Proteínas: Métodos para su Estudio

Propiedades Espectroscópicas • Todos los aminoácidos absorben luz en la región infraroja • Sólo Phe, Tyr, & Trp absorben UV • Absorbancia a 280 nm es un buen diagnóstico para aminoácidos

Medida de absorbancia en un espectofotómetro

Separación de Aminoácidos • Mikhail Tswett, botánico ruso, separó pigmentos coloreados de plantas por ‘cromatografía’ • Existen muchos métodos cromatográficos para separar mezclas de aminoácidos – Cromatografía de intercambio iónico – Cromatografía líquida de alta performance (HPLC)

Cromatografía en columna

Cromatografía de Partición / Tamiz molecular

Mezcla de proteínas es añadida a la columna la cual contiene un polímero Moléculas de proteínas se separan en base a tamaño; las más grandes es añadida a la columna la cual cpasan más libremente y aparecen en las primeras fracciones

Cromatografía de Intercambio Ionico

Perlitas del polímero tienen grupos cargados positiva (int. aniónico) o negativas (int. catiónico) Mezcla de proteínas es añadida a columna con intercambiador (cat)

Proteínas se mueven por la columna a velocidades determinadas por su carga neta al pH que se está usando. En el intercambiador catiónico, las proteínas con mayor carga negativa se moverán más rápido y eluirán antes

Intercambiador catiónico: La resina tendrá carga negativa e intercambiará cationes (p. ej. Na+) por un aminoácido cargado positivamente p.ej. Carboximetil celulosa

Muestra Conteniendo varios aa. Columna conteniendo resina de intercambio catiónico

Elución separa aa en bandas discretas

Cromatografía de Afinidad

Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes (SDS-PAGE)

Luego de la tinción : con nitrato de plata o Azul de Coomassie

Determinación de peso molecular aprox.de una proteína (Mr)

Isoelectroenfoque : Separación de proteínas en base a su punto isoeléctrico Primer paso para la electroforesis de proteínas en 2 dimensiones

Frederick Sanger terminó la secuencia de la insulina bovina en 1953: una década de trabajo y muchos investigadores para un péptido de 51 residuos

Determinando la Secuencia Una Estrategia de Ocho Pasos • 1. Si hay más de una cadena polipeptídica, separarlas. • 2. Romper (reducir) puentes disulfuro • 3. Determinar composición de c/ cadena • 4. Determinar residuos N- y C-terminal • 5. Cortar c/cadena en fragmentos pequeños y determinar su secuencia

Determinar la Secuencia Una Estrategia de Ocho Pasos • 6. Repetir paso 5, usando procedimiento de corte diferente para generar un juego diferente de fragmentos • 7. Reconstruir la secuencia de la proteína a partir de la secuencia de fragmentos que se sobreponen • 8. Determinar las posiciones de los puentes disulfuro

Paso 1: Separación de cadenas • Interacción entre subunidades depende de fuerzas débiles • Separación es llevada a cabo con : - pH extremo - 8M urea - 6M guanidina HCl - concentración alta de sales (generalmente sulfato de amonio)

Paso 2: Corte de Puentes Disulfuro • Oxidación de Acido Perfórmico • Agentes reductores Sulfhidrílicos - mercaptoetanol - ditiotreitol o ditioeritritol - para prevenir recombinación, seguir con agente alquilante como iodoacetato

Paso 3: Determinar composición de aminoácidos 1. Hidrólisis química de todos los enlaces peptídicos con HCl 6N, 110 ºC x 24 h 2. Cromatografía de intercambio iónico 3. Aminoácidos + compuesto fluorescente/coloreado es eluido de columna de intercambio iónico 4. Intensidad de señal es proporcional a concentración del aminoácido

