Prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP Kit de amplificación

REF. 441637 REF. 441639

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48 pruebas 200 pruebas

Fecha: 2014-09

BD Diagnostics

BD GeneOhm™ MRSA ACP

ÍNDICE USO PREVISTO.................................................................................................................................................................. 3 RESUMEN Y EXPLICACIÓN .................................................................................................................................................. 3 PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO ........................................................................................................................................ 3 REACTIVOS ...................................................................................................................................................................... 4 PRECAUCIONES ................................................................................................................................................................ 5 MATERIALES SUMINISTRADOS ............................................................................................................................................ 5 CONSERVACIÓN, MANEJO Y ESTABILIDAD ............................................................................................................................ 6 MATERIALES NECESARIOS NO SUMINISTRADOS .................................................................................................................... 6 MODO DE EMPLEO............................................................................................................................................................. 7 PREPARACIÓN ....................................................................................................................................................... 7 PRUEBA BD GENEOHM™ MRSA ACP ................................................................................................................... 7 PROCEDIMIENTO

DE REPETICIÓN DE LA PRUEBA CUANDO FALLA EL CONTROL DE

PCR

Y CUANDO FALLA EL CONTROL DE

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA (CPM, CUANDO SE REALIZAN CPM) ........................................................................ 8

PROCEDIMIENTO DE REPETICIÓN DE LA PRUEBA PARA RESULTADOS NO RESUELTOS O INDETERMINADOS ......................... 8 CONTROL DE CALIDAD ....................................................................................................................................................... 8 CONTROLES POSITIVOS Y NEGATIVOS DE PCR ......................................................................................................... 8 CONTROLES DE PROCESAMIENTO DE MUESTRAS (CPM) ............................................................................................ 9 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS ............................................................................................................................... 9 SERIE INVÁLIDA ..................................................................................................................................................... 9 MUESTRA NO RESUELTA ......................................................................................................................................... 9 ®

MUESTRA INDETERMINADA POR FALLO DEL MÓDULO I–CORE .................................................................................. 9 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO .................................................................................................................................. 10 VALORES ESPERADOS ..................................................................................................................................................... 11 CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO ................................................................................................................................. 11 RENDIMIENTO CLÍNICO ......................................................................................................................................... 11 SENSIBILIDAD ANALÍTICA ....................................................................................................................................... 12 ESPECIFICIDAD ANALÍTICA ..................................................................................................................................... 13 SUSTANCIAS INTERFERENTES ............................................................................................................................... 13 REPRODUCIBILIDAD ............................................................................................................................................. 13 PRECISIÓN .......................................................................................................................................................... 14 CONTAMINACIÓN POR ARRASTRE ........................................................................................................................... 14 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................................................ 15 ÍNDICE DE SÍMBOLOS ....................................................................................................................................................... 16

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BD GeneOhm™ MRSA ACP

Español Uso previsto La prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP es una prueba diagnóstica cualitativa in vitro para la detección directa de ADN de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) en torundas nasales de pacientes con riesgo de colonización nasal. La prueba utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, de sus siglas en inglés) para la amplificación del ADN de SARM y sondas de hibridación fluorescentes específicas para la detección del ADN amplificado. La prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP está indicada para facilitar la prevención y el control de las infecciones por SARM en entornos sanitarios. No está concebida para diagnosticar infecciones por SARM ni para guiar o controlar el tratamiento de las infecciones por SARM. Únicamente se requieren cultivos concomitantes con el fin de obtener microorganismos para tipificación epidemiológica o para la posterior realización de pruebas de sensibilidad a antibióticos.

Resumen y explicación El SARM es una causa importante de infecciones hospitalarias. La mayoría de las transmisiones pueden producirse a través de las manos contaminadas de una persona portadora de SARM. El SARM provoca infecciones con manifestaciones clínicas que van desde pústulas a sepsis, 1 e incluso muerte . También se puede encontrar en la nariz y en la piel de individuos sanos (portadores asintomáticos). El tratamiento de las infecciones por SARM se ha convertido en un verdadero desafío, debido a su amplia resistencia a los agentes antimicrobianos. Las cepas de S. aureus resistentes a meticilina se encuentran frecuentemente en entornos de asistencia sanitaria y representan más del 50% de las cepas de 2 S. aureus de adquisición nosocomial en algunos hospitales de Estados Unidos y Canadá . La prevalencia del SARM continúa aumentando en los hospitales de EE. UU. y en la comunidad2,3. Entre los factores de riesgo para la adquisición de SARM en los centros sanitarios figuran la estancia prolongada en el hospital, la proximidad a pacientes infectados o colonizados por SARM, la colonización por otros organismos resistentes, como enterococos resistentes a la vancomicina (ERV) o C. difficile, la exposición a tratamientos múltiples o prolongados con antibióticos, la exposición a zonas de elevada prevalencia de SARM dentro del centro sanitario y la infección o la colonización anterior por SARM. La identificación precoz de los pacientes portadores de SARM forma parte importante de un programa efectivo de prevención de la infección por SARM. La detección de SARM mediante técnicas tradicionales requiere el aislamiento de colonias puras mediante cultivo y someter estos aislados a pruebas de sensibilidad a oxacilina o cefoxitina, detección del gen mecA o detección de la proteína de fijación a la penicilina (PBP 2a) codificada por el gen mecA. El proceso de cultivo implica un mínimo de 24 horas para identificar el SARM, con una mediana del tiempo hasta el resultado más próxima a las 48 horas. Con la rapidez con la que se pueden extender las infecciones por SARM, especialmente en entornos de asistencia sanitaria donde son frecuentes los portadores, la capacidad de determinar la presencia nasal de SARM el mismo día del ingreso representa una clara ventaja para los programas de prevención de infecciones.

Principios del procedimiento Obtener una muestra nasal y transportar al laboratorio utilizando una de las torundas recomendadas (véase la sección “Materiales necesarios no suministrados”). La lisis de las células bacterianas en muestras de torundas nasales se realiza utilizando el kit de lisis BD GeneOhm™ MRSA ACP. Añadir una alícuota del lisado a los reactivos de PCR ya preparados, que contienen los cebadores específicos de SARM que amplificaran en presencia de la diana genética específica. La prueba contiene también un control interno (CI) para controlar la presencia de inhibidores de la PCR y para confirmar la integridad de los reactivos. Los lisados de los tubos control y de las muestras se añaden a tubos de reacción desechables y se colocan en el instrumento SmartCycler® II. El software del instrumento SmartCycler® II lleva a cabo la amplificación, la detección y la interpretación de los resultados de forma automática. El procedimiento de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP se puede concluir en un plazo de 2 horas, en función del número de muestras procesadas. Para poder recuperar SARM para su tipado epidemiológico o para posteriores pruebas de sensibilidad a antibióticos, se puede inocular un medio de cultivo adecuado durante la preparación de las muestras o hasta 24 horas después. Los cebadores y sondas de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP detectan una secuencia patentada que se encuentra en el cromosoma de S. aureus y que indica la presencia de ADN de SARM. La amplificación del CI y del ADN de SARM se detecta utilizando sondas de hibridación específicas que se fijan a una secuencia concreta de la diana amplificada. La diferenciación del ADN de SARM y del CI se realiza utilizando balizas moleculares que presentan diferentes propiedades fluorescentes. El híbrido baliza-diana emite fluorescencia a una longitud de onda diferente para el SARM y para el CI, y el instrumento SmartCycler® II mide la luz emitida en esa reacción. Los amplicones específicos del SARM o del CI se detectan simultáneamente en dos canales de fluorescencia diferentes del instrumento SmartCycler® II, pudiendo así diferenciarse. El funcionamiento del instrumento SmartCycler® II está basado en el módulo patentado I–CORE® (Intelligent Cooling/Heating Optical Reaction, reacción óptica inteligente de enfriamiento/calentamiento), controlado por un microprocesador4.

