MA, E.U. Soltis, D.E. y P. Soltis (eds.). 1989. Isozymes in plant biology. Dioscorides Press, Portland, OR. Tanksley, S.D. y T.J. Orton (eds.). 1983. Isozymes in plant genetics and breeding. Parte A y Parte B. Elsevier Science, Amsterdam, Holanda.

A continuación Tecnologías basadas en el ADN Fundamentos del ADN Tecnologías basadas en el ADN • Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) • Tecnologías basadas en la PCR

Tecnologías complementarias Consideraciones finales Glosario Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Isoenzimas 40

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Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas: Módulo de aprendizaje

Tecnologías basadas en el ADN Fundamentos del ADN

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 1

Contenido La molécula de ADN: • • • • •

Estructura y características Replicación Empaquetamiento en el cromosoma Organización de las secuencias ADN citoplasmático

Tecnología del ADN: • Enzimas de restricción • Electroforesis de ácidos nucleicos • Polimorfismo de ADN

Procedimientos para el aislamiento del ADN, en imágenes Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 2

La molécula del ADN: Estructura y características

El ADN y el ARN son moléculas constituidas por filamentos de nucleótidos Un nucleótido consta de: • Un azúcar pentosa • Un grupo fosfato • Una base nitrogenada

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 3

Los elementos fundamentales del ácido desoxirribonucleico (ADN) y del ácido ribonucleico (ARN) son los nucleótidos. Un nucleótido consta de: • Un azúcar pentosa: en el ADN es la desoxirribosa, y en el ARN es la ribosa • Un grupo fosfato • Una base nitrogenada, que puede ser (en el ADN y en el ARN): • Bases púricas: adenina (A) o guanina (G) • Bases pirimidínicas: citosina (C) o timina (T); el uracilo (U) reemplaza la timina en el ARN La molécula de ADN consta de una cadena constituida por cuatro elementos fundamentales sencillos (A, G, C y T) que se reúnen para formar una doble hélice. Una hélice consta de dos hebras, cada una con su soporte de azúcar-fosfato, unidas por enlaces débiles de hidrógeno entre las bases adenina-timina (dos enlaces de hidrógeno) y citosina-guanina (tres enlaces de hidrógeno). La conformación de las bases A y T y la de las bases C y G son ‘complementarias’ y esta es la razón por la que el ADN puede copiarse a sí mismo. Dos cadenas de soportes y de bases, que corren en direcciones opuestas (antiparalelas) forman la estructura de la doble hélice. El orden o ´secuencia’ de estas bases a lo largo de la cadena forma el código genético que lleva las instrucciones genéticas precisas para que el organismo funcione.

La molécula del ADN: Replicación 3’

3’

3’ 5’ 5’ 5’

3’

5’ Adaptado de Griffiths y col. 1996

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 4

En ciertas circunstancias (es decir, durante la replicación del ADN celular), las dos cadenas de la molécula de ADN se separan. La ARN polimerasa sintetiza un tramo corto de ARN complementario a una de las hebras de ADN en un sitio específico, conocido como el sitio de inicio de la replicación. Esta sección corta de ARN actúa como un patrón para que comience la réplica del ADN. Nuevas bases de ADN se acercan al extremo 3’ y se adhieren a su pareja complementaria en la hebra del ADN patrón. Las nuevas bases se unen luego para hacer una cadena de ADN que es 'hija' del patrón anterior. Como los nucleótidos siempre se agregan al extremo 3’, la síntesis de ADN ocurre en la dirección que va de 5’ a 3’. Este proceso se presenta en cada una de las cadenas de la molécula de ADN original.

La molécula del ADN: Empaquetamiento en el cromosoma 20 Å

110 Å

14000 Å 300 Å {

{

3000 Å

Å = angstrom, una unidad de longitud que equivale a 1/109 m

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 5

Una molécula de ADN es mucho más larga que un cromosoma, de manera que se necesita un mecanismo para plegar densamente y empaquetar la fibra de ADN. La mezcla del material del cual se forman los cromosomas se llama cromatina, y es la suma de la molécula de ADN más algunas proteínas. En los organismos eucariotas, el ADN se condensa con proteínas histonas, con otras no histonas y con un poco de ARN. Las histonas se organizan en nucleosomas y dan al ADN enroscado una apariencia de cuenta de collar. El enroscado adicional de los nucleosomas produce una conformación de solenoide, y todavía hace falta otro nivel de empaquetamiento para llegar a la estructura cromosómica. Los cromosomas están constituidos por regiones eucromáticas, levemente empacadas y que contienen la mayoría de los genes activos, y por regiones heterocromáticas, densamente empacadas y que aparentemente desactivan los genes a su alrededor. Con frecuencia se encuentra heterocromatina alrededor de los centrómeros. [La definición de Angstrom está modificada a partir del Merriam-Webster en línea (http:/www.m-w.com)]

La molécula del ADN: Organización de las secuencias

ADN de copia única

Centrómero

ADN de copia múltiple

Telómeros

Adaptado de Flavell y Moore (1996)

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 6

El ADN eucariótico puede agruparse en diferentes tipos o clases: • De copia única, genes que codifican proteínas • ADN presente en copias múltiples: • Secuencias con función conocida Codificantes No codificantes • Secuencias con función desconocida Repeticiones (dispersas o en tándem) Transposones • ADN espaciador Se pueden encontrar numerosas repeticiones en el ADN espaciador. Constan de la misma secuencia presente en muchas localizaciones, especialmente en los centrómeros y telómeros. Las repeticiones varían en tamaño, en número y en distribución en todo el genoma, lo que las hace sumamente apropiadas para su consideración como marcadores moleculares. Referencia Flavell, R.B. y G. Moore. 1996. Plant genome constituents and their organization. En: Plant Genome Isolation: Principles and Practice (Foster, G.D. y D. Twell, eds.). John Wiley & Sons, Chichester, NY.

La molécula del ADN: ADN citoplasmático ADN citoplasmático • ADN de los cloroplastos (ADNcp) • ADN de las mitocondrias (ADNmt)

Características: • Herencia materna • Tasas dispares de evolución (orden de los genes vs. secuencia de los nucleótidos) • Acumulación lenta de mutaciones

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 7

Se encuentran cantidades pequeñas de ADN en el citoplasma, fuera del núcleo: en los cloroplastos (ADNcp) y en las mitocondrias (DNAmt). Tanto los cloroplastos como las mitocondrias tienen su propio cromosoma, del cual hay varias copias. Sus genes codifican para la traducción y la transcripción de los componentes de los organelos, y tienen funciones altamente especializadas en la expresión del fenotipo del organismo a que pertenecen. El ADN citoplásmico se hereda comúnmente, aunque no siempre, a través del progenitor materno, un modelo conocido como herencia materna. Las secuencias del ADNcp y del ADNmt tienen sus peculiaridades. El ADNmt de las plantas parece evolucionar rápidamente en lo que se refiere al orden de los genes, y lentamente en la secuencia nucleotídica. La razón de que las mutaciones se acumulen lentamente no se conoce con certeza, pero podría ser un efecto de la presencia ya sea de un mecanismo sumamente eficaz de reparación de daños del ADN o de un sistema de replicación del ADN relativamente libre de errores. En cambio, la tasa de evolución del ADNcp parece, en general, lenta, tanto en función de la secuencia nucleotídica primaria como del reordenamiento de genes.

Tecnología del ADN La tecnología del ADN incluye los conceptos de: Enzimas de restricción Electroforesis de ácidos nucleicos Polimorfismo del ADN

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 8

Enzimas de restricción Cada enzima de restricción corta el ADN en fragmentos definidos, gracias a la acción que ejerce en secuencias específicas que son su objetivo Dan lugar a extremos pegajosos o romos Los enzimas de restricción son de varios tipos:

T A G C

• Tipo I y III, que cortan el ADN de hebra o cadena doble por fuera de la secuencia de reconocimiento • Tipo II, que identifican secuencias de 4, 5 ó 6 pb y cortan por dentro de dicha secuencia Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 9

Las bacterias producen enzimas de restricción como un mecanismo de defensa contra los bacteriófagos. Estos enzimas pertenecen a una clase que parte (o corta) el ADN en posiciones internas específicas y únicas en toda su longitud. Por ello, también se los llama endonucleasas. Estas enzimas actúan como tijeras y así cortan el ADN de los fagos y los desactivan. De los tres tipos de enzimas de restricción, los tipos I y III cortan el ADN de doble cadena fuera de la secuencia de reconocimiento. En cambio, los enzimas de tipo II identifican secuencias específicas de 4, 5 ó 6 pares de bases y cortan por dentro de estas secuencias. Debido a sus características, estos tres tipos de enzimas se han tornado esenciales para la tecnología del ADN recombinante. Los enzimas pueden cortar una secuencia dada de ADN, dejando extremos escalonados (o pegajosos) que permiten la creación de puentes de hidrógeno con una secuencia complementaria (finales contusos). Cuando dos fragmentos de ADN se cortan con el mismo enzima, se producirán fragmentos que tendrán extremos pegajosos complementarios, y a ellos se podrán adherir, por tanto, fragmentos alternativos. Los enzimas de restricción están disponibles comercialmente y suelen venir con la solución tampón apropiada y con las instrucciones acerca de las condiciones y las temperaturas de reacción.

Electroforesis de ácidos nucleicos Un método para separar fragmentos de ADN y permitir su visualización o su identificación (o ambos) Fuente de energía eléctrica

Gel

-

+ Unidad de electroforesis

+

Adaptado de Griffiths y col. 1996

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 10

Después de la digestión a que es sometida por un enzima de restricción, la molécula de ADN se convierte en una colección de fragmentos de restricción. Estos fragmentos pueden separarse según su tamaño al hacerlos migrar en un gel de agarosa o de acrilamida. Para lograr esa separación, la mezcla de fragmentos de ADN y del sobrante de enzima se coloca en pocillos formados cerca de un borde del gel. El gel se somete luego a un campo eléctrico que hace migrar los fragmentos de ADN según su tamaño, de modo que los fragmentos grandes migran más lentamente que los fragmentos cortos. Las moléculas de ADN, que están cargadas negativamente a pH neutro, migran hacia el ánodo. Los geles de agarosa (de 0.8% a 2.0%) son muy útiles para separar fragmentos de ADN cuyo tamaño esté comprendido en el intervalo de 300 a 10.000 pb. Los geles de acrilamida (de 3.5% a 20%) son muy útiles para fragmentos cuyo tamaño oscile entre 20 y 1000 pb. La visualización de los fragmentos de ADN, después de la electroforesis, se logra mediante la tinción con bromuro de etidio; las moléculas de esta sustancia se colocan entre las bases del ADN y producen una fluorescencia de color anaranjado bajo la luz ultravioleta. La distancia de migración es proporcional al logaritmo del número de bases. Por consiguiente, el tamaño real de los fragmentos obtenidos puede calcularse partiendo de la movilidad de los fragmentos de ADN de tamaño conocido.

Polimorfismo del ADN Diversos sucesos pueden causar variantes, más o menos complejas, en la secuencia de nucleótidos del ADN. Tales variantes se describen, generalmente, como polimorfismos El polimorfismo se manifiesta en diferencias del genotipo —lo que se demuestra en los diversos perfiles de bandas que se detectan con un procedimiento apropiado— y quizás del fenotipo Varios sucesos pueden producir polimorfismos: • Mutaciones puntuales • Inserciones o deleciones • Rearreglos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 11

Mutaciones puntuales Las mutaciones puntuales ocurren cuando una base de la secuencia del ADN es reemplazada por otra. La longitud de la secuencia del ADN no cambia

Reemplazo

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 12

Las mutaciones puntuales pueden ocurrir en una base solamente, o en unas pocas bases del mismo sitio. En el diagrama de la diapositiva, cuatro bases de la secuencia cromosómica original (parte superior) son reemplazadas por cuatro bases alternativas. Dado que el número original de bases no cambia, la longitud total de la secuencia no se altera.

Inserciones o deleciones Las inserciones o las eliminaciones son el resultado de la adición o la desaparición de varias bases en la secuencia del ADN. La longitud de la molécula cambia Deleción

Inserción

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 13

La parte superior del diagrama ilustra una deleción: se pierden algunas bases y el fragmento de ADN resultante se vuelve más corto. La mitad inferior del diagrama ilustra una inserción: se introducen algunas bases en una sección de la secuencia del ADN. La secuencia original se torna, por tanto, más larga según el número de bases que se hayan insertado.

Rearreglos Los reordenamientos cromosómicos ocurren como resultado de la recombinación genética o de la inserción de elementos transponibles. La longitud de la molécula puede cambiar o quedar igual

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 14

También pueden darse cambios en la secuencia del ADN debidos a los reordenamientos; por ejemplo, cuando un segmento se da la vuelta. En estos casos, aunque quizás no cambie la longitud de la secuencia del ADN, su composición puede cambiar suficientemente para que se observe en este caso un polimorfismo.

Procedimiento de aislamiento del ADN en imágenes Las siguientes fotografías ilustran los diversos pasos del procedimiento para aislar ADN

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 15

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 16

El técnico de laboratorio está recolectando unas pocas hojas, muy jóvenes, de tomate para hacer una extracción pequeña de ADN. Para una extracción grande, se recolectarían muchas más hojas y más grandes (cerca de 10 g) de plantas más viejas.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 17

El tejido de la hoja (para las extracciones pequeñas de ADN) y la solución tampón se convierten en una mezcla homogénea en un tubo de centrífuga de 1.5 ml, empleando un taladro equipado con un vástago de plástico. Para aumentar la eficiencia, se pueden usar dos taladros simultáneamente, que pueden ser controlados con pedales como los usados en las máquinas de coser.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 18

Para extracciones grandes de ADN, el tejido de la hoja se homogeneiza con una solución tampón de extracción en batidoras estándar de cocina. Aunque no sean necesarios por razones de seguridad, sí conviene usar guantes y un delantal de laboratorio para proteger la ropa y la piel, ya que puede haber salpicaduras durante el procedimiento.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 19

La mezcla del tejido foliar y solución tampón se vierte de la batidora, a través de una gasa, en botellas de centrífuga colocadas sobre un lecho de hielo. Se exprime la gasa para obtener tanto líquido como sea posible reteniendo en el filtro los pedazos grandes de tejido foliar, que luego se descartan junto con el filtro.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 20

Después de centrifugar y resuspender la bolita (pellet) de ADN (que es todavía verde y contiene algo de material foliar), la mezcla se transfiere a un tubo nuevo al que se le agrega cloroformo. Este paso debe realizarse en una campana extractora con ventilación, y deben usarse guantes de seguridad y una bata de laboratorio.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 21

Los tubos se invierten primero para mezclar suavemente el cloroformo y luego se centrifugan para separar el ADN.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 22

La capa más clara, que contiene el ADN, está ahora en la parte superior y puede ser transferida a un tubo limpio. La capa inferior contiene tejido foliar no deseado, paredes celulares y otros residuos, y se descarta.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 23

Se agrega alcohol para precipitar el ADN, el cual, mediante una inversión suave, se congrega generalmente como una sustancia filamentosa. Este ADN puede ser retirado con un gancho o centrifugado. Luego se lava y se resuspende.

En resumen Los elementos fundamentales del ADN son los nucleótidos, que se unen haciendo una doble hélice con la que se forma la cadena del ADN La molécula del ADN se pliega cada vez más a medida que la secuencia de los nucleótidos le da forma al cromosoma El ADN se organiza en diferentes clases: de copia única, de copia múltiple y espaciador Las mitocondrias y los cloroplastos tienen su propia molécula de ADN Varios sucesos causan polimorfismos en la molécula de ADN: las mutaciones puntuales, las inserciones, las deleciones y los rearreglos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 24

Hasta el momento usted debería saber Los componentes de un nucleótido De qué modo los nucleótidos forman la doble hélice del ADN Las diferentes clases de ADN Las características principales del ADN citoplasmático Lo que es un enzima de restricción La forma en que se producen los polimorfismos en la cadena de ADN Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 25

Referencias básicas Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M. Gelbart. 1996. An introduction to genetic analysis (6a. ed.). W.H. Freeman, Nueva York. Lewin, B. 1994. Genes V. Oxford University Press. Schleif, R. 1993. Genetics and molecular biology (2a. ed.). Johns Hopkins University Press, Baltimore, MD, E.U. Singer, M. y P. Berg. 1991. Genes and genomes. University Science Books, Mill Valley, CA, E.U. Watson, J.D., N.H. Hopkins, J.W. Roberts, J.A. Steitz y A.M. Weiner. 1987. Molecular biology of the gene (4a. ed.). Vol. I: General principles. Benjamin/Cummings Publishing, Menlo Park, CA, E.U.

A continuación Tecnologías basadas en el ADN Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) Tecnologías basadas en el ADN • Tecnologías basadas en la PCR

Tecnologías complementarias Consideraciones finales Glosario Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 26

Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas: Módulo de aprendizaje

Tecnologías basadas en el ADN Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 1

Contenido Tecnología RFLP • • • • •

Aislamiento del ADN Digestión de restricción y electroforesis Transferencia del ADN por el método Southern Hibridación del ADN Equipo

Tecnología RFLP en imágenes Interpretación de las bandas RFLP Ventajas y desventajas de los RFLP Ejemplos de aplicaciones • Maíz • Trigo • Pino escocés Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 2

Tecnología RFLP La detección del RFLP se basa en la posibilidad de comparar patrones de bandas generados mediante la digestión con enzimas de restricción del ADN patrón. Las etapas de laboratorio son: Aislamiento del ADN Digestión y electroforesis Transferencia del ADN por el método Southern Hibridación del ADN • Procedimiento • Sonda de ADN • Fuentes de sondas

Equipo Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 3

El análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) fue una de las primeras técnicas que se usó ampliamente para detectar variaciones a nivel de la secuencia del ADN. Esta tecnología se basa en el principio de que es posible comparar patrones de bandas generados a partir de moléculas de ADN de diferentes individuos que han sido sometidas a digestión con enzimas de restricción. Las diversas mutaciones que afectan a las moléculas de ADN de muchas maneras producen fragmentos de longitud variable. Estas diferencias de longitud de los fragmentos pueden observarse una vez realizadas la electroforesis, la hibridación y la visualización.

Aislamiento del ADN Se extrae ADN total de las células de la planta Alternativamente, puede usarse el ADN cloroplástico y el mitocondrial El ADN debe estar limpio y debe tener elevado peso molecular Complicaciones: • • • •

Rotura durante el aislamiento ADN degradado por las nucleasas Polisacáridos aislados junto con el ADN Aislamiento de metabolitos secundarios

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 4

El aislamiento del ADN es el primer paso en las tecnologías moleculares. El ADN se encuentra tanto en los cromosomas nucleares como en los organelos (mitocondrias y cloroplastos). Para extraer el ADN del sitio en que se halla, son necesarios varios pasos de laboratorio para romper la pared celular y la membrana nuclear, y separar apropiadamente el ADN de otros componentes celulares. Mientras se hace esto, hay que asegurarse cuidadosamente de que el proceso no dañe la molécula de ADN y de que ésta se recupere en forma de una hebra larga.

Digestión de restricción y electroforesis

+ Es necesaria la hibridación para detectar fragmentos específicos

+

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

-

RFLP 5

El ADN extraído es digerido con enzimas de restricción específicos, cuidadosamente elegidos. Cada enzima de restricción, en condiciones apropiadas, reconocerá el ADN y lo cortará de manera predecible, dando lugar a un conjunto reproducible de fragmentos de ADN (‘fragmentos de restricción') de diferentes longitudes. Los millones de fragmentos de restricción así obtenidos son separados comúnmente mediante electroforesis en geles de agarosa. Dado que los fragmentos se verían como un rastro continuo si el gel se tiñera con bromuro de etidio, la sola tinción no puede detectar los polimorfismos. Por consiguiente, debe recurrirse a la hibridación para detectar fragmentos específicos.

Transferencia del ADN por el método Southern Peso

Membrana Gel

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 6

La transferencia del ADN se realiza por el método Southern, nombre tomado de E.M. Southern (1975), quién inventó la técnica. En este método, primero se desnaturaliza el gel en una solución básica y se pone en una bandeja. Se coloca sobre el gel una membrana porosa de nylon o de nitrocelulosa y al conjunto se le superpone un peso. Todos los fragmentos de restricción de ADN que estaban en el gel se transfieren, como cadenas simples a la membrana por acción capilar. Todos los fragmentos conservan en la membrana el mismo patrón que tenían en el gel. Referencia Southern, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-517.

Hibridación del ADN: El procedimiento ADN adherido a la membrana

Hibridado con la sonda

Sonda hibridada

Se descarta el sobrante de sonda

Película expuesta a rayos X

Adaptado de Griffiths y col. 1996

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 7

La membrana con el ADN patrón se incuba con la sonda de ADN. Las condiciones de incubación son tales que si las cadenas de ADN de la membrana son complementarias a las de la sonda, se dará la hibridación y se formarán duplos marcados. En condiciones muy rigurosas, no ocurrirá la hibridación con un ADN que no sea homólogo o no emparentado. De este modo, la sonda reconoce las secuencias complementarias e “idealmente” homólogas entre los miles o millones de fragmentos no detectados que migran a través del gel. Los fragmentos deseados se pueden detectar después de que haya una exposición simultánea de la membrana hibridada y una película fotográfica.

Hibridación del ADN: La sonda ADN total o ADNc

Los clones recombinantes se seleccionan y siguen creciendo

ADN digerido

+

Selección de fragmentos de ADN según su tamaño

Los clones se dejan crecer en una placa

Fragmento del ADN patrón

Vector extraído de bacterias y abierto

El fragmento de ADN se inserta en el vector

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

El vector recombinante se introduce en las bacterias y se clona

RFLP 8

Para detectar el subconjunto de fragmentos de ADN que interesan, de entre todos los fragmentos generados por la digestión con restricción, se necesita una sonda. La sonda de ADN generalmente proviene de una genoteca de ADN (ADN genómico o complementario), que es una colección de vectores (por ejemplo plásmidos) que contiene una representación de una molécula de ADN original cortada en pedazos. Los vectores se pueden transformar en bacterias y pueden multiplicar muchas veces el pedazo de ADN que contienen. La sonda de ADN también se convierte en una molécula de cadena simple, se marca convenientemente usando cualquier método estándar (por ejemplo un radioisótopo o digoxigenina), y se hibrida con el ADN patrón que está adherido a la membrana.

Hibridación del ADN: Fuentes de sondas (1) ADN nuclear: • Genotecas genómicas • ADNc

ADN citoplasmático La especificidad de muchas sondas de copia única requiere que se construyan genotecas cuando se estudian nuevas especies. Sin embargo, a menudo pueden usarse sondas de géneros emparentados Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 9

Entre las fuentes de sondas de ADN están las siguientes: • Genotecas genómicas: en ellas el ADN total de la planta se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos individuales se clonan en un vector que puede ser un plásmido de una bacteria o un virus. Se seleccionan sondas apropiadas de esta genoteca ‘anónima’ para el análisis de RFLP. • Genotecas de ADNc (ADN complementario): el RNAm se aísla y se transcribe en ADN, usando el enzima transcriptasa reversa. El ADNc obtenido se clona en vectores y se usa como genoteca para sondas en el análisis de RFLP. • ADN citoplasmático: genotecas de ADN mitocondrial y cloroplástico. Como resultado de la especificidad mostrada por muchas sondas de copia única, a menudo deben construirse genotecas genómicas o de ADNc para estudios sobre especies nuevas. Este trabajo puede requerir mucho tiempo. Sin embargo, el conocimiento actual acerca de secuencias y genes comunes permite usar con frecuencia sondas de géneros emparentados.

Hibridación del ADN: Fuentes de sondas (2) Secuencias repetitivas o de tipo minisatélite: • Repetición básica de 10 a 60 pb en tándem • Altamente variables entre individuos del género humano • Polimorfismos en el número de unidades repetidas (también llamados VNTR)

En las plantas, para detectar secuencias minisatélite se han usado sondas provenientes de una repetición interna del gen de la proteína III del bacteriófago M13 Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 10

Las secuencias repetitivas de tipo minisatélite tienen también su aplicación específica en el análisis de RFLP. Son repeticiones de secuencias de un ‘motivo’ básico. Miden de 10 a 60 pb, se encuentran en tándem (es decir, en unión de cabeza con cola) y se dan en muchos loci del genoma. El trabajo con marcadores minisatélite de plantas fue el resultado de estudios pioneros sobre el genoma humano hechos por Jeffreys y col. (1985a, b), en los que se demostró que los marcadores minisatélite eran sumamente variables en los seres humanos. Dado que los polimorfismos están relacionados con el número de unidades repetidas, las secuencias también se han llamado número variable de repeticiones en tándem (VNTR; Nakamura et al. 1987). Una sonda seleccionada adecuadamente puede detectar fragmentos de restricción que representan un gran número de loci. En la película, los patrones de fragmentos de restricción que contienen minisatélites (la denominada ‘huella identificadora’ del ADN) permiten discriminar claramente entre diferentes individuos.

