CIDCA

UNLPUNLP-CONICET

Propiedades fisiológicas de péptidos y proteínas de amaranto Maria Cristina Añon

CIDCA CONICET - UNLP La Plata, Argentina PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Conceptos claves en la definición de un alimento funcional Ø el concepto de aportar beneficios para la salud es central Ø la naturaleza del alimento ser o asemejarse a un alimento tradicional Ø el nivel de función más allá de la función nutricional Ø el perfil de consumo debe ser parte de la dieta normal Doyon y Labrecque 2008 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Fronteras del universo de los alimentos funcionales Efecto fisiológico medicamento

Cura

Función aumentada

Alimento funcional

Reducción de riesgo Alimento enriquecido Equilibrio nutricional +

Alimento básico

Necesidades básicas

Intensidad funcional Intensidad mínima PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Doyon y Labrecque 2008

Componentes presentes en alimentos funcionales

Fibra dietética

Azúcares de baja energía Fitoesteroles

Ácidos grasos insaturados

Antioxidantes Vitaminas y minerales PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Probióticos

Proteínas Propiedades Nutricionales materia y aas esenciales

Propiedades Funcionales de hidratación, espumantes, emulsificantes, gelificantes, etc.

Propiedades Biológicas

ingredientes potenciales que promueven la salud del consumidor PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Actividades biológicas detectadas

πεπτιδια antitumoral

opioide

antimicrobiana

antihipertensiva

antitrombótica unión de metales

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

inmunomoduladora antioxidante

Características de los péptidos bioactivos En general poseen entre 3 y 20 aas, con aas característicos Actúan como moduladores y compuestos regulatorios Su actividad es función de la composición de aas y de la secuencia En la base BIOPEP se encuentran registrados 1968 péptidos bioactivos de distinto origen PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Características de algunos tipos de biopéptidos Antioxidantes Antitrombóticos Hipocolesterolémicos

Antiobesidad y antitumoral PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Alta cantidad de His y aa hidrofóbicos Ile, Lys, Asp Baja relacion Met/Gly y Lys/Arg alto contenido de aa hidrofóbicos Péptidos largos

Péptidos bioactivos • Son

péptidos derivados de proteínas de la dieta que ejercen un beneficio a nivel fisiológico independiente de su función nutricional

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Liberación de péptidos encriptados Proceso de digestión in vivo Hidrólisis enzimática in vitro Acción de microorganismos Combinación de procedimientos

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

h i d r ó l i s i s

Etapas a seguir en el estudio de biopéptidos Obtención de péptidos Búsqueda de la actividad biológica Ensayos de simulación e in vitro Separación y caracterización del o los péptidos responsables de la actividad Ensayos de actividad in vivo y en humanos

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Amaranto Pseudocereal – familia Amaranthaceae Autóctono de América Central Propiedades agronómicas interesantes Proteínas de almacenamiento ü 15- 17% contenido total ü composición de aminoácidos bien balanceada ü Principales fracciones: albuminas, 11S globulinas, P-globulina and prolaminas PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Estrategia de experimental Harina de amaranto

Aislados proteicos Acción de enzimas in vivo o in vitro

Hidrolizados proteicos Actividad Inhibidora de ACE

Actividad antitumoral

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Actividad antihipertensiva

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Sistema ACE REGULACION DE LA PRESIÓN ARTERIAL

Inhibidores de ACE captopril, enalpril,etc.

angiotensina I decapéptido

Se previene la degradación de bradiquina que es vasodilatador PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

ACE

angiotensina II octapéptido

aumenta la presión por vasoconstricción afecta la síntesis y liberación de aldosterona

Actividad antihipertensiva Longitud de péptidos activos : 2-15 aa

Péptidos activos poseen Pro en el Cterminal y residuos hidrofóbicos en el extremo N-terminal PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Curva dosis - respuesta

IC50 415 µM - 600 µM

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Ensayos in vivo Modelos de hipertensión utilizados Ø ratas genéticamente hipertensas SHR Ø ratas hipertensas renales SHRr Ø ratas hipertensas por administración de fructuosa SHRf Administración del hidrolizado en forma intragástrica y medida de presión carotídea directa PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Efecto del hidrolizado en ratas SHR Presión media carotídea (mmHg)

200

Hidrolizado de amaranto g=kg de rata

180 160

Blanco

140

0.5 1.0

120

2.4

100

1.5

80 60 40 20 0 0

1

2

3

Tiempo (horas)

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

4

5

6

7

La presión arterial disminuye de forma dosisdependiente. Máximo efecto a 1,5 g/kg de peso. El efecto persiste hasta 7 horas, luego la presión retorna a valores normales.