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BD GeneOhm™ MRSA ACP

Reactivos Prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP Mezcla maestra (Master Mix)

48 pruebas

200 pruebas

8 tubos

30 tubos

8 tubos

30 tubos

8 x 700 µL

30 x 700 µL

< 0,0005% del complejo ADN polimerasa < 0,001% de control interno: ADN no infeccioso que contiene secuencias de unión de los cebadores de SARM y una secuencia única para la hibridación de la sonda. < 0,06% de cebadores < 0,02% de sondas moleculares < 1% de mezcla de nucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Albúmina de suero bovino Carbohidratos MgCl2 < 0,001% de ADN genómico no infeccioso de Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990) ADN de control (Control DNA) Tampón Tris-EDTA Carbohidratos < 0,001% de ADN genómico no infeccioso de SARM (ATCC 43300) Diluyente (Diluent) Tampón Tris-HCl MgCl2 (NH4)2SO4 KCl Tween-20

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BD GeneOhm™ MRSA ACP

Precauciones •

Para uso diagnóstico in vitro.

•

No utilizar el kit si está roto el precinto de seguridad de la caja exterior.

•

No utilizar los reactivos si las bolsas protectoras están abiertas o desgarradas a su llegada.

•

Cerrar inmediatamente con el cierre rápido las bolsas protectoras de la mezcla maestra y del ADN de control después de cada uso. Eliminar el

•

No retirar el desecante de las bolsas de mezcla maestra ni de ADN de control.

•

No utilizar los reactivos si el desecante dentro de las bolsas de mezcla maestra y de ADN de control está roto o ausente.

•

Los reactivos no son intercambiables entre lotes.

exceso de aire de las bolsas antes de cerrarlas.

•

Nunca se deben mezclar reactivos de diferentes tubos, aunque sean del mismo lote.

•

No utilizar los reactivos después de su fecha de caducidad.

•

No intercambiar las tapas entre los reactivos ya que se puede producir contaminación, comprometiendo los resultados de la prueba.

•

Evitar la contaminación de los reactivos con microorganismos y con desoxirribonucleasa (DNasa) cuando se extraigan alícuotas de los tubos. Se recomienda el uso de puntas de pipeta estériles y desechables, libres de DNasa y bloqueadas con filtro, o puntas para pipetas de desplazamiento positivo.

•

Para evitar la contaminación ambiental con amplicones del SARM, no abrir los tubos de reacción después de la amplificación.

•

Utilizar una punta de pipeta con un diámetro lo bastante pequeño como para llegar hasta el líquido que está en el fondo del tubo de muestra

•

La realización de la prueba fuera de los plazos recomendados puede producir resultados inválidos. Las pruebas no realizadas dentro de los

o de reactivo. plazos especificados deben repetirse. •

Se pueden analizar controles adicionales de acuerdo con las directrices o requisitos de la normativa local, estatal, provincial o federal, o de las organizaciones de acreditación.

•

Si el laboratorio realiza otras pruebas de PCR en tubo abierto hay que utilizar zonas de trabajo separadas y segregadas para la preparación de muestras y para las actividades de amplificación/detección. El material utilizado y el equipo deben ser específicos para cada zona y no deben trasladarse de una zona a otra. Hay que llevar siempre guantes y cambiarlos antes de trasladarse de una zona a otra. Hay que cambiar de guantes antes de manipular reactivos liofilizados.

•

Manejar siempre las muestras como si fueran infecciosas y de conformidad con procedimientos de laboratorio seguros tales como los descritos 5 6 en Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories y en el Documento M29 del CLSI .

•

Llevar indumentaria protectora y guantes desechables cuando se manejen los reactivos del kit. Lavarse bien las manos después de realizar la prueba.

•

No pipetear con la boca.

•

No fumar, beber ni comer en áreas donde se manipulen muestras o reactivos del kit.

•

Desechar los reactivos no utilizados y los desechos de conformidad con la normativa nacional, federal, provincial, estatal y local.

Materiales suministrados •

Mezcla maestra (Master Mix)

•

ADN de control (Control DNA)

•

Diluyente (Diluent)

•

Tubos de reacción de SmartCycler , 25 µL de capacidad.

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®

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BD GeneOhm™ MRSA ACP

Conservación, manejo y estabilidad Nota:

seguir las especificaciones descritas en cada bolsa en relación con las condiciones de conservación. La preparación de la mezcla maestra y de los controles positivos y negativos ha de realizarse en un ambiente donde la temperatura no sobrepase los 25 °C. Condiciones de conservación de la mezcla maestra (Master Mix, etiqueta con banda blanca), del ADN de control (Control DNA, etiqueta con banda roja) y del diluyente (Diluent, etiqueta con banda negra)

Componente del kit

Bolsa cerrada

Temperatura

2 – 25 °C

Estabilidad

Fecha de caducidad 1

Bolsa abierta

Temperatura

2 – 8 ºC

2

Estabilidad

1 mes

1

Una vez abierto el cierre original de la bolsa, eliminar el exceso de aire, cerrar cuidadosamente la bolsa con el cierre rápido después de cada uso y conservar a temperatura adecuada. 2 Siempre que la bolsa se cierre debidamente con el cierre rápido después de cada uso.

Temperatura Estabilidad Temperatura

Mezcla maestra (Master Mix, etiqueta con banda blanca) y ADN de control (Control DNA, etiqueta con banda roja) 15 – 25 °C 2 horas 2 – 8 °C2

Estabilidad

3 horas

Temperatura

2 – 8 °C4

Estabilidad

26 horas

Temperatura

2 – 8 °C2 Pasos del procedimiento 5 – 10: 30 minutos Pasos del procedimiento 11 – 15: 30 minutos

Componentes del kit fuera de su bolsa protectora Tubos que contienen reactivos no reconstituidos

Tubos que contienen reactivos reconstituidos1

Nueva mezcla maestra reconstituida en el envase original (tubo nuevo lleno con 8 reacciones completas) Mezcla maestra reconstituida en el envase original (tubo parcialmente usado con ≥ 3 reacciones restantes)3 Tubo de SmartCycler®

Estabilidad

1

Desechar los tubos no utilizados después de la fecha de caducidad de la estabilidad indicada. 2 Tiene que conservarse sobre hielo o sobre un bloque de enfriamiento, en un entorno que no supere los 25 °C. 3 Véase la sección “Modo de empleo” para obtener directrices sobre la realización de pruebas con tubos de mezcla maestra parcialmente usados. 4 Tiene que conservarse refrigerado para mantener la temperatura entre 2 – 8 °C.

Materiales necesarios no suministrados •

Kit de lisis BD GeneOhm™ MRSA ACP (Nº de catálogo de BD 441638).

•

Vórtex Genie 2 (Nº de catálogo de VWR 58815 – 234) con soporte para microtubos de 1,5 mL o equivalente; para procesar múltiples muestras se puede usar un adaptador diseñado para múltiples tubos (Nº de catálogo de VWR 58816 – 146).

•

Micropipetas calibradas (intervalo de precisión de 1 – 10 µL, 10 – 100 µL y 100 – 1000 µL).