Referencias Jeffreys, A.J., V. Wilson y S.L. Thein.1985a. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature 314:67-73. Jeffreys, A.J., V. Wilson y S.L.Thein.1985b. Individual-specific "fingerprints" of human DNA. Nature 316:76-79. Nakamura, Y., M. Leppert, P. O'Connell, R. Wolff, T. Holm, M. Culver, C. Martin, E. Fujimoto, M. Hoff, E. Kumlin y R. White. 1987. Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) markers for human gene mapping. Science 235:1616-1622. Rogstad, S.H., J.C. Patton, II y B.A. Schaal. 1988. M13 repeat probe detects DNA minisatellite-like sequences in gymnosperms and angiosperms. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 85: 9176-9178. Ryskov, A.P., A.G. Jincharadze, M.I. Prosnyak, P.L. Ivanov y S.A. Limborska. 1988. M13 phage DNA as a universal marker for DNA fingerprinting of animals, plants and microorganisms. FEBS Lett. 233:388-392.

Equipo Recursos: • Agua destilada o desionizada (o ambas) • Reactivos

Equipo: • Refrigerador y congelador • Campana extractora de flujo laminar • Centrífuga • Fuente de energía eléctrica • Hornillo o microondas Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

• Medidor de pH • Balanza estándar • Unidades de electroforesis • Cuarto oscuro • Transiluminador ultravioleta RFLP 11

Tecnología RFLP en imágenes

Las siguientes diapositivas ilustran los pasos del procedimiento para detectar RFLP

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 12

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 13

Después de que la agarosa se haya vertido en el molde del gel, se insertan de inmediato los peines para formar los pocillos y se dejan allí hasta que endurezca el gel. Luego se retiran los peines y el gel se coloca en una cubeta de electroforesis.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 14

Las muestras del ADN digerido, a las que se añadió colorante de azul de bromofenol, se descargan en los pocillos con una pipeta.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 15

Después de la electroforesis, el gel se trata con NaCl para romper los enlaces de la doble hélice del ADN y convertirlo en cadenas simples. Esto permite lograr luego la hibridación con una sonda de ADN de cadena simple.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 16

Primero se prepara la bandeja para hacer la transferencia saturando las esponjas con NaOH. Se requieren gafas de seguridad y guantes y se recomienda el uso de una bata de laboratorio. Deben seguirse los reglamentos de seguridad de la institución donde se trabaja.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 17

Se coloca papel absorbente encima de las esponjas para impedir el contacto directo con el gel.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 18

Se quitan las burbujas entre el papel absorbente y las esponjas haciendo rodar una pipeta o una varilla de vidrio por encima del papel. Esta operación asegura una transferencia completa de la solución a través del gel.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 19

Los espacios libres entre las esponjas y la bandeja se cubren con tiras plásticas para prevenir la evaporación, porque ésta reduciría la eficiencia de la transferencia.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

El gel de agarosa tratado se coloca encima del papel absorbente.

RFLP 20

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 21

Se hacen salir las burbujas que haya entre el gel y el papel oprimiendo contra éste una varilla de vidrio mientras se la hace rodar.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

La membrana se corta según el tamaño apropiado.

RFLP 22

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 23

Se coloca la membrana encima del gel, y luego se cubre con una hoja de papel absorbente.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 24

Se coloca un bloque de papel poroso (p.e., toallitas de papel o papel periódico) encima del papel absorbente que protege la membrana.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 25

Sobre todo este conjunto se coloca un peso (en la foto, una botella de agua que descansa en una lámina de vidrio) para promover una buena transferencia. Después de unas horas, la transferencia se ha completado; se quita entonces el papel secante y la membrana se almacena hasta el momento de la hibridación con la sonda.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 26

Empieza el proceso de la hibridación. Un ADN denominado bloqueador (porque minimiza la hibridación de fondo que se realiza con la membrana) se hierve para desnaturalizarlo a cadenas simples.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 27

La membrana se coloca en un recipiente plástico junto con la solución de hibridación apropiada y el ADN bloqueador y preincubado.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 28

Se añade la sonda marcada al recipiente que contiene la solución de hibridación y la membrana, y se incuba el conjunto toda la noche en un horno. Al día siguiente se saca la membrana del recipiente de hibridación y se lava con la solución restringente apropiada. (Nota: Las medidas de seguridad varían según las instituciones; por favor, revise las de la institución en que usted trabaja)

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 29

Se seca la membrana con papel absorbente y se mete en una carpeta como las que contienen películas de rayos X.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 30

Pasando a un cuarto oscuro, se inserta también en la carpeta una película de rayos X.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 31

La carpeta se envuelve, o se sella con cinta adhesiva, y se almacena en un congelador hasta que la película haya estado expuesta suficiente tiempo, generalmente de 1 a 4 días.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

La foto muestra un autorradiograma de RFLP.

RFLP 32

RFLP en imágenes: Resumen Sitio de restricción

Sonda

A Digestión

B A

B

Mutación = un nuevo sitio de restricción

Transferencia

Electroforesis Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Hibridación RFLP 33

Interpretación de las bandas RFLP (1) Una mutación crea un nuevo sitio de restricción dentro de la región de interés. Por consiguiente, se detectan dos bandas más pequeñas en la película Sitio de restricción

Nuevo sitio de restricción

A

A

B

B Sonda

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 34

El resultado ideal de la tecnología de RFLP es una serie de bandas en un gel, que pueden calificarse ahora ya sea por su presencia o por su ausencia, o como marcadores codominantes. Las diferencias entre genotipos se visualizan generalmente como un patrón variado de fragmentos de restricción de ADN. En ésta y en las siguientes diapositivas se presentan los diferentes casos de mutación que son responsables de los polimorfismos detectados mediante el análisis de RFLP. En el diagrama anterior, una mutación crea un sitio de restricción nuevo en el segmento A, precisamente en el sitio de reconocimiento de la sonda. En consecuencia, la sonda hibridará simultáneamente con los dos segmentos creados por el enzima. En el segmento B no ha habido mutación, y sólo un segmento hibridará con la sonda. Durante la electroforesis, los dos segmentos de A migrarán más lejos en el gel que el segmento hibridado en B y el polimorfismo como tal se observará en el gel del modo indicado en el cuadrado a la derecha de la imagen.

Interpretación de las bandas RFLP (2) Una mutación crea un nuevo sitio de restricción entre sitios de restricción contiguos, creando un fragmento de restricción más corto Sitio de restricción

Nuevo sitio de restricción

A

A

B

B Sonda

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 35

En este caso una mutación crea un nuevo sitio de restricción en el segmento A. Sin embargo, el nuevo sitio aparece a un lado del lugar de reconocimiento de la sonda. En consecuencia, sólo un fragmento hibridará en el segmento A y sólo uno en el segmento B. El polimorfismo se mostrará como un fragmento hibridado en A que es más corto que el hibridado en B. El fragmento más corto, a su vez, migrará más lejos en el gel (ver el cuadrado, a la derecha).

Interpretación de las bandas RFLP (3) Una inserción de una secuencia de ADN entre sitios de restricción contiguos crea un fragmento de restricción más largo Sitio de restricción

Inserción ocurrida

A

A

B

B Sonda

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 36

Si tiene lugar un caso de inserción entre dos sitios de restricción (segmento A), el fragmento hibridado será más largo. Como resultado, se observará un polimorfismo entre los individuos A y B, en el sentido de que el fragmento hibridado en A será más largo que el hibridado en B y su distancia de migración más corta (ver cuadrado, a la derecha).

Interpretación de las bandas RFLP (4) Una deleción de una secuencia de ADN entre sitios de restricción contiguos crea un fragmento de restricción más corto Sitio de restricción

Deleción ocurrida

A

A

B

B Sonda

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 37

Si ocurre una deleción entre sitios de restricción adyacentes, la sonda hibridará con un segmento más corto. Esta acción se observará en el gel como un polimorfismo con un fragmento que migró más lejos para el individuo A (ver cuadrado, a la derecha).

Interpretación de las bandas RFLP (5) Uno de los sitios de restricción adyacentes cambia o se pierde a causa de una mutación o una deleción. En consecuencia, el fragmento de restricción se altera Sitio de restricción

Sitio perdido

A

A

B

B Sonda

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 38

Si queda sólo un sitio de restricción, no se genera ningún fragmento de restricción, y no habrá hibridación. Si el cambio generó un sitio nuevo, el nuevo fragmento hibridará y mostrará un patrón de bandas diferente que el de un individuo en que no se produjo un cambio.

Ventajas de los RFLP Metodología sumamente sólida y muy transferible entre laboratorios Se heredan en forma codominante y, como tales, pueden estimar heterocigosidad No se requiere información acerca de la secuencia del ADN Muy recomendables para el análisis filogenético de especies emparentadas porque se basan en la homología de las secuencias Adecuado para construir mapas de ligamiento genético Marcadores específicos del locus que permiten hacer estudios de sintenia Poder discriminatorio: tanto a nivel de especie o de población (sondas de copia única) como a nivel de individuo (sondas de copia múltiple) Simplicidad: si se dispone de sondas adecuadas, la técnica puede aplicarse fácilmente a cualquier planta Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 39

Desventajas de los RFLP Requieren cantidades grandes de ADN No permiten la automatización Bajos niveles de polimorfismo en algunas especies Pocos loci detectados por ensayo Necesitan disponer de una genoteca de sondas apropiadas Lentos, especialmente con sondas de copia única Costosos Requieren la distribución de sondas a los laboratorios colaboradores Tienen exigencias técnicas moderadas Pueden necesitar diferentes combinaciones de sonda/enzima Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 40

Ejemplos de aplicaciones Diversidad genética Relaciones genéticas Historia de la domesticación Origen y evolución de las especies Deriva genética y selección Cartografía de genomas y de tipo comparativo Localización de genes Descubrimiento de genes valiosos de especies silvestres Construcción de genotecas exóticas Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 41

En las siguientes diapositivas se tratarán en detalle las referencias impresas en color púrpura. Ahn, S. y S.D. Tanksley. 1993. Comparative linkage maps of the rice and maize genomes. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 90(17):7980-7984. Autrique, E., R.P. Singh, S.D. Tanksley y M.E. Sorrells. 1995. Molecular markers for four leaf rust resistance genes introgressed into wheat from wild relatives. Genome 38(1):75-83. de Vicente, M.C. y S.D. Tanksley. 1993. QTL analysis of transgressive segregation in an interspecific tomato cross. Genetics 134(2):585-596. de Vicente, M.C., M.J. Truco, J. Truco, J. Egea, L. Burgos y P. Arús. 1998. RFLP variability in apricot (Prunus armeniaca L.). Plant Breed. 117:153-158. Dubreuil, P. y A. Charcosset. 1999. Relationships among maize inbred lines and populations from European and North American origins as estimated using RFLP markers. Theor. Appl. Genet. 99:473-480. Enjalbert, J., I. Goldringer, S. Paillard y P. Brabant. 1999. Molecular markers to study genetic drift and selection in wheat populations. J. Expl Bot. 50(332):283-290. Lagercrantz, U. y D.J. Lydiate. 1996. Comparative genome mapping in Brassica. Genetics 144(4):1903-1910. Sinclair, W.T., J.D. Morman y R.A. Ennos. 1999. The postglacial history of Scots pine (Pinus sylvestris L.) in western Europe: evidence from mitochondrial DNA variation. Mol. Ecol. 8:83-88. Sun, C.Q., X.K. Wang, Z.C. Li, A. Yoshimura y N. Iwata. 2001. Comparison of the genetic diversity of common wild rice (Oryza rufipogon Griff.) and cultivated rice (O. sativa L.) using RFLP markers. Theor. Appl. Genet. 102:157-162. Tanksley, S.D., M.W. Ganal, J.P. Prince, M.C. de Vicente, M.W. Bonierbale, P. Broun, T.M. Fulton, J.J. Giovannoni, S. Grandillo, G.B. Martin, R. Messeguer, J.C. Miller, L. Miller, A.H. Paterson, O. Pineda, M.S. Röder, R.A. Wing, W. Wu y N.D. Young. 1992. High density molecular linkage maps of the tomato and potato genomes. Genetics 132:1141-1160. Tanksley, S.D. y S.R. McCouch. 1997. Seed banks and molecular maps: unlocking genetic potential from the wild. Science 277:1063-1066. Zamir, D. 2001. Improving plant breeding with exotic genetic libraries. Genetics 2:983-989.

Ejemplo: Maíz Título: Relationships among maize inbred lines and populations from European and North American origins as estimated using RFLP markers. Theor. Appl. Genet. 1999. 99:473-480

Objetivo: Estudiar las relaciones genéticas entre líneas puras de grupos heteróticos conocidos y razas locales de gran importancia histórica en el desarrollo del material élite

Materiales y métodos: Se analizaron 62 líneas puras de grupos heteróticos conocidos y 10 poblaciones de maíz (cerca de 30 individuos por población) respecto a 28 loci de RFLP (29 combinaciones diferentes de sonda/enzima) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 42

(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Maíz (continuación) Resultados: La comparación de alelos específicos de cada tipo de germoplasma mostró un déficit de alelos dentro de las líneas, que representaba cerca del 22% de la riqueza alélica total de las poblaciones: • Las asociaciones entre líneas puras y poblaciones resultaron compatibles con los datos genealógicos de las líneas puras y aportaron nueva información sobre la base genética de los grupos heteróticos • Las líneas puras europeas mostraron ser tan cercanas a la población estudiada del nordeste de Estados Unidos como a las típicas poblaciones europeas Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 43

(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Maíz (continuación) Discusión: Las poblaciones representan reservorios importantes de diversidad, y no es probable que el germoplasma selecto contenga todos los alelos útiles Pregunta: ¿Cómo puede el grupo heterótico europeo estar más cerca de las poblaciones del nordeste de Estados Unidos de tipo 'Compton's Early' que de las demás poblaciones de los Estados Unidos?

Conclusiones: Los resultados indican que debería estudiarse un conjunto más grande de poblaciones empleando marcadores moleculares, con el fin de diseñar estrategias apropiadas para que se usen con la máxima efectividad estos recursos genéticos en los programas de fitomejoramiento Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 44

Ejemplo: Trigo Título: Molecular markers to study genetic drift and selection in wheat populations. J. Expl. Bot. 1999. 50(332): 283-290

Objetivo: Comparar las frecuencias alélicas de poblaciones de trigo que han estado sometidas a selección natural

Materiales y métodos: Se estudiaron respecto a 30 loci dos poblaciones originales y seis subpoblaciones derivadas, que se cultivaron durante 10 años en lugares contrastantes Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 45

(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Trigo (continuación) Resultados y discusión: La diferenciación entre subpoblaciones basada en la diversidad de RFLP fue muy significativa: • Se encontró que la variación de frecuencias alélicas era mucho mayor que la esperada considerando la deriva genética solamente. La selección influyó mucho en la evolución de las poblaciones • Algunos loci mostraron mayor diferenciación que otros. Esto puede haber indicado que estaban genéticamente ligados a otros loci polimórficos relacionados con la adaptación

Conclusiones: Las variaciones de frecuencias alélicas observadas respecto a los marcadores RFLP no pueden explicarse por la evolución bajo deriva genética solamente, sino también por efectos directos o indirectos de la selección Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 46

Ejemplo: Pino escocés Título: The postglacial history of Scots pine (Pinus sylvestris L.) in Western Europe: evidence from mitochondrial DNA variation. Mol. Ecol. 1999. 8:83-88

Objetivo: Investigar la estructura geográfica de las variantes del ADN mitocondrial en poblaciones de pino escocés del oeste de Europa

Materiales y métodos: Se estudiaron 20 poblaciones de P. sylvestris de Escocia y 18 de Europa continental (21 individuos por población, en promedio), empleando el análisis RFLP de ADN total Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 47

(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Pino escocés (continuación) Resultados: Se detectaron tres patrones principales de RFLP para el ADNmt (mitotipos a, b y d): • En España se encontraron los tres mitotipos. La diversidad génica fue alta y se distribuyó predominantemente entre las poblaciones más que dentro de ellas. El mitotipo d sólo estuvo presente en la población más sureña (Sierra Nevada, España) • Las poblaciones italianas estaban fijadas para el mitotipo b. Las poblaciones del norte de Francia, de Alemania, de Polonia, de Rusia y del sur de Suecia estaban fijadas para el mitotipo a. Las poblaciones del norte de Fennoscandia (Noruega, Suecia y Finlandia) estaban fijadas para el mitotipo b • En Escocia, el mitotipo a se hallaba, en su mayoría, fijado. El mitotipo b estaba presente en algunas poblaciones polimórficas Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 48

(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Pino escocés (continuación) Discusión: • La detección de diferentes mitotipos fue una prueba inequívoca de las diferencias genéticas existentes en el genoma de las mitocondrias. La diversidad de mitotipos en las poblaciones españolas indica que o bien descienden de los que sobrevivieron en refugios durante la última glaciación o representan reliquias del Terciario que han sobrevivido como poblaciones aisladas • En Europa, después de la era glacial, P. sylvestris inició, aparentemente, su progresión en tres direcciones evolutivas, por lo menos, cada una de origen diferente: España, Norte de centro Europa y Norte de Fennoscandia

Conclusiones: Estudios de marcadores de ADNmt heredados por vía materna pueden arrojar luz sobre la historia de las especies y ayudar a definir zonas geográficas en las que hay germoplasma que debería conservarse Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 49

En resumen La tecnología RFLP detecta cambios en longitud en las moléculas de ADN después de ser sometidas a digestión con enzimas de restricción Las bandas del RFLP se detectan cuando el ADN de interés hibrida con una sonda de ADN Los patrones de bandas RFLP reflejan diferentes casos de mutación en el sitio de hibridación de la sonda o en la región contigua a ella RFLP es una tecnología sumamente sólida, pero es lenta y técnicamente exigente Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 50

Hasta el momento usted debería saber Los pasos principales que comprende la detección de los RFLP Las distintas fuentes de sondas El efecto de los diferentes casos de mutación en la detección de los patrones de bandas RFLP Las ventajas y desventajas de la tecnología RFLP para el análisis de la diversidad genética Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 51

Referencias básicas Botstein, D., R.L. White, M. Skolnick y R.W. Davis. 1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Human Genet. 32:314-331. Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M. Gelbart. 1996. An introduction to genetic analysis (6a. ed.). W.H. Freeman, NY, E.U. Jeffreys, A.J., V. Wilson y S.L. Thein.1985a. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature 314:67-73. Jeffreys, A.J., V. Wilson y S.L.Thein.1985b. Individual-specific "fingerprints" of human DNA. Nature 316:76-79. Nakamura, Y., M. Leppert, P. O'Connell, R. Wolff, T. Holm, M. Culver, C. Martin, E. Fujimoto, M. Hoff, E. Kumlin y R. White. 1987. Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) markers for human gene mapping. Science 235:1616-1622. Rogstad, S.H., J.C. Patton, II y B.A. Schaal. 1988. M13 repeat probe detects DNA minisatellite-like sequences in gymnosperms and angiosperms. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 85:9176-9178. Ryskov, A.P., A.G. Jincharadze, M.I. Prosnyak, P.L. Ivanov y S.A. Limborska. 1988. M13 phage DNA as a universal marker for DNA fingerprinting of animals, plants and microorganisms. FEBS Lett. 233:388-392. Southern, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503-517.

A continuación Tecnologías basadas en el ADN Tecnologías basadas en la PCR Fundamentos de la PCR

Tecnologías basadas en el ADN • Tecnologías basadas en la PCR • PCR con cebadores arbitrarios • Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP) • Sitios de secuencia etiquetada (STS) • Últimas estrategias

Tecnologías complementarias Consideraciones finales Glosario Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

RFLP 52

Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas: Módulo de aprendizaje Tecnologías basadas en el ADN

Tecnologías basadas en la PCR Fundamentos de la PCR

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

PCR 1

Contenido La reacción en cadena de la polimerasa Procedimientos de la PCR: • • • • • • • •

Etapas Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Condiciones de los ciclos Condiciones para la mezcla de la reacción Componentes Equipo

Tecnología de la PCR en imágenes Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

PCR 2

La reacción en cadena de la polimerasa La PCR es un método rápido, de bajo costo y sencillo para copiar fragmentos específicos de ADN a partir de cantidades mínimas de ADN original • Comprende la preparación de la muestra del ADN y de una mezcla maestra de cebadores, y luego la detección de los productos de reacción • La detección no requiere necesariamente el uso de radioisótopos o de productos químicos tóxicos

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

PCR 3

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Erlich, 1989) es una técnica potente que se ha convertido rápidamente en una de las más ampliamente usadas en la biología molecular porque es rápida, de bajo costo y sencilla. La técnica amplifica fragmentos específicos de ADN a partir de cantidades mínimas del ADN patrón, aun cuando ese ADN sea de calidad relativamente baja. Referencia Erlich, H.A. 1989. PCR technology: principles and applications for DNA amplifications. Stockton Press, NY, E.U.

Procedimientos de la PCR: Etapas Desnaturalización: La reacción se calienta a altas temperaturas para reducir la doble hélice del ADN a cadenas simples. Estas cadenas se tornan accesibles a los cebadores Hibridación: Se enfría la mezcla de reacción. Los cebadores hibridan con las regiones complementarias de las cadenas del ADN patrón, y se forman nuevamente cadenas dobles entre los cebadores y las secuencias complementarias Extensión: La Taq polimerasa sintetiza una cadena complementaria. El enzima lee la secuencia de la cadena opuesta y extiende los cebadores agregando nucleótidos en el orden en que pueden emparejarse. El proceso entero se repite una y otra vez Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

PCR 4

El ADN polimerasa, conocido como ‘Taq polymerasa’, se denominó así por la bacteria Thermus aquaticus que fue aislada originalmente de aguas termales. El enzima puede resistir las altas temperaturas necesarias para la separación de las cadenas del ADN, permaneciendo en el tubo de la reacción. El ciclo de calentamiento y enfriamiento se repite una y otra vez, lo que estimula a los cebadores a unirse a las secuencias originales y a las secuencias recién sintetizadas. El enzima volverá a alargar las secuencias del cebador. Este ciclo de temperaturas produce copias y luego copias de copias, y así sucesivamente, lo que lleva a un aumento exponencial del número de copias de determinadas secuencias. Dado que la cantidad de ADN colocado en el tubo al comienzo es muy pequeña, casi todo el ADN presente al final de los ciclos de reacción pertenece a secuencias copiadas. Los productos de la reacción se separan mediante electroforesis. Según la cantidad producida y el tamaño del fragmento amplificado, los productos de reacción se pueden visualizar directamente tiñendo con bromuro de etidio o con tinción de plata, o mediante radioisótopos y autorradiografía.

Procedimientos de la PCR: Ciclo 1 ADN patrón de doble cadena Desnaturalización 5’

3’

3’

5’ Hibridación

5’

3’

3’

Cebador 1 5’

Cebador 2

Extensión

Sitio de reconocimiento del cebador

5’ 3’

3’ 5’

{

5’ 3’ Adaptado de Griffiths y col. 1996

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

{

3’ 5’

Sitio de reconocimiento del cebador

PCR 5

Las etapas de la PCR se llevan a cabo, una tras otra, en episodios cíclicos. El ciclo 1 es como sigue: •

Durante la desnaturalización (cerca de 1 min a 95°C), las cadenas del ADN se separan para formar cadenas sencillas.

•

Durante la hibridación (cerca de 1 min a temperaturas que oscilan entre 45°C y 60°C), un cebador se une a una cadena de ADN y otro se une a la cadena complementaria. Los sitios de hibridación de los cebadores se han elegido para que fomenten la síntesis del ADN en la región de interés durante la extensión.

•

Durante la extensión (cerca de 1 min a 72°C), la síntesis del ADN se lleva a cabo en la región de interés y con distancias variables en la región flanqueante, produciendo fragmentos de longitudes variables.

Procedimientos de la PCR: Ciclo 2 ADN original

ADN recientemente sintetizado 5’ ADN patrón 3’ en el 2o ciclo 5’ 3’

3’ 5’ 3’ 5’ Desnaturalización

5’ 3’

3’ 5’

3’ 5’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

3’ 5’

5’ 3’

3’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

Hibridación 5’ 3’

5’

5’

3’

3’

5’ Extensión

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Adaptado de Griffiths y col. 1996

PCR 6

Cuando comienza el segundo ciclo, hay en realidad dos tipos de patrón: (1) las cadenas del ADN original; y (2) las cadenas del ADN recién sintetizadas, que constan de la región de interés y de fragmentos de longitud variable de la región flanqueante, en el extremo 3’. Cuando se usa este último patrón en este ciclo, solamente se copia la región de interés.

