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Biomarcadores nuevos para el infarto agudo de miocardio: ¿es el microARN el recie´n llegado? Moderadores: Joshua E. Raizman1,2 y Eleftherios P. Diamandis1,2,3* Expertos: Katey Rayner,4,5 Stephanie Dimmeler,6 George A. Calin,7 y Thomas Thum8

La deteccio´n temprana del infarto agudo de miocardio (IAM)9 es crucial en la decisio´n del curso del tratamiento a fin de preservar y prevenir el dan˜o futuro al tejido mioca´rdico. Las directrices del American College of Cardiology (Colegio Estadounidense de Cardiologı´a) brindan los criterios para el IAM como un aumento o una disminucio´n en la troponina con al menos un valor ⬎99 % del percentilo de una poblacio´n sana (con una imprecisio´n ⬍10 %) acompan˜ado por sı´ntomas de isquemia o evidencia de IM con base en las modalidades de digitalizacio´n de ima´genes o electrocardiografı´a. Durante los u´ltimos an˜os, las pruebas de creatina-cinasa MB se han reemplazado por generaciones ma´s nuevas de ana´lisis de troponina. Los ana´lisis de alta sensibilidad se consideran en la actualidad el marcador de referencia para la necrosis mioca´rdica. De hecho, la mayor sensibilidad analı´tica de los ana´lisis de troponina de alta sensibilidad ha reducido el umbral de lesio´n mioca´rdica, lo que facilita la deteccio´n de los valores iniciales en el rango de picogramos por mililitro y, por tanto, acelera el diagno´stico temprano. Sin embargo, las ganancias en la sensibilidad del diagno´stico se consiguieron a costa de las reducciones en la especificidad del diagno´stico. Un desafı´o principal es que los ana´lisis de alta sensibilidad cuantifiquen la troponina en una mayor proporcio´n en comparacio´n con los individuos sanos. Estos ana´lisis tambie´n detectan la muerte celular mioca´rdica relacionada con otras afecciones fisiopatolo´gicas, tales como las miocardiopatı´as, miocarditis, insuficiencia renal, insuficiencia cardı´aca congestiva y embolia pulmonar, y no distinguen entre mecanismos de lesio´n tisular, lo que limita la capacidad de diferenciacio´n sobre la base de la gravedad del IM [p. ej., infarto de miocardio sin

elevacio´n del segmento ST (IMSEST) en comparacio´n con no-IMSEST]. En consecuencia, la introduccio´n de los ana´lisis de troponina de alta sensibilidad a la pra´ctica clı´nica ha causado confusio´n entre los me´dicos que tratan pacientes con dolor tora´cico agudo. Por lo tanto, au´n no se cuenta con un biomarcador ideal para incluir y descartar el IAM de forma ra´pida y confiable.

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Alemania; 7 Profesor, Department of Experimental Therapeutics (Departamento de Terape´utica Experimental) Anderson Cancer Center (Centro Oncolo´gico Anderson ), University of Texas (Universidad de Texas), Houston, TX; 8 Profesor, Hannover Medical School (Facultad de Medicina de Hannover), IFB, Molecular and Translational Therapeutic Strategies (Estrategias Terape´uticas Moleculares y de Transferencia), Hannover, Alemania. * Dirigir correspondencia para estos autores a: Mount Sinai Hospital, 60 Murray St., 6th Floor, Toronto, Ontario, M5G 1X5 Canada´. Fax 416-586-8628; correo electro´nico: [email protected]. Recibido para la publicacio´n el 17 de octubre de 2013; aceptado para la publicacio´n el 22 de octubre de 2013. 9 Abreviaturas no esta´ndar: IAM, infarto agudo de miocardio; IMSEST, infarto de miocardio sin elevacio´n del segmento ST; miARN, microARN; Ago2, argonauta 2.