•

Puntas de micropipeta estériles libres de ADNasa y bloqueadas con filtro, o de desplazamiento positivo [1 – 10 µL (46 mm), 10 – 100 µL y

•

® Hielo o bloque de enfriamiento para tubos de 1,5 mL y para tubos de SmartCycler .

•

Microcentrífuga para tubos de SmartCycler®.

•

Starter kit SmartCycler® II con software Dx (bloque de procesamiento/refrigeración, manual del usuario, kit de accesorios y ordenador).

•

Herramienta para quitar tapones (p. ej. Nº de catálogo de MATRIX 4469) (opcional).

•

Guantes desechables, sin talco.

•

Cronómetro o temporizador.

100 – 1000 µL].

•

CD con el programa para la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP (contactar con el Servicio de Atención al Cliente de BD para obtener asistencia para la instalación).

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BD GeneOhm™ MRSA ACP

Modo de empleo Preparación Consultar la ficha técnica del kit de lisis BD GeneOhm™ MRSA ACP para obtener instrucciones sobre la preparación del reactivo de lisis, recogida de muestras, preparación de las muestras, lisis de las muestras y cultivo de muestras clínicas. Hay que incluir dos (2) controles de PCR (uno [1] positivo y uno [1] negativo) en cada serie de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP. Consultar la ficha técnica del kit de lisis BD GeneOhm™ MRSA ACP para obtener instrucciones sobre la preparación de controles de PCR.

Prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP Nota:

con un (1) tubo de mezcla maestra reconstituida (Master Mix, etiqueta blanca) se pueden realizar hasta ocho (8) reacciones. Se necesita un (1) tubo de SmartCycler® para cada muestra. Se necesitan dos (2) tubos adicionales de SmartCycler® para los controles de PCR. Retirar el número necesario de tubos de su bolsa protectora, extraer el exceso de aire y cerrar la bolsa inmediatamente con el cierre rápido. Comprobar que la bolsa protectora quede herméticamente cerrada. El número máximo de ® ® ® tubos de SmartCycler por serie se basa en el número de módulos de I–CORE disponibles en el (los) instrumento(s) SmartCycler II.

1.

Colocar el número necesario de tubos de mezcla maestra sobre hielo o en un bloque de enfriamiento específico para tubos de 1,5 mL.

2.

Añadir 225 µL de diluyente (etiqueta con banda negra) en cada tubo de mezcla maestra. Insertar la punta de la micropipeta a través del tapón con septum del tubo de mezcla maestra. No insertar la punta a demasiada profundidad en el tapón. Dispensar el diluyente en el tubo. Desechar el diluyente restante no utilizado.

3.

Agitar el (los) tubo(s) en vórtex durante 5 – 10 segundos. Hasta el momento de su utilización, colocar el tubo de mezcla maestra reconstituida sobre hielo o en un bloque de enfriamiento diseñado para tubos de 1,5 mL.

NOTAS: cuando el tubo de mezcla maestra está lleno (contiene 8 reacciones completas), la mezcla maestra reconstituida (en su envase original) puede conservase sobre hielo o en un bloque de enfriamiento durante un máximo de 3 h. Véase la sección “Conservación, manejo y estabilidad” para conocer las condiciones de conservación de los tubos llenos de mezcla maestra reconstituida. La mezcla maestra reconstituida (en su envase original) puede conservarse refrigerada a 2 – 8 ˚C durante un máximo de 26 h, cuando queden ≥ 3 reacciones en el tubo de mezcla maestra. Véase la sección “Conservación, manejo y estabilidad” para conocer las condiciones de conservación de los tubos parcialmente llenos de mezcla maestra reconstituida.

4.

Colocar el número necesario de tubos de SmartCycler® en el bloque de enfriamiento SmartCycler®. Rotular cada tubo de SmartCycler® con la identificación correspondiente. Evitar tocar las ventanas de detección óptica que hay en los bordes inferiores del tubo y la zona inferior en forma de rombo.

Los siguientes pasos (5 a 10) DEBEN realizarse EN EL PLAZO DE 30 MINUTOS NOTA: para garantizar la oportuna conclusión de los pasos 5 – 10, se recomienda centrifugar los tubos SmartCycler® en grupos de 8 una vez añadidas las muestras. Para preparar un análisis utilizando mezcla maestra de un tubo parcialmente usado, hay que seguir las siguientes directrices. 1. Si el tubo de mezcla maestra parcialmente usado contiene reactivo suficiente para una serie completa [incluyendo controles y muestra(s)]. – Utilizar el reactivo que queda en el tubo de mezcla maestra parcialmente usado para los controles y para la(s) muestra(s). 2. Si el tubo de mezcla maestra parcialmente usado no contiene reactivo suficiente para una serie completa [incluyendo controles y muestra(s)]. – Utilizar el reactivo de un tubo nuevo (lleno) de mezcla maestra reconstituida para los controles positivo y negativo; utilizar el reactivo que queda en el tubo nuevo, junto con el reactivo que queda en el anterior tubo de mezcla maestra parcialmente usado, para las muestras. 5.

Añadir 25 µL de mezcla maestra reconstituida a cada tubo de SmartCycler®. Retirar con cuidado el tapón con septum antes de pipetear el reactivo. Dispensar reactivo de la mezcla maestra reconstituida en el depósito ® (parte superior) de cada tubo de SmartCycler . Si quedara reactivo al menos para 3 reacciones, conservar el tubo de mezcla maestra para su uso en análisis posteriores. Después de pipetear, volver a cerrar el tubo de mezcla maestra con el tapón con septum original. En caso de utilizar el resto de mezcla maestra reconstituida, centrifugar brevemente el tubo (spin) antes de retirar el tapón con septum.

NOTA: si se ha utilizado un tapón con septum para cerrar los tubos de lisis, se necesitarán puntas de pipeta de 46 mm para los pasos 6 a 8. 6.

®

Añadir 3 µL de la muestra lisada a cada tubo de SmartCycler correspondiente (previamente rotulado) que contiene el reactivo de la ® mezcla maestra. Cerrar bien el tubo SmartCycler después de la adición de cada lisado de la muestra. Tras la adición de la muestra, aspirar con cuidado la punta de la pipeta 2 – 3 veces dentro del depósito del tubo SmartCycler® para garantizar que se dispensa completamente el volumen de muestra. Utilizar una punta nueva para cada muestra.

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BD Diagnostics 7. 8.

BD GeneOhm™ MRSA ACP ®

®

Añadir 3 µL de control positivo al tubo de SmartCycler correspondiente (previamente rotulado). Cerrar bien el tubo de SmartCycler . ®

® Añadir 3 µL de control negativo al tubo de SmartCycler correspondiente (previamente rotulado). Cerrar bien el tubo de SmartCycler .

9.

Por si fuera necesario realizar más pruebas, guardar a -20 ºC los tubos de lisis, que contienen la parte no utilizada de los lisados.

10.

Centrifugar todos los tubos de reacción durante 5 – 10 segundos. Utilizar una microcentrífuga compatible con los tubos de SmartCycler®.

Los siguientes pasos (11 a 15) DEBEN realizarse EN EL PLAZO DE 30 MINUTOS ®

11.

Mantener los tubos a 2 – 8 ºC en el bloque de enfriamiento SmartCycler antes de cargarlos en el instrumento.

12.

Crear una serie usando el protocolo “BD GeneOhm MRSA ACP”. Introducir el número de muestras a analizar. Consultar el manual de usuario del software SmartCycler® Dx si fuera necesario.

