PROTOCOLO DEL PROYECTO Título de proyecto Desarrollo de formulados de bacteriófagos como agentes de biocontrol de Salmonella y E. coli O157:H7 en frutas y hortalizas frescas.

Demanda Desarrollo de formulados biológicos para descontaminar hortalizas de bacterias patógenas a humanos. Tipo:

Investigación Aplicada

Eslabon: Producción Primaria

Clase:

Temporal y Riego (Mixto)

Estatus:

Fecha inicio:

Junio de 2010

Fecha Mayo de 2011 termino:

Cadena:

Transversales

Nuevo

Municipios donde se realizarán acciones del proyecto Culiacan, Elota y Navolato. Grupo de interés El grupo de interés de este trabajo son las 48 agrícolas de la zona centro de Sinaloa (Culiacán, Navolato y Elota) que se encuentran dentro del programa de inocuidad Estatal. Culiacán: Valores Horticolas Del Pacifico, Santa Fé, All Green, E. San Roberto, Agricola Gero S.A. De C.V., Nueva Yamal S.A. De C.V., La Flor, Agricultura Controlada S.A. De C.V., Eureka, Paralelo 38, Patricia (Empaque 2) Exportalizas De Mexico, Exportalizas Mexicanas, El Porvenir I, Distribuidor Hortimex, Paredes, Divemex Culiacan, Agricola Epsa, Terra Santa, Empaque Castros, Chaparral, Batan1, El Porvenir Ii, Higueras De Abuya. Navolato: Alfa Bita, Agricola Rita Rosario, Agricola La Guajira, Agricola Ritz Sa De Cv, La Primavera, Agroexportaciones S. De R.L. De C.V., Agricola Hortifresh, Empaque Pia, De La Costa S.A. De C.V., Agricola Santa Teresa Sa De Cv, Ecosistemas Agricolas, Agroexportadora Del Noroeste Sa De Cv, Agricola Beltran, Empaque Don Memo, Agricola San Isidro De Culiacan Spr. De Rl, Campaña Agricultores Y Divecam, Altata, Batan Ii, Cachanilla, Agricola 5 Hermanos, Malem. Elota: Arcadia, Agrobo, San Juan, Palita, Ceuta Produce. Superficie o número de animales aproximados a trabajar Se tomarán 324 muestras de la zona centro de Sinaloa (Culiacán, Navolato y Elota), de las cuales 108 corresponderán a muestras de agua (54 de agua de río y 54 de agua de canales de riego agrícola) y 108 a heces (54 muestras de heces de animales y 54 muestras de heces de humano). Los muestreos se realizarán de manera estratégica (muestreo dirigido), las muestra de agua de río serán de los Ríos Humaya, Tamazula, Culiacán y Elota; las muestras de agua de canal, se realizará en 3 canales de cada municipio, dando en total, 9 canales de riego agrícola; las muestras de heces de humanos se tomarán de las personas que habitan en los poblados cercanos a los ríos, canales y empaques, y las de animales comprenderán animales domésticos (vacas, caballos, perros y aves de corral) que se encuentren en los trans-patios de dichas viviendas. El muestreo se realizará de agosto a octubre de 2010, considerando que en estudios previos se ha visto que en la zona centro de Sinaloa, la época del año no influencia la presencia de los microorganismos en estudio, estos se encuentran presentes de manera permanente durante las diferentes condiciones climáticas. Otros Fondos Ninguno: $ 0.00.

REPONSABLE DEL PROYECTO Responsable del Nohelia Castro del Campo proyecto: Especialidad: Microbiologia Ambiental CURP: CACN771017MSLSMH04

Correo electrónico: [email protected] Telefonos: 6677605536(Tel.) 6671316396 (Cel.) Institución Centro de Investigación en responsable del Alimentación y Desarrollo proyecto:

COLABORADORES #

Nombre

Institución

1

María Guadalupe García Camarena

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias

2

Juan Pedro Campos Sauceda

Instituto Tecnológico de Culiacán

RESUMEN EJECUTIVO Antecedentes Los bacteriófagos, significan literalmente “comedores de bacterias” y son muy abundantes en la naturaleza y es posible emplearlos potencialmente para destruir bacterias patógenas encontradas en hortalizas (Hagens y Offerhaus, 2009). Los bacteriófagos o “fagos” son los microorganismos más abundantes en el ambiente, están presentes en grandes cantidades en agua y alimentos de varios orígenes. Algunos fagos son específicos para una bacteria en particular y no puede atacar otra bacteria, mientras otros presentan un amplio rango de hospederos. Los bacteriófagos contribuyen a la homeostasis bacteriana en la naturaleza, manteniendo a las bacterias bajo control. Gracias a la tecnología actual, ahora podemos entender y utilizar esta herramienta natural. Los fagos no cambian las propiedades organolépticas de los alimentos (sabor, estructura, color y olor), no dejan huellas ecológicas –los fagos se debilitan y desintegran en aminoácidos y ácidos nucleicos, y tienen acción solo en células procariotes. Esto los convierte en agentes naturales para el control de ciertas bacterias patógenas como Listeria en alimentos (Hagens y Offerhaus, 2009). Los bacteriófagos son abundantes especialmente en ambientes con un gran número de bacterias. Las bacterias son abundantes en ecosistemas marinos y de agua fresca, y como consecuencia, el número de fagos estimado es de 1031 y solo se han identificado y reportado 5, 100 a finales del siglo pasado (Dorsal et al., 2009; Ackermann, 2001). Muy pocos alimentos están completamente inocuos, esto significa que la mayoría de los alimentos consumidos contendrán bacterias y por tanto, los fagos estarán presentes. Los bacteriófagos líticos, es decir, aquellos capaces de destruir las células bacterianas, son una forma de control biológico contra bacterias patógenas y proveen una alternativa atractiva para descontaminar hortalizas sin necesidad de utilizar agentes químicos (Tabla 2). Los bacteriófagos se usaron ampliamente entre 1930 y 1940, alrededor de todo el mundo como antibióticos en humanos, sin embargo, su uso no progresó debido a la falta de información de su biología. Ahora con el amplio conocimiento de la biología celular y molecular, su uso se está extendiendo a otras áreas de aplicación, como el área de alimentos, en donde se ha demostrado su efectividad. Recientemente, la FDA ha aprobado el uso de bacteriófagos para el control de algunas bacterias patógenas que generan grandes problemas de inocuidad alimentaria. Hace dos años, en Estados Unidos se aprobaron varias aplicaciones de bacteriófagos. En 2006, EBI Food Safety Listex, una sustancia natural y orgánica de fagos anti-Listeria que se puede usar como ayuda en el procesamiento en todos los productos alimenticios susceptibles a L. monocytogenes, se aprobó como GRAS (Generally Recognized As Safe) por la FDA y el Departamento de Agricultura. La información qué se tiene sobre su eficacia en frutos contaminados es la siguiente; Leverentz et al. (2001) evaluó los efectos de fagos contra Salmonella en el productos frescos cortados y logró una reducción del 3.5 log10, usando una mezcla del fagos en las rodajas de melón de honeydew almacenadas a 5 °C y 10 °C. Whichard et al. (2003) observaron una reducción entre 1.8-2.1 log10 de Salmonella por tratamientos de fagos en salchichas de pollo contaminadas. En cuanto a la investigación en Eschericia coli se ha evaluado un combinado de tres fagos para el biocontrol de E. coli O157:H7 en carne (O'Flynn et al., 2004). La aplicación del fago en caldos nutritivos redujo 5 unidades logarítmicas los números celulares de E. coli. Se inocularon números bajos del patógeno en la superficie de carne y después se incubaron a 37 °C durante una hora con un combinado de fagos, 7 de 9 muestras estaban libre de E. coli. Las dos muestras restantes tenían una cuenta bacteriana muy baja. Estos experimentos ilustran que diferentes matrices de comida, cambian las condiciones para las aplicaciones de los fagos y ese estudio del caldo es de uso limitado para las aplicaciones de fagos (Rees y Dodd, 2006). En la lucha contra bacterias peligrosas y no deseadas, los fagos ofrecen una oportunidad única. La aplicación de fagos para reducir las bacterias patógenas con el objetivo producir hortalizas más segura está hasta ahora todavía en una fase experimental. El concepto de usar fagos no es nuevo, pero sabemos que posee lo necesario para aprovechar su potencial. Los fagos ofrecen una solución completamente natural al problema de contaminación con patógenos y tienden a proporcionar una contribución positiva a la industria de alimentos y a la salud pública. El uso de bacteriófagos en la mezcla de ceras para prolongar la acción desinfectante en hortalizas fresca aun no se ha demostrado, llegando a ser una alternativa conveniente, siendo Sinaloa el pionero en la implementación de esta alternativa biotecnológica. Introducción La agricultura y la comercialización, son actividades generadoras de ingresos, que sustentan la economía de