Department of Pathology and Laboratory Medicine (Departamento de Patologı´a y Medicina de Laboratorio), Mount Sinai Hospital (Hospital Monte Sinaı´), Toronto, Ontario, Canada´; 2 Department of Laboratory Medicine and Pathobiology (Departamento de Medicina de Laboratorio y Biopatologı´a), University of Toronto (Universidad de Toronto), Toronto, Ontario, Canada´ (J.E.R., afiliacio´n actual); 3 Department of Clinical Biochemistry (Departamento de Bioquı´mica Clı´nica), University Health Network (Red Universitaria de Salud), Toronto, Ontario, Canada´; 4 Profesora Asistente, Cardiometabolic MicroRNA and Epigenetics Laboratory (Laboratorio de Epigene´tica y MicroA Cardiometabo´lico) y; 5 Profesora Asistente, University of Ottawa Heart Institute, Ottawa (Instituto del Corazo´n de la Universidad de Ottawa), Ontario, Canada´; 6 Profesora, Institute of Cardiovascular Regeneration, Centre for Molecular Medicine (Instituto de Regeneracio´n Cardiovascular, Centro de Medicina Molecular), Frankfurt/Main,

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Durante los u´ltimos an˜os, ha habido un creciente intere´s en los microARN (miARN) circulantes como posibles biomarcadores nuevos del IAM. El miARN es un tipo de a´cido ribonucleico pequen˜o no codificante monocatenario (alrededor de 22 nucleo´tidos de longitud) ubicado dentro de intrones de genes de codificacio´n de proteı´nas que funciona en la supresio´n de sı´ntesis de proteı´nas mediante silenciamiento ge´nico. Recientes estudios clı´nicos y en animales han demostrado que los miARN aumentan en el plasma poco despue´s de la aparicio´n de una complicacio´n coronaria. Una reciente explosio´n de datos clı´nicos ha proporcionado evidencia de que los miARN circulantes son u´tiles en el diagno´stico y en la prediccio´n de los resultados de supervivencia y la carga ateroesclero´tica. Ciertas isoformas miARN tienen lugar exclusivamente en la circulacio´n despue´s de un IAM y aparecen para mostrar una cine´tica de liberacio´n ma´s ra´pida que la observada en las troponinas detectadas con ana´lisis de alta sensibilidad. Asimismo, las pruebas del miARN circulante parecen coincidir con los beneficios de las pruebas de troponinas de alta sensibilidad en te´rminos de sensibilidad y especificidad clı´nicas. En ciertas instancias, las pruebas de miARN mejoran el posible diagno´stico cuando dichas pruebas se usan junto con biomarcadores cardiacos o como una

Q&A prueba independiente. Adema´s, ciertos grupos han identificado patrones distintivos u´nicos de miARN circulantes que distinguen de forma precisa entre pacientes con IMSEST y no-IMSEST, un diagno´stico que tiene importantes repercusiones en el tratamiento temprano en el contexto de los cuidados intensivos. En la presente publicacio´n de Preguntas y respuestas, invitamos a 4 expertos en miARN interesados en enfermedades arteriales coronarias para que brinden informacio´n sobre la utilidad de los miARN circulantes en las pruebas de IAM y aporten conocimientos sobre los beneficios, las aplicaciones, los desafı´os y las limitaciones de esta nueva herramienta de gran potencial. ¿Considera que au´n hace falta un biomarcador ideal para el diagno´stico ra´pido y confiable del IAM? ¿Cua´les son algunos de los desafı´os con el actual panteo´n de los enfoques de pruebas de IM que se usan actualmente? Katey Rayner: La necesidad clı´nica de pruebas ra´pidas y precisas de un IAM es evidente, y el actual uso de la troponina (y otras mediciones basadas en enzimas cardiacas) predice de forma confiable la presencia de un IAM. Por el contrario, hace falta una prueba ra´pida y eficaz para la enfermedad coronaria estable y, ma´s importante, la enfermedad coronaria inestable. Es mi opinio´n que a pesar de que los miARN pueden estar relacionados estrechamente con los valores de las enzimas cardiacas y pueden de hecho indicar la aparicio´n de un IAM, estas mediciones basadas en miARN no hara´n ma´s que consolidar el diagno´stico y no necesariamente revelara´n informacio´n nueva. Por otra parte, existe la urgente necesidad de marcadores que identifiquen las placas inestables en riesgo de ruptura y los miARN pueden proporcionar esta herramienta. Stephanie Dimmeler: Existen biomarcadores confiables para la deteccio´n temprana y sensible del IAM disponibles (ana´lisis de troponina de alta sensibilidad) y no considero que los miARN circulantes serı´an mejores en la pra´ctica habitual. Quiza´s la liberacio´n de los miARN tenga lugar