Paso 4: Identificar residuos N- y C-terminal • Analisis N-terminal : – Método de Sanger: utiliza 1-fluoro-2,4 dinitrobenzeno (FDNB) que marca 1er aa. e hidroliza el resto del polipéptido – Método de Edman = Fenilisotiocianato derivados son Feniltiohidantoínas (o derivados PTH) Se marca extremo N-terminal, se hidroliza este residuo y se repite

Degradación de Edman

Paso 4: Identificar residuos N- y C-terminal • Análisis C-terminal – Análisis enzimático (carboxipeptidasa) – Carboxipeptidasa A corta cualquier residuo en extremo carboxilo excepto Pro, Arg, y Lys – Carboxipeptidasa B (pancreas de cerdo) sólo actúa en Arg y Lys del extremo C-terminal

Pasos 5 y 6: Fragmentación de las cadenas • Fragmentación Enzimática – tripsina, quimiotripsina, clostripaina, proteasa de Staphylococcus

• Fragmentación Química – Bromuro de cianógeno

Fragmentación Enzimática • Tripsin - corta en lado C de Lys, Arg • Quimiotripsina – lado C de Phe, Tyr, Trp • Clostripaina - como tripsina, pero ataca a las Arg más que a las Lys • Proteasa de Staphylococcus – Lado C de Glu, Asp en buffer fosfato – Específico para Glu en buffer acetato o bicarbonato

Fragmentación Química Bromuro de Cianógeno • CNBr actúa sólo en residuos de metionina • CNBr es útil porque proteínas generalmente tienen pocos residuos de Met • Se genera un péptido con una homoserina lactona C-terminal (producto de la reacción de la Met con CNBr)

Corte por Bromuro de Cianógeno

Paso 7: Reconstruyendo la Secuencia • Usar dos o más agentes fragmentadores en experimentos separados • Secuenciar todos los péptidos producidos (generalmente por degradación de Edman) • Comparar y alinear péptidos con secuencias que se sobrepongan para determinar la secuencia de la cadena polipeptídica original

Reconstruyendo la Secuencia Comparar corte por tripsina y proteasa de Staphylococco en un péptido típico : • Corte por Tripsina : A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K • Proteasa de Staphylococcus: F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K-A-E Comparamos: L-V-G-K A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K-A-E F-S-G-I-T-P-K

• Secuencia Correcta: L-V-G-K-A-E-F-S-G-I-T-P-K

Ejemplo de péptido de 38 residuos que es secuenciado

FDNB: FluoroDiNitroBenceno

Naturaleza de las Secuencias de Proteínas • Secuencias y composición reflejan la función de la proteína • Proteínas de membrana tienen más residuos hidrofóbicos, mientras que las proteínas fibrosas pueden tener secuencias atípicas • Proteínas homólogas de diferentes organismos tienen secuencias homólogas • e.g., citocromo c está altamente conservado

Espectrometría de masas

Muestra ionizada en vacío→en campo eléctrico/magnético Medida de relación masa/carga (m/z)

Las especies separadas difieren en 1 unidad en su masa (más grande hacia la derecha)

Después de la hidrólisis proteolítica de una proteína, solución es inyectada en el MS Sólo un péptido entra al análisis Péptido es fragmentado y se mide m/z de cada fragmento

Péptido de 10 residuos. Diferentes picos difieren en 1 residuo en tamaño Secuencia: Phe-Pro-Gly-Gln-(Ile/Leu)-Arg (misma masa)

PREGUNTAS POR RESOLVER 1. Buscar ejemplos de resinas de intercambio aniónico y catiónico 2. Revisar la estructura de los agentes reductores de puentes disulfuro 3. Cómo reacciona la ninhidrina con los aminoácidos; qué aa. produce un derivado de diferente color y por qué? 4. Qué aminoácidos se destruyen por el tratamiento con ácido a 100 ºC utilizado para determinar la composición de aminoácidos de una proteína 5. Qué ventaja tiene la degradación de Edman sobre la de Sanger 6. Revisar las técnicas de difracción de rayos X y espectros de resonancia magnética nuclear (NMR)