nuestro país y que pueden considerarse como un proceso en constante innovación. La producción de frutas y hortalizas frescas es una de las actividades que más contribuye en el sector agropecuario, al Producto Interno Bruto (PIB) y a la generación de empleos y divisas (Sobac y Carter, 1999). En las últimas dos décadas, las frutas y hortalizas frescas mexicanas, han jugado un papel muy importante en el comercio internacional, generando miles de millones de dólares para la economía nacional. Estados Unidos, es el principal país importador de estos productos. Sinaloa es uno de los estados con mayor aporte de frutas y hortalizas, con una superficie sembrada de aproximadamente 180 mil hectáreas. Tradicionalmente, la producción de hortalizas ha sido tanto para el mercado exportador como nacional; con un valor que superó los 70 mil millones de dólares en la temporada 2008-2009 (CIDH, 2009). Sin embargo, los precios de liquidación están sujetos a la calidad e inocuidad que estos productos presentan al momento del mercadeo. La pérdida de calidad microbiológica de un producto durante la producción y comercialización, repercute en el valor económico del mismo y en la imagen comercial de las regiones productoras, causando bajas a la economía mexicana. La calidad e inocuidad, son requisitos indispensables para la comercialización de los productos hortícolas debido a que frutas y hortalizas han sido asociadas a brotes de Enfermedades Transmitidas por los Alimentos (ETAs), disminuyendo así la aceptación por parte de los consumidores. Esto ha ocasionado que organizaciones como la Oficina para la Administración de Drogas y Alimentos (FDA) y el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) se interesen en desarrollar guías prácticas para reducir al mínimo el riesgo microbiano en frutas y vegetales frescos (FDA, 1997). México por su parte, emitió la Norma-093-SSA1-1994, y la implementación de los protocolos de las Buenas Prácticas Agrícolas (BPAs) y Buenas Prácticas de Manejo (BPMs), de donde surge además el Sello México Calidad Suprema. Cada vez con más frecuencia a nivel internacional, las frutas y hortalizas frescas se han visto implicadas en brotes de enfermedades ocasionadas por Salmonella (Imagen 1), así como también Escherichia coli. Por lo qué, enfocar los programas de inocuidad a disminuir estos brotes es la prioridad del gobierno de Estados Unidos, principal importador de los productos sinaloenses. Cuando las hortalizas no cumplen con los requisitos de calidad se comercializan dentro de estado y del país, llegando a ocasionar brotes de ETA´s por su forma de consumo, que es en fresco. Sinaloa está entre los primeros cinco lugares de salmonelosis y fiebre tifoidea en el país, teniendo como promedio 15,000 casos anuales, eso significa $18, 000,000 de pesos por un solo día de cama generados por solo el 20% de los casos. Eso sin mencionar los problemas económicos que ocasionan a las familias sinaloenses por dejar de trabajar hasta recuperar su salud y el gasto en medicamentos. Esto pone en evidencia la necesidad de producir hortalizas inocuas tanto para exportación, comercialización nacional, como para su consumo estatal. Para respaldar la inocuidad de los productos agrícolas frescos, es necesario conocer qué tipo (género, especie, subespecie, serotipo, genotipo y potencial patogénico) de microorganismos se encuentran presentes en el agua y el ambiente, que pueden en un momento dado ser fuentes de contaminación de los alimentos y generar las ETAs. Es por ello, que es necesario generar una base de datos de los mismos, particularmente de los que han sido mayormente implicados en brotes de contaminación como lo son Salmonella y E. coli O157:H7. Una vez conocidas las características (serotipo y genotipo) de estos, es necesario implementar estrategias de intervención para evitar la contaminación de las fuentes de agua y del ambiente, lo cual no se pude garantizar. Por tanto, es necesario implementar métodos de descontaminación/desinfección de las probables fuentes de contaminación (agua, personas y ambiente) de los alimentos. Dentro de los métodos más usados se encuentra el cloro, debido a que se maneja a bajas concentraciones y está aprobado por la FDA, sin embargo, presenta algunas características desfavorables, como ser dependiente del pH y ser inactivado por la materia orgánica, así como el no tener un efecto perdurable. Varios son los desinfectantes que se pueden emplear para la desinfección de productos agrícolas frescos. La cloración del agua alrededor de las 200 ppm, es rutinariamente utilizada para reducir la contaminación. El mecanismo fundamental de este producto es la acción oxidativa. Ya que la formación y liberación de radicales libres asegura una adecuada inactivación de los microorganismos adheridos a superficies, siendo evidente y, también demostrable, la acción antimicrobiana. El hecho de que, puede llegar a producir compuestos como trihalometanos que son potencialmente cancerígenos (Fawell, 2000), ha creado la necesidad de investigar la eficacia de desinfectantes no tradicionales y otras tecnologías alternativas, para su uso en la agricultura convencional y orgánica. En la búsqueda de nuevas alternativas para la desinfección de hortalizas se han evaluado diferentes desinfectantes, entre los que destacan los que son amigables con el ambiente, como lo son los desinfectantes biológicos (bacteriófagos), los cuales no representan una fuente de contaminación química residual, por tanto, pueden utilizarse en la agricultura orgánica, son específicos contra los microorganismos para los cuales van dirigidos, evitando destruir flora benéfica y tienen efecto perdurable y ya han sido aprobados por la FDA para la descontaminación de alimentos. En este contexto, el objetivo de este trabajo es obtener y caracterizar bacteriófagos específicos para el control de bacterias patógenas a humanos que contaminan las hortalizas producidas en la zona centro de Sinaloa.

Problemática El estado de Sinaloa, es el principal productor y exportador de hortalizas a nivel nacional, y la mayor superficie sembrada es dedicada a la producción de hortalizas. En la temporada 2008-2009, la producción de hortalizas fue de 1, 564, 313 hectáreas. De las cuales 643, 867 has fueron de tomate; 382, 628 has de chile; 147, 788 has de pepino y 37, 118 has de berenjena, las cuales tienen en común el uso potencial de ceras. La rentabilidad de los cultivos Sinaloenses está basado principalmente en las exportaciones, ya que en la temporada anterior se exportaron casi 317,000 toneladas, dejando ganancias para el estado de más de 854 millones de dólares (CIDH, 2007). Debido a que las hortalizas se consumen principalmente frescas, estás proveen un vehículo de transporte para microorganismos patógenos al humano, debido a esto, las hortalizas se han colocado dentro de los 5 principales alimentos asociados a brotes epidemiológicos en los Estados Unidos de América (EUA) y alrededor del 80% de los brotes se han atribuido a bacterias como Salmonella, Cyclospora, variedades patógenas de Escherichia coli, y Shigella (Beuchat, 1996; Castillo y Rodríguez-García, 2004). Aún cuando los procesos de empacado incluyen una desinfección del fruto, en repetidas ocasiones se ha puesto en evidencia el fracaso de los desinfectantes y la recontaminación a lo largo de la cadena de transporte, por lo tanto, la vulnerabilidad de las hortalizas para acarrear patógenos en su superficie hasta su destino final. Diversos reportes muestran la problemática actual en el consumo de productos frescos. En el período 2000-2002, se presentaron tres grandes brotes epidemiológicos por Salmonella serotipo Poona ocasionados por el consumo de melón cantaloupe mexicano, culminando con un cierre de fronteras y grandes pérdidas económicas para el país (CDC, 2002). Estudios realizados en el Valle de Culiacán, Sinaloa han mostrado la presencia de contaminación microbiológica en agua de uso agrícola, Cázares Diarte (2004) demostró la presencia de Escherichia coli en un 78.5 % y Salmonella spp. en un 14.2 % del total de las muestras analizadas, posteriormente, López et al. (2005) demostró la presencia de altos niveles de Escherichia coli y del género Salmonella, identificando 7 diferentes serotipos de esta última (Typhimurium, Give, Anatum, Agona, Infantis, Oranienburg y Minnesota). En 2006, Campos-Sauceda et al. (2009) identificó la presencia de Escherichia coli y de Salmonella serotipo Typhimurium en una empacadora de pimiento verde localizada en el Valle Agrícola de Culiacán. Recientemente, el CDC (Centro para el Control y Prevención de Enfermedades), reportó en julio de 2008, un brote epidemiológico en varios puntos geográficos de los EUA, ocasionado por Salmonella serotipo Saintpaul con más de 1000 casos de enfermos, siendo los productos sospechosos el tomate y el chile mexicano (MMWR, 2008), las especulaciones causaron grandes perdidas a los productores de Sinaloa, ya qué al ser asociados con el brote los consumidores la comercialización de los productos mexicanos bajo drásticamente por el riesgo que estos representaban. La pérdida estimada en el periodo de junio-julio de 2008 fue de 100 millones de dólares para los productores (CIDH, 2008). Estos acontecimientos ponen en manifiesto la importancia de mantener la inocuidad de los productos agrícolas frescos para conservar la aceptación en el mercado internacional. Los métodos de vigilancia microbiológica en la producción de frutas y hortalizas como el análisis de riesgos y puntos críticos de control (HACCP, por sus siglas en inglés) y aplicación de las buenas prácticas agrícolas (BPAs) van encaminadas a la prevención de la contaminación de los alimentos, así como a reducir al máximo la presencia de contaminantes químicos. Debido a esto, en los últimos años el control biológico para combatir microorganismos patógenos ha tomado importancia, debido principalmente a la baja o nula contaminación a los ecosistemas donde se aplican y por la especificidad que ofrecen sobre una plaga o patógeno en particular. Los bacteriófagos (fagos), han sido considerados un método de control biológico, ya que mediante el uso de fagos se puede reducir/eliminar la presencia y/o el crecimiento de bacterias patógenas. Por lo qué, ofrecen un alto grado de especificidad y no afectan la microflora del entorno en el que se aplican, al igual que no afectan a células de plantas y animales. Los bacteriófagos, se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente de manera natural, forman parte de la microflora natural del tracto intestinal de los animales y el hombre. De tal manera que no representan un riesgo de enfermedad para los humanos ni animales, por lo que pueden ser considerados una excelente alternativa para utilizarse como descontaminantes de bacterias patógenas como Salmonella y E. coli (O157:H7) en hortalizas. Además de su uso en la agricultura convencional, es una buena alternativa en la agricultura orgánica, respaldado por diversos estudios que han propuesto a los bacteriófagos como una herramienta para el control de patógenos en los alimentos.