13.

Insertar cada tubo de reacción en un módulo I–CORE® del intrumento SmartCycler® y cerrar la tapa del I–CORE®. Colocar los controles positivo y negativo de la prueba en sus posiciones correspondientes asignadas por el software SmartCycler® Dx.

14.

Presionar la parte superior de cada tubo para garantizar que los tubos estén colocados firmemente en su sitio.

15.

Iniciar la serie. Introducir la identificación de cada muestra manualmente o por medio de un lector de códigos de barras.

Procedimiento de repetición de la prueba cuando falla el control de PCR y cuando falla el control de procesamiento de la muestra (CPM, cuando se realizan CPM) Nota:

1.

para repetir las pruebas se pueden utilizar los tubos originales de tampón de muestras (que contienen muestras y controles eluídos) y que se han conservado a 2 – 8 °C durante un máximo de 72 horas (consultar la sección “Conservación, manejo y estabilidad” de la ficha técnica del kit de lisis BD GeneOhm™ MRSA ACP). Colocar todos los tubos (muestra y controles) que se vayan a utilizar en la repetición sobre un bloque de enfriamiento a 2 – 8 °C. Si se han preparado CPM junto que requieren la repetición de la prueba, colocar los tubos de tampón de muestras del CPM en el bloque de enfriamiento a 2 – 8 °C.

2.

Seguir los pasos 4 a 10 de la sección “Lisis de las muestras” de la ficha técnica del kit de lisis BD GeneOhm™ MRSA ACP.

3.

Seguir los pasos 1 a 15 de la sección “Prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP” descritos arriba.

Procedimiento de repetición de la prueba para resultados no resueltos o indeterminados Nota:

se deben repetir las muestras y los controles utilizando los tubos de lisado congelados y conservados durante un máximo de 8 días a -20 °C.

Dentro de una serie que incluye nuevas muestras: 1.

Preparar las nuevas muestras y controles según las instrucciones descritas en la ficha técnica del kit de lisis BD GeneOhm™ MRSA ACP.

2.

Descongelar los lisados de las muestras que se van a analizar de nuevo.

3.

Colocar los lisados en un bloque de enfriamiento a 2 – 8 °C. Agitar en vórtex durante 5 – 10 segundos y centrifugar durante 5 – 10 segundos (spin) para garantizar que el líquido quede en el fondo de los tubos.

4.

Para los controles, muestras descongeladas y muestras nuevas, repetir los pasos 1 a 15 de la sección “Prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP” descritos arriba.

Dentro de una serie que solo incluye muestras repetidas (de una o más listas de trabajo): 1.

Descongelar los lisados de las muestras y de control que se van a analizar de nuevo.

2.

Colocar los lisados en un bloque de enfriamiento a 2 – 8 °C. Agitar en vórtex durante 5 – 10 segundos y centrifugar durante 5 – 10 segundos (giro rápido) para garantizar que el líquido quede en el fondo de los tubos.

3.

Repetir los pasos 1 a 15 de la sección “Prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP” descritos arriba.

Control de calidad Controles positivos y negativos de PCR Los procedimientos de control de calidad están diseñados para controlar el rendimiento de la prueba. El control positivo está destinado a controlar un fallo sustancial de los reactivos. El control negativo se utiliza para detectar la contaminación (o el arrastre) por ADN o por amplicones de SARM de los reactivos o del entorno. Los controles positivo y negativo son controles del análisis (controles de la serie). Por último, se incorpora un control interno (CI) en cada mezcla de reacción para controlar la integridad del reactivo y la inhibición de la PCR en cada muestra. Hay que incluir un (1) control positivo y uno (1) negativo en cada serie de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP. Estos controles han de incubarse e inactivarse con el reactivo de lisis como se describe en la ficha técnica del kit de lisis BD GeneOhm™ MRSA ACP. El software de PCR asigna

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automáticamente la posición de los controles en el instrumento (véase el manual del operador del software SmartCycler Dx). Todos los controles positivos y negativos deben producir resultados válidos. Con las muestras negativas para ADN de SARM, los controles internos deben producir resultados válidos (consultar la sección “Interpretación de los resultados”).

Controles de procesamiento de muestras (CPM) Se recomienda utilizar controles de procesamiento de muestras (CPM) para ofrecer garantías de que no se produce una contaminación cruzada significativa y para controlar fallos sustanciales de los reactivos o de la metodología durante el procedimiento de la prueba. En conformidad con las directrices o requisitos de la normativa local, estatal o federal, o de las organizaciones de acreditación, se deben analizar cepas de control adicionales como CPM. Se puede utilizar como CPM positivo una cepa de SARM de referencia (p. ej., ATCC 43300) o un aislado clínico de SARM bien caracterizado; si se dispone de las cepas de SARM del tipo MREJ iii y vii, se pueden utilizar como CPM positivos adicionales, para controlar las sondas y cebadores de la prueba no directamente controlados en la misma. Como CPM negativo se puede utilizar una cepa de Staphylococcus aureus sensible a la meticilina (p. ej., ATCC 25923) o cualquier otro estafilococo no aureus (p. ej., Staphylococcus epidermidis ATCC 14990). Los CPM deben producir resultados válidos cuando se realizan. En el caso de que se produzca un resultado incorrecto del CPM, se recomienda analizar de nuevo las muestras que se hayan incluido en la misma serie analítica que los CPM, de conformidad con el procedimiento descrito en la sección “Procedimiento de repetición de la prueba cuando falla el control de PCR y cuando falla el control de procesamiento de la muestra (CPM, cuando se realizan CPM)” antes de validar los resultados. 3 4 Para obtener una orientación general acerca del control de calidad, el usuario puede consultar los documentos del CLSI C24 y MM3 .

Interpretación de los resultados ®

El algoritmo de toma de decisiones de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP está integrado en el software SmartCycler . La interpretación de los resultados de la prueba se realiza según los siguientes criterios: Resultado del análisis registrado

Resultado del CI registrado

Interpretación del resultado1

NEG (NEG)

PASS (PASA)

No se detecta ADN de SARM

POS (POS)

NA (no aplicable)

Se detecta ADN de SARM

Unresolved (No resuelto)

FAIL (FALLO)

Muestra no resuelta o inhibida, o fallo de los reactivos

ND (no determinado)

ND (no determinado)

No determinado debido a un fallo del módulo I–CORE® 2 (con códigos de advertencia o error )

CI: control interno; NA: no aplicable; ND: no determinado. Los resultados de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP pueden utilizarse para guiar el aislamiento y el nivel de precauciones de conformidad con los programas y prácticas institucionales. 2 Consultar el manual del operador del software SmartCycler® Dx para conocer la interpretación de los códigos de advertencia y error. 1

Consultar el manual del operador del software SmartCycler® Dx para la impresión de los resultados.

Serie inválida Un control de PCR positivo o negativo no válido invalida la serie analítica. En estos casos, los resultados analíticos obtenidos para esa serie se consideran no válidos y no se deben informar. En los informes se registran las series analíticas no válidas o los códigos de error o advertencia del instrumento. Antes de informar resultados de SARM, verificar siempre que la serie analítica es válida. Consultar la sección “Procedimiento de repetición de la prueba cuando falla el control de PCR y cuando falla el control de procesamiento de la muestra (CPM, cuando se realizan CPM)”.