Procedimientos de la PCR: Ciclo 3

ADN patrón en el 3er ciclo Desnaturalización

Extensión

Hibridación

Y así sucesivamente Adaptado de Griffiths y col. 1996

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

PCR 7

En el tercer ciclo, la región de interés recién sintetizada (es decir, sin regiones flanqueantes) actúa como patrón. La molécula de ADN original está todavía presente y lo estará hasta el final de la reacción. Sin embargo, después de unos pocos ciclos, el fragmento de ADN recién sintetizado se establece rápidamente como el patrón predominante. Lo usual es que los ciclos se repitan de 25 a 45 veces. La normalización de las condiciones de funcionamiento del termociclador es esencial para poder reproducir los resultados.

Procedimientos de la PCR: Condiciones de los ciclos Desnaturalización completa del patrón de ADN Temperatura óptima para la hibridación Temperatura óptima para la extensión Número de ciclos de la PCR Etapa final de extensión

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

PCR 8

En la etapa inicial de desnaturalización, es esencial que se desnaturalice completamente el patrón de ADN. La desnaturalización incompleta del ADN dará como resultado el uso ineficiente del patrón en el primer ciclo de amplificación y, en consecuencia, en un escaso rendimiento del producto de la PCR. La temperatura de hibridación se calcula en 5°C por debajo de la temperatura de fusión del duplo cebador-patrón de ADN. Si se obtienen productos de la PCR no específicos, además del producto esperado, la temperatura de hibridación se puede optimizar aumentándola por incrementos de 1 a 2°C. La etapa de extensión se realiza, generalmente, a 72°C y una extensión de 1 min es suficiente para sintetizar fragmentos de PCR de hasta 2 kb (kb = kilobase = 1000 pb). Cuando se amplifican fragmentos de ADN más grandes, el tiempo generalmente se extiende a razón de 1 min por cada 1000 pb. El número de ciclos de la PCR dependerá, básicamente, del rendimiento esperado del producto de la PCR. Después del último ciclo, las muestras suelen incubarse a 72°C durante 5 min para completar los extremos que sobresalen de los productos de la PCR recién sintetizados.

Procedimientos de la PCR: Condiciones de la mezcla de reacción Hay que evitar la contaminación del ADN con las siguientes medidas: Separando las zonas de extracción del ADN y de la PCR Empleando equipo de laboratorio dedicado a un solo uso Esterilizando en autoclave y haciendo alícuotas Añadiendo una reacción testigo Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

PCR 9

Algunos consejos útiles: •

La extracción del ADN y la preparación y el procesamiento de la mezcla de reacción de la PCR deben hacerse en zonas separadas.

•

Se recomienda emplear recipientes dedicados a un solo uso, pipetas de desplazamiento positivo y puntas de pipeta diferentes para cada muestra de ADN y para cada preparación de mezcla.

•

Todas las soluciones, excepto la de los dNTP, de los cebadores y de la Taq polimerasa, deben esterilizarse en autoclave. Cuando sea posible, las soluciones deben repartirse en cantidades pequeñas y almacenarse en zonas designadas para la PCR.

•

Una buena práctica, para confirmar la ausencia de contaminación, es añadir una reacción testigo sin el ADN patrón.

Procedimientos de la PCR: Componentes Componentes:

Consideraciones:

• Agua desionizada estéril • Solución tampón de PCR 10X • Mezcla de dNTP • Cebador • Taq polimerasa • MgCl2 • ADN patrón

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

• ADN patrón • Cebadores • Concentración de MgCl2 • Taq polimerasa • dNTP

PCR 10

Actualmente hay muchas máquinas de PCR disponibles en formatos de 48, 96 ó 384 pocillos. Esta opción, combinada con el uso de pipetas multicanal, puede aumentar enormemente el número de reacciones que se pueden hacer simultáneamente. Para preparar varias reacciones a la vez, se debe hacer una mezcla maestra que contenga lo siguiente: agua, solución tampón, dNTP, cebadores, MgCl2 y Taq polimerasa, en un solo tubo. Luego se repartirán alícuotas en los tubos individuales. Consideraciones: ADN patrón. Casi todos los métodos estándar de extracción de ADN son apropiados. La cantidad adecuada está entre 0.1 y 1 µg de ADN genómico, para una mezcla total de reacción de 100 µl. Cantidades más grandes de ADN patrón elevan, generalmente, el rendimiento de productos de la PCR no específicos. Cebadores. (1) Los cebadores de la PCR deben tener entre 10 y 24 nucleótidos de longitud. (2) El contenido de GC debe estar entre 40% y 60%. (3) El cebador no debe ser auto-complementario o complementario de otro cebador en la mezcla de reacción, para evitar así la formación de dímeros de cebadores u horquillas. (4) Las temperaturas de fusión de los pares de cebadores no deben diferir en más de 5°C, de modo que tanto el contenido de GC como la longitud se deben elegir adecuadamente. (5) Las temperaturas de fusión y de hibridación de un cebador se calculan así: si la longitud del cebador es menor que 25 nucleótidos, el valor de la temperatura de fusión se calcula con la fórmula: Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T). (6) La temperatura de hibridación debe ser, aproximadamente, 5°C inferior que la temperatura de fusión. Concentración de MgCl2. Puesto que los iones Mg++ forman complejos con los dNTP, con los cebadores y los patrones de ADN, hay que establecer la concentración óptima de MgCl2 para cada experimento. Si los iones Mg++ son demasiado escasos, se obtiene un bajo rendimiento del producto de la PCR y si son demasiado abundantes, aumentará el rendimiento de productos no específicos. El intervalo recomendado de concentración de MgCl2 es de 1 a 3 mM, en las condiciones de reacción estándar especificadas. Taq polimerasa. Si las concentraciones de Taq polimerasa son mayores que las requeridas pueden sintetizarse productos no específicos. dNTP. La concentración de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) en la mezcla de reacción es, generalmente, de 200 µM. Se debe comprobar que estas concentraciones sean iguales, porque una inexactitud aumentará el grado de incorporación errónea.

Procedimientos de la PCR: Equipo Micropipetas Termociclador Unidades de electroforesis Fuente de energía eléctrica Equipo fotográfico

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PCR 11

Tecnología de la PCR en imágenes

Las siguientes fotografías muestran la forma en que se lleva a cabo la tecnología de la PCR

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PCR 12

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PCR 13

La mezcla para la PCR se prepara sobre hielo. No se requiere ropa de seguridad, pero ésta puede beneficiar la reacción a menos que se practiquen buenas técnicas de manejo estéril.

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Los tubos de reacción se colocan en el termociclador.

PCR 14

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Se cierra el termociclador, se bloquea y se programa.

PCR 15

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PCR 16

Hay diferentes tipos de termocicladores: el de color negro es una tétrada, y en él se pueden procesar simultáneamente 4 conjuntos de 96 muestras. Los cuatro más pequeños, de color blanco tienen, cada uno, una capacidad de 96 pocillos.

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PCR 17

Según el tamaño de las bandas que generó la PCR y de la discriminación que se requiera, la visualización de las bandas puede lograrse mediante un gel de agarosa corriente y horizontal, o con un gel de secuenciación vertical de acrilamida (ver la próxima diapositiva). En esta diapositiva, los productos migran en un gel de agarosa.

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PCR 18

El gel de acrilamida puede procesarse en una unidad independiente o en un secuenciador automático. La preparación del gel de secuenciación, aunque es un poco compleja, es similar para ambos casos. En esta diapositiva se limpia el vidrio y se seca antes de preparar el gel que se usará en un secuenciador automático.

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PCR 19

Las placas de vidrio se insertan en el marco, que se colocará en el secuenciador.

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PCR 20

Las placas de vidrio se sujetan firmemente en su sitio, y se alista toda la unidad para verter en ella el gel.

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PCR 21

El gel de acrilamida líquido se vierte en el molde. Puesto que la acrilamida es un carcinógeno, debe usarse ropa de protección.

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PCR 22

Las pinzas sujetan los bordes inferiores de las placas de vidrio para impedir que haya fugas de gel.

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PCR 23

Se inserta un peine en el extremo superior del gel para formar los pocillos en los que se depositarán las muestras.

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PCR 24

Una vez que el gel se solidifica, la unidad se coloca en el aparato secuenciador.

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Las muestras son tomadas con una multi-pipeta…

PCR 25

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...y se cargan en los pocillos del gel.

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PCR 27

Esta diapositiva es una toma de cerca de la fotografía anterior. Observe que los pocillos son de tamaño muy pequeño lo mismo que las puntas de pipeta, lo que permite cargar muchas muestras en cada gel.

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PCR 28

Se coloca una placa de calentamiento contra el gel para garantizar una temperatura de funcionamiento constante.

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Se vierte la solución tampón en el reservorio superior del gel…

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…y en el reservorio inferior.

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Se le da un vistazo final, luego se cierra la puerta y empieza el programa.

PCR 31

En resumen La PCR es una técnica sencilla para obtener múltiples copias de fragmentos específicos de ADN La PCR comprende tres etapas: desnaturalización, hibridación y extensión Para que el éxito sea seguro, hay que tener cuidado tanto en preparar bien la mezcla de reacción como en establecer las condiciones óptimas de los ciclos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

PCR 32

Hasta el momento usted debería saber El fundamento en que se basa la PCR Los elementos que pueden afectar, paso por paso, el desempeño de la PCR, y los efectos que tendrían en sus resultados

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PCR 33

Referencias básicas Erlich, H.A. 1989. PCR technology: principles and applications for DNA amplifications. Stockton Press, NY, E.U. Erlich, H.A. y N. Arnheim. 1992. Genetic analysis using the polymerase chain reaction. Ann. Rev. Genet. 26:479-506. Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M. Gelbart. 1996. An introduction to genetic analysis (6a. ed.). W.H. Freeman y Co., NY, E.U. Newton, C.R. y A. Graham. 1994. PCR, Parte 1: Basic principles and methods. EngBios Scientific Publishers, Oxford, U.K. Saiki, R.K., D.H. Gelfand, S. Stoffel, S.J. Scharf, R. Higuchi, G.T. Horn, K.B. Mullis y H.A. Erlich. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239:487-491.

A continuación Tecnologías basadas en el ADN Tecnologías basadas en la PCR PCR con cebadores arbitrarios

Tecnologías basadas en el ADN • Tecnologías basadas en la PCR • Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP) • Sitios de secuencia etiquetada (STS) • Últimas estrategias

Tecnologías complementarias Consideraciones finales Glosario Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

PCR 34

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Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas: Módulo de aprendizaje Tecnologías basadas en el ADN

Tecnologías basadas en la PCR PCR con cebadores arbitrarios (RAPD, DAF, AP-PCR)

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Cebadores arbitrarios 1

Contenido PCR con cebadores arbitrarios Tecnología RAPD, paso a paso: • Aislamiento del ADN • Reacción en cadena de la polimerasa • Detección del producto de RAPD • Diagrama de resumen Equipo Interpretación de los patrones de bandas RAPD Ventajas y desventajas de los RAPD Ejemplos de aplicaciones • Festuca pratensis • Pimiento • Rosa Diferencias: DAF y las tecnologías de la AP-PCR Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Cebadores arbitrarios 2

PCR con cebadores arbitrarios MAAP (caracterización con ‘amplicones’ múltiples arbitrarios) es la sigla propuesta para incluir las tres tecnologías principales que corresponden a esta categoría: • Polimorfismo de ADN amplificado al azar (RAPD) • Amplificación de la huella de ADN (DAF) • Reacción en cadena de la polimerasa iniciada al azar (AP-PCR)

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Cebadores arbitrarios 3

Tres técnicas principales se inscriben dentro de la categoría de marcadores basados en la PCR usando cebadores arbitrarios: RAPD, DAF y AP-PCR. MAAP es la sigla propuesta por Caetano-Anollés et al. (1992), aunque no suele usarse, para incluir estas técnicas estrechamente relacionadas. En este submódulo se prestará atención especial a los RAPD y al final se hará una comparación entre los RAPD y las técnicas DAF y APPCR. Referencia Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1992. DNA fingerprinting: MAAPing out a RAPD redefinition? Bio/Technology 10 (9):937.

Tecnología RAPD, paso a paso Características principales: • Emplea un cebador aleatorio corto (generalmente, de 10 bases) • Amplifica trozos anónimos de ADN

Etapas de laboratorio: • Aislamiento del ADN • PCR con un cebador • Separación de los fragmentos de ADN mediante electroforesis • Visualización de los fragmentos de ADN con bromuro de etidio Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Cebadores arbitrarios 4

La técnica para detectar polimorfismo en el ADN amplificado al azar (RAPD) es un método basado en la PCR, en el que se emplea un cebador corto (generalmente, de 10 bases) para amplificar porciones anónimas de ADN. Con esta técnica no se busca ningún fragmento de ADN específico, ya que el cebador se adherirá al ADN patrón en secuencias complementarias de ubicación desconocida. En consecuencia, no se conocerá la naturaleza de los productos obtenidos. Los fragmentos de ADN así generados se separan y se detectan mediante electroforesis.

Aislamiento del ADN Se puede usar ADN total, cloroplástico o mitocondrial • Cantidades diminutas de ADN son suficientes • El ADN debe estar limpio y su peso molecular debe ser elevado

Si no es posible obtener un ADN de calidad mínima, será difícil garantizar la reproducibilidad de los resultados

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Cebadores arbitrarios 5

Reacción en cadena de la polimerasa Componentes de la PCR Los cebadores (10 bases de longitud) se consiguen de diferentes proveedores comerciales Es habitual la adición de MgCl2 Los ciclos de hibridación (acoplamiento de los cebadores al ADN patrón) se realizan a temperaturas bajas (cerca de 40°C) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Cebadores arbitrarios 6

Los componentes que necesita la PCR se tratan en el submódulo “Nociones básicas de la PCR”. Aquí sólo se usa un cebador corto (generalmente de 10 pb de longitud). Los cebadores con estas características están comercialmente disponibles de marcas diferentes. A menudo se agrega una concentración de MgCl2 para promover la amplificación de más bandas durante la reacción. Sin embargo, se debe tener cuidado de determinar la concentración apropiada para cada caso, lo que evitará la aparición de productos no específicos. Entre las condiciones de la PCR está, generalmente, un ciclo de hibridación a baja temperatura (aproximadamente 40°C) que estimulará la hibridación entre el cebador y el ADN y dará lugar a una cantidad suficiente de productos. Además, se debe impedir la aparición de productos no específicos, y esto puede hacerse determinando la temperatura apropiada en que no aparecerán bandas ‘fantasma’.

Detección de productos RAPD Electroforesis de geles de agarosa o de acrilamida y visualización con bromuro de etidio

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Cebadores arbitrarios 7

Los RAPD pueden detectarse al migrar los productos de la PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa o de acrilamida. En ambos casos, el gel se tiñe con bromuro de etidio. La diferencia entre hacer migrar los productos del RAPD en acrilamida o en agarosa está solamente en el grado de resolución de las bandas. En la mayoría de los casos, la electroforesis en geles de agarosa proporciona suficiente resolución.

Diagrama de resumen A

Banda amplificada

D

Cebador

E

B G C

F

Molécula de ADN

Gel E C A D B F

Adaptado de Griffiths y col. 1996

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Cebadores arbitrarios 8

Equipo Recursos: • Agua destilada o desionizada (o ambas) • Reactivos

Equipo: • Refrigerador y congelador • Campana extractora de flujo laminar • Centrífuga • Termociclador • Fuente de energía eléctrica

• • • •

Hornillo o microondas Medidor de pH Balanza Unidades de electroforesis • Transiluminador de luz ultravioleta

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Cebadores arbitrarios 9

Interpretación de patrones de bandas RAPD (1) El polimorfismo del ADN en un grupo de individuos puede deberse a: Ensamblaje frustrado en el sitio del cebador Aparición de un nuevo sitio de reconocimiento del cebador Longitud de la región amplificada entre los sitios de reconocimiento del cebador

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Cebadores arbitrarios 10

Interpretación de patrones de bandas RAPD (2) A causa de la naturaleza de los marcadores RAPD, sólo puede evaluarse la presencia o la ausencia de una banda. Los criterios para seleccionar bandas que califican son: Reproducibilidad: es necesario obtener los mismos resultados en experimentos repetidos Espesor (de la banda) Tamaño Observación de la segregación esperada en una población segregante Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Cebadores arbitrarios 11

Interpretación de patrones de bandas RAPD: Ejemplo de un gel RAPD de mala calidad

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Cebadores arbitrarios 12

Esta foto es una imagen de un gel de RAPD de mala calidad. Las bandas son borrosas. Las de la parte superior tienen una sombra que comienza en el pocillo donde se cargó el producto de la PCR y muchas se observan con dificultad. El fondo difuso complica la observación: ¿en qué casos hay una banda o hay dos lado a lado? Algunas bandas son claras, sin duda, y podrían tenerse en cuenta, pero otras muchas son dudosas y su interpretación sería sumamente arriesgada. Esas dificultades hacen dudar de la confianza que merecen los datos obtenidos.

Interpretación de patrones de bandas RAPD: Ejemplo de un gel RAPD de buena calidad

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Cebadores arbitrarios 13

Esta foto es una imagen de un gel de RAPD de buena calidad. Tanto la presencia como la ausencia de la mayoría de las bandas son datos claros y el fondo es transparente. El investigador no tendría dudas al seleccionar las bandas y tomar datos de este gel. En consecuencia, la interpretación de los resultados sería muy fiable.

Ventajas de los RAPDs Número alto de fragmentos Técnica sencilla Los cebadores arbitrarios se adquieren fácilmente, y no requieren de información inicial de tipo genético o genómico Se requieren cantidades diminutas del ADN patrón Los costos unitarios por ensayo son bajos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Cebadores arbitrarios 14

Algunos comentarios: • Normalmente se amplifican muchos fragmentos diferentes (que corresponden a múltiples loci dispersos por todo el genoma) empleando un solo cebador. Por consiguiente, la técnica es rápida para detectar polimorfismos. Aunque la mayoría de los cebadores comerciales dan lugar a varios fragmentos, algunos cebadores pueden fallar en la amplificación de fragmentos de algunos materiales. • La técnica es sencilla. El análisis de RAPD no requiere la pericia especial con que se maneja la hibridación del ADN a membranas u otras actividades más especializadas.

Desventajas de los RAPDs De herencia dominante Falta de conocimiento previo de la identidad de los productos de la amplificación Problemas de reproducibilidad Problemas por co-migración

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Los marcadores de RAPD son dominantes. La amplificación ocurre en un locus o no ocurre, lo que exige considerar las bandas partiendo de su presencia o de ausencia. Esto significa que los homocigotos y los heterocigotos no pueden distinguirse. Además, la ausencia de una banda debida a la falta de una secuencia determinada no puede distinguirse de la ausencia debida a la falta de amplificación por otras razones (por ejemplo, porque el ADN era de calidad deficiente), lo que contribuye a la ambigüedad en la interpretación de los resultados. No se sabe nada acerca de la identidad de los productos de amplificación a menos que los estudios estén apoyados en análisis de herencia. Los problemas de reproducibilidad provienen de que la tecnología de RAPD es sensible a los cambios en la calidad del ADN, en los componentes de la PCR y en las condiciones de la PCR, todo lo cual ocasiona cambios en los fragmentos amplificados. Se pueden obtener resultados reproducibles si se tiene cuidado de estandarizar las condiciones de los experimentos (Munthali y col., 1992; Lowe y col., 1996). Los problemas de co-migración motivan preguntas como ésta: “¿Corresponden las bandas de igual tamaño al mismo fragmento de ADN?” •

La presencia de una banda de idéntico peso molecular en diferentes individuos no es, por sí misma, una prueba de que los individuos comparten el mismo fragmento de ADN (fragmento `homólogo`).

•

Una banda detectada en un gel como banda sola puede en realidad comprender diferentes productos de amplificación. Esto ocurre porque el tipo de electroforesis usado, aunque es capaz de separar el ADN cuantitativamente (es decir, según el tamaño), no puede separar los fragmentos de igual tamaño cualitativamente (es decir, según la secuencia de las bases).

Referencias Lowe, A.J., O. Hanotte y L. Guarino. 1996. Standardization of molecular genetic techniques for the characterization of germplasm collections: the case of random amplified polymorphic DNA (RAPD). Plant Genet. Resour. Newsl. 107:50-54. Munthali, M., B.V. Ford-Lloyd y H.J. Newbury. 1992. The random amplification of polymorphic DNA for fingerprinting plants. PCR Methods Appl. 1(4):274-276.

Ejemplos de aplicaciones Diversidad genética Caracterización de germoplasma Estructura genética de poblaciones Domesticación Detección de variación somaclonal Identificación de cultivares Pureza híbrida Cartografía genética Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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Las referencias en color púrpura se explican detalladamente en las siguientes diapositivas. Cattan-Toupance, I., Y. Michalakis y C. Neema. 1998. Genetic structure of wild bean populations in their South Andean centre of origin. Theor. Appl. Genet. 96:844-851. Cristofani, M., M.A. Machado y D. Grattapaglia. 1999. Genetic linkage maps of Citrus sunki Hort. ex. Tan. and Poncirus trifoliata (L.) Raf. and mapping of citrus resistance gene. Euphytica 109(1):25-32. Hashmi, G., R. Huettel, R. Meyer, L. Krusberg y F. Hammerschlag. 1997. RAPD analysis of somaclonal variants derived from embryo callus cultures of peach. Plant Cell Rep 16(9): 624-627. Kölliker, R., F.J. Stadelmann, B. Breidy y J. Nösberger. 1998. Fertilization and defoliation frequency affect genetic diversity of Festuca pratensis Huds. In permanent grasslands. Mol. Ecol. 7:1557-1567. Martelli, G., F. Sunseri, I. Greco, M.R. Sabina, P. Porreca y A. Levi. 1999. Strawberry cultivars genetic relationship using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. Adv. Hortic. Sci. 13(3):99-104. Martin, M., F. Piola, D. Chessel, M. Jay y P. Heizmann. 2001. The domestication process of the Modern Rose: genetic structure and allelic composition of the rose complex. Theor. Appl. Genet. 102:398-404. Morden, C.W. y W. Loeffler. 1999. Fragmentation and genetic differentiation among subpopulations of the endangered Hawaiian mint Haplostachys haplostachya (Lamiaceae). Mol. Ecol. 8:617-625. Nebauer, S.G., L. del Castillo-Agudo y J. Segura. 1999. RAPD variation within and among natural populations of outcrossing willow-leaved foxglove (Digitalis obscura L.). Theor. Appl. Genet. 98:985-994. Rodríguez, J.M., T. Berke, L. Engle y J. Nienhuis. 1999. Variation among and within Capsicum species revealed by RAPD markers. Theor. Appl. Genet. 99:147-156. Rom, M., M. Bar, A. Rom, M. Pilowsky y D. Gidoni. 1995. Purity control of F1-hybrid tomato cultivars by RAPD markers. Plant Breed. 114(2):188-190.

