Pruebas básicas de Coagulación Departamento de Hemostasia y Trombosis. IIHEMA Academia Nacional de Medicina

Vía Intrínseca de la coagulación Bioq. Luis Bastos Dpto. Hemostasia y Trombosis IIHEMA Academia Nacional de Medicina

VIA INTRÍNSECA DE LA COAGULACION

PK

XII XIIa QAPM XI XIa Ca2+ IX

IXa VIIIa FL Ca2+

X Xa Va FL Ca2+

FT VIIa Ca2+

II

IIa

Fibrinógeno M. Fibrina

IIHEMA

XIIIa

Fibrina

¿QUÉ PRUEBAS EVALÚAN LA VIA INTRÍNSECA DE LA COAGULACION? IIHEMA

XII

FC

VIA INTRINSECA

XIIa

XI

Activador + FL IX

APTT KCT SCT

XIa Ca2+ IXa VIIIa FL Ca2+

X Xa Va FL Ca2+

II IIa

Fibrinógeno Fibrina

APTT o KPTT • Prueba de elección para la evaluación de la vía intrínseca

IIHEMA

APTT

¿CUALES SON LOS COMPONENTES Y/O REACTIVOS NECESARIOS PARA REALIZAR LA DETERMINACIÓN? IIHEMA

Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada

• Fosfolípidos de distinto origen y concentración • Activador (Kaolín, Ac. Elágico, Sílice) • Cloruro de calcio 0,025 M IIHEMA

APTT

¿Qué sensibilidad debería poseer el reactivo de elección ? IIHEMA

APTT 9 Déficit de factores de la vía 9 Presencia de heparina 9 Inhibidores de la vía

IIHEMA

¿ DE QUÉ VARIABLES VA A DEPENDER LA SENSIBILIDAD DE LA PRUEBA? IIHEMA

APTT Sensibilidad Activador

Naturaleza y concentración de FL IIHEMA

¿ CÓMO REALIZAMOS LA PRUEBA ?

IIHEMA

APTT o KPTT • •

100 µl plasma paciente 100 µl cefalina + activador 2 minutos 37 ºC

•100 µl cloruro de calcio 0,025M •V.N.: 37-48 segundos IIHEMA

¿ES IMPORTANTE RESPETAR EL TIEMPO DE INCUBACIÓN? IIHEMA

VIA EXTRINSECA

VIA INTRINSECA

XIIa QAPM PK XI

FASE DE CONTACTO VIIa FT PL Ca 2+

XIa IXa

IX

VIIIa PL Ca 2+

II fibrinógeno

Xa Va PL Ca 2+

X

IIa fibrina

XIIIa

Fibrina insoluble

IIHEMA

X

¿ EN QUÉ SITUACIONES PENSARIAMOS AL OBTENER UN APTT PROLONGADO ? IIHEMA

APTT prolongado • Déficit de factores : VIII, IX, XI, XII, QAPM, PK • Pacientes bajo tratamiento anticoagulante oral

• Fibrinógeno < 100 mg/dl IIHEMA

APTT prolongado • Heparina no fraccionada • Inhibidores • P. Politransfundido

↓ VIII, V

IIHEMA

APTT prolongado • Déficit de vitamina K • Hepatopatías • CID IIHEMA

ANTE UN APTT PROLONGADO, ¿ QUÉ PRUEBA DEBEMOS REALIZAR ? IIHEMA

Corrección con plasma normal ( relación 1:1) IIHEMA

APTT prolongado APTT mezcla plasma del paciente con plasma normal (1:1)

Corrige

Déficit de factores

No corrige o prolonga Inhibidor IIHEMA

APTT Corregir con plasma normal (1:1)

Indice de Rosner APTT (P+N) – APTT N APTT P > Valor de corte (0,1)⇒ No Corrige ≤ Valor de corte ⇒ Corrige IIHEMA