antes que la troponina (lo que permitirı´a una deteccio´n ma´s ra´pida del IAM); sin embargo, esto au´n no esta´ claro. George A. Calin: La falta de especificidad diagno´stica para diversos marcadores del IM es un factor. Por otra parte, varios miARN presentan expresio´n tisular especı´fica (p. ej., la familia miR-133) y; por lo tanto, existen amplias expectativas por identificar marcadores ma´s especı´ficos que puedan usarse como marcadores de la etapa inicial de la necrosis mioca´rdica. Asimismo, si fueran a identificarse nuevos marcadores no relacionados con los miARN como altamente especı´ficos, podrı´a concebirse la prediccio´n del IM tomando como base una combinacio´n de tales marcadores con la expresio´n de miARN. Thomas Thum: En te´rminos generales, considero difı´cil vencer la sensibilidad y especificidad de los actuales enfoques de deteccio´n de IM, particularmente en relacio´n con aquellos provenientes del uso de ana´lisis de troponina de alta sensibilidad. Sin embargo, existen varias circunstancias en las que los nuevos marcadores serı´an muy u´tiles, por ejemplo en la deteccio´n de otras enfermedades cardiacas que acompan˜an el dan˜o mioca´rdico (y desarrollo de biomarcadores tradicionales) como la miocardiopatı´a de takotsubo o varias formas de miocarditis. ¿Por que´ ha habido tal explosio´n de intere´s en la comunidad cardiovascular por trasladar la investigacio´n del miARN en la mesa de laboratorio al contexto clı´nico? Katey Rayner: El entusiasmo que gira en torno del uso de terapias basadas en miARN para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares se debe en parte al desarrollo relativamente ra´pido de estrategias dirigidas anti-miARN. Menos de 5 an˜os despue´s de que se detectaran los miARN en mamı´feros, se utilizaron “antagomires” de forma correcta en primates no humanos para inhibir el miR-122 y reducir las concentraciones de colesterol en plasma total, y esto condujo al ra´pido Clinical Chemistry 60:6 (2014) 813

Q&A progreso del anti-miR122 en los ensayos clı´nicos. Pra´cticamente se podrı´a argumentar que la comprensio´n de la biologı´a de los miARN ha quedado por detra´s del desarrollo de tecnologı´as de inhibicio´n, pero esto ha ayudado a un gran nu´mero de laboratorios a validar la funcio´n de los miARN especı´ficos en enfermedades cardiovasculares y ha respaldado su consideracio´n en ensayos clı´nicos. A diferencia de los enfoques orientados a un gen/una mole´cula a la vez (es decir, pequen˜as mole´culas, farmacolo´gicas), la terapia basada en miARN tiene el potencial de modular una vı´a completa mediante el ajuste de mu´ltiples genes a la vez, lo que con frecuencia causa un efecto ma´s duradero y continuo. Stephanie Dimmeler: Los miARN pueden cambiar las redes de expresio´n de genes y con frecuencia se regulan de forma profunda durante la enfermedad. Asimismo, los pequen˜os inhibidores farmacolo´gicos esta´n disponibles para dirigirse a los miARN, lo que permite pruebas sencillas de estrategias terape´uticas. En general, los inhibidores del miARN se han usado de forma segura en un estudio reciente de fase II (para el tratamiento de la hepatitis); por tanto, se podrı´a esperar que los inhibidores del miARN tambie´n fueran u´tiles para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. George A. Calin: Los miARN esta´n involucrados en cualquier tipo de proceso biolo´gico que se haya investigado a la fecha y tambie´n cualquier tipo de enfermedad analizada. Por lo tanto, se ha dedicado gran cantidad de esfuerzos y fondos a la identificacio´n de nuevas aplicaciones terape´uticas basadas en los miARN, ası´ como otros nuevos biomarcadores, para responder las diversas preguntas clı´nicas au´n sin resolucio´n, como la prediccio´n de la respuesta al tratamiento. El ensayo clı´nico recientemente publicado en fase II con miravirseno (anti–miR-122, un antagonista de un miARN en el hı´gado altamente especı´fico) en pacientes con infeccio´n por el genotipo 1 del virus de la hepatitis C cro´nica demostro´ prolongadas reducciones dependientes de las dosis en niveles del ARN del virus de la hepatitis C sin evidencia de resistencia vı´rica, lo que ciertamente an˜ade esperanza de que se desarrollara´n nuevos tratamientos. Thomas Thum: Esta explosio´n de intere´s se observa en el desarrollo de nuevos enfoques de transferencia terape´uticos y de diagno´stico. El hecho de que los objetivos del miARN con frecuencia se agrupen de forma funcional los convierte en objetivos terape´uticos muy atractivos y recientes estudios realizados en varios modelos de enfermedad en animales han demostrado un inmenso potencial para tales tratamientos de miARN. De hecho, 814 Clinical Chemistry 60:6 (2014)