Ejemplo: Festuca pratensis Título: Fertilization and defoliation frequency affect genetic diversity of Festuca pratensis Huds. in permanent grasslands. Mol. Ecol. 1998. 7:1557-1567

Objetivo: Evaluar la variabilidad genética de Festuca pratensis y determinar si la frecuencia de fertilización y de defoliación afectan la variabilidad genética dentro de las poblaciones naturales

Materiales y métodos: • Se estudiaron 6 poblaciones naturales y 3 cultivares de Festuca pratensis mediante 69 marcadores RAPD (13 cebadores) y 7 caracteres agronómicos • Se tomaron muestras de las poblaciones naturales de dos experimentos de largo plazo no relacionados entre sí, en los que se habían aplicado tratamientos durante períodos que iban de 11 a 38 años Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Festuca pratensis (continuación) Resultados: • El análisis factorial de los caracteres agronómicos no permitió separar los cultivares de las otras poblaciones • El análisis de agrupamiento con los datos de RAPD señaló una clara distinción entre cultivares y poblaciones naturales • La variabilidad genética dentro de cultivares fue inferior que dentro de poblaciones naturales • El análisis de la varianza molecular (AMOVA) mostró un efecto significativo del manejo sobre la variación genética Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Festuca pratensis (continuación) Discusión: Existe variación genética significativa dentro de los cultivares y de las poblaciones naturales de Festuca pratensis. Sin embargo, la fertilización y alta frecuencia de corte pueden reducirla

Conclusiones: Las poblaciones de Festuca pratensis no fertilizadas y raramente cortadas deben conservarse como un acervo genético. Se necesitan estudios adicionales sobre otras especies para aprender más acerca de la forma en que los sistemas de manejo afectan la diversidad de las comunidades vegetales y la arquitectura genética de la especie Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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Ejemplo: Pimiento Título: Variation among and within Capsicum species revealed by RAPD markers. Theor. Appl. Genet. 1999. 99:147-156

Objetivo: Caracterizar el germoplasma de especies de Capsicum

Materiales y métodos: Se caracterizaron 134 entradas de seis especies de Capsicum, conservadas en el banco de germoplasma del Asian Vegetable Research and Development Center (AVRDC), empleando 110 marcadores RAPD (25 cebadores) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Pimiento (continuación) Resultados y discusión: •

Se documentó la existencia de 10 pares de entradas que podían estar duplicadas • Se identificaron RAPD de diagnóstico que se emplearon para mejorar la identificación taxonómica. También podrían usarse para verificar la hibridación natural y artificial • Tres entradas de Capsicum que estaban mal clasificadas según sus caracteres morfológicos, fueron re-identificadas con los RAPD de diagnóstico • Se asignaron tres entradas, no clasificadas antes, a una especie partiendo de los RAPD de diagnóstico • Las entradas de Capsicum annuum del banco no fueron diferentes de las líneas del programa de fitomejoramiento respecto a la variación o diversidad indicada por los marcadores RAPD Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Pimiento (continuación) Conclusiones: El programa de mejoramiento de pimiento del AVRDC trabaja, al parecer, con una diversidad que es representativa de su colección en el banco de germoplasma. Los marcadores moleculares pueden ser útiles para racionalizar el manejo de una colección ex situ (por ejemplo, identifican duplicados o errores taxonómicos)

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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Ejemplo: Rosa Título: The domestication process of the Modern Rose: genetic structure and allelic composition of the rose complex. Theor. Appl. Genet. 2001. 102:398-404

Objetivo: Evaluar la variabilidad genética existente entre variedades cultivadas de rosa e investigar la historia de su fitomejoramiento

Materiales y métodos: Se seleccionaron, de 13 grupos horticulturales, 100 variedades antiguas de rosa cultivada por el modo en que definieron las etapas sucesivas de su domesticación. Se estudiaron mediante AP-PCR con cinco cebadores largos (de 20 bp) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Rosa (continuación) Resultados y discusión: • Se produjeron 58 fragmentos polimórficos de ADN, de los cuales 55 fueron informativos y discriminatorios, y permitieron diferenciar casi todos los 100 cultivares • Un dendrograma mostró las relaciones existentes entre las rosas de fundación chinas y europeas, los grupos híbridos de la primera y segunda generaciones, y los híbridos más modernos producidos durante la domesticación • El análisis de componentes principales demostró la existencia de un gradiente continuo en la proporción entre alelos europeos y alelos chinos, y una considerable reducción de la variabilidad genética en el curso de la domesticación Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Rosa (continuación) Conclusiones: El efecto de la selección de un rango limitado de caracteres morfológicos resultó en la retención de un bajo número de alelos durante la domesticación de la rosa. La rosa tiene mucha más variación genética de la que se ha usado hasta ahora. Debe estudiarse la posibilidad de seleccionar diversas variantes con nuevos y valiosos caracteres estéticos para desarrollar más variedades Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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Diferencias entre las tecnologías DAF y RAPD Respecto a la DAF: Las concentraciones de cebador son más altas Se usan cebadores más cortos (de 5 a 8 nucleótidos) Un ciclo de dos temperaturas en lugar de un ciclo de 3 temperaturas (usado en RAPD) Obtención de combinaciones de bandas sumamente complejas Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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Referencias Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1991a. DNA amplification fingerprinting: a strategy for genome analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 9(4):294-307. Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1991b. DNA amplification using very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/Technology 9:553-557.

Diferencias entre las tecnologías AP-PCR y RAPD Respecto a AP-PCR: La amplificación se realiza en tres partes, cada una con sus propios requisitos y concentración de elementos constitutivos Se emplean concentraciones altas del cebador en los primeros ciclos de la PCR Se eligen arbitrariamente cebadores de longitud variable y diseñados, a veces, para otros fines (por ejemplo, el cebador universal de análisis de secuencias M13) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Cebadores arbitrarios 27

Referencia Welsh, J. y M. McClelland. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18(24):7213-7218.

En resumen La tecnología RAPD se basa en una PCR sencilla con un solo cebador arbitrario y corto La técnica RAPD produce fácilmente un número notable de bandas, pero sus marcadores son dominantes y son frecuentes los problemas de reproducibilidad DAF y AP-PCR son tecnologías alternas respecto a los RAPD, pero más complejas

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Cebadores arbitrarios 28

Hasta el momento usted debería saber Las características principales del procedimiento de RAPD Las causas de los polimorfismos de la molécula de ADN que pueden detectarse con RAPD Los criterios para la selección de bandas RAPD para análisis de diversidad genética Las ventajas y las desventajas de la tecnología RAPD Las diferencias principales de la DAF y de la AP-PCR con respecto a la tecnología de RAPD Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Cebadores arbitrarios 29

Referencias bá sicas Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1991a. DNA amplification fingerprinting: a strategy for genome analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 9(4):294-307. Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1991b. DNA amplification using very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/Technology 9:553-557. Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1992. DNA fingerprinting: MAAPing out a RAPD redefinition? Bio/Technology 10(9):937. Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M. Gelbart. 1996. An introduction to genetic analysis (6th edn.). W.H. Freeman, NY, E.U. Lowe, A.J., O. Hanotte y L. Guarino. 1996. Standardization of molecular genetic techniques for the characterization of germplasm collections: the case of random amplified polymorphic DNA (RAPD). Plant Genet. Resour. Newsl. 107:50-54. Munthali, M., B.V. Ford-Lloyd y H.J. Newbury. 1992. The random amplification of polymorphic DNA for fingerprinting plants. PCR Methods Appl. 1(4):274-276. Welsh, J. y M. McClelland. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18(24):7213-7218. Williams, J.G.K., A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski y V. Tingey. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18(22):6531-6535.

A continuación Tecnologías basadas en el ADN Tecnologías basadas en la PCR Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP)

Tecnologías basadas en el ADN • Tecnologías basadas en la PCR • Sitios de secuencia etiquetada (STS) • Últimas estrategias

Tecnologías complementarias Consideraciones finales Glosario Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Cebadores arbitrarios 30

Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas: Módulo de aprendizaje Tecnologías basadas en el ADN

Tecnologías basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

AFLP 1

Contenido La tecnología AFLP, paso a paso: • • • •

Cuatro etapas Digestión del ADN y ligación Reacciones de la PCR y su detección Resumen de la tecnología

Equipo Interpretación de las bandas AFLP Ventajas y desventajas de los AFLP Ejemplos de aplicaciones • Limonium sp. • Stylosanthes spp. • Mostaza india Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

AFLP 2

La tecnología AFLP*, paso a paso Características principales: Es una combinación de las tecnologías de RFLP y de PCR Está basada en la amplificación selectiva de los fragmentos de restricción mediante la PCR Es un método muy sensible para caracterizar el ADN cualquiera que sea su origen y su complejidad Se puede aplicar con ADN genómico total o con ADNc (‘perfiles de transcripción’) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

AFLP 3

* La técnica de AFLP fue propuesta por KeyGene (Holanda), una empresa privada de biotecnología que adquirió los derechos de propiedad de esa tecnología. Para más información, vea la página web de KeyGene: http:/www.keygene.com

Referencia Zabeau, M. y P. Vos. 1993. Selective restriction amplification: a general method for DNA fingerprinting. Publicación Europea de Patente 92402629 (Publicación No. EP0534858A1).

Cuatro etapas El ADN es digerido con dos enzimas de restricción diferentes Adaptadores oligonucleótidos se ligan a los extremos de los fragmentos de ADN Se amplifican subconjuntos específicos de los productos de digestión del ADN empleando combinaciones de cebadores selectivos Se detecta el polimorfismo empleando radioisótopos, colorantes fluorescentes o tinción de plata Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

AFLP 4

Digestión del ADN y ligación Uno de los enzimas de restricción hace cortes frecuentes (su sitio de reconocimiento es de cuatro bases, por ejemplo MseI) El segundo enzima de restricción hace cortes infrecuentes (su sitio de reconocimiento es de seis bases, por ejemplo EcoRI) Se ligan a los fragmentos de ADN generados adaptadores sintéticos de doble cadena, que son específicos de cada sitio de restricción Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

AFLP 5

El ADN objeto de estudio se digiere con dos enzimas de restricción diferentes, uno de los cuales hace cortes frecuentes (el enzima de restricción de cuatro bases) y el otro hace cortes poco frecuentes (el enzima de restricción de seis bases). Se pueden usar diversas combinaciones de enzima/cebador. MseI y EcoRI son más apropiados en los genomas ricos en pares adenina-timina (AT), dado que generan menos fragmentos en los genomas ricos en pares guanina-citosina (GC). Hecho esto, se ligan unos adaptadores sintéticos, específicos de cada sitio de restricción, al ADN digerido. Tanto la etapa de restricción como la etapa de ligación se pueden realizar en una sola reacción.

Reacciones de la PCR y su detección Se realiza una primera PCR (preselectiva), usando cebadores oligonucleótidos complementarios al adaptador y a los sitios de restricción. Se añade un nucleótido a los cebadores para seleccionar sólo un subconjunto de fragmentos Los productos de la amplificación preselectiva se someten a otra PCR, y nuevamente se selecciona un subconjunto de fragmentos. Generalmente, en la segunda amplificación selectiva se agregan dos nucleótidos más a los cebadores La separación de los fragmentos de la reacción se realiza mediante electroforesis en geles de poliacrilamida de tipo desnaturalizante (geles de secuenciación) o electroforesis capilar Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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Digamos que un nucleótido A se añade a los cebadores preselectivos. En consecuencia, sólo se amplificará el subconjunto de fragmentos de la mezcla en los que la secuencia del sitio de restricción vaya seguida directamente por una A. Los cebadores de amplificación tienen generalmente de 17 a 21 nucleótidos de longitud y se acoplan perfectamente a sus secuencias complementarias. Luego se lleva a cabo una segunda amplificación, empleando cebadores similares a los de la primera reacción pero con dos bases adicionales (por ejemplo CA). Así, sólo un subconjunto de la primera reacción de amplificación experimentará amplificación durante la segunda ronda de PCR, es decir, aquellos fragmentos en los que la secuencia CA vaya a continuación en la secuencia del sitio de restricción. El subconjunto de fragmentos obtenidos se analiza mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes para generar una huella identificadora. Las bandas de ADN pueden detectarse empleando diversos procedimientos. Si se usan cebadores fluorescentes, éstos tienen la ventaja de que se pueden cargar en conjuntos de tres en el mismo carril del gel, cada uno marcado con diferente color, de modo que se maximiza el número de datos recogidos por gel (Zhao et al,. 2000). Una segunda ventaja de estos cebadores, al igual que la detección con nitrato de plata, es la de evitar el uso de radioisótopos. Referencia Zhao, S., S.E. Mitchell, J. Meng, S. Kresovich, M.P. Doyle, R.E. Dean, A.M. Casa y J.W. Weller. 2000. Genomic typing of Escherichia coli 0157:H7 by semiautomated fluorescent AFLP analysis. Microbes Infect. 2:107-113.

Resumen de la tecnología* ADN genómico Digestión con 2 enzimas de restricción

Empalme de los adaptadores

Preamplificación: Cebadores = adaptadores + 1 base Amplificación selectiva: Cebadores = adaptadores + 1 base + 2 bases

Perfil de AFLP

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

* Adaptado del sitio web de KeyGene: http:/www.keygene.com

AFLP 7

Equipo Recursos: • Agua destilada o desionizada (o ambas) • Reactivos

Equipo: • Refrigerador y congelador • Campana extractora de flujo laminar • Centrífuga • Termociclador • Fuente de energía eléctrica

• • • •

Hornillo o microondas Medidor de pH Balanza estándar Unidades de electroforesis vertical • Transiluminador para luz ultravioleta • Secuenciador automático

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Interpretación de las bandas de AFLP La técnica AFLP detecta polimorfismos generados por cambios (de presencia o tamaño) en los sitios de restricción o en los adyacentes a éstos Se pueden usar diferentes enzimas de restricción. Distintas combinaciones de nucleótidos preselectivos y selectivos aumentarán la probabilidad de encontrar polimorfismos útiles A mayor número de bases selectivas, menor detección de polimorfismo Las bandas se registran, generalmente, como presentes o ausentes En función del espesor de la banda, se pueden detectar bandas heterocigóticas y homocigóticas, aunque no siempre los resultados son confiables Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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La base molecular de los polimorfismos de AFLP generalmente se origina en los nucleótidos. Se detectan cambios de un solo nucleótido cuando: (1) se afectan los propios sitios de restricción; y (2) se afectan los nucleótidos adyacentes a los sitios de restricción, lo que hará que los cebadores hibriden erróneamente en el extremo 3’ impidiendo la amplificación. La mayoría de los marcadores de AFLP son de tipo mono-alélico, lo que significa que sólo se podrá registrar un alelo porque su alelo complementario no se detecta. Aunque es poco frecuente, se pueden identificar marcadores bi-alélicos como resultado de pequeñas inserciones o deleciones en los fragmentos de restricción.

Un gel de AFLP procesado con cebadores fluorescentes

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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Esta imagen muestra un gel de AFLP obtenido en un secuenciador automático. Antes de cargar el gel, las muestras se marcaron con uno de tres colorantes fluorescentes (amarillo, azul o verde). El rojo marca una muestra testigo que se incluyó con las demás como comprobante del comportamiento de la electroforesis. La evaluación directa de la presencia o ausencia de bandas específicas es casi imposible debido al elevado número de bandas que normalmente se generan en el procedimiento de AFLP, y porque los colorantes fluorescentes no pueden distinguirse a simple vista. Las bandas pueden identificarse con un rayo láser, y los datos se recopilan con ayuda de programas informáticos especializados.

AFLP detectados con tinción de plata

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Esta imagen muestra un gel de AFLP proveniente de la electroforesis en una unidad vertical y teñido con nitrato de plata. La imagen presenta ciertas regiones del gel con alta concentración de bandas, mientras que otras están relativamente vacías. La recopilación de los datos de geles teñidos con nitrato de plata puede hacerse mediante apreciación visual, o con ayuda de programas informáticos después de haber adquirido la figura del gel de forma electrónica mediante un escáner.

Ventajas de los AFLP Los AFLP permiten una exploración rápida de los polimorfismos del genoma entero Puesto que se genera un gran número de bandas, cada marcador da una huella identificadora de ADN sumamente informativa Son también altamente reproducibles No se necesita información previa de las secuencias ni hay que generar sondas de hibridación Es una técnica muy útil para crear mapas genéticos en forma rápida Permiten la generación de “perfiles de trascripción” Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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La tecnología de AFLP puede aplicarse a cualquier muestra de ADN, incluyendo el humano, el animal, el vegetal y el microbiano, lo que le da el potencial de convertirse en un sistema universal para la caracterización de ADN. Debido a la naturaleza de los cebadores de AFLP, los marcadores obtenidos son sumamente confiables y sólidos, y no son afectados por las pequeñas variaciones del proceso de amplificación. Una “huella identificadora” característica de AFLP contiene entre 50 y 100 fragmentos amplificados, muchos de los cuales pueden servir como marcadores genéticos. La generación de perfiles de trascripción de AFLP con ADNc es una herramienta eficaz para identificar los ARNm expresados diferencialmente. Esta herramienta tiene ventajas que pueden ser útiles para descubrir genes en el germoplasma.

Desventajas de los AFLP Los AFLP generan cantidades enormes de información, por lo que pueden requerir un análisis automatizado y, por consiguiente, tecnología de computación adecuada Son de tipo dominante En los mapas genéticos, los AFLP se agrupan, con frecuencia, en los centrómeros y telómeros Requieren bastante técnica en el laboratorio y, especialmente, en el análisis de los datos

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Un inconveniente adicional de la tecnología de AFLP es, quizás, que no puede garantizar la homología entre bandas de peso molecular (MW) similar, lo que dificulta los estudios del tipo del análisis filogenético. Ahora bien, mientras bandas no homólogas de peso similar también se encuentran utilizando otros marcadores como los RAPD, pueden ser menos comunes en la tecnología de AFLP porque la resolución de los geles es muy alta y, en consecuencia, la probabilidad de que las bandas no homólogas sean, por coincidencia, del mismo peso molecular es más baja.

Ejemplos de aplicaciones Evaluación de diversidad genética Análisis de distancia genética Huella identificadora de ADN Análisis de colecciones de germoplasma Construcción de mapas genéticos Seguimiento de marcadores de diagnóstico Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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Las referencias en color púrpura se explican más detenidamente en las diapositivas que vienen a continuación. Badr, A., K. Müller, R. Schäfer-Pregl, H. El Rabey, S. Effgen, H.H. Ibrahim, C. Pozzi, W. Rohde y F. Salamini. 2000. On the origin and domestication history of barley (Hordeum vulgare). Mol. Biol. Evol. 17(4):499-510. Barret, B.A. y K.K. Kidwell. 1998. AFLP-based genetic diversity assessment among wheat cultivars from the Pacific Northwest. Crop Sci. 38:1261-1271. Beebe, S., J. Rengifo, E. Gaitán, M.C. Duque y J. Tohme. 2001. Diversity and origin of Andean landraces of common bean. Crop Sci. 41:854-862. Gilbert, K.G., S. Garton, M.A. Karam, G.M. Arnold, A. Karp, K.J. Edwards, D.T. Cooke y J.H.A. Barker. 2002. A high degree of genetic diversity is revealed in Isatis spp. (dyer's wood) by amplified fragment length polymorphism (AFLP). Theor. Appl. Genet. 104:1150-1156. Miyashita, N.T., A. Kawabe y H. Innan. 1999. DNA variation in the wild plant Arabidopsis thaliana revealed by amplified fragment length polymorphism analysis. Genetics 152:1273-1731. Palacios, C. y F. González-Candelas. 1999. AFLP analysis of the critically endangered Limonium cavanillesii (Plumbaginaceae). J. Hered. 90(4):485-489. Rouf-Mian, M.A., A.A. Hopkins y J.C. Zwonitzer. 2002. Determination of genetic diversity in Tall Fescue with AFLP markers. Crop Sci. 42:944-950. Sawkins, M.C., B.L. Maass, B.C. Pengelly, H.J. Newbury, B.V. Ford-Lloyd, N. Maxted y R. Smith. 2001. Geographical patterns of genetic variation in two species of Stylosanthes Sw. using amplified fragment length polymorphism. Mol. Ecol. 10:1947-1958. Srivastava, A., V. Gupta, D. Pental y A.K. Pradhan. 2001. AFLP-based genetic diversity assessment amongst agronomically important natural and some newly synthesized lines of Brassica juncea. Theor. Appl. Genet. 102:193-199. Vuylsteke, M., R. Mank, B. Brugmans, P. Stam y M. Kuiper. 2000. Further characterization of AFLP (R) data as a tool in genetic diversity assessment among maize (Zea mays L.) inbred lines. Mol. Breed. 6(3):265-276.

Ejemplo: Limonium sp. Título: AFLP analysis of the critically endangered Limonium cavanillesii (Plumbaginaceae). J. Hered. 1999. 90(4):485-489

Objetivo: Comparar la efectividad de los AFLP para analizar la diversidad genética de L. cavanillesii y su eficiencia respecto a un estudio anterior de RAPD

Materiales y métodos: Se extrajo el ADN de 29 individuos silvestres. Estos individuos eran los mismos que se emplearon en un estudio anterior* de RAPD. Se seleccionaron tres combinaciones de cebadores Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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(continúa en la siguiente) *Palacios, C y F. González-Candelas. 1997. Lack of genetic variability in the rare and endangered Limonium cavanillesii (Plumbaginaceae) using RAPD markers. Mol. Ecol. 6:671-675.

Ejemplo: Limonium sp. (continuación) Resultados: Se generaron, en total, 231 fragmentos: en promedio, 223 por individuo y 77 por combinación de cebadores. Sólo 6% de los marcadores fueron polimórficos y distinguieron 11 perfiles AFLP diferentes, mientras que en un estudio anterior* con RAPD no se obtuvo ningún marcador polimórfico

Discusión: Los AFLP demostraron ser un tipo de marcador apropiado para recopilar información crítica para la identificación de poblaciones naturales en riesgo y para la planificación de estrategias de recuperación de L. cavanillesii. Los bajos niveles de variabilidad genética encontrada en L. cavanillesii podrían explicarse como efecto de su sistema reproductivo apomíctico o como un caso de cuello de botella reciente y severo Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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*Palacios, C y F. González-Candelas. 1997. Lack of genetic variability in the rare and endangered Limonium cavanillesii (Plumbaginaceae) using RAPD markers. Mol. Ecol. 6:671-675.

Ejemplo: Stylosanthes spp. Título: Geographical patterns of genetic variation in two species of Stylosanthes Sw. using amplified fragment length polymorphism. Mol. Ecol. 2001. 10:1947-1958

Objetivo: Evaluar la variación genética en dos especies del género tropical Stylosanthes Sw.

Materiales y métodos: Se escogieron 111 entradas: 59 de S. viscosa y 52 de S. humilis, las cuales representan la distribución geográfica de ambas especies. Se usaron cinco combinaciones de cebadores para S. humilis y cuatro para S. viscosa Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Stylosanthes spp. (continuación) Resultados: • S. humilis: de un total de 417 bandas, 316 eran polimórficas (75%). La semejanza entre las entradas fue, en promedio, de 0.71, y la distancia genética promedio fue de 0.17 (coeficiente de Jaccard) • S. viscosa: de un total de 373 bandas, 312 eran polimórficas (83%). El valor de la semejanza entre entradas fue, en promedio, de 0.67, y la distancia genética promedio fue de 0.20 • El análisis de conglomerados y de PCA agruparon las entradas de ambas especies según su origen geográfico, con algunas excepciones. Una explicación de esto sería la incidencia de sucesos de dispersión de largo alcance o la introducción de genotipos de una zona a otra por el hombre Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Stylosanthes spp. (continuación) Discusión: Estos resultados demuestran la utilidad de la tecnología AFLP, no sólo para detectar la diversidad genética dentro de las especies de Stylosanthes, sino también para identificar individuos mal clasificados

Conclusiones: Este estudio revela la capacidad de los AFLP para detectar patrones geográficos en la variación genética, información que es necesaria para desarrollar estrategias óptimas de conservación

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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Ejemplo: Mostaza india Título: AFLP-based genetic diversity assessment amongst agronomically important natural and some newly synthesized lines of Brassica juncea. Theor. Appl. Genet. 2001. 102:193-199

Objetivo: • Estudiar la variación genética existente entre entradas de B. juncea • Identificar las combinaciones de cebadores AFLP que son informativas para la identificación varietal • Buscar marcadores polimórficos para un posible etiquetado de los caracteres agronómicos que se suponen presentes en el germoplasma estudiado

Materiales y métodos: El estudio empleó 30 entradas de B. juncea, que representaban 21 poblaciones naturales y 9 variedades sintéticas y líneas de mejoramiento. La amplificación selectiva se llevó a cabo con 21 combinaciones de cebadores EcoRI/MseI Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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(continúa en la siguiente)

Ejemplo: Mostaza india (continuación) Resultados: • Se registraron 1251 fragmentos en los 30 genotipos. Por término medio, 37 bandas por combinación de cebadores fueron polimórficas • Ni un solo par de cebadores pudo distinguir los 30 genotipos sobre la base de la presencia o la ausencia de bandas específicas de la variedad • Cuatro pares de cebadores fueron los más informativos y tuvieron un poder discriminatorio del 100% • El análisis de conglomerados basado en estos cuatro cebadores concordó con resultados de estudios anteriores basados en caracteres morfológicos* y en datos de RAPD** Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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(continúa en la siguiente) *Pradhan, A.K., Y.S. Sodhi, A. Mukhopadhyay y D. Pental. 1993. Heterosis breeding in Indian mustard (Brassica juncea (L.) Czern. & Cross): analysis of component characters contributing to heterosis for yield. Euphytica 69:219-229. **Jain, A., S. Bhatia, S.S. Banga, S. Prakash y M. Lakshmikumaran. 1994. Potential use of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique to study the genetic diversity in Indian mustard (Brassica juncea) and its relationship to heterosis. Theor. Appl. Genet. 88:116-122.

Ejemplo: Mostaza india (continuación) Discusión y conclusiones: En un estudio anterior* con 32 cebadores RAPD se obtuvo un promedio de 12 loci polimórficos por cebador. Por tanto, la técnica AFLP proporcionó un mayor grado de resolución para discriminar el germoplasma estrechamente relacionado. El análisis con AFLP tiene potencial para complementar tanto los datos convencionales como otros de distintos tipos de marcadores moleculares

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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*Jain, A., S. Bhatia, S.S. Banga, S. Prakash y M. Lakshmikumaran. 1994. Potential use of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique to study the genetic diversity in Indian mustard (Brassica juncea) and its relationship to heterosis. Theor. Appl. Genet. 88:116-122.