Justificación El consumo de frutas y hortalizas ha ido en aumento, paralelamente la incidencia de enfermedades gastrointestinales. Esto debido a que hay deficiencias en la cadena productiva y las bacterias patógenas presente en el agua de riego o en las manos del personal de campo que llegan finalmente a las frutas y hortalizas. La presencia de bacterias cómo Salmonella y Escherichia coli en hortalizas es una evidencia de exposición a la contaminación fecal. El Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés) ha estimado que los patógenos provenientes de los alimentos causan aproximadamente 76 millones de enfermedades y 5000 muertes cada año, solamente en los Estados Unidos. A la fecha, las principales causas de muerte debido a patógenos bacterianos provenientes de los alimentos son Salmonella y

Listeria, seguido, cercanamente por Escherichia coli (E. coli O157:H7) y Campylobacter jejunii. En México existe un promedio de 160,000 casos anuales de salmonelosis y fiebre tifoidea y el costo promedio por paciente es de 6,500.00 por día cama. Sinaloa está entre los primeros 5 lugares de salmonelosis y fiebre tifoidea en el país teniendo como promedio 15,000 casos anuales, eso significa 18, 000,000 de pesos que se pierden si solo se atiende el 20% de los casos por un solo día de cama. El estado de Sinaloa es reconocido por su alta producción de hortalizas frescas, la exportación de estos productos favorecen la economía de nuestro país, sin embargo, la aparición de brotes epidemiológicos ocasionados por el consumo de tomates frescos contaminados pone en riesgo la salud de los consumidores y por ende su comercialización. Una gran variedad de factores contribuye a la contaminación de frutas y hortalizas por microorganismos causantes de enfermedades a los humanos. El agua es uno de los principales vehículos conductores de sustancias contaminantes, por la presencia de heces fecales de humanos y animales. En la inocuidad también influyen procesos inadecuados en los campos de cultivo; prácticas deficientes de desinfección; condiciones inapropiadas durante empaque; higiene deficiente de los trabajadores; y el mal manejo durante almacenamiento y transporte. Aunado a esto, una vez que ocurre la contaminación, muchos microorganismos patógenos poseen la capacidad de formar biopelículas lo que les ayuda a sobrevivir por largos períodos de tiempo en la superficie de hortalizas frescas (Badaway et al, 1985). Algunos microorganismos son también capaces de sobrevivir a procesos de desinfección, e incluso de multiplicarse en el producto durante su almacenamiento y transporte (Berrang et al, 1989; Del Rosario et al, 1995). Debido a reciente brote de Salmonelosis surgido en EUA, dónde se asoció al tomate sinaloense, la FDA junto con el Laboratorio Estatal de Salud Pública y el Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C., Unidad Culiacán, condujeron un estudio, en el cual, no se encontró Salmonella de dicho serotipo, sin embargo, se encontraron otros serotipos de Salmonella, lo cual debe poner en alerta a los agricultores mexicanos y en especial a los Sinaloenses en tomar medidas correctivas dentro de las cuales destacan las Buenas Prácticas Agrícolas y de Manufactura, así como también la búsqueda de nuevas alternativas de descontaminación, las cuales incluyan, además de los desinfectantes químicos que actualmente se utilizan, alternativas que den protección prolongada y segura a los productos agrícolas frescos, y sobre todo, alternativas a los productos orgánicos, los cuales no deben contener productos químicos, tal es el caso del control biológico, en donde se utilizan microorganismos benéficos, como los bacteriófagos. Objetivos Fecha de cumplimiento

#

Objetivo

1

Aislar bacteriófagos específicos de los diversos serotipos y/o genotipos de Salmonella y E coli O157:H7 purificados de agua y heces de la zona centro de Sinaloa.

May-2011

2

Caracterizar bacteriófagos específicos de los diversos serotipos y/o genotipos de Salmonella y E coli O157:H7 purificados de agua y heces de la zona centro de Sinaloa.

May-2011

3

Generar un documento técnico que describa la metodología y resultados de la obtención de los bacteriófagos específicos de los diversos serotipos y/o genotipos de Salmonella y E coli O157:H7.

May-2011

Metas Fecha de cumplimiento

#

Meta

1

Aislar y caracterizar al menos 10 bacteriófagos con potencial para reducir al menos 2 log10 de concentración de los diversos serotipos y/o genotipos de Salmonella y E. coli O157:H7, obtenidos de la zona centro de Sinaloa, para Mayo de 2011.

May-2011

2

Generar un documento técnico que describa la metodología y los resultados de la obtención de los 10 bacteriófagos específicos hacia los 40 diversos serotipos de Salmonella y hacia los 10 genotipos de E coli O157:H7, para marzo de 2011.

May-2011

Hipótesis Se aislarán y caracterizarán al menos 10 bacteriófagos con potencial para reducir al menos 2 log10 de concentración de los diversos serotipos y/o genotipos de Salmonella y E. coli O157:H7, obtenidos de la zona centro de Sinaloa.

Materiales Infraestructura física: Materiales 1 laboratorio para el análisis de muestras (Lab. De Biotecnología de INIFAP-CEVACU). 1 laboratorio de microbiología ambiental y de alimentos en CIAD, Culiacán. 2 Vehículos para la toma de muestra 1 Equipo completo para PCR tiempo real: Termociclador, Computadora acoplada al equipo con software específico 3 Equipos de PCR punto final (termociclador) 6 Equipos para electroforesis Sistemas de filtración por membrana: tren de filtración, embudos para filtración, bomba de vacío Autoclaves y ollas de presión para esterilización Centrífugas refrigeradas y microcentrífugas Campanas de bioseguridad tipo II Incubadoras con aereación y con CO2 Potenciómetros Espectrofotómetros Cuenta-colonias Equipo para ultrafiltración: bomba peristáltica y acopladores de filtros Agitadores orbitales Baño maría y Shaker Placas de calentamiento Liofilizador Material para la toma de muestra (recipientes de polipropileno y bolsas herméticas estériles) 400 Filtros de fibra hueca de 0.02-0.1 µm de tamaño de poro 1Bomba peristaltica Masterflex Cole Parmer para ultrafiltración 10 m de manguera plástica esterilizable 10 L de Agar de cultivo selectivo (Mac.Conkey, XLD,SS y Hektoen) 5000 cajas petri 4 kits de reactivos para PCR 1000 tubos de 0.2 mL para mezcla de reacción de PCR 3000 tubos de 1.5 mL para lisis celular 5000 puntillas desechables, 1,2,5, 10, 20, 100, 1000 y 10000 microlitros 7 L de agarosa al 1% 2500 tubos cónicos para almacenamiento de cepas 4 kits para extracción de ADN 15 L de glicerol 15 kits de PCR punto final 40 L de agua peptonada 40 L de Rappaport Vassiliadis 10 L de agua nanopura 10 frascos de agar Agar XLD, 10 frascos de agar Hektoen 10 frascos de agar Mac.Conkey Métodos 1. Toma de muestra Características del Muestreo Se seleccionaron para el estudio 3 municipios (Culiacán, Navolato y Elota) de la zona centro de Sinaloa, en donde se ubica la mayor actividad hortícola. El muestreo se realizará durante los meses de agosto, septiembre y octubre de 2010, recolectándose muestras de aguas de ríos y canales; así como de heces de animales: vacas, caballos, perros, aves de corral; y heces de humanos: niños y adultos. Las muestras procederán de tres lugares diferentes por cada municipio y su recolección se llevará a cabo cada 15 días. Se seleccionaron como lugares de muestreo, los ríos Tamazula, Culiacán, Humaya y Elota; 9 canales de riego agrícola que irrigan la mayor parte de las agrícolas de estos tres municipios; 9 establos de traspatio y 9 viviendas, localizados en las cercanías de los ríos y canales de riego agrícola de los municipios antes mencionados, en estos lugares se ubicaron sitios de muestreo de los cuales se tomaron muestras de agua de río, agua de canal, heces de animales y heces de humanos. Las muestras que se tomarán corresponden a agua de río. Se realizará un total de 6 muestreos con una periodicidad quincenal. 2. Procesamiento de muestras. Muestras de agua (río y canal): Las muestras de agua (agua de río y agua de canal) serán recolectadas en recipientes de polipropileno de 20