Muestra no resuelta Repetir la prueba con los correspondientes lisados congelados de la(s) muestra(s) y de los controles. El ciclo de congelación-descongelación ha demostrado reducir las sustancias inhibidoras de la PCR en el lisado de la muestra. Consultar la sección “Procedimiento de repetición de la prueba para resultados no resueltos o indeterminados”.

Muestra indeterminada por fallo del módulo I–CORE

®

Repetir la prueba con los correspondientes lisados congelados de la(s) muestra(s) y de los controles. Consultar la sección “Procedimiento de repetición de la prueba para resultados no resueltos o indeterminados”. Para la interpretación de los mensajes de códigos de advertencia o error, consultar el manual del operador del software SmartCycler® Dx.

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BD GeneOhm™ MRSA ACP

Limitaciones del procedimiento •

Este producto debe utilizarse únicamente con muestras obtenidas mediante torundas nasales y lisadas con el kit de lisis BD GeneOhm™

•

Este producto debe utilizarse solamente con el instrumento SmartCycler II.

•

Se pueden producir resultados analíticos negativos por una recogida, manipulación o conservación de las muestras incorrectas, error técnico,

MRSA ACP. ®

confusión de muestras o porque el número de organismos de la muestra es inferior a la sensibilidad analítica de la prueba. Es necesario el cumplimiento estricto de las instrucciones de la ficha técnica y del (de los) manual(es) del operador para evitar resultados erróneos. •

Es esencial una buena técnica de laboratorio para la debida ejecución de esta prueba. A causa de la elevada sensibilidad analítica de esta prueba, hay que tener sumo cuidado para conservar la pureza de todos los reactivos, especialmente en los casos en que se extraen múltiples alícuotas de un tubo.

•

El cribado determina el estado de colonización en un momento determinado, que puede variar en función del tratamiento del paciente (p. ej., en régimen de descolonización), el estado del paciente (p. ej., no diseminando activamente SARM) o la exposición a entornos de alto riesgo (p. ej., contacto con un portador de SARM, hospitalización prolongada). El estado de colonización debe controlarse de acuerdo con las normas de la institución.

•

Los resultados de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP deben utilizarse como complemento de las medidas de control de las infecciones hospitalarias para identificar a los pacientes que necesitan mayores precauciones. La prueba no está indicada para identificar a pacientes con infección estafilocócica. Los resultados no debe utilizarse para guiar o controlar el tratamiento de las infecciones por SARM.

•

Un resultado positivo de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP no indica necesariamente un fracaso del tratamiento de erradicación ya que la presencia de ADN puede persistir. Un resultado negativo después de un resultado positivo anterior puede indicar el éxito del tratamiento de erradicación o puede deberse a una diseminación intermitente.

•

Un resultado positivo de la prueba no indica necesariamente la presencia de organismos viables. No obstante, el resultado positivo es indicativo de la presencia de ADN de SARM, ya que la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP detecta simultáneamente el casete SCCmec (portador del gen mecA) y una secuencia específica de S. aureus localizada en el gen orfX. Se han descrito en la literatura médica veinte (20) genotipos MREJ (los genotipos MREJ i a

•

XX)

basados en análisis de secuencias de la

confluencia SCCmec/orfX de diferentes aislados clínicos de SARM. El genotipo MREJ no está correlacionado con el tipo de SCCmec, esto es, puede haber diferentes genotipos MREJ asociados con cada uno de los ocho (8) tipos de SCCmec conocidos. La prueba BD GeneOhmTM MRSA ACP está diseñada para detectar solamente los genotipos MREJ i, ii, iii, iv, v y vii; estos seis (6) genotipos MREJ suponen más del 98% de las cepas analizadas por BD Diagnostics en todo el mundo hasta la fecha. La prueba BD GeneOhmTM MRSA ACP puede no detectar otros genotipos MREJ, dando lugar a resultados falsos negativos. •

La prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP no detecta directamente el gen mecA ni la proteína de unión a la penicilina (PBP 2a) codificada por

•

La prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP puede presentar reactividad cruzada con ciertas cepas de Staphylococcus aureus sensible a la

este gen. Se puede producir un resultado falso positivo para SARM si está presente una variante de S. aureus “de casete vacío”. meticilina (SASM) cuando están presentes a concentraciones extremadamente elevadas. La prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP generó 5 resultados falsos positivos durante un estudio de especificidad analítica que analizó un total de 111 cepas de SASM bien caracterizadas, con unas 3 x 105 copias del genoma/reacción de PCR (~ 7 x 107 UFC/torunda). Una cantidad excesiva de sangre en la muestra puede inhibir la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP. Rhinaris® y Secaris® a concentraciones

•

elevadas pueden provocar una ligera inhibición de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP (consultar la sección “Sustancias interferentes” para obtener más datos). •

Como en todas las pruebas diagnósticas in vitro basadas en PCR, se pueden detectar niveles extremadamente bajos de la diana por debajo del LdD, pero los resultados pueden no ser reproducibles (consultar la sección “Reproducibilidad” para obtener más datos).

•

Se pueden producir resultados falsos negativos debido a la pérdida de ácido nucleico por una recogida, transporte o conservación de las muestras inadecuadas, o por una lisis inadecuada de las células bacterianas. Para facilitar la identificación de muestras que contienen inhibidores de la amplificación por PCR se ha añadido un control interno a la prueba. El control interno no indica si se ha perdido ácido nucleico por una recogida, transporte o conservación de las muestras inadecuadas, ni si las células bacterianas han sido lisadas adecuadamente.

•

Los resultados de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP pueden a veces quedar no resueltos o no válidos debido a un control no válido, lo que requiere un nuevo análisis que puede ocasionar un retraso en la obtención de resultados finales.

•

Las mutaciones o los polimorfismos en las regiones de unión de los cebadores o de las sondas pueden afectar a la detección de variantes nuevas o desconocidas de SARM, provocando un resultado falso negativo con la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP.

•

La preparación de la mezcla maestra y de los controles positivos y negativos ha de realizarse en un ambiente que no sobrepase los 25 °C.

•

Como en todas las pruebas diagnósticas in vitro, los valores pronósticos positivos y negativos son muy dependientes de la prevalencia. El rendimiento de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP puede variar en función de la prevalencia y de la población analizada.

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Valores esperados En el estudio clínico de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP se analizaron un total de 1228 muestras procedentes de tres centros clínicos de diferentes áreas geográficas de EE. UU. La población en estudio fue agrupada por pacientes en cuidados intensivos, en institución de asistencia a largo plazo y en servicios médicos. En la tabla siguiente se muestran el número y el porcentaje calculado de casos positivos y negativos determinados por el método de referencia de cultivo comparativo. SARM por cultivo En grupo

Total N

Número positivo

Número negativo

Prevalencia observada

Cuidados intensivos

137

10

127

7,3%

Institución de asistencia a largo plazo

263

58

205

22,1%

Servicios médicos1

828

121

707

14,6%

Total

1228

189

1039

15,4%

1

La categoría de servicios médicos comprende muestras identificadas como médicas, obstétricas/ginecológicas, pediátricas, quirúrgicas y otras.