En resumen La tecnología AFLP se basa en la amplificación selectiva de fragmentos de restricción después de la digestión del ADN Esta tecnología detecta polimorfismos causados por cambios en los sitios de restricción o en sus regiones adyacentes Esta tecnología produce un gran número de bandas por experimento; no obstante, las bandas son dominantes y el procedimiento tiene requisitos técnicos considerables Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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Hasta el momento usted debería saber Las diferentes etapas que comprende la generación de los AFLP Las principales consideraciones que requiere la interpretación de las bandas de AFLP Las ventajas y las desventajas de los AFLP respecto al análisis de la diversidad genética

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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Referencias básicas Brown, S.M. y S. Kresovich. 1996. Molecular characterization for plant genetic resources conservation. p. 85-93. En: Genome mapping in plants (H. Paterson, ed.). RG Landes Company and Academic Press, Austin, TX, E.U. KeyGene, N.V. 2001. Empowering genomics. http://www.keygene.com (30 junio 2002). Vos, P., R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. van de Lee, M. Hornes, A. Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper y M. Zabeau. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23:4407-4414. Zabeau, M. y P. Vos. 1993. Selective restriction amplification: a general method for DNA fingerprinting. Publicación de Patente Europea 92402629 (Publicación No. EP0534858A1). Zhao, S., S.E. Mitchell, J. Meng, S. Kresovich, M.P. Doyle, R.E. Dean, A.M. Casa y J.W. Weller. 2000. Genomic typing of Escherichia coli 0157:H7 by semiautomated fluorescent AFLP analysis. Microbes Infect. 2:107-113.

A continuación Tecnologías basadas en el ADN Tecnologías basadas en la PCR Sitios de secuencia etiquetada

Tecnologías basadas en el ADN • Tecnologías basadas en la PCR • Últimas estrategias

Tecnologías complementarias Consideraciones finales Glosario Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas: Módulo de aprendizaje Tecnologías basadas en el ADN

Tecnologías basadas en la PCR Sitios de secuencia etiquetada (Microsatélites, SCAR, CAPS, ISSR)

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 1

Contenido Sitios de secuencia etiquetada (STS) como marcadores Microsatélites (SSR, STMS o SSRP) • • • • • • •

Identificación de las regiones de microsatélite Estructura Selección de los cebadores Metodología y visualización Equipo Ventajas y desventajas Aplicaciones de los SSR y ejemplos

SCAR CAPS ISSR Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 2

Sitios de secuencia etiquetada (STS) como marcadores A diferencia de las técnicas basadas en cebadores arbitrarios, los STS dependen de un cierto conocimiento de las secuencias Los marcadores basados en STS son codominantes Tienden a ser más reproducibles porque se usan secuencias cebadoras más largas Requieren, básicamente, los mismos protocolos de laboratorio y el mismo equipo que la PCR estándar Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 3

A diferencia de la PCR con cebadores arbitrarios, el diseño de los cebadores para detectar sitios de secuencia etiquetada (STS) está basado en cierto conocimiento de las secuencias. Estos cebadores son únicos y específicos de las secuencias, y detectan variación en el ADN genómico alélico. Los STS tienen una ventaja especial sobre los RAPD por ser codominantes, o sea, pueden distinguir entre los homocigotos y los heterocigotos. Tienden también a ser más reproducibles, porque las secuencias de los cebadores son más largas. Tienen, sin embargo, una desventaja: requieren de algún conocimiento preexistente de la secuencia del ADN de la región, aunque sólo sea parcial. Su inconveniente principal es la inversión en esfuerzo y costo que se necesita para diseñar los cebadores específicos de cada locus. Del mismo modo que con los RAPD, el uso de la PCR genera datos rápidamente y requiere poco ADN. Todos los métodos de STS usan los mismos protocolos básicos que usan los RAPD (extracción de ADN y PCR) y requieren el mismo equipo.

Microsatélites (SSR, STMS o SSRP) Los microsatélites son secuencias cortas (1-10 pb) que se repiten en serie Para poder usarlos como marcadores, debe identificarse, en primer lugar, su ubicación en el genoma de interés Los polimorfismos en la región repetida se pueden detectar mediante una PCR con cebadores diseñados a partir de la región del ADN adyacente a la repetición

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 4

Los microsatélites también se llaman repeticiones de secuencia simple (SSR) y, ocasionalmente, sitios de microsatélite de secuencia etiquetada (STMS) o polimorfismo de repeticiones de secuencia simple (SSRP). Son con mucho el tipo de STS que más se usa. Los SSR son repeticiones cortas en serie cuya longitud está entre 1 y 10 pb; los más típicos miden de 2 a 3 pb. Son altamente variables y están distribuidos por igual en todo el genoma. Este tipo de ADN repetitivo es común en organismos eucariotas, y el número de unidades repetidas varía ampliamente entre los organismos, hallándose en algunos hasta 50 copias de la unidad repetida. Para identificar estos polimorfismos, se construyen cebadores de PCR para la región del ADN que flanquea el microsatélite. Las regiones adyacentes a los microsatélites tienden a conservarse dentro de las especies, aunque a veces se conservan también en niveles taxonómicos mayores. Referencia Hajeer, A., J. Worthington y S. John (eds.). 2000. SNP and microsatellite genotyping: Markers for genetic analysis. En: Biotechniques: Molecular laboratory methods series. Eaton Publishing, Manchester, U.K.

Identificación de regiones microsatélite Secuencias disponibles en las bases de datos

Identificar las secuencias que contienen microsatélites

No hay secuencias disponibles en las bases de datos

Usar microsatélites conocidos para aislar clones candidatos de una genoteca

Diseñar cebadores específicos

Secuenciar los clones positivos

Detectar el polimorfismo

Diseñar cebadores específicos

Usar secuencias de microsatélite como sonda frente al ADN digerido

Detectar el polimorfismo

Detectar el polimorfismo

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 5

Tal como ocurre en las zonas del genoma con alta concentración de repeticiones, los SSR tienden a agruparse en los centrómeros y en los telómeros. Sin embargo, este problema se puede resolver identificando SSR a partir de genotecas de EST, que son ricas en genes y cuya distribución es más uniforme.

Estructura = región repetida (p.e., GA)

Regiones adyacentes únicas

El número de repeticiones es altamente variable entre individuos

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 6

Selección de los cebadores

Diseñar cebadores ( regiones adyacentes

) complementarios de las

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 7

Metodología y visualización Metodología: • Extracción del ADN • PCR con cebadores específicos de las regiones adyacentes al microsatélite • Separación de fragmentos

Visualización: • Mediante electroforesis en geles de agarosa, usando tinción con bromuro de etidio y luz ultravioleta, o • En geles de acrilamida, tiñendo con nitrato de plata, o empleando radioisótopos, o • Con secuenciadores automáticos, empleando cebadores pre-marcados con fluorescencia

Análisis de datos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 8

La variación en tamaño de los productos de la PCR se debe a la diferencias en el número de las unidades repetidas en el microsatélite. Los polimorfismos de SSR se pueden visualizar mediante electroforesis en geles de agarosa o de poliacrilamida. Los alelos del microsatélite se detectan usando diversos métodos: tinción con bromuro de etidio, nitrato de plata, radioisótopos o fluorescencia. Si se usan cebadores marcados con fluorescencia, y los productos son suficientemente diferentes en tamaño y no se sobreponen, se puede cargar un carril con varios productos de reacción de forma simultánea, lo que aumenta enormemente la eficiencia de estos marcadores, (Dean et al., 1999, trae un buen ejemplo). Referencia Dean, R.E., J.A. Dahlberg, M.S. Hopkins, S.E. Mitchell y S. Kresovich. 1999. Genetic redundancy and diversity among 'Orange' accessions in the U.S. national sorghum collection as assessed with Simple Sequence Repeat (SSR) markers. Crop Sci. 39:1215-1221.

Tinción con bromuro de etidio

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 9

Como se mencionó anteriormente, una manera de visualizar los microsatélites es empleando electroforesis en geles de agarosa. Este método es apropiado cuando los alelos son suficientemente largos, o sea, de más de 200-300 pares de bases, y las diferencias entre alelos también son significativas (es decir, más de 10-20 pb). Esta foto muestra un microsatélite que se hizo migrar en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. Los carriles segundo y tercero (el primero, muy débil, lleva un marcador de tamaño) corresponden a los progenitores, uno de los cuales tiene solo una banda y el otro dos. El heterocigoto, por lo tanto, tiene tres. En el segundo progenitor, una de las bandas es mucho más tenue. Como las dos bandas co-segregan, no son el resultado de dos loci que estén en diferentes lugares, pero puede deberse a que las dos copias del microsatélite están separadas por una inserción o una deleción, o bien están ubicadas una cerca de la otra.

Tinción con nitrato de plata

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 10

Los microsatélites pueden analizarse también después de hacer migrar los productos de la PCR en un gel de acrilamida teñido con nitrato de plata. En esta imagen, las muestras pertenecen a una especie diploide y, por consiguiente, tienen un máximo de dos alelos. Cada banda (cada alelo) parece ser más de una banda. Este fenómeno ocurre con frecuencia en la amplificación de los microsatélites. Puesto que puede causar confusión, se debe poner especial cuidado en la interpretación de los resultados.

Equipo Recursos: • Agua destilada o desionizada (o ambas) • Reactivos

Equipo: • Refrigerador y congelador • Campana extractora de flujo laminar • Centrífuga • Termociclador • Fuente de energía eléctrica • Hornillo o microondas

• Medidor de pH • Balanza estándar • Unidades de electroforesis para geles horizontales y verticales • Transiluminador para luz ultravioleta • Secuenciador automático

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 11

Ventajas y desventajas Ventajas: • Requieren muy poco ADN y éste no necesariamente de alta calidad • Sumamente polimórficos • Uniformemente distribuidos en todo el genoma • Interpretación sencilla de los resultados • Automatizados fácilmente, y permiten la carga simultánea de productos en el mismo carril • Buena resolución analítica y alta reproducibilidad

Desventajas: • Procedimiento de descubrimiento complejo • Costo elevado Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 12

Los loci identificados son generalmente multi-alélicos y co-dominantes. Las bandas pueden registrarse o de manera codominante, o como bandas presentes o ausentes. Dado que el ADN adyacente al microsatélite tiene mayor probabilidad de ser conservado, los cebadores derivados de microsatélites se pueden usar a menudo con muchas variedades e incluso con otras especies. La detección de estos marcadores se automatiza fácilmente, son muy polimórficos y tienen buena resolución analítica. Todo esto los convierte en una alternativa preferida como marcadores (Matsuoka y col., 2002). Referencia Matsuoka, Y., S.E. Mitchell, S. Kresovich, M. Goodman y J. Doebley. 2002. Microsatellites in Zea - variability, patterns of mutations, and use for evolutionary studies. Theor. Appl. Genet. 104:436-450.

Ejemplos de aplicaciones de los SSR Genotipificación de individuos Evaluación de germoplasma Diversidad genética Cartografía de genomas Estudios filogenéticos Estudios evolutivos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 13

Las referencias en color púrpura se explican en detalle en las diapositivas que siguen. Cipriani, G., M.T. Marrazzo, R. Marconi, A. Cimato y R. Testolin. 2002. Microsatellite markers isolated in olive (Olea europaea L.) are suitable for individual fingerprinting and reveal polymorphism within ancient cultivars. Theor. Appl. Genet. 104:223-228. Dean, R.E., J.A. Dahlberg, M.S. Hopkins, S.E. Mitchell y S. Kresovich. 1999. Genetic redundancy and diversity among 'Orange' accessions in the U.S. national sorghum collection as assessed with Simple Sequence Repeat (SSR) markers. Crop Sci. 39:1215-1221. Matsuoka, Y., S.E. Mitchell, S. Kresovich, M. Goodman y J. Doebley. 2002. Microsatellites in Zea - variability, patterns of mutations, and use for evolutionary studies. Theor. Appl. Genet. 104:436-450. Smith, J.S.C., S. Kresovich, M.S. Hopkins, S.E. Mitchell, R.E. Dean, W.L. Woodman, M. Lee y K. Porter. 2000. Genetic diversity among elite sorghum inbred lines assessed with simple sequence repeats. Crop Sci. 40:226-232. Westman, A.L. y S. Kresovich. 1999. Simple sequence repeats (SSR)-based marker variation in Brassica nigra genebank accessions and weed populations. Euphytica 109:85-92.

Aplicaciones: Ejemplo en sorgo Título: Genetic diversity among elite sorghum inbred lines assessed with simple sequence repeats. Crop Sci. 2000. 40:226-232

Objetivo: Evaluar los niveles de redundancia genética en las entradas de sorgo mantenidas por el Sistema Nacional de Germoplasma Vegetal (NPGS) de los Estados Unidos

Materiales y métodos: Se analizaron 96 individuos (5 plantas de cada una de las 19 introducciones de la línea "Orange" y una variedad pura selecta) empleando 15 marcadores SSR Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 14

(continúa en la siguiente)

Aplicaciones: Ejemplo en sorgo (continuación) Resultados y discusión: La mayoría de las accesiones fueron genéticamente distintas, pero se encontraron dos grupos redundantes (que incluían, en total, 5 entradas) Los valores promedio de heterocigosidad fueron muy bajos (lo que se espera de un cultivo autógamo). Una entrada contenía una mezcla de genotipos, lo que indicaba algún tipo de contaminación El análisis de varianza molecular (AMOVA) indicó que un 90% de la variación genética total se debía a las diferencias entre entradas, mientras que un 10% era el resultado de las diferencias genéticas entre plantas individuales dentro de las entradas Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 15

(continúa en la siguiente)

Aplicaciones: Ejemplo en sorgo (continuación) Conclusiones: Los 15 marcadores SSR dieron una notable resolución genética El número de entradas de ‘Orange’ conservadas podría reducirse a casi la mitad sin causar una pérdida sustancial en la variación genética general y reduciendo mucho, por tanto, los costos de mantenimiento La combinación de reacciones resultó en un ahorro de 1152 carriles, o sea, en un 80% de reactivos y de tiempo Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 16

Aplicaciones: Ejemplo en olivo Título: Microsatellite markers isolated in olive (Olea europaea L.) are suitable for individual fingerprinting and reveal polymorphism within ancient cultivars. Theor. Appl. Genet. 104:223-228

Objetivo: Evaluar la eficiencia de los marcadores SSR para identificar polimorfismos entre cultivares de olivo

Materiales y métodos: Se usaron 36 SSR para analizar 12 cultivares de olivo (4 bien conocidos y 8 antiguos) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 17

(continúa en la siguiente)

Aplicaciones: Ejemplo en olivo (continuación) Resultados y discusión: Todos los marcadores SSR, excepto dos, mostraron polimorfismo (entre 2 y 5 alelos). Todos los cultivares se separaron fácilmente entre sí • Cinco pares de cebadores amplificaron dos loci diferentes • Se descartaron seis pares de cebadores porque produjeron patrones ilegibles • Se confirmó que dos variedades, que parecían idénticas, lo eran en realidad porque mostraron patrones de bandas iguales en todo los loci. Otro par de variedades, que también se creían idénticas, mostraron que no lo eran Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 18

(continúa en la siguiente)

Aplicaciones: Ejemplo en olivo (continuación) Conclusiones: Los SSR podrían fácilmente diferenciar todas las variedades y, por tanto, son una buena herramienta para encontrar patrones exclusivos de ADN. Se identificó también la variabilidad genética dentro de los cultivares de olivo, empleando un número muy bajo de marcadores. En estudios anteriores con AFLP se requirieron muchos más marcadores

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 19

Aplicaciones: Ejemplo en mostaza negra Título: Simple sequence repeats (SSR)-based marker variation in Brassica nigra genebank accessions and weed populations. Euphytica. 1999. 109:85-92

Objetivo: Determinar el grado y la distribución de la variación genética en B. nigra (la mostaza negra)

Materiales y métodos: Se usaron cinco marcadores SSR para analizar 32 entradas de B. nigra (accesiones del banco de germoplasma y poblaciones arvenses) provenientes de cuatro regiones: África del Norte/Europa, India, Etiopía y América del Norte Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 20

(continúa en la siguiente)

Aplicaciones: Ejemplo en mostaza negra (continuación) Resultados y discusión: Las entradas etíopes formaron el grupo más sobresaliente Más de la mitad de la variación se detectó entre plantas, dentro de entradas Las entradas europeas y norteamericanas contenían la mayor cantidad de variación y, generalmente, se agrupaban juntas En las poblaciones arvenses de América del Norte se detectaron variantes únicas, pero la variación entre poblaciones no se correlacionó con la distancia geográfica Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 21

(continúa en la siguiente)

Aplicaciones: Ejemplo en mostaza negra (continuación) Conclusiones: Aunque se creía que había poca variación genética dentro de B. nigra, los marcadores SSR demostraron que los patrones de variación de la especie eran compatibles con su historia agrícola

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 22

Región amplificada caracterizada por una secuencia (SCAR) Los SCAR aprovechan una banda que ha sido generada en un experimento de RAPD Usan cebadores de16 a 24 pb, diseñados a partir de los extremos de marcadores RAPD clonados Esta técnica transforma una banda —propensa a dificultades de interpretación o de reproducibilidad— en un marcador muy confiable Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 23

Referencia Paran, I. y R.W. Michelmore. 1993. Development of reliable PCR based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Genet. 85:985-993.

Pasos para la obtención de polimorfismos de SCAR Se identifica, en un gel de RAPD, una banda que despierta un interés potencial La banda se corta y se retira del gel El fragmento de ADN se clona en un vector y se obtiene su secuencia Se diseñan cebadores específicos (16 a 24 pb de longitud) para ese fragmento de ADN La reamplificación del ADN patrón con los nuevos cebadores presentará un patrón de PCR nuevo y más sencillo Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 24

Diagrama del procedimiento para obtener los SCAR 1

2

3

Gel de RAPD Clonar la banda polimórfica en un vector

Banda polimórfica

Secuenciar el fragmento y diseñar nuevos cebadores para amplificar únicamente la banda de interés Después de la amplificación con los nuevos cebadores, el resultado es un patrón de bandas más fácil de interpretar

1

2

3

Banda polimórfica Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 25

Ventajas y desventajas Ventajas: • Patrones más sencillos que los RAPD • Ensayo sólido gracias al uso de cebadores largos específicos • Herencia mendeliana. A veces convertibles a marcadores codominantes

Desventajas: • Requieren un conocimiento mínimo de las secuencias • Requieren esfuerzo y gastos para diseñar cebadores específicos de cada locus Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 26

Dado que los cebadores empleados son más largos que los que se usan en los RAPD, los SCAR se caracterizan por ser más reproducible que los RAPD, de los cuales se derivan. Los SCAR son generalmente co-dominantes, excepto si uno o ambos cebadores se superponen en el sitio de variación de la secuencia.

Secuencia de restricción amplificada y polimórfica (CAPS) Este método se basa en el diseño de cebadores específicos, en la amplificación de fragmentos de ADN, y en la generación de fragmentos más pequeños, posiblemente variables, mediante un enzima de restricción El objetivo de esta técnica es convertir una banda amplificada, que no muestra variación, en una banda polimórfica

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 27

Los marcadores de secuencia de restricción amplificada y polimórfica (CAPS) son como los SCAR, pero con una paso adicional (una digestión de restricción) para favorecer la identificación de polimorfismos que quizás no hubieran podido identificarse entre el total de productos de la PCR. Tanto los SCAR como los CAPS se basan en la presencia de cambios en los nucleótidos o de inserciones o deleciones, los cuales causan diferencias entre las secuencias experimentales. Un inconveniente de ambas tecnologías es que detectan polimorfismo sólo en un intervalo pequeño del genoma, o sea, en la zona entre los cebadores que se caracteriza por ser menor que 5 kb. Referencia Konieczny, A. y F.M. Ausubel. 1993. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using codominant ecotype-specific PCR-based markers. Plant J. 4(2):403-410.

Pasos que requiere la generación de CAPS Se reconoce la importancia de una banda, de un fragmento de ADN, de una secuencia génica o de otro tipo de marcador O bien la banda se detecta a través de la PCR (y se corta del gel y el fragmento se clona y es secuenciado) o la secuencia del fragmento está ya disponible Se diseñan cebadores específicos partiendo de la secuencia del fragmento Los cebadores recién diseñados se usan para amplificar el ADN patrón El producto de la PCR se somete a digestión con varios enzimas de restricción Se identifica el polimorfismo empleando alguno de los enzimas Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 28

Una vez identificado un polimorfismo con un enzima de restricción específico, los cebadores pueden rediseñarse sobre la base de los fragmentos recién generados, para optimizar la detección y la visualización del polimorfismo. En cuanto sea posible, los cebadores deben elegirse de modo que exista la probabilidad de que los productos de la PCR incluyan intrones. Así aumentarán las oportunidades de obtener polimorfismos.

Generación de CAPS R

A/A R

B/B R R R

A/B R R R

PCR + digestión con el enzima R + electroforesis

* *

De: Konieczny, A. y F.M. Ausubel. 1993. Plant J. 4(2):403-410.

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 29

En este ejemplo, se generaron CAPS para dos ecotipos de Arabidopsis. En la parte superior del diagrama se muestran los tres genotipos posibles para el experimento: los dos ecotipos homocigóticos (A/A y B/B) y el ecotipo heterocigótico (A/B). Si se llevara a cabo una PCR estándar de los ADN originales con los cebadores dibujados (flechas azules), no se obtendría ningún polimorfismo entre los tres genotipos. Se encontró un enzima de restricción que digería los fragmentos A dos veces y el fragmento B tres veces. En consecuencia, el heterocigoto A/B debe producir una copia del fragmento digerido dos veces y otra del fragmento digerido tres veces. Se realizó entonces una PCR y los productos se digirieron con el enzima de restricción específico ya mencionado. La visualización en gel de agarosa mostró tres fragmentos para el genotipo A/A, cuatro fragmentos para el genotipo B/B y siete fragmentos para el heterocigoto A/B. El diagrama muestra sólo 5 fragmentos para A/B, porque dos de los siete fragmentos (señalados por asteriscos) migran a distancias similares a las de otros fragmentos.

Ventajas y desventajas Ventajas: • Ensayo sólido, porque se usan cebadores específicos largos • Marcadores co-dominantes • Favorecido por marcadores que pueden estar ya localizados en un mapa genético • Identifican polimorfismos en marcadores que anteriormente no eran informativos

Desventajas: • Requieren, al menos, un mínimo nivel de conocimiento de las secuencias • El diseño de cebadores específicos para cada locus requiere trabajo adicional y más gastos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 30

Secuencia entre repeticiones simples (ISSR) Son las regiones situadas entre microsatélites La técnica se basa en la amplificación, mediante la PCR, de las secuencias ubicadas entre microsatélites Gracias a la conocida abundancia de secuencias repetitivas esparcidas por todo el genoma, identifica múltiples loci

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 31

Referencia Zietkiewicz, E., A. Rafalski y D. Labuda. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20:176-183.

Identificación de polimorfismos ISSR Se ejecuta una PCR típica en la cual los cebadores han sido diseñados partiendo de una secuencia repetitiva de microsatélite y se han extendido, en una o varias bases, en la secuencia adyacente a modo de puntos de anclaje. Puede haber varias opciones: Se emplea sólo un cebador Se emplean dos cebadores de características similares Se combinan un cebador de secuencia de microsatélite anclado y un cebador aleatorio (como los usados para RAPD) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 32

Diseño de cebadores para polimorfismos ISSR NNNN(CA)n

(CA)nNN Repetición CA

ADN genómico

NNNNNNNNNNNN CACACACACACACACA NNNNNNNNNNNNNN TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNN NNNNNNNNNNNNNN

CACACACACACACACACACACACACAC A

TGTGTGTGTGTGTGTG

NNNNNNNNNNNN

NNNNNN

Repetición CA (CA)nNN

NN(CA)n

Producto de la PCR cebador anclado en 3’ Producto de la PCR cebador anclado en 5’

De: Zietkiewicz, E., A. Rafalski y D. Labuda. 1994. Genomics 20:176–183

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 33

El diagrama anterior presenta tres puntos diferentes: • La secuencia del ADN original, en la cual se identifican dos secuencias repetidas diferentes (CA), orientadas en sentido inverso. Entre las dos secciones repetidas hay, además, un espacio bastante corto. • Si los cebadores se diseñaran solamente del interior de la región repetida, se amplificaría la sección entre las repeticiones pero podría no estar garantizada la especificidad del locus. En la segunda hilera (ver diagrama), aparece un producto de la PCR como resultado de la amplificación de un cebador anclado en 3’ (CA)nNN en cada extremo de la región entre las repeticiones. CA es la secuencia que se alargó en NN, dos nucleótidos que entran dentro de la región situada entre las repeticiones. • Alternativamente, las anclas pueden elegirse de la región 5’. El producto de la PCR de la tercera hilera resulta de emplear cebadores basados en la repetición CA pero prolongados en el extremo 5’ por NNN y NN, respectivamente.