litros de capacidad, por duplicado, debidamente etiquetadas y cerrados, se colocarán en hieleras y se trasladarán a los Laboratorios del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (CIAD) Culiacán y serán procesadas entre las primeras 4 y 6 horas después de su recolección por los colaboradores del Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) y del Instituto Tecnológico de Culiacán (ITC) y y el responsable del proyecto (CIAD). El muestreo se llevará a cabo de la siguiente manera: El colaborador del INIFAP será el responsable de realizar la toma de muestras en los municipios de Culiacán y Navolato; La muestra será tomada por duplicado; una de estas será conservada por el colaborador de INIFAP para detectar la presencia de Salmonella, mientras que la otra muestra será entregada al colaborador del ITC para que realice el aislamiento de Escherichia coli O157:H7. Por otro lado, el colaborador de ITC será el responsable de realizar la toma de muestras, por duplicado, en el municipio de Elota para de la misma forma, una de estas muestras sea entregada al colaborador del INIFAP y este realice la detección de Salmonella; la muestra que conserve el colaborador del ITC será procesada por este mismo para la detección de E. coli O157:H7. Los 20 litros de agua se someterán a un sistema de ultrafiltración, para eliminar el mayor volumen de agua y concentrar la muestra. Para ello, se recirculará el volumen de muestra hasta alcanzar un volumen de retenido de 250 mL aproximadamente, se tomarán 25 mL del retenido y se añadirán a un matraz estéril conteniendo 225mL de caldo de pre-enriquecimiento, (mEHEC, para E. coli O157:H7 y agua peptonada al 1% para Salmonella) y se incubará por 20 - 24 horas a 37°C. Muestras de heces (humano y animal): La recolección de la muestra se llevará a cabo en condiciones asépticas, recolectando la materia fecal en estado fresco, utilizando guantes de látex estériles y depositando la muestra en bolsas de plástico estériles (27 x 28 cm, Ziploc), debidamente identificadas con el tipo de animal de granja, el poblado y el número de muestreo. Posteriormente, serán almacenadas y transportadas en hieleras a fin de mantenerlas a 4°C para su conservación hasta su llegada a los Laboratorios, donde serán procesadas inmediatamente, para ello, se pesarán 25g de heces de cada muestra en una balanza (Sartorius, USA) y se agregarán individualmente en bolsas transparentes y estériles (27 x 28 cm, Ziploc) y se procederá a colocar el caldo de preenriquecimiento (mEHEC, para E. coli O157:H7 y agua peptonada al 1%, para Salmonella). Se incubará por 20 - 24 horas a 37°C. 3. Identificación y aislamiento de Salmonella Identificación de Salmonella Se utilizará el método estándar (ISO 6579, 2002), con algunas modificaciones, mismas que a continuación se describen. Para el análisis de agua de uso agrícola se tomarán 25 mL del retenido y se añadirán a un matraz estéril conteniendo 225mL de caldo de pre-enriquecimiento de agua peptonada al 1% (BD Difco, Maryland, U. S. A.), éste se incubará durante 20 - 24 horas a 37°C. Transcurrido el tiempo, se tomará 1 mL del preenriquecimiento y se agregará a 9 mL de caldo de enriquecimiento Rappaport Vassiliadis (BD Difco, Maryland U. S. A.) y se incubará 20 - 24 horas a 37°C. Posteriormente, se tomarán 2 mL del caldo de enriquecimiento y se centrifugará a 16,000 Xg por 10 minutos, se le realizarán dos lavados con agua nanopura estéril y la pastilla celular obtenida se lisará por calor a 100°C por 5 minutos. De este lisado se tomarán 2 µL para la detección de Salmonella por PCR. Aislamiento y purificación de Salmonella Del caldo de enriquecimiento se tomarán 10 µL y se sembrarán por estría con un asa de platino estéril en medios selectivos Agar entérico Hektoen (BD Bioxon, México) y Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) (BD Bioxon, México), mismos que se incubarán por 24 horas a 37°C. Dos o tres colonias típicas (colonias transparentes con el centro negro) del género Salmonella se confirmarán por PCR y las colonias positivas se aislarán en agar soya tripticaseína (BD Bioxon, México). Posteriormente, se realizará una purificación de las colonias de Salmonella mediante dos pases sucesivos en medio selectivo. Preservación Las colonias purificadas se preservarán con la técnica de agar inclinado por estría en agar de soya tripticaseína cubierto con glicerol, almacenándose a temperatura ambiente para posteriores análisis (serotipificación y electroforesis por campos pulsados). Pruebas de Serotipificación La serotipificación de los aislados de Salmonella se realizará mediante el esquema de Kauffmman – White. Para ello, se solicitará el servicio al Laboratorio de Bacteriología Entérica, del Departamento de Bacteriología del Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) en México, D.F. 4) Confirmación de colonias bacterianas PCR para confirmación bacteriana Para confirmación bacteriana de E. coli O157:H7, se hará por separación inmunomagnética acoplada a PCR

en tiempo real, como se menciona arriba. 5. Identificación de bacteriófagos Preparación de cepas hospederas Se analizarán las muestras mediante la técnica de doble agar para determinar la presencia de fagos específicos para cada especie bacteriana aislada de la zona centro de Sinaloa. Una colonia de cada especie bacteriana, se inoculará en 6 L de caldo de soya y tripticaseína (TSB, siglas en inglés, Bioxon, México) y se incubará por 24 horas a 37 ºC. Posteriormente, el cultivo se concentrará a 500 mL con un sistema de ultrafiltración, el cual incluye una bomba peristáltica (Cole-Parmer modelo 7524-40) y un filtro de fibra hueca hemoflow F80A (Fresenius Medical Care, Lexington, MA) a base de polisulfona con un corte de peso molecular (MWCO) de 15,000 a 20,000, un área de contacto de 1.8 m2 y un diámetro interno de fibra de 200 µm (Hill et al., 2005). Dicho sistema permitirá obtener un concentrado bacteriano de 500 mL. El concentrado bacteriano se colocará en tubos estériles para centrífuga y se centrifugará a 13,080 χ g durante 10 minutos a 4ºC (Thermo IEC, Multi RF 120). El sedimento bacteriano obtenido se lavará, resuspenderá y centrifugará 2 veces en las condiciones descritas anteriormente, con 15 mL de solución amortiguadora estéril (fosfato de potasio monobásico 0.01 M, pH 7.2). La concentración aproximada de la suspensión bacteriana se determinará mediante el uso de un biofotómetro (Eppendorf modelo 22331, EUA), esta se ajustará a una densidad óptica (DO) de 1, midiendo a una longitud de onda (λ) de 600 nm, para obtener una concentración aproximada de 1x109 UFC/mL (Leverentz et al., 2001) Finalmente, la concentración inicial de la suspensión bacteriana será 4x109 UFC/mL y se determinará por siembra en agar mFC mediante diluciones decimales (0.1mL, 1x10-2,1x10-4, 1x10-6, 1x10-8) por duplicado, en placa que contendrá agar selectivo mFC (Difco) . 6. Aislamiento de bacteriófagos Se tomarán 5 gramos de muestra agregándose a 50 mL de cultivo bacteriano (106 UFC/mL cultivadas a 37ºC). El cultivo se incubará de 18-24 h a 37ºC con agitación constante (200 rpm). Después de haber sido incubado, el cultivo bacteriano con cada muestra se centrifugará a 10 000 rpm por 10 min. El sobrenadante se recuperará y se filtrará a través de una membrana de nitrocelulosa (PALL, USA) con un tamaño de poro de 0.45 μm, enseguida la muestra recolectada se someterá a ensayo por la técnica del doble agar para propagación del bacteriófago (O’ Flynn et al., 2004). La técnica del doble agar se desarrollará en cajas petri de 10 cm y la capa superior de agar consistirá de peptona 1% (p/v), cloruro de sodio 0.8% (p/v) y TSA 1%, la capa inferior consistirá de TSA al 1.5%. Para cada muestra se utilizarán 3 mL de agar al 1% contenido en tubos, se calentarán por 10 min y se dejará enfriar en el termo baño a 47ºC. Se tomará una alícuota de 1 mL del cultivo bacteriano de cada especie en estudio y se mezclará con el agar al 1% (líquido 47-50ºC, antes de solidificación) y con 100 μl del lisado de los bacteriófagos anteriormente obtenidos, se agitará en vórtex y se vaciará sobre la capa inferior de TSA al 1.5%. La capa superior de dejará solidificar a temperatura ambiente, se invertirán las cajas y se incubarán a 37ºC toda la noche. 7. Purificación de bacteriófagos Los bacteriófagos se purificarán mediante el corte de una placa bien aislada, utilizando una asa de platino, de esta manera se corta cuidadosamente la zona que rodea la placa y se añade a 9 mL de cultivo bacteriano, se incuba durante 24 horas a 37ºC en agitación constante (O’ Flynn et al., 2001). La suspensión de bacteriófagos se esterilizará por filtración a través de una jeringa de 0.45 μm montada, para eliminar cualquier bacteria dado que la suspensión debe contener alrededor de 104 a 105 UFP/mL. Un segundo y tercer ciclo de purificación son necesarios para garantizar una única cepa de población de bacteriófagos. 8. Propagación de bacteriófagos Se tomarán 50 mL de cada cultivo bacteriano (E. coli O157:H7, Salmonella spp, con un periodo de incubación de 24h a una concentración de (109 UFC/mL) y 5 mL de la solución purificada del bacteriófago (109-1011) UFP/mL), posteriormente se incubará con agitación a 37ºC durante toda la noche. Después de la incubación, la suspensión de bacteria-bacteriófago se tratará con 10 mL de cloroformo para destruir las bacterias y liberar cualquier progenie del bacteriófago que pudiera estar presente en la bacteria hospedera. Para eliminar los detritus de la bacteria, se centrifugará a 10 000 rpm a 4ºC durante 10 min, el sobrenadante será separado y filtrado por una membrana de nitrocelulosa (PALL, USA) con un tamaño de poro de 0.45 μm de diámetro y el producto del lisado se almacenará a 4ºC hasta su uso (Goodridge et al., 2003).