Características de rendimiento Rendimiento clínico El rendimiento clínico de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP se determinó en un estudio de investigación prospectivo multicéntrico. En dicho estudio participaron tres (3) centros de investigación. Para ser incluidos en el estudio, los pacientes tenían que ser idóneos para la prueba de SARM según las normas institucionales. Los requisitos de elegibilidad para el cribado dirigido, según las normas del centro clínico, comprendían, pero sin estar limitados, a los siguientes: todos los pacientes ingresados en un determinado sistema sanitario, pacientes ingresados en la unidad de cuidados intensivos, pacientes transferidos a la unidad de cuidados intensivos, pacientes antes de una intervención quirúrgica programada y pacientes ingresados procedentes de instituciones de asistencia a largo plazo. No se permitió la inclusión de pacientes previamente incluidos en el estudio. El método comparativo de referencia consistió en un análisis inicial en medio cromogénico selectivo, seguido de un subcultivo en agar sangre (AS) de las supuestas colonias de S. aureus. La identificación se confirmó mediante una prueba de aglutinación, mientras que la resistencia a la meticilina se confirmó mediante pruebas de sensibilidad por difusión con disco de cefoxitina. En el caso de no confirmarse la presencia de S. aureus resistente a la meticilina por el método inicial, se realizó un enriquecimiento en caldo de triptona y soja (TSB). El TSB se utilizó para inocular medio cromogénico y placas de AS adicionales, y la confirmación del SARM se realizó según el procedimiento descrito arriba. Un total de 1228 muestras obtenidas mediante torundas nasales se analizaron con el método de referencia comparativo y con la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP. Se obtuvieron 1216 resultados registrables (Tabla 1); doce (12) muestras obtenidas mediante torundas nasales fueron excluidas del análisis de rendimiento por incumplimiento de la estrategia de control del protocolo del estudio clínico. En comparación con el método de referencia, la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP identificó el 92,0% de las muestras positivas para SARM y el 94,6% de las muestras negativas (Tabla 2). Dentro de la población analizada, estos resultados ofrecían un valor pronóstico negativo (VPN) del 98,5% y a un valor pronóstico positivo (VPP) del 75,4%. De las 1216 muestras obtenidas mediante torundas nasales analizadas con la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP, 12 (1,0%) se registraron inicialmente como no resueltas (Tabla 3). Tras repetir el análisis con los lisados congelados, las 12 obtuvieron resultados registrables. Tres (3) series se registraron como inválidas debido a un fallo del control de la serie (4,4%, Tabla 4). Estas series se registraron como válidas tras repetir el análisis con los lisados de las muestras. Tabla 1: Resultados obtenidos con la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP en comparación con el método de referencia. Método de referencia comparativo + Prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP

–

+

172

56

228

–

15

973

988

187

1029

1216

Tabla 2: Rendimiento obtenido con la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP en comparación con el método de referencia. Centros clínicos

Prevalencia 11,6% (67/579)

Sensibilidad con un IC* del 95%

Especificidad con un IC* del 95%

Centro 1

94,0% (85,4%, 98,3%)

96,7% (94,7%, 98,1%)

Centro 2

17,5% (56/320)

88,9% (77,4%, 95,8%)

89,8% (85,4%, 93,2%)

Centro 3

20,1% (66/329)

92,4% (83,2%, 97,5%)

95,1% (91,7%, 97,3%)

General

15,4% (189/1228)

92,0% (87,1%, 95,4%)

94,6% (93%, 95,9%)

* IC: Intervalo de confianza.

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Tabla 3: Tasas de muestras no resueltas. Tasa inicial de no resueltas con un Centros clínicos IC* del 95% Centro 1 1,0% (6/579) (0,4% – 2,2%)

Tasa de no resueltas tras la repetición con un IC* del 95% 0,0% (0/579) (0,0% – 0,6%)

Centro 2

0,3% (1/308)

(0,0% – 1,8%)

0,0% (0/308)

(0,0% – 1,2%)

Centro 3

1,5% (5/329)

(0,5% – 3,5%)

0,0% (0/329)

(0,0% – 1,1%)

General

1,0% (12/1216)

(0,5% – 1,7%)

0,0% (0/1216)

(0,0% – 0,3%)

* IC: Intervalo de confianza.

Tabla 4: Tasas generales de series no válidas. Tasas de series inválidas Centro con un IC* del 95% Centro 1 0,0% (0/25) (0,0% – 13,7%) Centro 2

4,5% (1/22)

(0,1% – 22,8%)

Centro 3

9,5% (2/21)

(1,2% – 30,4%)

General

4,4% (3/68)

(0,9% – 12,4%)

* IC: Intervalo de confianza.

Sensibilidad analítica Determinación del límite de detección (LdD) utilizando ADN genómico La sensibilidad analítica (límites de detección o LdD) de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP se determinó utilizando cantidades decrecientes de ADN genómico cuantificado (copias/reacción de PCR) de cultivos de 6 cepas de SARM que representan 6 genotipos MREJ (i, ii, iii, iv, v y vii) y 4 tipos de SCCmec (I, II, III, IV). Cada cepa de SARM se analizó por 2 técnicos diferentes en 48 duplicados por concentración, utilizando 3 lotes distintos de mezclas maestras liofilizadas de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP. La sensibilidad analítica (LdD), definida como la concentración más baja a la que ≥ 95% de todos los duplicados dieron un resultado positivo, varió entre 2,5 y 5 copias/reacción de PCR, con un valor medio de 5 copias de ADN/reacción de PCR. cepa de SARM 1 2 3 4 5 6

Genotipo MREJ tipo i tipo ii tipo iii tipo iv tipo v tipo vii

Tipo de SCCmec I II III III IV II

Concentración del LdD 5 copias/reacción de RCP 5 copias/reacción de RCP 5 copias/reacción de RCP 5 copias/reacción de RCP 2,5 copias/reacción de RCP 5 copias/reacción de RCP

Determinación del límite de detección (LdD) utilizando bacterias viables con una matriz nasal clínica Se determinó la sensibilidad analítica (límites de detección o LdD) de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP mediante el análisis de cepas viables de SARM con matriz nasal clínica, utilizando torundas positivas simuladas que se prepararon empapándolas en una amplia gama de suspensiones bacterianas de SARM preparadas y cuantificadas a partir de cultivos de 6 cepas de SARM, que representan 6 genotipos MREJ (i, ii, iii, iv, v y vii) y 4 tipos de SCCmec (I, II, III, IV), y después descargadas/eluídas en una matriz nasal clínica negativa. Cada cepa de SARM fue analizada por 2 técnicos diferentes en 24 duplicados por concentración, utilizando 3 lotes distintos de mezclas maestras liofilizadas de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP. La sensibilidad analítica (LdD), definida como la concentración más baja a la que ≥ 95% de todos los duplicados dieron un resultado positivo, varió entre 130 y 576 UFC/torunda, con un valor medio de 300 UFC/torunda. cepa de SARM 1 2 3 4 5 6

Genotipo MREJ tipo i tipo ii tipo iii tipo iv tipo v tipo vii

Tipo de SCCmec I II III III IV II

Concentración del LdD 207 UFC/torunda 576 UFC/torunda 256 UFC/torunda 245 UFC/torunda 130 UFC/torunda 386 UFC/torunda

Inclusión analítica En el estudio de inclusión analítica se evaluó la ubicuidad analítica de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP. En el estudio se incluyeron diversas cepas de Staphylococcus aureus teniendo en cuenta su origen geográfico, genotipo MREJ, tipo de SCCmec, tipo de electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE, de sus siglas en inglés), diversidad temporal y patrón de sensibilidad. En este estudio de inclusión analítica se analizaron ciento cuarenta (140) cepas provenientes de 31 países, 52 de colecciones públicas y 88 de aislados clínicos bien caracterizados, entre ellas cepas de Staphylococcus aureus resistente a la vancomicina (SARV) y de Staphylococcus aureus intermedio para la vancomicina (SAIV). Cuando se analizó a la carga clínica relevante (unas 100 copias del genoma/µL), se detectaron el 99% de todas las cepas. La prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP detectó todos los tipos naturales de MREJ i, ii, iii, iv, v y vii analizados, así como los tipos mutantes de MREJ ii mut16, ii mut25 y iii mut25. La prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP detectó SARM de los tipos de SCCmec I, II, III, IV, V y VI, así como SARM de los tipos de PFGE USA 100 a 800, 1000 y 1100. También se detectaron todas las cepas de Staphylococcus aureus que mostraban resistencia adicional a la vancomicina (SARV y SAIV). Cuando se analizaron las mismas cepas por triplicado a concentraciones < 3 X LdD, el 83% se detectaron en los tres duplicados y el 99% se detectaron al menos en uno de los tres duplicados.