Ventajas y desventajas Ventajas: • No requieren información previa sobre secuencias • Se puede encontrar variación dentro de regiones únicas del genoma en varios loci simultáneamente • Tienden a identificar niveles significativos de variación • Específicos de secuencias de microsatélites • Muy útiles para realizar perfiles de ADN, especialmente de especies estrechamente relacionadas

Desventajas: • Marcadores dominantes • Puede ser necesaria la electroforesis en gel de poliacrilamida y la detección con tinción de plata o con radioisótopos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 34

En resumen El uso de los STS como marcadores se apoya en algún conocimiento sobre secuencias. Son codominantes y altamente reproducibles Los SSR son el tipo de STS más ampliamente usado. Otros son SCAR, CAPS e ISSR Los SSR son repeticiones cortas en serie, sumamente variables y distribuidas uniformemente en el genoma. Estas características hacen de los SSR los marcadores preferidos para el análisis de diversidad genética Los polimorfismos de los SSR son causados por las diferencias en el número de unidades repetidas Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 35

Hasta el momento usted debería saber Las características de los STS como marcadores Los diferentes tipos de marcadores STS y sus rasgos contrastantes Los pasos necesarios para identificar microsatélites, diseñar los cebadores y detectar los polimorfismos Las propiedades de los microsatélites respecto a los análisis de diversidad genética Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 36

Referencias básicas Ajay, J., C. Apparanda y P.L. Bhalla. 1999. Evaluation of genetic diversity and genome fingerprinting of Pandorea (Bignoniaceae) by RAPD and inter-SSR PCR. Genome 42:714-719. Blair, M.W., O. Panaud y S.R. McCouch. 1999. Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatellite motif frequency and fingerprinting in rice (Oryza sativa L.). Theor. Appl. Genet. 98:780-792. Brown, S.M. y S. Kresovich. 1996. Molecular characterization for plant genetic resources conservation. p. 85-93 en: Genome mapping in plants (H. Paterson, ed.). R.G. Landes Company, Georgetown, TX, E.U. Buso, G.S.C., P.H.N. Rangel y M.E. Ferreira. 2001. Analysis of random and specific sequences of nuclear and cytoplasmatic DNA in diploid and tetraploid American wild rice species (Oryza sp.). Genome 44:476-494. Hajeer, A., J. Worthington y S. John (eds.). 2000. SNP and microsatellite genotyping: markers for genetic analysis. Biotechniques: Molecular Laboratory Methods Series. Eaton Publishing, Manchester, U.K. Joshi, S.P., V.S. Gupta, R.K. Aggarwal, P.K. Ranjekar y D.S. Brar. 2000. Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter-simple sequence repeat (ISSR) polymorphism in the genus Oryza. Theor. Appl. Genet. 100:1311- 1320. Kantety, R.V., X.P. Zeng, J.L. Bennetzen y B.E. Zehr. 1995. Assessment of genetic diversity in dent and popcorn (Zea mays L.) inbred lines using inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification. Mol. Breed. 1:365-373. Konieczny, A. y F.M. Ausubel. 1993. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotypespecific PCR-based markers. Plant J. 4(2):403-410. Lowe, A.J., J.R. Russell, W. Powell y I.K. Dawson. 1998. Identification and characterization of nuclear, cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) loci in Irvingia gabonensis and I. wombolu, indigenous fruit trees of west and central Africa. Mol. Ecol. 7(12):1786-1788. Morgante, M. y A.M. Olivieri. 1993. PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics. Plant J. 3(1): 175-182. Paran, I. y R.W. Michelmore. 1993. Development of reliable PCR based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Genet. 85:985- 993. Zietkiewicz, E., A. Rafalski y D. Labuda. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20:176-183.

A continuación Tecnologías basadas en el ADN Tecnologías basadas en la PCR Últimas estrategias

Tecnologías complementarias Consideraciones finales Glosario

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

STS 37

Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas: Módulo de aprendizaje Tecnologías basadas en el ADN

Tecnologías basadas en la PCR Últimas estrategias (Secuenciación de ADN, EST, matrices, DArT, SNP) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 1

Contenido Secuenciación de ADN Marcador de secuencia expresada (EST) Tecnología de matrices Tecnología de matrices de diversidad (DArT) Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 2

Secuenciación del ADN La secuenciación del ADN es la medida fundamental de la diversidad porque detecta polimorfismos dentro de los elementos básicos del ADN La información puede obtenerse automáticamente

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 3

La secuenciación del ADN es la medida de la diversidad verdaderamente fundamental, porque todos los marcadores se derivan de polimorfismos en los elementos básicos del ADN, o sea, en la secuencia nucleotídica de un segmento específico de ADN. La tecnología de la secuenciación ha mejorado enormemente en los últimos años, y ahora los productos de la PCR (una región de ADN amplificada en cantidad suficiente) pueden provenir de cualquier posición genómica de interés y secuenciarse directamente. La recopilación de los datos puede automatizarse. Referencias básicas Maxam, A.M. y W. Gilbert. 1977. A new method for sequencing DNA. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 74:560-564. Sanger, F. 1988. Sequences, sequences and sequences. Annu. Rev. Biochem. 57:1-28. Sanger, F., S. Nicklen y A.R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5468.

Secuenciación del ADN: Métodos Hay dos métodos principales: Maxam-Gilbert Sanger (secuenciación dideoxy o terminación de cadena)

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 4

Los dos métodos difieren ligeramente; el método de Sanger (descrito en la diapositiva 6) es más fácil de automatizar y, por tanto, es mucho más empleado.

Secuenciación del ADN: Procedimientos El ADN se divide en fragmentos, que luego se subclonan Cada pedazo corto se usa como una plantilla para generar un conjunto de fragmentos que difieren entre sí, en longitud, en una sola base Los fragmentos se separan mediante electroforesis Se identifica la base que queda al final de cada fragmento. Se recrea la secuencia original de las bases (A, T, C y G) de cada pedazo corto generado en el primer paso Las secuencias cortas se ensamblan en una secuencia larga Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 5

Un diagrama del método Sanger 5’

3’

C A T A G C T G T T T C C T G T G A A A C T T T

Marcaje

Polimerasa + dNTP C A T A G C T G T T T C C T G T G A A A

+ A G G A C A C T T T

+

G

C

A

A

A

G G

A

C

A

C

T

T

T

+ C A C T T T

+ G T A T C G A C A A A G G A C A T T T

ddATP ddTTP ddCTP ddGTP C A T A G C T G T T T C C T G T G A A A

Adaptado de Griffiths y col. 1996

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 6

Pueden usarse colorantes fluorescentes de diversos colores, lo que permite la separación de los cuatro fragmentos en un solo carril del gel y aumenta mucho la eficiencia. Los secuenciadores automáticos pueden analizar los electroferogramas resultantes y producir un cromatograma de cuatro colores en que aparecen los picos que representan cada una de las cuatro bases de ADN.

Secuenciación del ADN: Ventajas y desventajas Ventajas: • Resultados altamente reproducibles • El contenido de información es máximo

Desventajas: • Costos todavía elevados • Presenta exigencias técnicas

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 7

Los resultados son, desde luego, sumamente reproducibles e informativos. Los costos son elevados, sin embargo, y se necesita un nivel alto de pericia técnica, dos factores que alejan esta tecnología de las posibilidades de muchos investigadores. El uso de la PCR para abordar regiones específicas del ADN y la disponibilidad de máquinas de secuenciación automatizadas han reducido las dificultades técnicas, aunque el proceso es todavía costoso, en particular en su etapa de establecimiento.

Ejemplos de aplicaciones Estudios evolutivos Cálculos de la variación genética Genómica comparativa Elaboración de ensayos de tipo PCR (diseño de cebadores para convertir cualquier marcador en otro marcador basado en la PCR)

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 8

Aunque la tecnología de los marcadores está basada, en general, en la variación de la secuencia del ADN, el investigador no necesita, por fortuna, conocer toda la secuencia del ADN para poder usar los marcadores moleculares. Desde luego, el análisis de la secuencia del ADN tiene muchas aplicaciones útiles, pero tiene un gran inconveniente, en particular para la medición de la diversidad: el hecho de que genes diferentes evolucionan en grado diferente. Por consiguiente, la extrapolación de información obtenida de genes específicos al nivel de la especie debe hacerse con cuidado (Brown, S.M. y S. Kresovich. 1996. Molecular characterization for plant genetic resources conservation. p. 85-93, en: Genome mapping in plants (H. Paterson, ed.). R.G. Landes Company, Georgetown, TX, E.U.)

Marcador de secuencia expresada (EST) Las etiquetas de secuencia expresada son pedazos pequeños de secuencia del ADN que tienen, generalmente, de 200 a 500 nucleótidos de largo Se generan al secuenciar bien sea uno o ambos extremos de un gen expresado proveniente de una genoteca de ADNc Esta estrategia es una forma sumamente eficaz de encontrar genes nuevos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 9

El número de secuencias de EST de plantas disponibles para el público ha aumentado extraordinariamente en los últimos años llegando a más de 1,000,000 en el momento de escribir este documento (Informe de Progreso de la Iniciativa Nacional del Genoma Vegetal, diciembre 2001). Una lista de bases de datos de los EST de muchas plantas se puede encontrar en la dirección electrónica http:/www.ostp.gov/NSTC/html/mpgi2001/building.htm Referencia básica National Center for Biotechnology Information (NCBI). 2001. ESTs: gene discovery made easier. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/est.html

Diseño de cebadores de EST ARNm

A

C

U

G

Transcriptasa inversa ARN

A

C

U

G

T

G

A

C

ADNc Degradación del ARN por ribonucleasas Síntesis de la segunda cadena del ADN

A

C

T

G

T

G

A

C

Cebador

ADN de doble cadena

Cebador

5’ EST

3’ EST

http:/www.ostp.gov/NSTC/html/mpgi2001/building.htm

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 10

Los EST: Ventajas y desventajas Ventajas: • • • •

Muy buenos como marcadores genéticos Codominantes Las secuencias se pueden generar rápidamente Fuente eficiente de secuencias para obtener cebadores para SSR

Desventajas: • El aislamiento del ARNm puede ser complicado • Los intrones, que pueden contener información importante, no son parte del ADNc Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 11

Los EST: Ejemplos de aplicaciones Las aplicaciones de los EST se basan en el hecho de que se originan a partir de segmentos de secuencias génicas: Comparación de la diversidad génica en diferentes organismos Estudios de evolución génica Búsqueda de supuestos ortólogos en bases de datos Sondas para estudios de expresión génica Detección de SNP* Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

* Ver la sección que empieza en la diapositiva 25.

Últimas estrategias 12

Tecnología de matrices o “arreglos” Las matrices son ordenamientos de pequeños fragmentos de ADN fijados a portaobjetos de vidrio o membranas de nylon Esta tecnología permite hacer el seguimiento simultáneo del genoma entero El principio fundamental de las matrices es el apareamiento de las bases o la hibridación de sondas cortas con secuencias complementarias de ADN Las matrices se construyen con ADNc (matrices de ADNc), con secuencias genómicas o con oligonucleótidos sintetizados in silico (“arreglos de ADN”) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 13

Mediante la tecnología de matrices (también llamada 'tecnología de chip'), los genomas pueden analizarse a escala del genoma entero. Esta tecnología se basa en la hibridación entre sondas cortas de oligonucleótidos y secuencias complementarias de ADN. Decenas de miles de muestras se pueden inmovilizar en una lámina pequeña de vidrio (que es lo más corriente) o en una membrana de nylon donde pueden hibridarse con diferentes sondas o trozos de ADN de interés (la terminología es equívoca y permite que al ADN inmovilizado en el “arreglo” se le llame también sonda o ADN de interés). Se puede hibridar más de una sonda a la vez, por ejemplo, para comparar diferencias en la expresión, marcando las sondas con tintes fluorescentes de diverso color. Hay programas informáticos especiales que captan datos automáticamente. Las matrices pueden aplicarse al diagnóstico, al estudio de la expresión de genes y al desarrollo o análisis de mapas genéticos, entre otros objetivos. Sin embargo, la tecnología es todavía relativamente costosa, en particular en su etapa inicial, y la cantidad de datos generados puede ser imponente. Referencias básicas Alscher, R. 2001. Grid it: resources for microarray research. http://www.bsi.vt.edu/ralscher/gridit/ Brown, V.O. y D. Botstein. 1999. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genet. 21(supp): 33-37. Richmond, T. y S. Somerville. 2000. Chasing the dream: plant EST microarrays. Current Opinion Plant Biol. 3(2):108-116.

Una matriz hibridada

http://bti.cornell.edu/CGEP/CGEP.html

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 14

La imagen es cortesía de Mark D’Ascenzo, Boyce Thompson Institute for Plant Research, Center for Gene Expression Profiling, Cornell University.

Matrices: Ventajas y desventajas Ventajas: • Tecnología de alto rendimiento • Exploración del genoma entero • Permite el descubrimiento de la relación genotipofenotipo

Desventajas: • Debe estar disponible la información sobre la secuencia de los genes • Costosa • Tiene requisitos técnicos considerables • La cantidad y el tipo de los datos producidos requiere de un alto nivel de pericia en computación y de un equipo avanzado Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 15

Matrices: Ejemplos de aplicaciones Identificación de secuencias (génicas o de mutación génica) Determinación del nivel de expresión de los genes • Ensayo de la abundancia de secuencias específicas en el ADN genómico • Análisis de la expresión de gran número de genes (matrices de ADNc) • Identificación de gran número de marcadores específicos de ADN (por ejemplo, polimorfismo de un solo nucleótido o SNP) mediante hibridación molecular (matrices de oligonucleótidos sintéticos) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 16

Tecnología de matrices de diversidad (DArT) Comprende dos pasos: Generación de la matriz Genotipificación de la muestra

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 17

Las matrices de diversidad, también llamadas DArT, fueron concebidas por CAMBIA (ver Glosario). Esta tecnología implica un nuevo uso de las matrices que no requiere un conocimiento previo de las secuencias; por tanto, puede convertirse en una herramienta muy útil para los investigadores. Las siguientes diapositivas de DArT se han tomado, con autorización previa de CAMBIA, del sitio web de dicho Centro: http://www.cambia.org.au/ Referencias básicas CAMBIA. 2000. Enabling innovation. http://www.cambia.org/ Jaccoud, D., K. Peng, D. Feinstein y A. Kilian. 2001. Diversity arrays: a solid-state technology for sequence information independent genotyping. Nucleic Acids Research 29 (4):E25.

DArT: Preparación de la matriz (1) Se clonan los fragmentos generados por restricción, que representan la diversidad de un acervo genético. Al resultado se le llama una 'representación' (de 0.1% a 10% del genoma, comúnmente) Se identifican los clones polimórficos de la genoteca obteniendo primero la matriz de fragmentos tomados de un conjunto aleatorio de clones e hibridando luego la matriz con diferentes muestras Los fragmentos de los clones polimórficos se inmovilizan en una matriz Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 18

DArT: Preparación de la matriz (2) Gx

Gy

Gn

ADN de interés

Utilizar método de reducción de complejidad, por ejemplo, digestión con enzimas de restricción, ligamiento de adaptadores, amplificación por PCR

Mezcla de genomas

Clonar fragmentos de la representación

Genoteca

Seleccionar clones individuales y amplificar por PCR

Productos de la PCR purificados y ordenados

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Últimas estrategias 19

DArT: Obtención del genotipo de una muestra (1) Marcar la representación (ADN) de la muestra con fluorescencia e hibridarla con la matriz Examinar la matriz y medir, para cada fragmento de la matriz, la cantidad de señal de hibridación Empleando marcas múltiples, contrastar la representación de una muestra con la representación obtenida de otra o con una sonda testigo Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 20

DArT: Obtención del genotipo de una muestra (2) Gx

Gy Seleccionar 2 genomas para el análisis

Utilizar el mismo método de reducción de la complejidad que usó para hacer el panel de diversidad

Cortar, ligar adaptadores y amplificar vía PCR

Marcar cada subgrupo genómico: color rojo… Marcar cada subgrupo genómico: color verde… Hibridar con la matriz

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Últimas estrategias 21

Una matriz DArT hibridada

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Últimas estrategias 22

DArT: Ventajas y desventajas Ventajas: • • • • • • • • •

No requiere información sobre las secuencias Alto rendimiento Adquisición rápida de datos y análisis rápido Detecta cambios de una sola base así como inserciones o deleciones Detecta diferencias en la metilación del ADN, según el enzima usado para generar los fragmentos Genera clones listos para secuenciar Requiere muestras pequeñas de ADN Buena transferencia de marcadores entre poblaciones de mejoramiento Puede automatizarse totalmente

Desventajas: • •

Los marcadores son dominantes Tiene requisitos técnicos considerables

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Últimas estrategias 23

DArT: Ejemplos de aplicaciones Caracterización rápida del germoplasma Construcción de mapas genéticos Mejoramiento asistido por marcadores

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Últimas estrategias 24

Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) Sustituciones de una sola base entre secuencias homólogas Los SNP se dan con mayor frecuencia que cualquier otro tipo de polimorfismo Pueden identificarse mediante matrices y el equipo DHPLC

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Últimas estrategias 25

Un tipo muy reciente de marcador, que está disponible gracias a las nuevas tecnologías de secuenciación, son los polimorfismos de un solo nucleótido (los SNP). Estos polimorfismos son sustituciones de una sola base entre secuencias. Los SNP ocurren con mayor frecuencia que cualquier otro tipo de marcador y están o muy cerca del gen que interesa o incluso dentro de él. Los SNP pueden ser identificados o empleando una matriz o con una máquina de DHPLC. Referencia Patil, N., A.J. Berno, D.A. Hinds, W.A. Barret, J.M. Doshi, C.R. Hacker, y otros. 2001. Blocks of limited haplotype diversity revealed by high-resolution scanning of human chromosome 21. Science 294:1719-1723.

Equipo DHPLC

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Últimas estrategias 26

DHPLC se refiere a la cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento, y se usa para visualizar los SNP.

Interpretación de los SNP (1)

http://bldg6.arsusda.gov/pberkum/Public/sarl/cregan/snps.htm

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Este dibujo esquemático del polimorfismo de un solo nucleótido muestra dos fragmentos de ADN (uno en la parte superior y otro en la inferior) que comparten la misma secuencia en 30 pares de bases y difieren sólo en un par: la posición 28 de los fragmentos. En esa posición, un A-T (parte superior) ha cambiado a un C-G (parte inferior).

Interpretación de los SNP (2)

SNP #1 SNP #2 De: Patil y col., 2001. Science 294:1719-1723

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Últimas estrategias 28

La altura del bloque representa un tramo de ADN en un cromosoma. Cada columna de cuadritos representa la misma sección de ADN en un individuo diferente por genotipo. Cada hilera de cuadritos amarillos o azules representa un solo SNP. Los cuadritos azules de cada hilera representan el alelo principal de ese SNP, y los cuadritos amarillos representan el alelo secundario. La ausencia de un cuadrito en cualquier posición de una hilera indica que faltan datos. En este bloque, se pueden identificar 26 SNP comunes. Pueden organizarse en siete patrones diferentes de haplotipos (número de genotipos: 5, 4, 4, 3, 2, 1 y 1). Entre los cuatro patrones más comunes están 16 de los 20 cromosomas muestreados. Los círculos azules y amarillos indican los patrones alélicos de dos SNP (encerrados por líneas rectas), que distinguen sin ambigüedad los cuatro haplotipos comunes del bloque.

En resumen Continuamente se desarrollan estrategias para mejorar la detección de polimorfismos La obtención de secuencias de ADN permite detectar la variación incluso a nivel de los nucleótidos Los EST son herramientas poderosas para detectar la diversidad dentro de regiones codificantes Las matrices y las DArT hacen posible el análisis simultáneo de muchos loci Los SNP son sustituciones de una sola base entre secuencias, y representan la variante más frecuente del ADN Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Últimas estrategias 29

Hasta el momento usted debería saber Los diferentes tipos de variación del ADN que pueden detectarse por secuenciación, los EST y los SNP El principio fundamental de las matrices y de las DArT Las ventajas y las desventajas de las más modernas tecnologías con que se analiza la diversidad genética

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Últimas estrategias 30

Referencias básicas Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M. Gelbart. 1996. An introduction to genetic analysis (6a edn.). W.H. Freeman y Co., NY. Hajeer, A., J. Worthington y S. John (eds.). 2000. SNP and microsatellite genotyping: markers for genetic analysis. Biotechniques: Molecular Laboratory Methods Series. Eaton Publishing, Manchester, U.K. USDA-ARS. 1999. The Cregan lab. http://bldg6.arsusda.gov/pberkum/Public/sarl/cregan/snps.htm Wang, D.G., J.B. Fan, C.J. Siao, A. Berno, P. Young, R. Sapolsky, y otros. 1998. Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome. Science 280(5366):1077-1082.

A continuación

Tecnologías complementarias Consideraciones finales Glosario

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Últimas estrategias 31

Agradecimientos La producción del módulo títulado Tecnologías de Marcadores Moleculares para Estudios de Diversidad Genética de Plantas: Módulo de Aprendizaje es el resultado de un esfuerzo de colaboración entre el Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos (IPGRI) y el Instituto para la Diversidad Genómica (IGD) de la Universidad de Cornell. Las autoras agradecen especialmente la contribución recibida de las siguientes personas o instituciones: La Oficina Regional del IPGRI para Asia, el Pacífico y Oceanía, que desde su Proyecto de Árboles Frutales Tropicales apoyado, a su vez, por el Banco Asiático de Desarrollo (ADB), financió en parte la preparación del material de este módulo. Félix Alberto Guzmán (Oficina Regional de IPGRI-Américas), por su ayuda en la recopilación de la información para los submódulos, especialmente por elegir buenos ejemplos de la aplicación de las tecnologías a estudios reales de diversidad genética, y también por sus sugerencias para hacer que los módulos fueran claros y comprensibles. Brian V. Ford-Lloyd (Universidad de Birmingham, Reino Unido), quien escribió el módulo de capacitación producido inicialmente por el IPGRI en 1996 (Measuring genetic variation using molecular markers), que sirvió de base en la preparación del módulo actual, extendido y actualizado. En realidad, conservamos el texto anterior en aquellos sitios en que resultó ser el más apropiado. Pere Arús (Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries, IRTA, España), por ayudar a hacer las diapositivas en que se interpretan los isoenzimas, y por prestarnos la serie de imágenes sobre los procedimientos de laboratorio empleados para detectar isoenzimas. Estas imágenes fueron incluidas en el submódulo correspondiente. Andrzej Kilian (Centre for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, CAMBIA, Australia), por permitirnos usar las ilustraciones esquemáticas de la tecnología DArT que aparecen en la página web de CAMBIA. Steve Tanksley (Cornell University, NY), quien nos prestó diapositivas de su colección didáctica sobre microsatélites para incluirlas en este módulo; también Rebecca Nelson, de Cornell University, por compartir información acerca de la simplificación de los protocolos de AFLP. Humberto Gómez Paniagua (Centro Internacional de Agricultura Tropical, CIAT, Colombia, y International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics, ICRISATColombia), quien facilitó imágenes de perfiles de RAPD para usarlas como ejemplos de resultados buenos o malos obtenidos con esta tecnología, y nos dio muchas ideas sobre la forma de mejorar la presentación didáctica de este módulo. Helmer Ayala (Universidad de San Carlos, Guatemala), por la imagen que sirvió de ejemplo de detección de AFLP con tinción de plata; Xiaoming Pang (Universidad de Guizhou, China), por facilitar una imagen de un microsatélite detectado con tinción de plata; y Kamel Chabane (International Center for Agricultural Research in Dry Areas, ICARDA, Siria) y Martin Fregene (CIAT, Colombia), quienes proporcionaron imágenes de diferentes marcadores moleculares, para fondo de las diapositivas de varios submódulos.