APTT P = 80 seg 46 seg Corrige

P+N

N = 40 seg 55 seg

No Corrige

APTT (P+N) – APTT N APTT P

= 0,10 Valor de corte

¿ QUÉ HACER SI TENEMOS UN APTT PROLONGADO, QUE CORRIGE Y FACTORES VIII, IX, XI, XII NORMALES ? IIHEMA

APTT c/incubación prolongada (10 min. a 37°C)

Corrige Posible déficit Precalicreínas IIHEMA

¿ CÓMO REALIZAMOS LA DETERMINACIÓN DE LOS FACTORES DE LA VÍA ? IIHEMA

Determinación de factores • Modificación del APTT • Reactivos: - fosfolípidos de distinto origen y concentración - activador - cloruro de calcio 0,025 M - plasma deficiente en factor a estudiar, (diluido ?) IIHEMA

Determinación de factores • Muestra: plasma diluido 1/5, 1/10, 1/20 • Curva del factor : -diluciones del estándar: 1/5, 1/10, 1/20, 1/40 • Diluyente Fluido II (buffer Owren modificado, pH 7,35) IIHEMA

Determinación de factores • • •

50 µl dilución paciente 50 µl dilución plasma deficiente 50 µl cefalina + activador 2 minutos 37 ºC

• 50 µl cloruro de calcio 0,025M IIHEMA

Determinación de factores • V.N.: 50%-150% • Valores

: 9déficit del factor 9 inhibidor IIHEMA

Determinación de factores

Tiempo (seg)

inhibidor específico o déficit normal

Factor (U/dl) IIHEMA

DEFICIENCIA DE FACTORES DEFICIENCIA Fibrinógeno Factor II Factor V Factor VII Factor VIII Factor IX Factor XI Factor XIII

INCIDENCIA 1:1 millón 1:2 millones 1:1 millón 1:500.000 1:10.000 1:60.000 1:100.000 1:2 millones

HERENCIA AR AR AR AR XLR XLR AR AR IIHEMA

Vía final o común Bioq. Luis Bastos Dpto. Hemostasia y Trombosis IIHEMA Academia Nacional de Medicina

VIA EXTRINSECA

VIA INTRINSECA XIIa HMK PK XIa

XI IX

IXa VIIIa PL Ca 2+

VIIa FT PL Ca 2+ Xa Va PL Ca 2+

X

II fibrinógeno

X

IIa fibrina XIIIa Fibrina insoluble

IIHEMA

¿ QUÉ PRUEBAS PODEMOS UTILIZAR PARA EVALUAR ESTA VÍA ? IIHEMA

„

Tiempo de Trombina (TT)

„

Fibrinógeno (I) IIHEMA

Tiempo de Trombina (TT)

Tiempo de Trombina • Mide el tiempo de coagulación del plasma en presencia de trombina.

• Evalúa la transformación de

fibrinógeno a fibrina, pero excluye la participación del factor XIII. IIHEMA

Tiempo de Trombina

• Reactivo: - solución de trombina de 10 unidades/ml

• Muestra: - plasma citratado IIHEMA

¿ CÓMO REALIZAMOS LA PRUEBA ?

IIHEMA

Tiempo de Trombina

• 100 µl de plasma 30 segundos 37ºC 100 µl de trombina

• Se debe informar su valor en relación con el normal del día. - valores normales entre 16-22 segundos. IIHEMA

¿ EN QUÉ SITUACIONES TENDRÍAMOS UN TT PROLONGADO ? IIHEMA

T T prolongado

•Fibrinógeno disminuido ( 24 horas

IIHEMA

Solubilidad en Trombina-Acético • 200µl fisiológica • 200 µl plasma • 100 µl trombina (30UI/ml) 30min 37 3ml Ac. Acético al 2% IIHEMA

Laboratorio (Cuantificación) • Inmunoelectroforesis específica

(Laurell) para subunidades A y B.

• Elisa para subunidades A y B.