en breve veremos estudios clı´nicos que realizan pruebas de tratamientos de miARN en humanos. Existen diferentes tipos de miARN. Teniendo en cuenta que se han detectado diferentes formas de miARN circulantes que reflejan el dan˜o mioca´rdico, ¿que´ criterios rigorosos deberı´an usarse para determinar su utilidad como biomarcadores y cua´les miARN considera que se adaptan a estas pautas? Katey Rayner: El criterio ma´s importante para que un miARN se considere biomarcador del IM es que este miARN no se encuentre en el plasma/espacio extracelular como resultado de ninguna otra patologı´a. Es decir, el miARN usado para diagnosticar una complicacio´n mioca´rdica no debe detectarse en pacientes con otras complicaciones, como hepatopatı´a, disfuncio´n renal o diabetes. Esto es de suma importancia dado que diversos pacientes con arteriopatı´a coronaria padecen mu´ltiples enfermedades asociadas que podrı´an complicar la prueba de diagno´stico basada en miARN. Actualmente, los miR-1/133 y miR-208b llevan la delantera en relacio´n con su precisio´n y sensibilidad para distinguir entre los pacientes con IAM y los controles sanos, si bien esto au´n debe confirmarse en cohortes ma´s amplias. Stephanie Dimmeler: Es muy temprano para realizar una conclusio´n final. Nuestras mediciones actuales y protocolos de normalizacio´n esta´n lejos del ideal y las mejoras en la metodologı´a podrı´an ser muy u´tiles en el camino hacia el establecimiento de los miARN como biomarcadores. Los criterios para definir la utilidad no son muy diferentes de los de cualquier otro biomarcador y simplemente requieren investigacio´n exhaustiva (y confirmacio´n de los resultados) en cohortes clı´nicas a gran escala. George A. Calin: Dado que los miARN circulantes actu´an como hormonas, una importante consecuencia pra´ctica se desprende de su gran variacio´n en la expresio´n en poblaciones normales. Por consiguiente, las concentraciones “normales” de miARN circulantes varı´an ampliamente entre humanos de acuerdo con la edad, el ge´nero y los acontecimientos fisiolo´gicos (tales como menarquia o embarazo) y se ven influenciadas por varios factores “extrı´nsecos”, tales como la temperatura ambiental y la tensio´n. Una consecuencia pra´ctica de esta perspectiva es el hecho de que para cualquier estudio que compare la expresio´n de los miARN en cualquier tipo de lı´quido corporal de individuos normales y pacientes con ca´ncer, es importante disen˜ar el estudio de una manera “emparejada”, al menos para la edad, el ge´nero y la raza, y usar al menos el doble de controles en relacio´n con los pacientes. De