El personal de la Unidad de Recursos Genéticos del CIAT (Colombia), por permitirnos tomar fotos de los procedimientos de detección de isoenzimas en su laboratorio. Heiber Cárdenas (Profesor del Departamento de Biología, Universidad del Valle, Cali, Colombia), quien ensayó el módulo de capacitación con cinco de sus estudiantes (Iván Andrés González, Olga Lucía Agudelo H., Martha Nora Moyano, Fernando Rondón G. y Diego Mauricio Villamarín M.) e hizo comentarios valiosos para el mejoramiento del módulo. Luigi Guarino, Ramanatha Rao, Issiaka Zoungrana, Margarita Baena, Toby Hodgkin, Jan Engels, Paul Neate y Elisabeth Goldberg (de diferentes oficinas del IPGRI), por sus comentarios y sugerencias sobre la forma de mejorar este producto y hacerlo más útil a nuestros socios. José Ignacio Cubero Salmerón (Universidad de Córdoba, España), por su ayuda para lograr una traducción adecuada de los nombres de las tecnologías de marcadores del inglés al español. W. H. Freeman y los Editores de Company/Worth (Nueva York), quienes dieron autorización para reproducir las versiones modificadas de las figuras 4-3, 11-12, 12-3(a), 12-6, 12-7(c), 12-7(d), 14-20, 14-24, 14-29 y 17-10(a) del libro que publicaron en 1996 bajo el título Introducción al Análisis Genético (escrito por Griffiths et al.). Francisco Motta, por su ayuda en la edición de estilo del manuscrito en español. Elizabeth L. McAdam, por su ayuda en la revisión del manuscrito en inglés y por sus útiles sugerencias para mejorar el formato de este producto.

Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas: Módulo de aprendizaje

Tecnologías complementarias

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Tecnologías complementarias 1

Contenido Introducción Electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante (DGGE) Electroforesis en geles de gradiente de temperatura (TGGE) Polimorfismo de conformación de cadena única (SSCP) Análisis de heteroduplex Cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento (DHPLC) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Tecnologías complementarias 2

Introducción Hay varias tecnologías que sirven para señalar la presencia de diferencias en las secuencias Ayudan a reducir la posibilidad de que sea necesario secuenciar algo (¿hay algún polimorfismo que merezca secuenciarse?) No indican, sin embargo, en qué consisten las diferencias que hay en las secuencias

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Tecnologías complementarias 3

Cuando se buscan diferencias en la secuencia del ADN, es necesario que podamos separar segmentos específicos de ADN de una mezcla (p.e. del genoma entero). La electroforesis separa las moléculas sometidas a un campo eléctrico basándose en su carga, su tamaño y su forma. Si una molécula de ADN se corta en secciones pequeñas y se coloca en un pocillo en el extremo (cátodo) de un gel de agarosa, los fragmentos de ADN se moverán a través del gel hacia el ánodo. La velocidad del movimiento dependerá de los tamaños individuales, de manera que aparecerán bandas en el gel en diferentes posiciones. Las bandas pueden visualizarse luego con tinción de bromuro de etidio, un compuesto que le da fluorescencia al ADN bajo la luz ultravioleta. El mismo resultado se logra con la electroforesis en gel de acrilamida, siendo la única diferencia el grado de resolución. La acrilamida permite discriminar diferencias más pequeñas en el tamaño de los fragmentos que la agarosa. La electroforesis es un procedimiento de diagnóstico que permite identificar moléculas de diferentes tamaños. Cuando se emplea como tal, la electroforesis es un medio para mostrar polimorfismos y, en consecuencia, la variación genética que hay entre genotipos. La electroforesis, no obstante, puede ser también útil como un primer paso hacia la identificación y el aislamiento de moléculas específicas de ADN que, aunque del mismo tamaño, difieren en la composición de sus secuencias.

Electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante (DGGE) (1) Hace posible la detección de polimorfismos o de mutaciones muy pequeñas del ADN También se puede aplicar a fragmentos de ADN grandes, que midan cientos de pares de bases No requiere un conocimiento previo de la existencia de algún polimorfismo Se basa en las propiedades de renaturalización de las cadenas de ADN La desnaturalización del ADN tiene lugar durante la electroforesis Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Tecnologías complementarias 4

Referencia básica Myers, R.M., N. Lumelsky, L.S. Lerman y T. Maniatis. 1985. Detection of single base substitutions in total genomic DNA. Nature 313:495-498.

Electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante (DGGE) (2) Fragmentos pequeños de ADN se someten a electroforesis en un gel de poliacrilamida bajo condiciones de desnaturalización progresiva (con concentraciones de formamida/urea) El ADN se ‘deshace’ y se convierte en ADN de cadena simple Las moléculas del ADN cambian de forma y se detienen Se identifican entonces las diferencias en la secuencia del ADN Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Tecnologías complementarias 5

Primero, los fragmentos de ADN migran como moléculas de cadena doble. Más adelante, y a causa de la composición cambiante del gel, las moléculas se desnaturalizan, y se convierten en cadenas simples formando una estructura ramificada. Esta estructura, así modificada, reduce la capacidad de las moléculas para moverse a través del gel. El punto en que el ADN se ‘deshace’ depende de la secuencia de los nucleótidos en la región afectada. Por consiguiente, la ubicación final de las moléculas en el gel depende de la secuencia nucleotídica de los fragmentos.

Electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante (DGGE) (3) La DGGE puede ser un proceso de dos etapas: Las muestras se hacen migrar para separar los fragmentos según su tamaño Los fragmentos se separan en las condiciones de la DGGE según el proceso de ‘punto de fusión’ Cuando las muestras se mezclan, las bandas dobles indican diferencias de secuencia entre las bandas del mismo tamaño Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Tecnologías complementarias 6

Se calcula que, con este procedimiento, se pueden detectar al menos 95% de las diferencias en la composición de las secuencias. La DGGE sirve también para distinguir los genotipos homocigotos de los heterocigotos respecto a un fragmento determinado de ADN. Para aprovechar esta capacidad, después del último ciclo de la PCR debe hacerse un ciclo de desnaturalización y otro de 'renaturalización'. A medida que los alelos se reasocian, se forman homoduplex y heteroduplex. En un gel de DGGE, las combinaciones homoduplex que migran rápidamente indicarán genotipos homocigóticos. Los genotipos heterocigóticos presentarán combinaciones tanto de homoduplex como de heteroduplex. Los heteroduplex se forman a causa del emparejamiento erróneo y de la desnaturalización rápida en el gel, los cuales detienen el curso migratorio de estas moléculas.

Electroforesis en geles de gradiente de temperatura (TGGE) Es similar a la DGGE Las condiciones de desnaturalización progresiva se logran con un gradiente de temperatura, no por cambios en la concentración de los reactivos Puede emplearse también para analizar ARN de cadena simple y proteínas

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Tecnologías complementarias 7

Referencia básica Myers, R.M., N. Lumelsky, L.S. Lerman y T. Maniatis. 1985. Detection of single base substitutions in total genomic DNA. Nature 313:495-498.

Polimorfismo de conformación de cadena única (SSCP) (1) La técnica de SSCP se basa en el comportamiento electroforético de una molécula de ADN de cadena simple a través de un gel de acrilamida no desnaturalizante • Una molécula de cadena simple tiene la propiedad de formar estructuras secundarias gracias a apareamientos internos de sus bases • Estas estructuras secundarias dependen de la secuencia y dan lugar a formas particulares en cada molécula de cadena simple

Las diferencias de estructura secundaria hacen que las cadenas de ADN migren de modo diferente en el gel Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Tecnologías complementarias 8

La técnica de SSCP puede distinguir entre dos secuencias de ADN muy similares, sólo basada en la forma específica de sus estructuras de cadena simple. Por consiguiente, pueden discriminarse, en principio, hasta dos alelos del mismo gen. Referencia básica Hayashi, K. 1992. A method for the detection of mutations. Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79.

SSCP (2) La secuencia objeto de estudio se somete a la PCR Enseguida, el producto de la PCR se desnaturaliza a 94°C y se enfría rápidamente en hielo. Las moléculas de cadena simple no se emparejan pero forman estructuras secundarias estables Los fragmentos reasociados se someten luego a electroforesis: • En el caso de un homocigoto, se observarán dos bandas, cada una de las cuales corresponde a una estructura secundaria ligeramente diferente • En el caso de un heterocigoto, podrán observarse cuatro bandas, por lo menos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Tecnologías complementarias 9

SSCP es una técnica sencilla, sin embargo tiene dos desventajas principales, por lo menos: • El comportamiento electroforético de las moléculas de cadena simple es impredecible, porque depende mucho de la temperatura y de las condiciones en que ocurre la migración. • Si se trata de fragmentos largos de ADN (> 200 pb), el método se vuelve insensible a algunas mutaciones. En principio, el SSCP funciona mejor, al parecer, para analizar inserciones o deleciones pequeñas.

Análisis de heteroduplex Dos productos amplificados mediante la PCR se mezclan en cantidades iguales, se desnaturalizan a 95°C y se dejan enfriar Durante el enfriamiento, las cadenas de ADN se reasocian para formar ADN heteroduplex Cualquier acoplamiento erróneo en el heteroduplex dará lugar a una estructura tridimensional diferente, cuya movilidad se reducirá proporcionalmente al grado de divergencia de las secuencias Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Tecnologías complementarias 10

Referencia básica Delwart, E.L., E.G. Shpaer, J. Louwagie, F. McCutchan, M. Grez, H. Rübsamen Waigmann y J.I. Mullins. 1993. Genetic relationships determined by a heteroduplex mobility assay: analysis of HIV env genes. Science 262:1257-1261.

Cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento (DHPLC): Metodología Este método puede detectar diferencias de secuencia en un solo par de bases, así como inserciones y deleciones Funciona con los productos directos de la PCR y no requiere la secuenciación previa del ADN Está basado en la elución diferencial del ADN homoduplex y el heteroduplex cuando migran a través de una columna cromatográfica

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Tecnologías complementarias 11

La DHPLC es un método de cromatografía líquida de alto rendimiento, en el cual se separan fragmentos de ADN según su tamaño o según la presencia de heteroduplex (cadenas de ADN reasociadas) durante su tránsito por un gradiente de una columna. En el ADN amplificado de cadena doble, los nucleótidos que se asocian erróneamente a causa de mutaciones y polimorfismos se hacen evidentes después de la formación de heteroduplex. La presencia de estos polimorfismos crea una mezcla de heteroduplex y homoduplex durante la reasociación del ADN salvaje y del mutante. Si esta mezcla de fragmentos se hace migrar, mediante HPLC en condiciones parcialmente desnaturalizantes, los heteroduplex fluyen de la columna antes que los homoduplex debido a su temperatura de fusión más baja. Este análisis puede hacerse para detectar variaciones de secuencia entre individuos o para determinar heterocigosidad. Referencia básica Oefner, P.J. y P.A. Underhill. 1998. DNA mutation detection using denaturing highperformance liquid chromatography (DHPLC). En: Current Protocols in Human Genetics, Suplemento 19, [7.10.1]-[7.10.12]. Wiley & Sons, NY, E.U.

DHPLC: Aplicaciones Descubrimiento de nuevas mutaciones y polimorfismos en cualquier fragmento de ADN o en cualquier secuencia específica de un gen Evaluación de clones para identificar fragmentos candidatos para secuenciación Evaluación de la fidelidad de fragmentos amplificados Diagnóstico de la presencia de mutaciones conocidas Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Tecnologías complementarias 12

En resumen Varias tecnologías sirven para identificar la presencia de diferencias en las secuencias Aunque no pueden identificar la variante, pueden ciertamente ayudar a reducir el intervalo de posibles estrategias que se emplearían para detectarla

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Tecnologías complementarias 13

Hasta el momento usted debería saber Los principios básicos de: La electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante (DGGE) La electroforesis en geles de gradiente de temperatura (TGGE) El polimorfismo de conformación de cadena única (SSCP) El análisis de heteroduplex La cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento (DHPLC) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Tecnologías complementarias 14

A continuación

Consideraciones finales

Glosario

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Tecnologías complementarias 15

Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas: Módulo de aprendizaje

Consideraciones finales

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Consideraciones finales 1

Contenido

Al elegir una técnica... Aplicaciones prácticas

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Consideraciones finales 2

Al elegir una técnica... Haga primero la pregunta biológica: ¿Cuál es el problema? ¿Cuántos loci o alelos (o ambos) se requieren? ¿A qué nivel se busca discriminar? ¿Es importante la modalidad de herencia del marcador?

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Consideraciones finales 3

(continúa en la siguiente) ¿Cuál es el problema que se presenta? Esta es la pregunta más importante. El primer paso es conocer exactamente la pregunta biológica a la que se quiere responder con la investigación. Este conocimiento es esencial para elegir la técnica correcta. Por ejemplo, para obtener información sobre historia de poblaciones o sobre relaciones filogenéticas, deben usarse datos de secuencias o de sitios de restricción. Número de loci o de alelos (o de ambos) que se requiera ¿Será suficiente la información derivada de unos pocos loci o se requerirá un examen más amplio del genoma? Los isoenzimas son limitados. Los AFLP detectan un alto número de loci. Cuando se requiere alta variabilidad, las mejores técnicas son las que se basan en loci específicos (por ejemplo, SSR). Nivel de discriminación Hay que definir el nivel taxonómico al cual queremos medir la variación genética: ¿Dentro de poblaciones, entre especies o entre géneros? ¿Es el método escogido el apropiado para detectar el nivel deseado de variación? Modalidad de herencia ¿Deberían identificarse tanto los homocigotos como los heterocigotos? ¿Se necesitan marcadores codominantes (RFLP de copia única, aloenzimas, microsatélites amplificados por PCR) o bastarán marcadores dominantes (RAPD, AFLP)? Si es suficiente la información que indique presencia o ausencia, se puede emplear cualquier tecnología de marcador molecular; pero si se necesita información acerca de los heterocigotos (por ejemplo, estructura poblacional y estructura de la diversidad, noción del tipo de herencia) deberían usarse solamente marcadores codominantes como los isoenzimas o los microsatélites.

Al elegir una técnica... (continuación) Recursos: ¿Es importante disponer de ADN de buena calidad? ¿Se dispone de la experiencia adecuada? ¿Se cuenta con un laboratorio bien equipado? Costos: • Equipo • Reactivos

Rapidez Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Consideraciones finales 4

(continúa en la siguiente) Disponibilidad del ADN El análisis de RFLP requiere cantidades grandes de ADN. La mayoría de los métodos basados en la PCR requieren sólo cantidades mínimas de ADN obtenido por métodos sencillos. En muchos casos, la PCR se lleva a cabo sólo para amplificar la cantidad original del ADN objeto de estudio. Experiencia requerida Las tecnologías que contemplan la hibridación o la secuenciación manual tienen más requisitos técnicos que las otras. Los RAPD o los SSR (estando ya disponibles los cebadores) son los que presentan menos exigencias. Disponibilidad de instalaciones y de equipo de laboratorio Una vez aclaradas las preguntas biológicas, los criterios técnicos y de organización adquieren importancia a la hora de seleccionar una tecnología. Consideremos, por ejemplo, los siguientes: (1) tener acceso a un laboratorio que tenga el equipo adecuado; (2) tener presupuesto para adquirir equipo adicional y reactivos cuando sean necesarios; (3) poseer buenos conocimientos de habilidades básicas de laboratorio; y (4) tener nociones básicas sobre diseño experimental y su ejecución. Costos Hablando de costos, los isoenzimas son los más baratos; RAPD, RFLP e incluso AFLP son de costo intermedio; la secuenciación es aún más costosa que los anteriores. Deben considerarse los costos de todos los tipos de experimentos, porque la falta de reproducibilidad de algunos marcadores puede ocasionar, al final, costos mayores. Respecto a las habilidades necesarias, una visita prolongada a otro laboratorio en que se empleen las técnicas requeridas aporta, a menudo, información excelente para establecer una investigación. Los contactos personales que puedan ayudar en los primeros pasos de la investigación, son de un valor inestimable. Rapidez ¿Con qué rapidez se necesitan los datos y qué tiempo nos rendirá el equipo disponible? Los métodos basados en la PCR dan, sin duda, resultados rápidos cuando se dispone ya de los cebadores. Los métodos basados en la hibridación son más lentos. La secuenciación convencional del ADN es lenta, mientras que la secuenciación automatizada es más rápida.

Al elegir una técnica... (continuación) Otros asuntos relacionados: Reproducibilidad Técnicas con PCR frente a técnicas no basadas en la PCR Últimas estrategias

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Consideraciones finales 5

Reproducibilidad ¿Es necesario emplear métodos sólidos? Preguntemos, por ejemplo: ¿se intercambiarán los marcadores? ¿Participa más de un laboratorio en la investigación? En tales casos, los isoenzimas, los RFLP, los SSR y la secuenciación son sólidos, pero los RAPD no lo son. Técnicas con PCR frente a técnicas no basadas en la PCR Las técnicas de marcadores moleculares basadas en la PCR abren numerosas posibilidades y podrían considerarse entre las primeras a la hora de decidir, en razón de su sencillez. Las técnicas basadas en hibridación suponen un trabajo más intenso, tienen mayores exigencias técnicas y requieren un equipo diferente. • •

•

RAPD es una técnica excelente que ayuda a familiarizarse con la PCR. Permite el examen rápido de los polimorfismos en la mayoría de las especies de interés y se dispone fácilmente de cebadores. Otros marcadores basados en la PCR, como los SSR, se pueden aplicar con relativa facilidad, cuando los cebadores están disponibles. Cada vez más, éste es el caso en muchas especies. Están mejorando también las estrategias para buscar cebadores apropiados, y hay enfoques de búsqueda de microsatélites que se apoyan en bases de datos de secuencias, de manera que se puede eludir la dificultad de tener que elaborar y examinar genotecas en el laboratorio. Los AFLP se han convertido en una opción muy popular; sin embargo, los requisitos de una PCR doble y la electroforesis en geles verticales los hacen más costosos y elevan sus requisitos técnicos.

Últimas estrategias Los costos de los experimentos de secuenciación han disminuido significativamente. Muchos EST están ya disponibles para varias especies. Las matrices, basadas ya sea en la caracterización anónima del genoma o en la expresión génica, se están convirtiendo en técnicas comunes. La tecnología de matrices plantea todavía muchas exigencias, tanto técnicas como relativas al equipo. Antes de decidirse por ella, es importante familiarizarse con las técnicas, sus requisitos y los resultados que entrega. Una mejor opción sería considerar la contratación del servicio de análisis de muestras y concentrarse en la interpretación de los resultados y en la toma de decisiones. Los SNP se usan habitualmente en los estudios realizados con seres humanos. Son todavía demasiado costosos para aplicarlos a los estudios corrientes de diversidad genética de plantas. Se orientan, no obstante, al último nivel de variación de la secuencia del ADN, es decir, a los nucleótidos, y tienen muchas probabilidades de ser la mejor opción como marcador molecular en el futuro, cuando hayan disminuido los costos de su descubrimiento y de su aplicación.

Aplicaciones prácticas: Estudios de diversidad genética Parentesco genético y diversidad: genética de poblaciones Estudio del polimorfismo en razas locales y en cultivares Identificación de cultivares y taxonomía Estudios filogenéticos Estudios de domesticación y evolución Flujo de genes e introgresión Cartografía comparativa de genomas Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Consideraciones finales 6

Algunos de los submódulos anteriores describen experimentos reales, en los cuales se aplicaron las técnicas moleculares para responder a preguntas sobre diversidad genética. En ellos se dieron también listas de referencias sobre la tecnología correspondiente.

Aplicaciones prácticas: Manejo de germoplasma Caracterización taxonómica de germoplasma Mantenimiento de las colecciones: • • • • •

Identificación de ausencias Identificación de duplicados Constitución de colecciones nucleares Evaluación de la estabilidad del material conservado Medición de la erosión genética

Desarrollo de estrategias de conservación

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Consideraciones finales 7

Los marcadores moleculares pueden usarse en el manejo de los bancos de germoplasma para: • Identificar con exactitud el germoplasma • Seleccionar el germoplasma que necesitan usar los mejoradores y otros investigadores. Ejecutar el mantenimiento rutinario del banco, que se simplificará gracias a la identificación de duplicados, a la evaluación de la estabilidad por medio de diferentes rondas de regeneración o multiplicación, y a la medición de la erosión genética • Identificar las ausencias que tiene la colección para planear futuras actividades de conservación y de recolección. Definir colecciones nucleares, con el complemento de otros datos, asegurando al máximo la riqueza alélica de la colección

Asimismo, la información molecular puede usarse para definir estrategias de conservación, tanto ex situ (por ejemplo estrategias de recolección) como in situ.

Aplicaciones prácticas: Uso del germoplasma Localización de genes en mapas genéticos y su identificación Selección asistida por marcadores para el fitomejoramiento Detección de variación somaclonal Evaluación de germoplasma para descubrir genes útiles Análisis de parentesco Identificación de híbridos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

Consideraciones finales 8

Las tecnologías moleculares ayudan a promover el uso del germoplasma al suministrar datos exactos acerca de los atributos genotípicos de las plantas, incluyendo las cultivadas. La caracterización del germoplasma ofrece información sobre la composición genómica del individuo y, como tal, permite que los mejoradores seleccionen material promisorio basados en el genotipo tanto como en el fenotipo. La construcción de mapas de ligamiento moleculares ha abierto la posibilidad de ubicar caracteres agronómicos importantes en los genomas de los cultivos y, en consecuencia, de seleccionar germoplasma partiendo de la presencia de un gen específico de interés. La introgresión de genes a partir del germoplasma ‘donante’ puede seguirse en las generaciones posteriores, mediante la denominada selección asistida por marcadores, facilitando y acelerando los ensayos tradicionales de selección. Las tecnologías de marcadores moleculares se emplean también para detectar la variación somaclonal —potencialmente útil para el fitomejoramiento— la cual se presenta a veces después de la regeneración que sigue al cultivo de tejidos. Estas tecnologías pueden ayudar también en las actividades corrientes de mantenimiento de un programa de fitomejoramiento, tales como seguirle el rastro a la descendencia a través del análisis de parentesco, identificar los individuos fuera de tipo en los lotes de semilla, y confirmar o rechazar la pureza híbrida. Se espera que las herramientas más modernas de la genética molecular aceleren los procedimientos de fitomejoramiento mediante actividades como facilitar el descubrimiento rápido de genes útiles en las colecciones de germoplasma o correlacionar el genotipo con el fenotipo de los individuos.

En resumen Los criterios más importantes que se aplican en la elección de una técnica molecular para un estudio de diversidad genética son: • La pregunta biológica que motiva el estudio • Los recursos de que se dispone frente a los que se requieren

Las aplicaciones de las tecnologías moleculares abarcan todos los aspectos del análisis de la diversidad genética, del manejo del germoplasma y del uso del germoplasma Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

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Hasta el momento usted debería saber Los criterios que le ayudarán a acertar en el proceso de selección de las tecnologías moleculares y en su aplicación a los recursos fitogenéticos de interés

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A continuación

Glosario

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Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas: Módulo de aprendizaje

Glosario Accesión: Muestra de un cultivo recolectada en una localidad y en un tiempo específicos; puede ser de cualquier tamaño. Se llama también entrada (por la acción de 'entrar' en una colección o tener 'acceso' a ella) Acervo genético: La suma total de los genes, con todas sus variantes, propios de una especie determinada en un momento dado. ADN: Acido desoxirribonucleico, una cadena doble de nucleótidos unidos entre sí (en los que el componente azúcar es la desoxirribosa), que es la molécula fundamental en la trasmisión de los genes. ADNc o ADN complementario: ADN trascrito de una molécula de ARN por un enzima llamada transcriptasa inversa. ADNcp: ADN de los cloroplastos. ADN homoduplex: Molécula de ADN de doble cadena en la que ambas cadenas tienen el mismo origen. ADN microsatélite: Tipo de ADN repetitivo que consiste en repeticiones muy cortas, tales como dinucleótidos, trinucleótidos o tetranucleótidos. Ver también ADN repetitivo. ADN minisatélite: Tipo de secuencia de ADN repetitivo que consiste en repeticiones cortas que tienen un núcleo común único. Ver también ADN repetitivo. ADNmt: ADN de las mitocondrias. ADN polimerasa: Cualquier enzima que sea capaz de sintetizar nuevas cadenas de ADN a partir de un ADN patrón. ADN repetitivo: Tramo de ADN que consta de repeticiones múltiples de un motivo. Ver también ADN microsatélite, ADN minisatélite y ADN satélite. ADN satélite: Repetición de alta frecuencia (desde 1000 hasta más de 100,000 copias) de un motivo básico o unidad de repetición (comúnmente de 100 a 300 pares de bases) que se presenta en unos cuantos loci del genoma. Ver también ADN repetitivo.