IIHEMA

Sistema Fibrinolítico Bioq. Luis Bastos Dpto. Hemostasia y Trombosis IIHEMA Academia Nacional de Medicina

Sistema Fibrinolítico PAI

Plasminógeno

PAI u-PA/u-PAR

t-PA

Plasmina α2 - Antiplasmina

Fibrina

PDF IIHEMA

Sistema Fibrinolítico Test Globales

•Lisis de Euglobulinas

Inhibidores

•Lisis en Sangre Entera

PAI α2 -PI

•PDF/f.

Sustrato y activador

• Plasminógeno • t-PA

Marcadores de Fibrinolisis

•D-Dímero IIHEMA

Evaluación Fibrinolítica Dosaje de plasminógeno

Método funcional cromogénico Electroinmunoensayo

Método funcional Dosaje de α2-antiplasmina cromogénico Electroinmunoensayo Lisis de Euglobulinas IIHEMA

Evaluación Fibrinolítica Lisis de Euglobulinas

TPA PAI Dímero D PDF

Pre y post isquemia por oclusión venosa Método funcional cromogénico Aglutinación en látex IIHEMA

Puntos a tener en cuenta: • Reposo previo : - 20 minutos (el estrés y ejercicio

la liberación endotelial de tPA)

• Ayuno previo: - Cafeína: la actividad fibrinolítica. - Carbohidratos ricos en calorías: la actividad del PAI-1 IIHEMA

Puntos a tener en cuenta:

• Evitar : - Alcohol:

- Tabaco:

la actividad fibrinolítica por la liberación del PAI-1 el antígeno del tPA IIHEMA

PAI Biológico (UI/m l)

15

RITMO CIRCADIANO

10 5 0 9

12

15

18

21

24

3

6

9

1

tPA inm unológico (ng/m l)

tPA Biológico (UI/m l)

Hora

Normales

0,8 0,6 0,4 0,2 0 9

12

15

18

21

24

Hora

AE Wallnöfer et al, 1993

3

6

9

8 6 4 2 0 9

12

15

18

21

24

3

6

Hora

IIHEMA

9

Lisis del coágulo • Evalúa globalmente la actividad fibrinolítica

• Afectada por los niveles de Plg/Plm,

fibrinógeno, activadores e inhibidores de la fibrinolisis (α2-PI)

IIHEMA

Lisis del coágulo • Sangre recién extraída en tubo de vidrio limpio y seco.

• Baño a 37ºC, tomar la hora cuando coagula.

• Tomar el tiempo de lisis completa del coágulo

IIHEMA

Lisis de Euglobulinas • Precipitación de fracción proteica (“Euglobulinas”) en medio ácido 9Fibrinógeno 9Plg

9Activadores del Plasminógeno

9Plasmina

9PAI

Sobrenadante: - Inhibidores de la Plasmina (α2-PI) IIHEMA

Lisis de euglobulinas • 250 µl PPP* • 4 ml agua destilada • 70µl ácido acético (1%) 30 min. en heladera 4-8ºC • Centrifugar a 1000 rpm, 5 min (*) PPP obtenido de sangre anticoagulada (9:1) con citrato ácido de sodio. IIHEMA

Lisis de euglobulinas • Descartar el sobrenadante • 250µl de borato de sodio • 250µl de CaCl2 0,025M

IIHEMA

FIBRINOLISIS

Respuesta a la isquemia • Muestra basal (pre) • Muestra luego de 10 min. de compresión (post) • Esfingomanómetro: presión media entre la mínima y la máxima (del paciente) IIHEMA

Respuesta a la isquemia • Tanto la muestra basal como la post oclusión se deben recoger en tubos con citrato ácido y mantener refrigeradas

• Índice post/pre: ƒ < 0,70 buena respuesta ƒ 0,70-0,75 pobre respuesta ƒ > 0,75 mala respuesta IIHEMA