Mecanismo de acción 3.5

F u e r z a (g r a m o s )

3.0

1a. Ringer

Músculo liso de aorta + serotonina o sorotonina e hidrolizado de amaranto

2.5

2.0

1.5

*

2a. Ringer 1.0

0.5

0.0

-6

10

10

-5

10

-4

Serotonina (moles/litro)

3.5

*

F u e r z a (g r a m o s )

3.0

1a. Ringer

*

*

2.5

Se registra la respuesta contráctil del músculo

* 2.0

1.5

* 1.0

0.5

2a. Hidrolizado

0.0 10-6

10 -5

10-4

Serotonina (moles/litro)

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

El hidrolizado posee efecto vasodilatador. Actúa como un antogonista no competitivo

Selección de péptidos antihipertensivos. Aproximación in silico a) Construir un modelo estructural de globulina 11S de A. hypocondriacus b) Localizar los péptidos potencialmente antihipertensivos encriptados en la secuencia de la globulina 11S y analizar su exposición al solvente c) Simular la interacción entre los péptidos encriptados en la globulina 11S, que forman parte de la librería armada, y la enzima convertidora de angiotensina (ACE) PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Modelo estructural de la globulina 11S de amaranto

(A - S-S – B)6 Modelo equivalente al de otras proteinas de almacenamiento del tipo de globulinas 11 S Vecchi y Añón (2009) PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Actividad antihipertensiva potencial y exposición al solvente de péptidos en la secuencia de la globulina 11S

61% de los péptidos antihipertensivos se encuentran localizados en el corazón de la molécula proteica y presentan mayor actividad que los de la superficie Vecchi y Añón (2009) PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Localización de los péptidos seleccionados en la superficie de la molécula de globulina 11S

IKP

LEP

Vecchi y Añón (2009) PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Péptidos potencialmente antihipertensivos de globulina 11S expuestos al solvente Position

Sequence

465

RP

275

log(EC50)

ASA

1,99

0.48

IKP

0,63

0.36

428

MF

1,65

0.37

320

VY

1,46

0.46

144

RF

1,73

0.37

294

YL

1,68

0.40

293

RY

1,49

0.49

276

KP

1,09

0.40

43

LEP

0,28

0.33

281

AW

1,14

0.44

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Energía libre de formación del complejo ACE-captopril Clustering Histogram for Captopril 11.2

Free Energy (kcal/mol)

11.1

11

10.9

10.8

10.7

10.6 0

1

2

3

4

5

6

7

8

Frequency

Constante de inhibición estimada: 6.35 nM Energía libre de formación del complejo: -11.18 kcal/mol Vecchi y Añón (2009)

El modelo funciona!!!

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Librerías seleccionadas gi|122726601|gb|ABM66807.1| 11S globulin [Amaranthus hypochondriacus] MAKSTNYFLISCLLFVLFNGCMGEGRFREFQQGNECQIDRLTALEPTNRIQAEAGLTEV WDSNEQEFRCAGVSVIRRTIEPHGLLLPSFTSAPELIYIEQGNGITGMMIPACPQTYESG SQQFQGGEDERIREQGSRKFGMRGDRFQDQHQKIRHLREGDIFAMPAGVFHWAYHN GDHPLVPVILIDTANHANQLDKNFPTRSYLAGKPQQEHSGEHQFSRESRRGERNTGNI FRGFETRLLAESFGVSEEIAQKLQAEQDDRGNIVRVQEGLHVIKPPSRAWEEREQGSR GSRYLPNGVEETICSARLAVNVDDPSKADVYTPEAGRLTTVNSFNLPILRHLRLSAAKG VLYRNAMMAPHYNLNAHNIMYCVRGRGRIQIVNDQGQSVFDEELSRGQLVVVPQNFAI VKQAFEDGFEWVSFKTSENAMFQSLAGRTSAIRSLPIDVVSNIYQISREEAFGLKFNRP ETTLFRSSGQGEYRRKISIA

KP IKP VIKP HVIKP LHVIKP GLHVIKP EGLHVIKP

EP LEP ALEP TALEP LTALEP RLTALEP Vecchi y Añón (2009)

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Energía libre de formación del complejo ACE-péptido Binding Energy of Docked peptides 15 average lowest

Free Energy of Binding (kcal/mol)