AFLP: Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados. Es un método muy sensible para detectar polimorfismos del ADN. Primero se somete el ADN a digestión con dos enzimas de restricción; luego se selecciona un subconjunto de los fragmentos de ADN que resultan de la digestión para que sean amplificados en la PCR y, finalmente, visualizados. Alelo: Una de las formas alternas de un gen que puede existir en un locus. Alelo dominante: Alelo que expresa su efecto fenotípico aun cuando esté en heterocigosis con un alelo recesivo (ver este término). Es decir, si A es dominante sobre a, entonces AA y Aa tienen el mismo fenotipo. Alelo recesivo: Alelo cuyo efecto fenotípico no se expresa en condición heterocigótica porque es ocultado por el alelo dominante. Aloenzima: Isoenzima cuya síntesis es controlada por los alelos codominantes de un gen. Aminoácidos: Compuestos orgánicos bi-funcionales que contienen un grupo básico amino (–NH2) y un grupo ácido carboxilo (–COOH). También se llaman ácidos aminos. Análisis de heteroduplex: Es el estudio de la movilidad del ADN heteroduplex sometido a electroforesis en geles de poliacrilamida. La reducción en la movilidad del ADN heteroduplex, comparada con la del ADN homoduplex, es proporcional al grado de divergencia de las secuencias. Ver también DGGE, SSCP y TGGE. Apomixis: Es la producción de un embrión sin meiosis. Las plantas superiores apomícticas producen semillas asexuadas, que provienen de tejido materno solamente. AP-PCR: Reacción en cadena de la polimerasa iniciada al azar. Una técnica para amplificar tramos anónimos de ADN mediante la PCR. Está relacionada con el RAPD. Árbol genealógico: Diagrama simplificado del linaje de una familia que muestra las relaciones entre los miembros de la familia y cómo se han heredado un carácter dado o enfermedades. ARN: Ácido orgánico constituido por unidades de nucleótidos de adenina (A), guanina (G), citosina (C) y uracilo (U) que se repiten, cuyos componentes de ribosa están unidos con enlaces de tipo fosfo-diester. Autogamia: Es la transferencia del polen desde la antera de una flor al estigma de la misma flor o, a veces, al de una flor genéticamente idéntica (o sea, de la misma planta o del mismo clon). Es también la habilidad que tienen muchas especies vegetales de lograr con éxito la fertilización natural de ellas mismas. Se llama también autopolinización. Autorradiografía: Es una técnica en que las moléculas marcadas radiactivamente se visualizan en una película de rayos X. Bacteriófago: Virus que infecta bacterias. Sus formas genéticamente alteradas se usan como vectores para clonar el ADN.

Banco de germoplasma: Instalación que se construye para la conservación ex situ de individuos (semillas), tejidos o células reproductivas de plantas o animales. Base: Unidad química que caracteriza a un nucleótido. En el ADN, las bases son: adenina (A), guanina (G), timina (T) y citosina (C). Las bases del ARN son adenina, guanina, uracilo (U) y citosina. Bases nitrogenadas: Moléculas que son componentes importantes de los ácidos nucleicos; están constituidas por una estructura de anillo que contiene nitrógeno. Los puentes de hidrógeno que unen las bases sirven de enlace a las dos cadenas de ADN para formar la doble hélice. CAPS: Secuencia de restricción amplificada y polimórfica, conocida también como PCR-RFLP; es una técnica que detecta polimorfismos en un locus específico. Un locus se somete a la amplificación por PCR y los polimorfismos resultantes se detectan por las diferencias en tamaño de los fragmentos de restricción entre individuos. Carácter: O rasgo, atributo de los individuos de una especie para el cual pueden definirse varias diferencias hereditarias. Cebador: Fragmento corto de ADN o de ARN hibridado con un ADN de cadena simple, y al cual pueden agregarse más nucleótidos mediante la polimerasa de ADN. Cebador arbitrario: Cebador constituido por un oligonucleótido corto, que se usa en ciertos métodos de PCR para iniciar la síntesis del ADN en posiciones aleatorias del ADN patrón. Centrómero: La región constreñida de un cromosoma, a la cual se adhieren las fibras del huso durante la división celular. Clonación: En biología molecular: es el proceso en que, mediante procedimientos de manipulación del ADN, se producen copias múltiples de un único gen o de un segmento de ADN. Codominancia: Es la situación en que un individuo heterocigótico exhibe el fenotipo de ambos alelos de un gen específico. Conservación ex situ: (1) Método de conservación que implica la remoción de los recursos de germoplasma (semilla, polen, esperma, organismos individuales) de su hábitat original o de su ambiente natural. (2) Es la acción de mantener vivos los componentes de la diversidad biológica fuera de su hábitat original o de su ambiente natural. Ver Conservación in situ Conservación in situ: Es un método de conservación que pretende preservar la integridad genética de los recursos genéticos manteniéndolos dentro de los ecosistemas de evolución dinámica del hábitat original o del ambiente natural. Ver Conservación ex situ. Cromatina: Complejo de ADN y proteínas de la célula en la interfase. Cromosoma: Organización lineal continua de genes y de otro ADN, además de proteínas y del ARN asociado.

Cuello de botella: Breve reducción del tamaño de una población que ocasiona, generalmente, deriva genética aleatoria. DAF: Amplificación de la huella de ADN. Técnica que amplifica tramos anónimos de ADN, aplicando la PCR. Está relacionada con el RAPD. DArT: Tecnología de matrices de diversidad. Deleción: Es una clase especial de mutación en que se pierde parte del ADN de un cromosoma. Dendrograma: Todo diagrama ramificado que muestre, mediante líneas en forma de U, una jerarquía de categorías u objetos basada en el grado de semejanza o en el número de caracteres compartidos. La longitud de cada rama en U representa, a veces, la distancia que separa los dos objetos conectados. Deriva genética: Es un cambio de frecuencia alélica entre una generación y la siguiente de una población, debida al muestreo de un número finito de genes, inevitable en todas las poblaciones de tamaño finito. Cuanto más pequeña es la población, mayor es la deriva genética, y el resultado será que algunos alelos se pierdan y que la diversidad genética se reduzca. Desnaturalización: Es la separación de las dos cadenas de la doble hélice del ADN, o la ruptura severa de una molécula compleja sin que se destruyan los enlaces principales de sus cadenas. DGGE: Electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante. Método para separar fragmentos de ADN según su movilidad en condiciones cada vez más desnaturalizantes (generalmente, por concentración creciente de formamida o de urea). Ver también Análisis de heteroduplex, SSCP y TGGE. DHPLC: Cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento. Este método permite detectar la variación en la secuencia de un sólo par de bases. Doble hélice: Estructura propuesta por Watson y Crick (los primeros en hacerlo) para el ADN, que consta de dos hélices afines unidas por enlaces de hidrógeno que se establecen entre las bases apareadas. Ecotipo: Población o raza de un organismo adaptada a un hábitat específico. Electroforesis: Técnica que separa, los componentes de una mezcla de moléculas (proteínas, ADN, ARN) según su tamaño, como resultado de un campo eléctrico en un gel que sirve de soporte. Elemento transponible: Elemento genético que tiene capacidad para moverse de un sitio a otro en un cromosoma. Algunos se asemejan a los retrovirus y es posible que se hayan originado en ellos. Enzima: Proteína que funciona como catalizador de reacciones bioquímicas. Enzima de restricción: Endonucleasa que reconoce como objetivo una secuencia específica y corta la cadena de ADN en ese punto.

EST: Marcador de secuencia expresada. Es una sección pequeña de la parte activa de un gen, y está hecha de ADNc. Puede usarse como un marcador, para buscar el resto del gen o para ubicarlo en un segmento más grande de ADN. Eucariota: Célula u organismo que posee un núcleo rodeado por una membrana, y otros componentes subcelulares diferenciados. Fenotipo: (1) Forma en que se manifiesta un carácter (o grupo de caracteres) en un individuo determinado; (2) la apariencia externa perceptible de un genotipo específico. F 1, F 2, F 3, …: Notación abreviada que se usa para indicar las diferentes generaciones que ocurren en un experimento de mejoramiento. F1 es la primera generación filial, o sea, la descendencia del cruzamiento paterno; F2 es la segunda generación filial, o sea, la descendencia de la autofecundación o del cruzamiento de los individuos de la F1; y así sucesivamente. Flujo génico: Intercambio de genes entre poblaciones diferentes aunque, por lo regular, con alguna relación. Fragmento de restricción: Fragmento de ADN que ha sido cortado por un enzima de restricción. Frecuencia alélica: Es una medida de la presencia continua o asidua de un alelo en una población, o de la proporción que representa de todos los alelos de un gen. Gen: Unidad básica, tanto física como funcional, de la herencia, que transmite información de una generación a la siguiente. Es un segmento de ADN que incluye una sección transcrita y un elemento regulador que permite su transcripción. Gen estructural: Cualquier gen que codifique para una proteína. Genoma: Todo el complemento de material genético en un organismo. Genoteca: Colección de clones de ADN obtenidos de un donante de ADN. Genotipo: Composición específica de alelos de toda la célula o, más comúnmente, de determinado gen o de un conjunto de genes. Germoplasma: La variabilidad genética total disponible de una población de organismos representados por células germinales, semillas, etc. Haplotipo: Constitución alélica específica de cierto número de loci en un bloque de ligamiento definido. Herencia: Proceso en que se transmiten los rasgos genéticos de los progenitores a sus progenies. Herencia citoplasmática: Herencia de los genes encontrados en los organelos del citoplasma (los cloroplastos o las mitocondrias). Heteroduplex: Molécula de ADN de doble cadena o híbrido de ADN y ARN, en que cada cadena tiene un origen diferente.

Híbrido: Puede ser: (1) un individuo heterocigótico, o (2) un individuo descendiente de un cruzamiento entre progenitores de diferente genotipo. Hibridación: En biología molecular, es la unión de secuencias complementarias de ADN y/o de ARN para formar una estructura de doble cadena. Homólogo: Correspondiente o similar en estructura, posición u origen. Huella identificadora de ADN: Patrón único de fragmentos de ADN que puede revelarse mediante la hibridación Southern o la PCR. Inserción: Anormalidad cromosómica en la que se inserta una secuencia de ADN en un gen, lo que distorsiona la estructura y la función normales de ese gen. Isoenzima: Formas múltiples de un enzima cuya síntesis es controlada por más de un gen. ISSR: Secuencia entre repeticiones simples. Los cebadores de la ISSR quedan anclados en sus extremos 3’ para dirigir la amplificación de los segmentos genómicos entre los ISSR. Ligación: Proceso en que se unen de nuevo dos o más fragmentos de ADN. Ligamiento genético: Proximidad de dos o más genes en un cromosoma, de modo que los genes tienden a heredarse juntos. Ligasa: Tipo de enzima que puede unir de nuevo un enlace fosfo-diester roto de un ácido nucleico. Locus (pl. loci): Sitio específico de un cromosoma donde está localizado un gen o un trozo definido de ADN. MAAP: Caracterización con amplicones múltiples arbitrarios. Término colectivo para las técnicas de tipo PCR en las que se emplean cebadores arbitrarios. Mapa de genes: Es la determinación de la posición relativa de los genes en un cromosoma o en un plásmido, y de la distancia que los separa. Marcador: Ubicación física identificable en un cromosoma cuya herencia puede rastrearse (por ejemplo, un gen, un sitio de corte de un enzima de restricción o marcador de RFLP). Marcador genético: Un alelo, una banda en un gel o un carácter que sirve experimentalmente como sonda para identificar a un individuo o a alguna de sus características. Matriz: Manchas pequeñas de ADN que se fijan en portaobjetos de vidrio o en membranas de nilón. Esta tecnología se basa en la hibridación de sondas cortas de oligonucleótidos con secuencias complementarias de ADN. Mutación: Alteración estructural permanente del ADN. En la mayoría de los casos, los cambios ocurridos en el ADN o no tienen ningún efecto o causan algún daño; ocasionalmente, una mutación puede mejorar la probabilidad de supervivencia de un organismo y pasar el cambio favorable a sus descendientes.

Mutación puntual: Cambio en un solo par de bases de ADN. Nucleasa: Enzima que corta los enlaces de tipo fosfodiéster que enlazan los nucleótidos adyacentes del ADN y del ARN. Una exonucleasa avanza cortando enlaces desde el extremo de la molécula de sustrato; una endonucleasa corta en sitios internos de la molécula del sustrato. Nucleótido: Molécula compuesta por una base nitrogenada, un azúcar y un grupo de tipo fosfato. Los nucleótidos son los componentes elementales de los ácidos nucleicos. Oligonucleótido: Segmento corto de ADN sintetizado artificialmente. Par de bases: Las dos bases de nucleótidos que están situadas en diferente cadena de una molécula de ácido nucleico y que se mantienen unidas por enlaces de hidrógeno. Las bases pueden emparejarse de dos maneras: adenina con timina (en el ADN) o con uracilo (en el ARN), y guanina con citosina (en ADN y ARN). Ver también Secuencia complementaria. Par de genes heterocigótico: Par de genes que tiene dos alelos diferentes en los dos cromosomas de un individuo diploide; por ejemplo, Aa o A1A2. Par de genes homocigótico: Par de genes en que hay alelos idénticos en ambas copias del cromosoma; por ejemplo, AA o aa. Patrón: Molécula que sirve como modelo para sintetizar otra molécula; por ejemplo, una molécula de ADN de cadena simple puede usarse como plantilla para sintetizar la cadena de nucleótidos complementaria. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa. Método para amplificar una secuencia de ADN en grandes cantidades mediante una polimerasa estable al calor y con cebadores apropiados, los cuales dirigen la amplificación de la región del ADN que interesa. PCR-RFLP: Nombre alternativo para la técnica conocida como ‘Secuencia de restricción amplificada y polimórfica’ o CAPS (Ver este término). Péptido: Conjunto de dos o más aminoácidos unidos por un enlace péptidico. Plásmido: Molécula cromosómica de ADN extra que es capaz de replicarse en forma autónoma. Polimerasa: Término genérico para los enzimas que llevan a cabo la síntesis de un ácido nucleico, usando un patrón de ácido nucleico pre-existente y los nucleótidos apropiados (es decir, ribonucleótidos para el ARN y desoxiribonucleótidos para el ADN). Polímero: Molécula compuesta por subunidades repetidas. Polimorfismo: Aparición de diferentes formas asociadas con diversos alelos de un gen o con homólogos de un cromosoma. Polipéptido: Una proteína, que es una cadena de aminoácidos unidos.

Proteína: Polímero de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, que puede incluir dos o más cadenas polipeptídicas. RAPD: Polimorfismo de ADN amplificado al azar. Técnica que amplifica tramos anónimos de ADN empleando la PCR con cebadores arbitrarios. Raza local: Cultivar vegetal o línea animal que ha evolucionado junto con los agricultores tradicionales y ha sido mejorado(a) genéticamente por ellos, sin la intervención de las prácticas modernas de mejoramiento. Reacción múltiple (en inglés: multiplexing): Es la realización simultánea de varias reacciones diferentes en un mismo tubo de reacción, o la electroforesis simultánea de varios productos de reacción obtenidos separadamente, con el fin de aumentar la eficiencia del proceso. Recombinación: También llamada sobrecruzamiento. Es la producción de una molécula de ADN con segmentos derivados de más de una molécula del ADN de los progenitores. En los organismos eucariotas, este proceso se realiza mediante el intercambio recíproco de ADN entre cromátidas no hermanas de un par homólogo de cromosomas durante la profase de la primera división meiótica. La recombinación permite a los cromosomas la reorganización de su material genético, y de este modo incrementa el potencial de la diversidad genética. Recursos genéticos: Genes que se encuentran en plantas y animales y que tienen un valor real o potencial para los seres humanos. Regiones flanqueantes: Secuencias de ADN que se extienden a uno y otro lado de un gen o de un locus. Repetición en tándem: Copias múltiples de una misma secuencia de bases en un cromosoma. RFLP: Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción. La variación entre los individuos se detecta por las diferencias en los tamaños de los fragmentos de ADN después de la digestión con un enzima de restricción. SCAR: Región amplificada caracterizada por una secuencia Es un locus identificado a partir de un solo fragmento de RAPD que ha sido secuenciado. Se pueden diseñar cebadores específicos para el locus y usarse para la amplificación específica del fragmento mediante PCR. Secuenciar: Determinar el orden de los nucleótidos en una molécula de ADN o de ARN, o el orden de los aminoácidos en una proteína. Secuencia complementaria: Secuencia de una cadena simple de ADN o de ARN, a la cual se puede unir una determinada secuencia de nucleótidos para formar una estructura de doble cadena de uno u otro ácido. Por ejemplo, TAGGAT es la secuencia complementaria de ATCCTA, donde A = adenina, C = citosina, G = guanina y T = timina. Ver también Par de bases. Secuencia de ADN: Orden de las bases de los nucleótidos en la molécula de ADN. Secuencia de bases: El orden de las bases de nucleótidos en el ADN o el ARN.

Segregación: Genéticamente, se refiere a la producción de los dos fenotipos separados correspondientes a los dos alelos de un gen. Sintenia: Se dice que ocurre donde todos los loci se localizan en el mismo cromosoma. Los loci quizás no parezcan ligados por las pruebas genéticas convencionales de ligamiento pero todavía pueden ser sinténicos. Sitio de restricción: Secuencia determinada de ADN, la cual es reconocida por un enzima de restricción específica de ADN. SNP: Polimorfismo de un solo nucleótido. Polimorfismos que resultan de la sustitución de una sola base entre secuencias homólogas. Sonda: Trozo finito de ácido nucleico empleado para identificar segmentos específicos de ADN que lleven su secuencia complementaria. SSCP: Polimorfismo de conformación de cadena única. Método para distinguir mutaciones en fragmentos de ADN de tamaño similar según la movilidad del ADN de cadena simple bajo electroforesis de geles de poliacrilamida. Ver también DGGE, análisis heteroduplex y TGGE. SSR: Repeticiones de secuencia simple. Ver ADN microsatélite. SSRP: Polimorfismo de repeticiones de secuencia simple. Ver ADN microsatélite. STMS: Sitios de microsatélite de secuencia etiquetada. Los cebadores son construidos de las regiones que flanquean el ADN microsatélite y pueden usarse en reacciones de PCR para amplificar la región repetida. STS: Sitios de secuencia etiquetada. Término general dado a un marcador que se define por la ubicación exacta de su cebador y por el orden de las bases. Telómeros: Extremos distales de cada brazo cromosómico, involucrados en la replicación y en la estabilidad de las moléculas lineales de ADN. Temperatura de fusión (Tm): Punto medio del intervalo de temperaturas al cual el ADN se desnaturaliza. TGGE: Electroforesis en geles de gradiente de temperatura. Método para separar fragmentos de ADN según su movilidad en condiciones desnaturalizantes gradualmente más calientes. Ver también DGGE, Análisis de heteroduplex y SSCP. Tipo silvestre: Tipo o forma de un organismo o gen que se da con más frecuencia en la naturaleza. Se refiere muchas veces a la forma en que los organismos o los genes se encuentran en la naturaleza, antes de que los investigadores indujeran mutaciones. Transcripción: Es la síntesis del ARN complementario, usando un patrón de ADN. Transcriptasa inversa: Enzima que, cuando dispone de un cebador de ADN, cataliza la síntesis de una cadena de ADN complementaria a partir de un patrón de ARN.

Transferencia Southern: Procedimiento en que los fragmentos de ADN, separados mediante electroforesis, son transferidos a una membrana para detectar secuencias de bases específicas mediante sondas complementarias marcadas radiactivamente. Se conoce también como hibridación Southern. Variación somaclonal: La variación hallada en células vegetativas que se dividen mitóticamente en un cultivo de tejidos. Vector: Agente (por ejemplo, un plásmido o un virus) que se emplea para transportar un segmento de ADN clonado. VNTR: Número variable de repeticiones en tándem. Tipo de polimorfismo caracterizado por un número muy variable de copias de secuencias idénticas o estrechamente relacionadas.

Formulario para sugerencias El tema de este módulo experimenta cambios continuos, lo que hace aconsejable su actualización periódica. Por esta razón, presentamos el módulo en formato electrónico. Para ayudarnos con nuestra tarea de actualización, agradeceríamos recibir comentarios y solicitudes de los usuarios para mejorar aún más el módulo. También nos ayudarán mucho sus opiniones sobre la utilidad de esta herramienta. Hacemos enseguida unas cuantas preguntas orientadoras para que usted las responda. Puede enviar sus respuestas directamente pulsando el botón ‘Enviar’ al final de esta página, o puede enviarlas por telefax [No: (57-2) 445 0096], por correo postal a su contacto en el IPGRI, o por correo electrónico a alguna de estas direcciones: [email protected] o [email protected]

Preguntas: 1. Descríbanos la forma en que usa esta herramienta…

2. ¿Usted piensa que el módulo…: a.

…proporciona una síntesis global de los conceptos científicos básicos relativos a las tecnologías de los marcadores moleculares y secuenciación del ADN, y de su uso en el campo de los recursos fitogenéticos? Sí No ¿Por qué?

b.

…suministra información sobre la forma de comparar las ventajas y las desventajas de cada tecnología y de contrastarlas entre sí, y permite así tomar decisiones adecuadas respecto a una situación específica de investigación? Sí No ¿Por qué?

c.

…proporciona una lista de los recursos bibliográficos actuales para cada una de las tecnologías tratadas? Sí No ¿Por qué?

3. Díganos lo  que le  gustó y lo que  usted  cambiaría  sobre los siguientes aspectos  del  módulo: a. El  contenido b. La diversidad  de  tecnologías ofrecidas c.

Los  criterios  empleados  para seleccionar las técnicas

d. La estructura que  tienen  los  submódulos e. Los dibujos,  los diagramas,  las  imágenes f.

Otros  aspectos

4. De los  siguientes temas, ¿cuál  agregaría  usted  al módulo  para  hacerlo más útil  en relación  con  su  situación  particular? a. Referencias  básicas b. Ejemplos  de  aplicaciones c.

Información adicional  sobre  conceptos básicos

d. Más  tecnologías: i.

Antiguas

ii.

Recientes

5. ¿Qué otros temas  querría  usted ver  en  este módulo?

5. ¿Fue  difícil  descargar  de  Internet  el módulo  o  alguna de  sus  partes? ¿Por  qué?

Enviar M.  Carmen  de  Vicente,  IPGRI Correo  electrónico:    [email protected] Theresa  Fulton,  IGD,  Cornell  University Correo  electrónico:    [email protected]

César  López,  Univ.  La  Molina Correo  electrónico:    [email protected]

IPGRI - El Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos (IPGRI) es un organismo internacional autónomo de carácter científico cuya misión es promover la conservación y el uso de los recursos fitogenéticos para beneficio actual y futuro de la humanidad. Es uno de los 16 Centros de Future Harvest que opera bajo los auspicios del Grupo Consultivo sobre Investigación Agrícola Internacional (GCIAI), una asociación de miembros públicos y privados que apoyan las actividades para promover los últimos descubrimientos de la ciencia para reducir el hambre y la pobreza, mejorar la salud y la nutrición y proteger el medio ambiente. El Instituto tiene su sede en Maccarese, cerca de Roma, Italia, y oficinas en más de 20 países del mundo. El IPGRI opera mediante tres programas: (1) el Programa de Recursos Fitogenéticos, (2) el Programa de Apoyo a las actividades en Recursos Fitogenéticos de los Centros del GCIAI y (3) la Red Internacional para el Mejoramiento del Banano y el Plátano (INIBAP). IGD - El Instituto para la Diversidad Genómica (Institute for Genomic Diversity, IGD) se encuentra en la ciudad de Ithaca, Nueva York, Estados Unidos. La misión del IGD es desarrollar, transferir y proveer tecnologías y recursos educacionales, para resolver los problemas que afectan la conservación de la biodiversidad y la seguridad alimentaria global. Específicamente, nuestros objetivos son: utilizar estrategias de genómica comparativa y evolutiva para resolver problemas aplicados; desarrollar y transferir tecnologías capacitadoras en genómica y bioinformática; proveer apoyo a los esfuerzos nacionales e internacionales en conservación, agricultura y mejoramiento de cultivos; y educar y entrenar en todos los niveles (incluyendo pero no limitados a los estudiantes de pregrado y posgrado, científicos visitantes, profesores y personal en general).

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Salvo lo declarado expresamente de otro modo, el IPGRI y Cornell University poseen los derechos de autor y todos los demás derechos relacionados con este trabajo. Los individuos pueden copiar e imprimir libremente los materiales para fines educativos o no comerciales, sin necesidad de obtener permiso previo de los propietarios de los derechos de autor. Sin embargo, es un requisito citar la fuente de los materiales. Cita de Vicente, M.C. y Fulton, T. (eds.). 2003. Tecnologías de Marcadores Moleculares para Estudios de Diversidad Genética de Plantas: Módulo de Aprendizaje. Illus. Nelly Giraldo. Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos (IPGRI), Roma, Italia. M. Carmen de Vicente, Ph.D., es Genetista Molecular de Plantas, en la Oficina Regional del IPGRI-Américas, en Cali, Colombia. Theresa Fulton, Ph.D., es Directora de Extensión en el Instituto para la Diversidad Genómica de la Universidad de Cornell, Ithaca, NY.