Q&A esta forma, puede evaluarse la amplia variacio´n de expresio´n en la poblacio´n normal y las comparaciones con los grupos de la enfermedad (IAM en este caso) sera´n ma´s significativos y reproducibles en cohortes independientes. El mejor miARN para usar como marcador sera´ aquel con una expresio´n exclusiva en el tejido mioca´rdico; los perfiles de expresio´n de secuenciacio´n de nueva generacio´n podrı´an ayudar en la identificacio´n de dichos miARN. Thomas Thum: Un primer tema de importancia es la normalizacio´n de los resultados. No existe actualmente un me´todo de referencia real para la normalizacio´n, dado que no se conoce un miARN “circulante estable”. La mayorı´a de los investigadores realizan la normalizacio´n mediante el ajuste de los miARN de control. No considero que un u´nico miARN sera´ mejor que los biomarcadores de IM tradicionales. Sin embargo, una combinacio´n de marcadores de miARN; p. ej., los miARN especı´ficos para el dan˜o de cardiomiocitos, la inflamacio´n y las alteraciones de ce´lulas endoteliales y fibroblastos pueden brindarnos informacio´n sobre la causa subyacente del IM que podrı´a realizar modificaciones en el tratamiento. Existe cierta controversia en la documentacio´n acerca de cua´les mecanismos determinan el nivel de miARN circulantes bajo condiciones fisiolo´gicas y en respuesta al estı´mulo patolo´gico. ¿Podrı´a remarcar esta controversia y explicar lo que se conoce sobre algunas de sus funciones biolo´gicas? ¿Son estos mediadores de la lesio´n mioca´rdica o es su liberacio´n una consecuencia de esta lesio´n en sı´ misma? Katey Rayner: Existen varios ejemplos de miARN que se secretan de forma activa de las ce´lulas en exosomas o microvesı´culas y se asocian con complejos de proteı´nas en respuesta a ciertos estı´mulos. Los cuerpos apopto´sicos tambie´n contienen miARN, aunque au´n no queda claro si dichos miARN se encuentran incluidos de forma especı´fica o no especı´fica en esos cuerpos. Es altamente probable que los miARN actu´en como mensajeros para comunicarse de modo paracrino con las ce´lulas adyacentes o distantes, aunque au´n deben interpretarse sus mecanismos precisos. En el caso del IM, los miARN se liberan con mayor probabilidad como sen˜al de tejidos dan˜ados por la lesio´n del mu´sculo cardiaco, quiza´s a las ce´lulas inflamatorias o progenitoras directas para que se encaminen al lugar de la lesio´n. Resulta poco relevante si este proceso es especı´fico o no especı´fico cuando tales miARN se usara´n como biomarcadores. Lo ma´s importante es su valor de prediccio´n en el diagno´stico del IM. En te´rminos meca´nicos, si algunos miARN alteran la respuesta a la lesio´n, pueden ser manipulados con intere´s terape´utico me-

diante el uso de la terapia de sustitucio´n o inhibicio´n de miARN. Stephanie Dimmeler: En te´rminos generales, los miARN pueden liberarse mediante diferentes mecanismos coexistentes pero ciertos miARN pueden exportarse por vı´as preferenciales. Conforme a nuestros propios estudios, concluirı´amos que los miARN incluidos en la vesı´cula constituyen la forma preferencial de la mayorı´a de los miARN. Sin embargo, tambie´n detectamos miARN unidos a las proteı´nas [p. ej., al argonauta 2 (Ago2)] y miARN unidos a lipoproteı´nas, aunque en menor medida. La naturaleza de la funcio´n de comunicacio´n fisiolo´gica de larga distancia resulta poco clara y compleja de investigar in vivo. Ciertamente, en el citocultivo varios grupos han demostrado la transferencia y la actividad biolo´gica de los miARN extracelulares; sin embargo, sigue siendo un tema abierto si las bajas concentraciones de miARN extracelulares pueden inducir funciones biolo´gicas in vivo. George A. Calin: Existen 2 aspectos por analizar en relacio´n con los miARN circulantes como hormonas. En primer lugar, el paso de secrecio´n, el resultado de varios mecanismos, incluida la presencia de los miARN en exosomas, microvesı´culas, o cuerpos apopto´sicos, ası´ como la interaccio´n con la proteı´na Ago2 y los complejos de las HDL. Todas estas formas vuelven mucho ma´s estables a los miARN de lı´quidos corporales y; por tanto, ma´s fa´ciles de cuantificar. En segundo lugar, ¿cua´les son los efectos en las ce´lulas efectoras? Estos efectos son el resultado del mecanismo “cla´sico” de accio´n, es decir el direccionamiento del ARNm mediante la complementariedad de secuencias, seguido de la degradacio´n del ARNm o el bloqueo de la traduccio´n, y ambos causan una reduccio´n en la expresio´n de proteı´nas. Se ha identificado recientemente un mecanismo nuevo e inesperado: las funciones de los miARN como agonistas directos de los receptores de peaje en ce´lulas de ca´ncer y enfermedad de Alzheimer. Es altamente probable que dichos mecanismos este´n presentes tambie´n en pacientes con varias miocardiopatı´as. Thomas Thum: Diversos miARN ya esta´n ligados a los complejos Ago2 estabilizadores y se liberan en esta forma estable luego de la rotura de la membrana celular; p. ej., luego de una lesio´n isque´mica. Asimismo, el miARN pueden secretarse de forma activa; p. ej., mediante cuerpos apopto´sicos o exosomas ma´s reducidos. Estos miARN circulantes pueden ser alojados por otras ce´lulas dianas y pueden tener funciones fisiolo´gicas (como hormonas) y, por tanto, presentar actividad paracrina. Esto es curioso pero se requieren diversos estudios de seguimiento sobre los mecanismos detallados. Clinical Chemistry 60:6 (2014) 815