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Evaluación con un grupo de cepas de referencia bien caracterizadas Se llevó a cabo un estudio analítico adicional para evaluar el rendimiento analítico de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP con un grupo de cepas de referencia bien caracterizadas que contenía cepas de SARM con concentraciones mínimas inhibidoras (CMI) de oxacilina elevadas y bajas, entre ellas los tipos PFGE USA 100, 300 y 400 (resaltando el USA 300), BORSA (cepas de S. aureus con resistencia dudosa a la oxacilina, que son negativas para mecA, pero presentan resistencia a la oxacilina por un mecanismo que no se conoce bien), S. aureus sensible a la meticilina (SASM) y cepas de Staphylococcus epidermidis resistente a la meticilina (SERM). El grupo de cepas de referencia utilizado en este estudio constaba de 15 cepas de SARM, 4 de BORSA, 1 de SERM y 5 de SASM. Todas las cepas de SARM analizadas pertenecían al tipo MREJ ii, con la excepción de una cepa de SARM que pertenecía al tipo MREJ iii. Se ha demostrado anteriormente que estas cepas presentan una amplia gama de CMI para oxacilina y cefoxitina. Para la determinación de los valores de CMI, todas estas cepas fueron analizadas mediante pruebas de sensibilidad por dilución en caldo según FDA. Todas las cepas de SARM analizadas (incluidos los tipos de PFGE USA 100, 300 y 400) dieron resultados positivos cuando se analizaron a una concentración de 2 – 3 X LdD. Todas las cepas de BORSA, SASM y SERM analizadas dieron resultados negativos cuando se analizaron a concentraciones elevadas.

Especificidad analítica Cuarenta y una (41) de las 42 cepas de diversas especies no estafilocócicas analizadas a una concentración correspondiente a ~ 3 x 105 copias/reacción de PCR (~ 7 x 107 UFC/torunda) dieron resultados negativos con la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP. Una (1) cepa fue registrada como positiva por la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP. Su investigación demostró que el resultado positivo obtenido se debía a contaminación por SARM. Diecinueve (19) cepas de estafilococos coagulasa negativos y sensibles a la meticilina (SCNSM), 15 cepas de estafilococos coagulasa negativos y resistentes a la meticilina (SCNRM) y 2 cepas de estafilococos coagulasa negativos (SCN) analizadas con la prueba BD GeneOhmTM MRSA ACP dieron resultados negativos. La especificidad con estafilococos coagulasa negativos fue del 100%. De las 111 cepas de SASM ensayadas a concentraciones extremadamente elevadas, ~ 3 x 105 copias/reacción de RCP (~ 7 x 107 UFC/torunda), 106 dieron resultados negativos con la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP; las 5 cepas restantes de SASM dieron resultados negativos a ~ 3 x 104 copias/reacción de PCR (~ 7 x 106 UFC/torunda). Por tanto, la especificidad de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP con SASM fue del 100% (111/111) a ~ 3 x 104 copias/reacción de PCR (~ 7 x 106 UFC/torunda) y del 95,5% (106/111) a ~ 3 x 105 copias/reacción de PCR (~ 7 x 107 UFC/torunda).

Sustancias interferentes Para determinar su posible interferencia con la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP, se evaluaron dieciocho (18) sustancias utilizadas en cultivos bacterianos y en medios de transporte, así como sustancias biológicas y químicas utilizadas ocasionalmente en las fosas nasales o encontradas en muestras obtenidas mediante torundas nasales. Se analizaron muestras positivas para SARM a 3 x el límite de detección (LdD) y a la concentración clínica habitual (valores de Ct en el canal de FAM entre 30,0 y 35,0), junto con la máxima cantidad de cada compuesto que de forma probable se puede encontrar en el punto de toma de muestras o en las muestras de torundas nasales. Los resultados no mostraron interferencia destacable con ninguna sustancia, salvo en el caso de sangre cuando estaba presente en exceso. Rhinaris® y Secaris® a concentraciones elevadas mostraron una ligera inhibición de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP, pero en cualquier caso se obtuvieron los resultados esperados de la prueba. Sustancias endógenas y exógenas comerciales analizadas con la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP Sustancia Resultado Sustancia Resultado Dristan® NI Placa de agar sal manitol NI ® Drixoral NI CHROMagar NI ® Flonase NI Líquido de Amies NI Nasonex® NI Líquido de Stuart NI Otrivin® NI Gel de Amies NI Vaselina NI Sangre I Rhinaris® NI* Secreción nasal NI ® ® Secaris NI* Colirio de cromoglicato NI Caldo de triptona y soja NI Solución salina NI NI: no hubo interferencia destacable con la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP. I: interferencia detectable con la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP solo si la sustancia está presente en exceso. *Rhinaris® y Secaris® a concentraciones elevadas mostraron una ligera inhibición de la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP, pero en cualquier caso se obtuvieron los resultados esperados de la prueba.

Reproducibilidad El panel de reproducibilidad consistió en 4 categorías de muestras próximas al LdD. Cada tubo contenía flora nasal simulada (Staphylococcus epidermidis, ATCC 14990). Se analizaron dos cepas de SARM en cada una de las 4 categorías, como sigue: • • • •

Positiva moderada (PM): 2 – 5 X LdD. Positiva baja (PB): 1 – 2 X LdD. Negativa alta 1:10 (NA1:10): dilución 10 veces de 1 X LdD. Negativa alta 1:100 (NA1:100): dilución 100 veces de 1 X LdD.

Una quinta categoría constaba de muestras negativas (Neg, flora nasal simulada sin SARM). Se analizaron por triplicado muestras de cada categoría, en 5 días diferentes, analizándose 2 paneles cada día por 2 técnicos, en 3 centros clínicos utilizando 1 lote de reactivos (reproducibilidad entre centros). Uno (1) de estos centros clínicos participó en un estudio ampliado en el que se analizaron 2 lotes adicionales de reactivos (reproducibilidad entre lotes). Se muestran los resultados para cada categoría de muestras, con los datos agrupados de ambas cepas de SARM. Para la reproducibilidad entre centros, la concordancia porcentual general fue del 100% para las categorías PM y Neg, 95,0% para PB, y concordancia negativa del 88,3% y del 47,2% para las categorías NA1:100 y NA1:10, respectivamente (Tabla 5).