Impactos ambientales esperados Existen pocos datos sobre impacto ambiental en México y no existen datos cuantitativos de impacto ambiental en Sinaloa, y mucho menos con respecto al uso de agentes biológicos, por ser una nueva tecnología. Sin embargo, al utilizar alternativas biológicas para la descontaminación de alimentos, se podrá reducir el uso de agentes químicos tales como hipoclorito de Sodio utilizado principalmente en el sector

agroalimentario. Sin embargo con este estudio no se pretende eliminar el uso de hipoclorito de sodio en el empaque, pero si de podrá evitar el uso de desinfectantes una vez que se aplique el producto biológico sobre las hortalizas, este permitirá el control de la contaminación microbiológica y por tanto, todas las posibles contaminaciones subsecuentes desde que el producto salga del empaque y llegue hasta el consumidor, esto evitará contaminaciones al humano y así se mantiene un equilibrio ecológico. Una vez que se adopte el uso de estos agentes biológicos, se podrá determinar dicho impacto. Impactos económicos esperados La rentabilidad en el cultivo de tomate Sinaloense, está basado principalmente en su exportación. La temporada 2008-2009 se exportaron 298,181 toneladas de este cultivo, con un valor de 278.1 millones de dólares. Los brotes de enfermedades originadas por microorganismos como Salmonella y E. coli O157:H7 transmitidas por frutas y hortalizas ha originado grandes pérdidas económicas. Por ejemplo, el caso del melón Cantaloupe, en 1999, México llegó a exportar 266,817 ton de este producto al mercado estadounidense (Claridades Agropecuarias, 2000). Sin embargo, el 28 de octubre del 2002, EUA cerró su frontera al melón Cantaloupe mexicano debido a 155 casos de salmonelosis, incluidas dos muertes, que fueron asociados al consumo de este producto durante los años de 2000 a 2002 (CDC, 2002). Actualmente, el gobierno estadounidense sujeta su importación al uso de un programa de certificación basado en estrategias para prevenir la contaminación microbiológica durante la producción, operaciones de precosecha y poscosecha; dicha certificación ha sido obtenida solo por un número reducido de empacadoras. De manera que en la temporada 2006-2007, México exportó 5,888 ton de melón Cantaloupe, lo que representa solo el 2.2% del nivel de exportación alcanzado en 1999 (CAADES-CIDH, 2008). Suponiendo que llegase a surgir, en Estados Unidos, un brote de Salmonelosis originado por el consumo de Tomate exportado por Sinaloa; las consecuencias económicas podrían ser similares a las de las exportaciones de melón. Es decir, no se tendría entrada de divisas por las exportaciones de tomate y cualquier otra hortaliza que presente este problema. Lo que representaría grandes pérdidas económicas para el estado y el país.

Impactos tecnológicos esperados Los microorganismos se adaptan genéticamente a las condiciones ambientales a las que están expuestos dentro de su nicho ecológico, es por esto que tanto bacterias como bacteriófagos pueden contener características que los convierten en endémicos de una región. La importancia de desarrollar un producto biotecnológico de la región de esta naturaleza, reside en el aseguramiento del efecto lítico o destructivo de las bacterias patógenas que se encuentran de manera natural en el estado de Sinaloa. La aportación de un producto biotecnológico, como lo es un formulado biológico, brinda una nueva alternativa para el control y desinfección de bacterias patógenas a humanos, con potencial de uso tanto en la agricultura convencional como en la agricultura orgánica. Además, los bacteriófagos tienen la capacidad de sobrevivir y conservar su potencial destructivo por un periodo hasta de 7 días; si esta biotecnología se implementara en empaques agrícolas, conferiría un poder residual en el fruto de eliminación de patógenos presentes, esto se traduce en una protección prolongada a lo largo de toda la cadena de distribución de las hortalizas hasta llegar a su destino final, asegurando así la inocuidad de las mismas.

Impactos sociales esperados La sociedad agrícola del estado de Sinaloa, se verá favorecida ya que podrá contar con un registro de la presencia de los serovares de Salmonella y Escherichia coli, así como la identificación de los bacteriófagos potencialmente activos para usarse como descontaminantes de hortalizas. La importancia de esto radica en qué en caso sospecha de algún brote de ETA´s en el que se relacione a los productos agrícolas del estado, se podrá saber con exactitud si el serovar implicado pertenece a los aislados y caracterizados. Así se podrá tener una mayor confianza de los productos Sinaloenses y se asegurará su permanencia en el mercado internacional, así como la mejora en la calidad y cantidad del producto a ofertar, razones por las que obtendrá ganancias extras. Además de asegurar más de 22 782 empleos en los empaques agrícolas a los que la población año con año tiene asegurado, evitando con esto la emigración de la gente del campo a la ciudad, salvaguardando sus costumbres y creencias. Además se reducirían considerablemente los casos de salmonelosis y fiebre tifoidea qué se presentan en el centro de Sinaloa por el consumo de hortalizas frescas que han sido regadas con aguas contaminadas, esto cuando se utilicen los bacteriófagos como descontaminates. Relación Beneficio-Costo esperado de el(los) resultado(s) y/o producto(s) en el ejercicio 20102011 En Sinaloa se cuenta con una superficie de 51,058 has sembrada de hortalizas las cuales representan una

producción total de 793.5 mil toneladas. Esto representa una exportación estatal de hortalizas que alcanza una captación total de 854.8 millones de dólares anuales (CIDH, 2009). El presente proyecto no pretende incrementar las ganancias por producción, sino mantenerlas, evitando comprometerlas por la presencia de patógenos en las hortalizas, el costo por pérdidas de exportación en base a experiencias pasadas representan 854 800 000/2 292 280 = 372 veces el beneficio. No se conocen los costos de producción de bacteriófagos, sin embargo, se sabe que el costo de los productos para control biológico oscilan alrededor de los 1100 pesos por hectárea, por lo que, asumiendo que este sea el costo para los bacteriófagos, por ser de semejante modo de acción se estarían invirtiendo alrededor de 1100 pesos por cada 15 toneladas, es decir 73.32 por tonelada, lo cual representa invertir alrededor de 58 millones de pesos por las 793.5 mil toneladas de hortalizas producidas en Sinaloa. Por lo que, el costo beneficio es de: 854’ 800, 000/58’187,355= 14.69 veces.

PARCELAS O LOTES #

Propietario/ Productor Cooperante

Municipio/ Ubicación

Cultivo a establecer

Superficie

Número de animales

1 Aristero Canelos Osvaldo Avila

Culiacan Las Puentes Km 5

Tomate

25

-

2 Victor Hugo García Salazar Diego Ley López

Culiacan Carretera a Navolato Km 12.5

Tomate

25

-

3 Daniel Beltran Daniel Beltrán

Culiacan Carretera a Vitaruto Km 27, Villa Adolfo López Mateos

Tomate

25

-

4 José María Pablos Ritz José María Pablos Ritz

Navolato Culiacán Limoncito Km 26.5 Villa Angel Flores

Tomate

20

-

5 Raul Enrique Díaz Jaime Tamayo Félix

Culiacan Carretera ElDorado Km 12.5

Tomate

20

-

6 Jimdow Ibarra Margarito Alfaro

Culiacan Carretera México Nogales Km 41

Tomate

20

-

BENEFICIARIOS DIRECTOS #

Nombre/CURP

Telefono/E-mail

Cultivo

Superficie

Culiacan

---

Tomate, Pepinos y chile

300

2 Productora Agrícola Florencia S. Culiacán A. de C. V. --

---

Tomate y chile

72

3 Agrícola Pony --

Culiacán

---

Chle

300

4 Higueras de Abulla S. P. R. de R. L --

Culiacán

---

Chile

20

5 All Green S. A. de C. V --

Culiacán

---

Tomate y Ejote

400

6 Agrícola Paredes --

Culiacán

---

Tomate, pepino y chiles

500

7 Agricola Paralelo 38 --

Culiacán

---

Pepinos y Chile

200

8 Productores Argoz --

Culiacán

---

Berejena

50

1 Valores Hortícolas del Pacífico --

Dirección

9 Agrícola Asley --

Culiacán

---

--

--

10 Agrícola la Capilla --

Navolato

---

Calabaza, berenjena, elote y chile

200

11 Agrícola la Guajira --

Navolato

---

Tomate, pepino y chile

90

12 Agrícola Santa Teresa --

Navolato

---

Tomate y pepino

500

13 Agroexportaciones S. P. R. de R. Navolato L --

---

Toamte

140

14 Agroexportadora del Noroeste --

Navolato

---

Tomate

400

15 Daniel Cárdenas Cevallos (Agricola el Porvenir) --

Navolato

---

Tomate, pepino y chile

300

16 De la Costa S. A. de C. V. --

Navolato

---

Ejotes

200

17 Jugos Organics --

Navolato

---

Ejotes

200

18 Agrícola Ritz --

Navolato

---

Tomate

--

19 Agrícola la Cruz --

Elota

---

Chile

100

20 Agrobo S. A. de C. V. --

Elota

---

Tomate

160

21 Agroindustrias Tombell --

Elota

---

Tomate y chile

400

22 Campo y Valle --

Elota

---

Tomate

30

23 Ceuta produce --

Elota

---

Tomate, pepino y chile

1500

24 Del campo y Asociados --

Elota

---

Tomate y chile

600

25 Ecoagro de México --

Elota

---

Tomate

200

26 Hortalizas Protegidas del Pacífico --

Elota

---

Tomate

100

27 Sol y Arenas --

Elota

---

Chile

200

28 Agrícola Belher --

Navolato

---

Tomate

200

BENEFICIARIOS INDIRECTOS Beneficiarios indirectos Son las 53 agrícolas se encuentran dentro del programa de inocuidad del Comité Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Sinaloa (CESAVESIN). de Culiacán: Agrícola paralelo 38, agrícola paredes, agrícola pony, All green S. A. de C. V., Higueras de Abulla S. P. R. de R. L., Productora Agrícola Florencia S. A. de C. V., Productores Argoz, Valores Hortícolas del Pacífico, Agrícola Asley; de Navolato: Agrícola la Capilla, Agrícola la Guajira, Agrícola Santa Teresa, Agroexportaciones S. P. R. de R. L., Agroexportadora del Noroeste, Daniel Cárdenas Cevallos (El porvenir), De la Costa S. A. de C. V., Jugos Organics, Agrícola Belher y Agrícola Ritz; y de Elota: Agrícola la Cruz, Agrobo S. A. de C. V., Agroindustrias Tombell, Campo y Valle, Ceuta produce, Del campo y Asociados, Ecoagro de México, Hortalizas Protegidas del Pacífico y Sol y Arenas; de Guasave: Agrícola Borquez, Pac de Lourdes y Agrofrutícola Rosario; de Ahome: Agrícola Cohuibampo, Agrícola Don

