Pruebas Colilert y Colisure

Preparado por Terry C. Covert Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos

La prueba de autoanalysis Colilert fue desarrollada por el Dr. Stephen Edberg de la Universidad de Yale en 1988. La técnica emplea una tecnología desarrollada para identificar microbios de infecciones del tracto urinario pero posteriormente fue adoptado para análisis de agua. La filtración por membrana (FM), la prueba de fermentación en tubos múltiples (MFM) y la prueba de presencia ausencia (PA) de coliformes se basan en la fermentación de la lactosa obteniéndose colonias con brillo metálico, gas o ácido y gas. Estos métodos requieren una verificación o confirmación de la presencia de coliformes, lo cual demanda un tiempo adicional de análisis. La prueba de Colilert fue desarrollada en respuesta a estas limitaciones y de los problemas experimentados en un sistema de distribución de agua de New Haven, Connecticut, debido a la reproducción de coliformes en la capa biológica. La prueba de Colisure fue desarrollada por la corporación Millipore en 1993. Las pruebas Colilert y Colisure están disponibles en los laboratorios Idexx Inc., Westbrook, Maine.

Las pruebas Colilert y Colisure se basan en la capacidad de los coliformes para producir la enzima β − galactosidasa que actúa sobre sustratos específicos, en el caso de Colilert sobre el O nitrofenil - β - D - galactopiranósido (ONPG), produciéndose un color amarillo al actuar sobre el O nitrofenil. La prueba Colisure contiene el sustrato clorofenol rojo β - D - galactopiranósido (CPRG). Con la hidrólisis por β - galactosidasa el CPRG libera un compuesto cromogénico, rojo de clorofenol, 1

que cambia el color del medio de amarillo a rojo o magenta. Además, la enzima β - glucoronidasa producido por E. coli forma una sustancia fluorescente cuando hidroliza 4 - metilumbelliferil - β - Dglucurónido (MUG). Tanto el Colilert como el Colisure contienen MUG. Esta combinación de sustratos permite detectar tanto los coliformes totales como la E. coli en un plazo de 24 horas. Además del ONPG y MUG, sustratos que son usados como fuentes de carbono, el Colilert contiene sulfato de amonio como fuente de nitrógeno, sales minerales y sulfito de sodio para ayudar a reparar los coliformes dañados, y solanium como dispersivo. El Colisure también contiene una combinación de nutrientes y sales inorgánicas. Así mismo, inhibe selectivamente el crecimiento de los no - coliformes mediante la acción de detergentes y antibióticos.

El uso de Colilert como el de Colisure es simple, en el sentido de que lo único que se debe hacer es añadir 10 ml de muestra a los tubos de Colilert, 20 ml de muestra a los tubos de Colisure o 100 ml a los frascos de presencia – ausencia que contienen sustratos definidos (medios). Las pruebas se incuban de 24 a 28 horas. Se recomienda incubar hasta por 48 horas. Ambas pruebas están diseñadas de tal manera que no se requiera ninguna prueba adicional de confirmación. La incorporación de los dos sustratos permite la detección y enumeración simultánea tanto de los coliformes totales como de E. coli. Como en ambas pruebas el medio de cultivo se encuentra en forma de polvo listo para su uso, no hay ningún medio para preparar ni esterilizar. Los tubos de Colilert o frascos de PA tienen un período máximo de almacenamiento sin refrigerar de 12 meses. La prueba Colisure tiene un período máximo de almacenamiento con refrigeración de nueve meses. Por lo general, es muy fácil leer o interpretar las pruebas positivas. La prueba Colilert tiene un comparador de color muy ténue, en caso de que los tubos o frascos de PA sean difíciles de “leer” o interpretar. Para los tubos Colilert o los 2

frascos de PA en donde el color es indefinido, se recomienda una incubación adicional de cuatro horas. Recientemente, los laboratorios Idexx desarrollaron la prueba Colilert de 18 horas que se basa en la misma formulación de la prueba de Colilert de 24 horas, con un tiempo menor de incubación. Primero se incuba la muestra por 20 minutos en baño maría a 35 °C después de agregar el sustrato de Colilert18, luego se incuba durante 18 horas a 35 °C. Otra innovación reciente del Idexx es el Quanti-Tray. Se trata de un sistema de NMP de 51 tubos (celdas) que usa el Colilert - 24 horas, el Colilert - 18 o el Colisure como medio o sustrato. El medio (sustrato) se añade a la muestra, la muestra se vierte en el Quanti-Tray, la bandeja se sella con calor y se incuba a 35 °C. Se enumeran las celdas positivas con coliforme totales o E. coli y se comparan con el cuadro de los NMP de las 51 celdas que proporcionan los laboratorios Idexx.