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Para la reproducibilidad entre lotes, la concordancia porcentual general fue del 100% para las categorías PM y Neg, 98,3% para PB, y concordancia negativa del 91,7% y del 41,7% para las categorías NA1:100 y NA1:10, respectivamente (Tabla 6). El umbral de ciclo (Ct), un criterio interno utilizado para determinar el resultado final de la prueba, se utilizó como medio adicional para evaluar la reproducibilidad de la prueba. En las Tablas 5 y 6 se presentan los valores medios generales del Ct con sus componentes de varianza (DE y %CV). Tabla 5: Resultados del estudio de reproducibilidad entre centros utilizando un lote. CENTRO Categoría

Neg

3

Centro 3

Concordancia porcentual

Concordancia porcentual

Concordancia porcentual

Concordancia porcentual general

Valores del Ct1 Media general

DE

% CV

30/30

100%

30/30

100%

30/30

100%

90/90

100%

34,9

0,3

0,9

49/60

81,7%

58/60

96,7%

52/60

86,7%

159/180

88,3%

40,8

1,6

3,8

2

26/60

43,3%

27/60

45,0%

32/60

53,3%

85/180

47,2%

39,8

1,5

3,8

3

NA1:10

2

Centro 2

NA1:100

2

1

Centro 1

PB

59/60

98,3%

60/60

100%

52/60

86,7%

171/180

95,0%

38,5

1,1

2,8

PM

60/60

100%

60/60

100%

60/60

100%

180/180

100%

36,8

1,0

2,6

Para la categoría Neg, los valores de Ct registrados son para el control interno. Para otras categorías, los valores de Ct registrados son para la diana de SARM. Para las categorías negativas altas, se consideró que el resultado esperado de la prueba era negativo. Por tanto, la concordancia porcentual se calculó para resultados negativos. Ocho (8) muestras PB inicialmente registradas como negativas dieron positivo tras repetir el análisis con los lisados congelados.

Tabla 6: Resultados del estudio de reproducibilidad entre lotes utilizando tres lotes. LOTE Categoría

Neg

Lote 1

Lote 2

Lote 3

Concordancia porcentual

Concordancia porcentual

Concordancia porcentual

30/30

100%

30/30

100%

NA1:1002

58/60

96,7%

54/60

90,0%

NA1:102

27/60

45,0%

28/60

46,7%

30/30

Concordancia porcentual general 100%

Valores del Ct1 Media general

DE

% CV

34,8

0,4

1,2

100%

90/90

53/60

88,3%

165/180

91,7%

39,9

1,1

2,7

20/60

33,3%

75/180

41,7%

39,6

1,0

2,5

PB

60/60

100%

58/60

96,7%

59/60

98,3%

177/180

98,3%

38,2

0,9

2,4

PM

60/60

100%

60/60

100%

60/60

100%

180/180

100%

36,5

0,9

2,5

1

Para la categoría Neg, los valores de Ct registrados son para el control interno. Para otras categorías, los valores de Ct registrados son para la diana de SARM. 2 Para las categorías negativas altas, se consideró que el resultado esperado de la prueba era negativo. Por tanto, la concordancia porcentual se calculó para resultados negativos.

Precisión Se evaluó en 1 centro la precisión dentro del laboratorio para la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP. El estudio se realizó con las mismas categorías de muestras y cálculos utilizados anteriormente. Las pruebas se llevaron a cabo por duplicado, por dos técnicos diferentes, a lo largo de 12 días y con 2 series por día. Todas las muestras y controles dieron resultados registrables, salvo 1 NA1:100 y 2 NA1:10 que dieron resultados no resueltos. La repetición de las pruebas con los lisados congelados arrojó resultados registrables. Los resultados del estudio de precisión para muestras Neg, PB y PM mostraron un 100% de concordancia. Los resultados del estudio de precisión para NA1:100 y NA1:10 mostraron una concordancia del 95,8% y del 41,7%, respectivamente.

Contaminación por arrastre Para evaluar el riesgo de arrastre en la prueba BD GeneOhm™ MRSA ACP durante el procesamiento de muestras con una carga bacteriana de SARM elevada, se llevó a cabo un estudio analítico para evaluar el proceso completo, desde la preparación de las muestras (incluyendo la utilización de tapones con septum y a rosca en los tubos de lisis) hasta el resultado de la PCR. Se utilizaron dos (2) cepas de SARM (tipo MREJ ii y vii) como grupo de SARM positivos altos (1,4 X 104 copias/reacción de PCP y 5,1 X 104 copias/reacción de RCP, respectivamente). Los negativos se prepararon con tampón de muestras. Se analizaron tres (3) duplicados de cada muestra del grupo positivo alto (un total de 6 positivos altos) y 6 duplicados del grupo negativo, alternando muestras negativas y positivas. Cada serie contenía controles positivos y negativos preparados según la ficha técnica. Todos los miembros del grupo y los controles se procesaron siguiendo la ficha ténica del kit de lisis BD GeneOhm™ MRSA ACP. El mismo experimento se realizó por 4 técnicos con cada uno de los dos tipos de tapones de los tubos de lisis (con septum y a rosca). Para evaluar la posible contaminación durante la conservación, el experimento se repitió 72 horas después utilizando los controles de la serie original del primer experimento. No se observó ningún resultado falso positivo debido a contaminación de arrastre en un total de 16 series (8 con tubos con tapón con septum y 8 con tubos con tapón a rosca, 4 técnicos). La conservación de los tubos de CP y CN a 4 °C durante 72 horas y su posterior uso en la repetición de las pruebas no dio lugar a series no válidas ni a contaminación por arrastre.

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Bibliografía 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

MMWR. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus skin or Soft Tissue Infection in a State Prison-Mississippi, 2000, Nota editorial. 26 de octubre de 2001. MMWR 50:919-922. Styers D et al., Laboratory-Based Surveillance of Current Antimicrobial Resistance Patterns and Trends among Staphylococcus aureus: 2005 Status in the United States. Ann Clin Microbiol Antimicrob 2006;5:2. Cosgrove SE et al. Comparison of Mortality Associated with Methicillin-resistant and Methicillin-susceptible Staphylococcus aureus Bacteremia: a Meta-analysis. Clin Infect Dis 2003;36:53-59. ® Software SmartCycler II DX, Manual del operador, D4198 Rev. D, Cepheid, Sunnyvale, CA, EE. UU. Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Richmond JY and McKinney RW (eds) (1993). HHS Publication number (CDC) 93-8395. Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue; Approved Guideline, Document M29 (Refer to the latest edition). Clinical and Laboratory Standards Institute. Statistical Quality Control for Quantitative Measurements: Principles and Definitions; Approved Guideline, Document C24 (Refer to the latest edition). Clinical and Laboratory Standards Institute. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline, Document MM3 (Refer to the latest edition).

Este kit se vende bajo licencia del Instituto de Investigación de Salud Pública (PHRI) de la Ciudad de Nueva York, Inc., y puede utilizarse bajo los derechos de patente del PHRI solamente para diagnóstico clínico humano in vitro. La adquisición de este producto permite al comprador utilizarlo para la amplificación y detección de secuencias de ácidos nucleicos para ofrecer diagnósticos humanos in vitro. Por la presente no se concede ninguna patente general ni ninguna otra licencia de ninguna clase más que este derecho específico de uso por la adquisición.

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Índice de símbolos SÍMBOLO

SIGNIFICADO

SÍMBOLO

SIGNIFICADO

Fabricante

Código del lote

Número de catálogo

Limites de temperatura

Uso diagnóstico in vitro

Protéjase de la luz y de la humedad

Representante europeo autorizado

Volver a cerrar las bolsas después de su uso

Fecha de caducidad

Consultar las instrucciones de uso

Contiene cantidad suficiente para “n” pruebas

Irrita los ojos y la piel R36/38

Caja 1 de 3

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