Manuel, Agrícola Daniela, Agrícola Luque, Agrícola Sacramento, Agrícola Santa Veneranda, Agropecuaria Industrial de México, Granero de Oro, Grupo Agrícola Esmeralda y Sunset Green; de Escuinapa: Agrícola las Cabras, Productores los Constantinos y Productores Diazteca; de Angostura: Agrícola Vianey, Edrulfo Angulo, Jorge Martínez Salomón y Teja washi; de El Rosario. Gustavo Domínguez Flores, Empaque Don Jorge, Frutas y Legumbres el Rodeo, Agrofrutícola Rosario y de Mocosito: El Nazario S. P. R. Explique cómo lograría este número de beneficiarios indirectos A través de la difusión de la información generada en la investigación, por medio de los medios masivos de comunicación como la prensa, televisión, radio y conferencias directas con los productores. Así como también a través de los días demostrativos.

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Tipo

Ficha

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MARCO LÓGICO

RESUMEN NARRATIVO

FINALIDAD

PROPÓSITO

RESULTADOS Y/O PRODUCTOS

INDICADORES

MEDIOS DE VERIFICACIÓN

SUPUESTOS

Contribuir al Que para el 2012, el fortalecimiento de 30% (15/48) de las los programas de agrícolas de la zona inocuidad para las centro de Sinaloa, hortalizas implementen, producidas en la dentro de los zona centro de programas de Sinaloa inocuidad, el uso de bacteriófagos como agentes de descontaminación en hortalizas.

Información contenida en las bases de datos de datos CESAVESIN y en su página web (www.cesavesin.gob.mx)

Obtener bacteriófagos específicos para el control de bacterias patógenas a humanos que contaminan las hortalizas producidas en la zona centro de Sinaloa

Que para mayo de 2011, se tengan aislados y caracterizados al menos 10 bacteriófagos con potencial para reducir al menos 2 log10 de concentración de los diversos serotipos y/o genotipos de Salmonella y E. coli O157:H7, obtenidos de la zona centro de Sinaloa.

Informes trimestrales y final de Fundación Produce Sinaloa con los resultados donde se muestre la capacidad de bacteriófagos de eliminar los patógenos bacterianos aislados en el centro del estado de Sinaloa. Resultados de análisis de laboratorios externos que respalden la información obtenida del estudio.

Que los agricultores estén dispuestos a utilizar y establezcan los bacteriófagos como agentes de descontaminación de hortalizas.

1. Bacteriófagos específicos de los diversos serotipos y/o genotipos de Salmonella y E coli O157:H7 purificados de agua y heces de la zona centro de Sinaloa, para marzo de 2011.. (2011) 2. Documento técnico que describa la metodología y resultados de la obtención la de los bacteriófagos específicos de los diversos serotipos y/o genotipos de Salmonella y E coli O157:H7, generado para abril de 2011.. (2011)

1. Para marzo de 2011, se tengan identificados al menos 10 bacteriófagos con especificidad hacia al menos 40 serotipos de Salmonella y hacia al menos 10 genotipos de E. coli O157:H7 obtenidas de la zona centro de Sinaloa. 2. . Para marzo de 2011, se generará un documento técnico que describa la metodología y los resultados de la obtención de los 10 bacteriófagos específicos hacia los 40 diversos serotipos de Salmonella y hacia

.Informes trimestrales proporcionados a Fundación Produce Sinaloa donde se especifican los resultados de la identificación de los diversos serotipos de Salmonella y E. coli 0157:H7, y bacteriófagos presente en centro del estado de Sinaloa. Bitácoras de laboratorio. Reportes operativos y financieros. Días de Laboratorio.

1. Que se aíslen bacteriófagos diferentes y logren tener amplio espectro de actividad sobre los diversos serotipos y/o genotipos de Salmonella y E. coli O157:H7. 2. Que el documento técnico llegue a las manos de los productores y les interese leerlo.

los 10 genotipos de y E coli O157:H7.

ACTIVIDADES

1. Bacteriófagos Servicios personales $ 784,367.28 específicos de los (1 becario con 4500 diversos serotipos durante 8 meses). y/o genotipos de Inversiones (un Salmonella y E coli software, BioNumerics, una O157:H7 purificados de incubadora, un agua y heces de la termociclador y un zona centro de fotodocumentador), Sinaloa, para gastos de operación marzo de 2011. y servicios (insumos (R)1. 1. La de laboratorio, preservación de las combustibles y cepas bacterianas lubricantes, gastos aisladas, se realizará indirectos (material por la responsable de oficina, útiles de del proyecto en sus impresión, y propias instalaciones mantenimiento (CIAD), mediante conservación de preservación en equipo). glicerol a -70°C y por liofilización (R)1. 2. La serotipificación de las cepas de Salmonella se realizará bajo cargo de la responsable del proyecto, por servicio externo en el InDRE mediante el esquema de Kauffman White (R)1. 3. La identificación los bacteriófagos, se realizará utilizando como hospederos, los diversos serotipos y genotipos de las cepas bacterianas identificadas, mediante la técnica de doble agar, a cargo de la responsable del proyecto en instalaciones propias (CIAD) (R)1. 4. La purificación de los bacteriófagos se realizará por la técnica descrita por O’ Flynn et al., 2001, bajo cargo de la responsable del proyecto en sus propias instalaciones (CIAD)

1. Los niveles de las bacterias (Salmonella y E. coli O157:H7) y de los bacteriófagos en las zonas de muestreo, son los adecuados para ser aislados e identificados. (R)1. 1. La preservación de las cepas bacterianas aisladas, se realizará por la responsable del proyecto en sus propias instalaciones (CIAD), mediante preservación en glicerol a -70°C y por liofilización (R)1. 2. La serotipificación de las cepas de Salmonella se realizará bajo cargo de la responsable del proyecto, por servicio externo en el InDRE mediante el esquema de Kauffman White (R)1. 3. La identificación los bacteriófagos, se realizará utilizando como hospederos, los diversos serotipos y genotipos de las cepas bacterianas identificadas, mediante la técnica de doble agar, a cargo de la responsable del proyecto en instalaciones propias (CIAD) (R)1. 4. La purificación de los bacteriófagos se realizará por la técnica descrita por O’ Flynn et al., 2001, bajo cargo de la responsable del proyecto en sus propias instalaciones (CIAD) (R)1. 5. La

(R)1. 5. La propagación de los bacteriófagos se realizará por la técnica descrita por Goodridge et al., 2003, bajo cargo de la responsable del proyecto en sus propias instalaciones (CIAD) (C1)1. 1. Toma de muestras de agua de ríos, canales y heces de animales (vacas, caballos, perros, aves de corral) y de humanos (niños y humanos), de los municipios de Culiacán y Navolato. Dichas muestras se tomarán por duplicado, una se trabajará en las Instalaciones de INIFAP y la otra en las Instalaciones de CIAD. (C1)1. 2. Identificación y aislamiento de Salmonella en muestras agua de ríos, canales, heces de animales (vacas, caballos, perros y aves de corral) y humanos (niños y adultos), recolectadas en Culiacán y Navolato, utilizando el método estándar ISO 6579,2002 (C2)1. 1. Toma de muestras de agua de ríos y canales, así como de heces de humanos: niños y adultos y animales: vacas, caballos, perros y aves de corral, del municipio de Elota. Las muestras se tomarán por duplicado y se trasladará una de ellas a las instalaciones del CIAD, para su respectivo procesamiento y análisis.

propagación de los bacteriófagos se realizará por la técnica descrita por Goodridge et al., 2003, bajo cargo de la responsable del proyecto en sus propias instalaciones (CIAD) (C1)1. 1. Toma de muestras de agua de ríos, canales y heces de animales (vacas, caballos, perros, aves de corral) y de humanos (niños y humanos), de los municipios de Culiacán y Navolato. Dichas muestras se tomarán por duplicado, una se trabajará en las Instalaciones de INIFAP y la otra en las Instalaciones de CIAD. (C1)1. 2. Identificación y aislamiento de Salmonella en muestras agua de ríos, canales, heces de animales (vacas, caballos, perros y aves de corral) y humanos (niños y adultos), recolectadas en Culiacán y Navolato, utilizando el método estándar ISO 6579,2002 (C2)1. 1. Toma de muestras de agua de ríos y canales, así como de heces de humanos: niños y adultos y animales: vacas, caballos, perros y aves de corral, del municipio de Elota. Las muestras se tomarán por duplicado y se trasladará una de ellas a las instalaciones del CIAD, para su respectivo procesamiento y análisis. (C2)1. 2.