10

5

0

-5

-10 Captopril

KP

IKP

VIKP

HVIKP

LHVIKP

GLHVIKP

Vecchi y Añón (2009) PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

EGLHVIKP

IKP Ki ~ 200 nM 61% electrostática 39% vdW + p. hid. + desolvatación

Inhibición de la Actividad ACE Péptidos sintéticos – Ensayo in vitro captopril

Por síntesis química

VIKP ALEP

Vecchi y Añón (2009) PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Actividad antitumoral

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Inhibición de la proliferación celular Se detectaron diferentes sensibilidades de API para las cuatro líneas celulares

P r o l i fe r a ti o n (U M R 1 0 6 ) P r o l i fe r a ti o n (U M R 1 0 6 )

% B asal % B asal

1 2 5 ,0 1 2 5 ,0 1 0 0 ,0 1 0 0 ,0 7 5 ,0 7 5 ,0 5 0 ,0 5 0 ,0 2 5 ,0 2 5 ,0 0 ,0 0 ,0 0 ,0 0 0 ,0 0

2 ,0 0 2 ,0 0

4 ,0 0 4 ,0 0

6 ,0 0 6 ,0 0 m g /m l m g /m l IA M IA M

8 ,0 0 8 ,0 0

IS

1 0 ,0 0 1 0 ,0 0

1 2 ,0 0 1 2 ,0 0

IS

La hidrólisis mejoro el efecto inhibitorio Líneas celulares

APIDH30 UMR106 IC50: 0.5 mg/ml

Barrio y Añon (2009)

UMR106 (IC50) [mg/ml]

MC3T3-E1 (IC50) [mg/ml]

Caco-2 (IC50) [mg/ml]

TC7 (IC50) [mg/ml]

API

1.0 ± 0.05

2.5 ± 0.06

1.5 ± 0.1

2.5 ± 0.08

SPI

10.0 ± 0.1

> 25

-

-

BSA

No se produce inhibición

BBI

No se produce inhibición

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Cambios en la morfología celular y proteínas del citoesqueleto UMR106

UMR106 + API 1mg/ml 24h Las células, luego de la incubación, exhiben núcleos densos rodeados de una pequeña cantidad de citoplasma Barrio y Añon (2009) PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Se observa desorganización parcial de los filamentos de actina y alteración en la forma celular

Posible mecanismo de muerte celular AnálisisNecrosis citométrico

300 300

% Basal % Basal

0.6 0.6 0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1 0 0 0

LDH – marcador de necrosis Apoptosis

0

0.5 0.5

1

1.5 1 1.5 mg/ml mg/ml

2

2

2.5 2.5

Luego de 24 h de incubación API aumenta la proporción de apoptosis de forma dependiente de la dosis

200 200

100 100

0 0

0 0

0,5 0,5

1 1,5 1 1,5 mg / ml mg / ml

2 2

2,5 2,5

La actividad de LDH aumenta para concentraciones de API mayores a 0,5mg/ml

API inhibe la adhesión celular de forma dosis dependiente Barrio y Añon (2009) PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Producción de péptidos bioactivos Aproximación tecnológica Preparación de los péptidos

Hidrólisis química o enzimática in vivo e in vitro Ingeniería genética – Biopharming Tecnología de DNA recombinante (péptidos largos)

Caracterización de péptidos bioactivos Separación y purificación Determinación de propiedades fisicoquímicas Evaluación de la bioactividad in vitro e in vivo

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Consideraciones a tener en cuenta para los alimentos funcionales con biopéptidos ü Complejidad de la matriz del alimento. Interacción del o los biopéptidos con otros componentes ü Efecto de las condiciones de procesamiento ü Cambios durante el período de vida útil PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Algunos ejemplos Producto fermentado – cambio del contenido de péptidos

tratamiento térmico

Desnaturalización Desfosforilación, ej. de caseína

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Destino de los biopéptidos Alimento funcional conteniendo biopéptidos digestión absorción

¿es afectado? transporte

¿llega en la concentración adecuada ? ¿un único punto de acción o puntos múltiples? PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Desafíos futuros para obtener alimentos funcionales con biopéptidos Desarrollar alimentos funcionales sin efectos colaterales de los biopéptidos adicionados y retener su estabilidad durante el período de vida útil Liberación y obtención

Efecto

Sitio de acción

PROBLEMAS A SORTEAR: degradación durante la digestión, mala absorción, baja concentración en sangre o el tejido específico, modificación de actividad por el procesamiento o interacción con otros ingredientes PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

CIDCA

UNLPUNLP-CONICET

Muchas gracias por la atención !!

Gustavo Rinaldi

Alejandra Quiroga

Daniel Barrio

CIDCA, La Plata, Pcia. Bs.As. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Marina Fritz

Bruno Vecchi

[email protected]