Aunque se ha informado que Colilert y Colisure equivalen a las pruebas estándares de coliformes en cuanto a la detección, recuperación y especificidad, ambas pruebas tienen limitaciones. No todas la E. coli son MUG-positivo, como la E. coli O157 H: 7, lo que puede dar resultados negativos falsos. Los altos niveles de Aeromonas hydrophila y Flavobacterium spp. también pueden provocar reacciones positivas falsas de ONPG y reacciones MUG. En las instrucciones del fabricante y en el Manual para la Certificación de laboratorios de análisis de agua potable de la EPA de los Estados Unidos, se recomienda que en cada lote de producto recibido se controlen los cultivos positivos y negativos y que se registren los resultados. Tanto la prueba de Colilert como la de Colisure están aprobadas por la EPA de los Estados Unidos para detectar coliformes totales y E. coli en el agua potable.

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Bibliografía

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McFeters, G. A., S. C. Broadway, B. H. Pyle, M. Pickett and Y. Egozy. 1996. Comparative performance of Colisure and accepted methods in the detection of chlorine-injured total coliforms and E. coli. Water Sci. Technol. 31:259.

Pruebas Colilert y Colisure Esquema Desarrollo * Colilert fue desarrollado por el Dr. Stephen Edberg de la Universidad de Yale en 1988.

* Todos los métodos para coliformes basados en la fermentación de la lactosa requieren una verificación adicional y pruebas de confirmación. Colilert se desarrolló en respuesta a estas limitaciones.

* Colisure fue desarrollado por la Corporación Millipore en 1993 y los laboratorios Idexx la 5

comercializa.

Principios de las pruebas * Se basan en la capacidad de los coliformes para producir la enzima β - galactosidasa y E. coli para producir la enzima β - glucuronidasa.

* El sustrato para β - galactosidasa con Colilert es O - nitrofenil - β - D -galactopiranósido (ONPG) y con Colisure es clorofenol rojo β - D - galactopiranósido (CPRG).

* El sustrato para β - glucuronidasa tanto en Colilert como en Colisure es 4 - metilumbelliferil - β - D - glucorónido (MUG).

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* Cuando ONPG (Colilert) es hidrolizado por β - galactosidasa se produce un color amarillo (O nitrofenil). Cuando el CPRG (Colisure) es hidrolizado por β - galactosidasa, se produce un color rojo o magenta (clorofenol rojo). El desarrollo del color amarillo con Colilert y rojo o magenta con Colisure, indica la presencia de coliformes totales.

* Cuando el MUG es hidrolizado por E. coli (β - glucoronidasa) para formar 4 - metilumbelliferil, la fluorescencia se puede detectar con una luz ultravioleta de onda larga de 366 nm. Una prueba MUG positiva indica la presencia de E. coli.

Resumen del método * Se añade 10 ml de muestra a diez (10) tubos Colilert, 20 ml de muestra a cinco (5) tubos Colisure o 100 ml de muestra a frascos de PA Colilert o Colisure o Quanti-Trays.

* Los tubos, frascos de PA o Quanti-Trays se incuban a 35 °C ± 0,5 °

* Los tubos, frascos de PA o Quanti-Trays se examinan para verificar la presencia de color amarillo o magenta y se exponen a la luz ultravioleta de onda larga para detectar la presencia de E. coli. 7

Ventajas/Desventajas de los métodos * No todas las E. coli son MUG - positivo. Actualmente se piensa que 93 – 95% son MUG positivo.

• Los métodos basados en MUG o los que usan una incubación a temperatura elevada (44,5 °C) no detectarán E. coli O157 H:7.

* No se requiere para preparar o esterilizar el medio de cultivo.

* No se necesita ninguna prueba adicional de confirmación.

* Los niveles altos de heterótrofos no interfieren con la detección de los coliformes totales o E. coli.

* El Colilert se puede almacenar a temperatura ambiente.

* Por lo general, es fácil interpretar las pruebas positivas. 8

* Los altos niveles de Aeromonas hydrophila y Flavobacterium spp. pueden dar origen a pruebas positivas falsas de ONPG o MUG.

Pruebas Colilert y Colisure

Notas del instructor

Este bloque de instrucción es una combinación de la ponencia y demostración. Por lo general no se usan diapositivas ni transparencias (acetatos). El participante recibe un esquema y material didáctico. Los tubos Colilert y Colisure y los frascos de PA se inoculan antes del curso con coliformes totales y E. coli junto con cultivos de control negativos de coliformes totales. La ponencia se desarrolla conforme al material didáctico. Las prácticas de AC/CC descritas en el Manual para la certificación de laboratorios de análisis de agua potable de la EPA de los Estados Unidos también están incluidas en la ponencia, es decir, el uso de cultivos de control positivos y negativos, comparador de color, etc.

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