(C2)1. 2. Identificación y aislamiento de Escherichia coli O157:H7 en las muestras de agua de ríos y canales, así como de heces de humanos: niños y adultos y heces de animales: vacas, caballos, perros y aves de corral, recolectadas en el municipio de Elota, utilizando el Método estándar ISO 6579, 2002. 2. Documento técnico que describa la metodología y resultados de la obtención la de los bacteriófagos específicos de los diversos serotipos y/o genotipos de Salmonella y E coli O157:H7, generado para abril de 2011. (R)2. 1. Análisis de resultados (R)2. 2. Escritura del documento técnico (R)2. 3. Edición del documento técnico (R)2. 4. Impresión del documento técnico (R)2. 5. Distribución de documento a productores

Identificación y aislamiento de Escherichia coli O157:H7 en las muestras de agua de ríos y canales, así como de heces de humanos: niños y adultos y heces de animales: vacas, caballos, perros y aves de corral, recolectadas en el municipio de Elota, utilizando el Método estándar ISO 6579, 2002. 2. Que la imprenta entregue el material impreso en tiempo y forma. (R)2. 1. Análisis de resultados (R)2. 2. Escritura del documento técnico (R)2. 3. Edición del documento técnico (R)2. 4. Impresión del documento técnico (R)2. 5. Distribución de documento a productores

1. Bacteriófagos específicos de los diversos serotipos y/o genotipos de Salmonella y E coli O157:H7 aislados de agua y heces de la zona centro de Sinaloa, purificados para marzo de 2011. (2010-2011) 2. Bacteriófagos caracterizados biológica y morfológicamente para mayo de 2011 (2010-2011) 3. Formulado a base

Este grupo de trabajo cuenta con 4 laboratorios de análisis (un laboratorio de microbiología ambiental y de alimentos y un laboratorio de biología molecular en CIAD, Culiacán; un laboratorio de Biotecnología de INIFAP-CEVACU y un laboratorio de microbiología de alimentos en el TEC de Culiacán).

de bacteriófagos para la descontaminación bacteriológica de hortalizas, validado para mayo de 2012. (2011-2012) 4. Biotecnología de bacteriófagos como agentes de descontaminación bacteriológica de hortalizas, transferida para mayo de 2013. (2012-2013)

RESULTADOS

En el laboratorio de Microbiología Ambiental y de Alimentos, se cuenta con un vehículo para la toma de muestra, dos sistemas de filtración por membrana: tren de filtración, embudos para filtración, bomba de vacío, una campana de bioseguridad tipo II, una incubadoras con aereación y con CO2, un potenciómetro, un cuenta-colonias, dos autoclaves y dos ollas de presión para esterilización, un equipo para ultrafiltración: bomba peristáltica y acopladores de filtros, 6 agitadores orbitales, dos baños María y Shaker (agitador con baño de agua y control de temperatura), 6 placas de calentamiento, un liofilizador; en el laboratorio de biología molecular se cuenta con un Sistema de detección genética, GDS (IMS-PCR en tiempo real), con computadora y software para análisis, un equipo de electroforesis en gel de campo Pulsante (PFGE), un equipo completo para PCR tiempo real (termociclador, computadora acoplada al equipo con software específico, Bio-Rad), tres equipos de PCR punto final (termociclador), 6 equipos para electroforesis, una centrífuga refrigerada y una microcentrífuga, un biofotómetro, un

Y/O PRODUCTOS POR EJERCICIO

Shaker (incubadora con agitación y control de temperatura); en el laboratorio de Biotecnología de INIFAP-CEVACU, se cuenta con un vehículo para toma de muestras y laboratorio para el aislamiento de patógneos. El laboratorio de análisis de muestra (Tecnológico de Culiacán), se encuentra en adaptación y equipamiento, se hará uso de instalaciones de CIAD para iniciar el trabajo y una vez listo este laboratorio, se continuará el trabajo. Personal altamente calificado: INIFAP: Tres investigadores, con nivel maestría CIAD, Tres investigadores, con nivel doctorado y 4 técnicos, dos con nivel licenciatura y dos con nivel maestría, se cuenta con tres estudiantes de maestría para la participación en este proyecto, así como un estudiante de doctorado. TEC Culiacán, un investigador con nivel doctorado, se apoyará este con un estudiante de licenciatura y experiencia en el monitoreo de Salmonella y E coli O157:H7, así como otras bacterias patógenas que generan enfermedades transmitidas por los alimentos, en

diferentes matrices como lo son: agua de canales de riego, agua de ríos, heces fecales de animales y de humanos. Para la realización de este proyecto de investigación, se cuenta con personal que tiene amplia experiencia en genética microbiana y microbiología ambiental. Se cuenta con información existente que nos llevará a generar y alcanzar los objetivos planteados. Dentro de esto último se encuentra el contar con mapas de la distribución de los canales de toda la región hortícola del Estado de Sinaloa, así como también algunos bacteriófagos previamente aislados de la región con capacidad lítica para ciertos serotipos de Salmonella. con Se cuenta personal altamente capacitado para el manejo de la PFGE, el cual se capacitó para la obtención de huellas genéticas de Salmonella (Universidad de Santiago de Compostela, España) y para E. coli (USDA, Albany California). Se cuenta con cepas de referencia de Salmonella y E. coli O157:H7 y se cuenta con 3 bacteriófagos aislados del Valle de Culiacán, así como con todas las metodologías estandarizadas para este proyecto.

R=Nohelia Castro del Campo; C1=María Guadalupe García Camarena; C2=Juan Pedro Campos Sauceda;

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ACTIVIDADES (R)1.1. La preservación de las cepas bacterianas aisladas, se realizará por la responsable del proyecto en sus propias instalaciones (CIAD), mediante preservación en glicerol a -70°C y por liofilización (R)1.2. La serotipificación de las cepas de Salmonella se realizará bajo cargo de la responsable del proyecto, por servicio externo en el InDRE mediante el esquema de Kauffman White (R)1.3. La identificación los bacteriófagos, se realizará utilizando como hospederos, los diversos serotipos y genotipos de las cepas bacterianas identificadas, mediante la técnica de doble agar, a cargo de la responsable del proyecto en instalaciones propias (CIAD) (R)1.4. La purificación de los bacteriófagos se realizará por la técnica descrita por O’ Flynn et al., 2001, bajo cargo de la responsable del proyecto en sus propias instalaciones (CIAD) (R)1.5. La propagación de los bacteriófagos se realizará por la técnica descrita por Goodridge et al., 2003, bajo cargo de la responsable del proyecto en sus propias instalaciones (CIAD) (C1)1.1. Toma de muestras de agua de ríos, canales y heces de animales (vacas, caballos, perros, aves de corral) y de humanos (niños y humanos), de los municipios de Culiacán y Navolato. Dichas muestras se tomarán por duplicado, una se trabajará en las Instalaciones de INIFAP y la otra en las Instalaciones de CIAD. (C1)1.2. Identificación y aislamiento de Salmonella en muestras agua de ríos, canales, heces de animales (vacas, caballos, perros y aves de corral) y humanos (niños y adultos), recolectadas en Culiacán y Navolato, utilizando el método estándar ISO 6579,2002 (C2)1.1. Toma de muestras de agua de ríos y canales, así como de heces de humanos: niños y adultos y animales: vacas, caballos, perros y aves de corral, del municipio de Elota. Las muestras se tomarán por duplicado y se trasladará una de ellas a las instalaciones del CIAD, para su respectivo procesamiento y análisis. (C2)1.2. Identificación y aislamiento de

2010

2011

JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC ENE

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MAY

JUN

Escherichia coli O157:H7 en las muestras de agua de ríos y canales, así como de heces de humanos: niños y adultos y heces de animales: vacas, caballos, perros y aves de corral, recolectadas en el municipio de Elota, utilizando el Método estándar ISO 6579, 2002. (R)2.1. Análisis de resultados (R)2.2. Escritura del documento técnico (R)2.3. Edición del documento técnico (R)2.4. Impresión del documento técnico (R)2.5. Distribución de documento a productores DOCUMENTACIÓN

Entrega Entrega Entrega Entrega

de de de de

Informe Informe Informe Informe

x

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x

x x

x x

x x x x

JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC ENE

Financiero Operativo Trimestral Final / Anual

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x x x

x x

x x

x x x

x x

x x

FEB

MAR

ABR

MAY

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x x

x x x

JUN

x

ENTRENAMIENTO, CAPACITACIÓN Y TRANSFERENCIA

JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC ENE

FEB

MAR

ABR

MAY

Asistencia a cursos Asistencia a Congresos

JUN

x

1 asistencia a congreso

Asistencia a Simposio Misiones Tecnológicas Días de campo Publicaciones

x

1 publicación

Cursos a Impartir Días de laboratorio

x

1 dia de laboratorio

R=Nohelia Castro del Campo; C1=María Guadalupe García Camarena; C2=Juan Pedro Campos Sauceda;

CONCEPTOS SERVICIOS PERSONALES

Sueldos Personal de campo Honorarios a Profesionistas Honorarios asimilables Subtotales: $ INVERSIONES

Eq.de cómputo Eq. de Lab. Eq. agrícola Software Eq.de protección Infraestructura y Eq. pecuario Semovientes (Ganado) Invernaderos Subtotales: $ GASTOS DE OPERACIóN Y SERVICIOS

Arrend. de Maq.y Eq. Material eléctrico Cuota de agua

CALENDOGRAMA DE RECURSOS 2010 JUN JUL

AGO

SEP

OCT

NOV

DIC

2011

ENE

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MAR ABR MAY

TOTALES 0 0

11000

11000

11000

11000

11000

11000

11000

11000

11000

11000

11000

11000

11000

11000

77000 0

0

0

JUN JUL

AGO

SEP

OCT

NOV

DIC

ENE

0

0

0

77000

MAR ABR MAY TOTALES

FEB

0 171950

171950 0 0

1000

1000 0 0 0

0

0

JUN JUL

172950

AGO

0

SEP

0

OCT

0

NOV

0

DIC

0

ENE

0

FEB

0

0

0

172950

MAR ABR MAY TOTALES 0 0 0

Análisis de suelo Análisis vegetativo Fármacos y biológicos Permiso de siembra Semilla Insumos de Lab. Insumos agrícolas Gtos.de viaje Alimentación animales Combustibles y Lub. Mto. de eq de comunicación Analisis de laboratorio Maquilas Subtotales: $ GASTOS INDIRECTOS

Mat. oficina Mat./útiles impresión Energía eléctrica Telefonos Mto. Eq.cómputo Ref. Acc.Herramienta Mto.y Cons. Eq. transporte Mto. y Cons. Eq. agrícola Servicio de Internet Mensajeria Revelado y rollos Mto.y Cons. Maq.y Eq. Comisiones Bancarias Subtotales: $ Presupuesto solicitado: $ GASTOS DE EVALUACIÓN

8% de gastos de evaluación PRESUPUESTO TOTAL: $

0 0 0 0 0 200000

20000

120000

20000

360000

2500

1000

2000

500

6000

6000

3000

1500

1500

12000

0

0

0 80000

80000 0

0

0

JUN JUL

208500

AGO

24000

SEP

203500

OCT

22000

NOV

0

DIC

0

ENE

0

FEB

0

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458000

MAR ABR MAY TOTALES

3000

3000 0

1000

1000

1000

1000

4000

1000

1000

1000

1000

4000 0 0

3000

3000

6000 0 0 0 0 0

119

119

119

239

120

120

120

120

120

120

1316

0

0

5119

5119

2119

2239

120

3120

120

120

120

120

18316

0

0

397569

40119

216619

35239

11120

14120

11120

120

120

120

726266

JUN JUL

AGO 31805.52

SEP 3209.52

OCT 17329.52

NOV 2819.12

DIC 889.6

ENE 1129.6

FEB 889.6

MAR ABR MAY TOTALES

0

0

9.6

58101.28

0

0 429374.52 43328.52 233948.52 38058.12 12009.6 15249.6 12009.6 129.6 129.6 129.6

9.6

9.6

784367.28

PRESUPUESTO TOTAL DEL PROYECTO: $ 784,367.28

JUSTIFICACIONES DE RESPONSABLE Monto radicado: $452,840.00 Justificación de Servicios personales: $77,000.00 (17.00% del monto solicitado) Este monto sera utilizado para la contratación de un técnico temporal debido a la gran carga de trabajo (Toma de muestras en 3 municipios del estado, procesamiento de muestras para la determinación de 3 microoganismos diferentes: Salmonella, E. coli O157:H7, y bacteriófagos, preservación de cepas, determinación de rango de hospederos, etc) a desarrollar para el alcance de los objetivos de este proyecto. Justificación de Inversiones: $0.00 (0.00% del monto solicitado) No aplica Justificación de Gastos de operación y servicios: $366,000.00 (80.82% del monto solicitado) Este rubro se requiere para la compra de insumos de laboratorio como lo son: medios de cultivo, amortiguadores salinos, bolsas hermeticas, ssitemas de detección, para PCR en tiempo real, materiales desehables como microtubos, puntillas, así como agarosa, marcadores de tamaňo molecular, 4 kits de reactivos para PCR, 2500 tubos de 0.2 mL para mezcla de reacción de PCR, 3000 tubos de 1.5 mL para lisis celular, 5000 puntillas desechables, 1, 2, 5,10, 20, 100, 1000 y 10000 microlitros, 2500 tubos conicos para almacenamiento de cepas, 15 kits de preservación punto final, 5000 cajas petri, 10 metros de manguera plsática esterlilizable, 7 L de agarosa al 1%, 40 L de agar Hecktoen, 40 L de agar XLD, caldo rappapolt vassiliadiss, 10 frascos de agar Mac conkey, 20 L de agua peptonada y 15 litros de glicerol. Así como gastos de viajes y combustibles y lubricantes necesarios en el desarollo del proyecto.

Justificación de Gastos indirectos: $9,840.00 (2.17% del monto solicitado) Este monto será utilizado para el mantenimiento de los vehiculos que serán utilizados para el transporte a los distintos sitios de muestreo. Así como también para la compra de papeleria

JUSTIFICACIONES DEL COLABORADOR: María Guadalupe García Camarena Monto radicado: $173,426.00 Justificación de Servicios personales: $0.00 (0.00% del monto solicitado) No aplica Justificación de Inversiones: $72,950.00 (42.06% del monto solicitado) Este monto sera utilizado para la compra de una incubadora para el crecimiento de las bacterias, parte importante del proyecto, ya qué en el laboratorio no se cuenta con dicho equipo. Así como equipo de protección para realizar las actividades con mayor seguridad para la persona. Justificación de Gastos de operación y servicios: $92,000.00 (53.05% del monto solicitado) Este recurso será utilizado para cubrir los gastos necesarios para el traslado a los puntos de muestreo y llevar a cabo la toma de muestras. Así como también para la compra de medios de cultivo, reactivos, materiales desechables, etc .necesarios para realizar los muestreos y la identificación de Salmonella. Justificación de Gastos indirectos: $8,476.00 (4.89% del monto solicitado) Este monto será utilizado para cubrir los gastos de energía electrica, teléfono y material de oficina que se estará usando en el desarrollo de las actividades. Así como también para el pago del manejo de la cuenta bancaria. En cuanto al gasto de teléfono esto es importante ya que independientemente de que los investigadores seamos de Culiacán, se tienen que realizar llamadas de larga distancia a los provedores de equipo e insumos.

JUSTIFICACIONES DEL COLABORADOR: Juan Pedro Campos Sauceda Monto radicado: $100,000.00 Justificación de Servicios personales: $0.00 (0.00% del monto solicitado) No aplica Justificación de Inversiones: $100,000.00 (100.00% del monto solicitado) En este rubro se considera la adquisición de un termociclador con gradiente marca eppendorf. Este equipo es requerido para llevar a cabo las reacciones de en cadena de la polimerasa o PCR, lo que permitirá confirmar e identificar las bacterias presuntivas de Salmonella. Justificación de Gastos de operación y servicios: $0.00 (0.00% del monto solicitado) No aplica Justificación de Gastos indirectos: $0.00 (0.00% del monto solicitado) No aplica

PRODUCTORES COOPERANTES # 1

Nombre

Monto

NA

Tipo 0.00

Animales

APORTACIONES DE INSTITUCIONES # 1

Intitucion Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo

Monto 120,000.00

Tipo Mano de obra

2

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias

52,000.00

Mano de obra

3

Instituto Tecnológico de Culiacán

50,000.00

Mano de obra

COTIZACIONES # 1

Cotización Nombre: TERMOCICLADOR EN GRADIENTE EPPENDORF Cotización 1 Empresa: CTR

Importe: 98,000.00

Fecha de la cotizacion: 2009-08-13

Cotización 2 Empresa: SUMILAB

Importe: 110,000.00

Fecha de la cotizacion: 2009-08-10

Cotización 3 Empresa: EPPERDORF 2

Importe: 100,000.00

Fecha de la cotizacion: 2009-08-12

Nombre: INCUBADORA Cotización 1 Empresa: CTR

Importe: 99,500.00

Fecha de la cotizacion: 2009-08-10

Cotización 2 Empresa: SUMILAB

Importe: 105,000.00

Fecha de la cotizacion: 2009-08-13

Cotización 3 Empresa: REACTIVOS Y EQUIPOS 3

Importe: 110,000.00

Fecha de la cotizacion: 2009-08-12

Nombre: INCUBADORA Cotización 1 Empresa: ASESORIA Y VENTA DE MATERIALES Y EQUIPO PARA PROCESOS QUIMICOS-FARMACÉUTICOS, BIOTECNOLOGÍA Y MANEJO Y CONTROL DE FLUÍDOS

Importe: 98,455.00

Fecha de la cotizacion: 2009-08-19

Cotización 2 Empresa: MAQUINARIA Y ACCESORIOS S.A DE C.V

Importe: 96,862.00

Fecha de la cotizacion: 2009-08-24

Cotización 3 Empresa: EQUIPOS Y SERVICIOS WESTEK S.A DE C.V

Importe: 97,889.00

Fecha de la cotizacion: 2009-08-28

INSTITUCIÓN RESPONSABLE Responsable del Nohelia Castro del Campo proyecto: Especialidad: Microbiologia Ambiental

CURP: CACN771017MSLSMH04

Institución Centro de Investigación en responsable del Alimentación y Desarrollo proyecto: Nombre del Cristóbal Chaidez Quiroz responsable de la institución: Puesto: Director