Q&A Como nuevos biomarcadores del IM, ¿de que´ forma considera que deberı´an usarse los miARN como herramienta de diagno´stico en el tratamiento de pacientes con enfermedades agudas y cro´nicas? ¿Co´mo imagina que se adaptara´n los miARN o quiza´s cubrira´n las carencias de los actuales paradigmas de diagno´stico, como las troponinas? Katey Rayner: La mayorı´a de los miARN circulantes se correlacionan estrechamente con las concentraciones de troponina en pacientes con IAM. Existe cierta evidencia de que los miR-208b podrı´an aparecer antes que la troponina T en el plasma, aunque esto au´n debe confirmarse. Si la aparicio´n de ciertos miARN precede la de las enzimas cardı´acas, el uso de estos miARN (en forma independiente o, ma´s probablemente, en combinacio´n) podrı´a ser de gran poder. Como se menciono´ antes; sin embargo, el potencial real de los biomarcadores de miARN circulantes yace en su capacidad para detectar o diagnosticar la enfermedad coronaria estable o inestable antes de la aparicio´n de un IM. Eso es lo que actualmente hace falta en la pra´ctica clı´nica. Stephanie Dimmeler: Los miARN circulantes podrı´an ser u´tiles en la estratificacio´n y prediccio´n de riesgos de enfermedades donde actualmente hacen falta biomarcadores de calidad, como la identificacio´n de pacientes con placas vulnerables, que presentan un gran riesgo de ruptura e IM pero cuyos resultados de troponina de alta sensibilidad son negativos. George A. Calin: Un aspecto que no se encuentra suficientemente desarrollado en relacio´n con el significado de la cuantificacio´n de los miARN en plasma en enfermedades agudas o cro´nicas de cualquier tipo, incluidas las cardiopatı´as, es el siguiente: Las concentraciones de miARN, al ser hormonas, son especı´ficas de cada individuo y cada uno nace con patrones de expresio´n especı´ficos. Por lo tanto, la medicio´n de concentraciones de miARN en plasma podrı´a representar una manera simple y sencilla de predecir la respuesta al tratamiento, dado que esto tambie´n presenta un componente hereditario individual. Thomas Thum: Pienso que existe un considerable beneficio en el diagno´stico a partir de los miARN, principalmente en las enfermedades cro´nicas. Centrando la atencio´n en el corazo´n, considero que habra´ patrones especı´ficos de los miARN para el diagno´stico de varias formas de insuficiencia cardiaca y sus causas subyacentes. El patro´n de los miARN circulantes tambie´n puede informarnos algo acerca de los eventos patolo´gicos que tienen lugar en el corazo´n durante las enfermedades cro´nicas, como la insuficiencia cardiaca; p. ej., la evolucio´n de la fibrosis intramioca´rdica. Asimismo, exis816 Clinical Chemistry 60:6 (2014)

ten actualmente estudios que demuestran el poder diagno´stico de los miARN circulantes. En el futuro, veremos resultados de cohortes ma´s amplias de pacientes, que respondera´n el interrogante acerca del uso clı´nico real de los miARN en enfermedades cardiovasculares. Ciertos estudios han demostrado que algunos miARN han aumentado de forma considerable y exclusiva en el plasma de pacientes con IAM. ¿Deberı´an interpretarse de forma cuantitativa o cualitativa las mayores concentraciones de miARN en el entorno clı´nico, y por que´? ¿Serı´an u´tiles los mayores lı´mites de valor de corte o intervalos de referencia en la poblacio´n normal o enferma al interpretar los resultados? Katey Rayner: En u´ltima instancia, el rango de concentraciones “normales” de cualquier miARN debe determinarse de forma empı´rica en una amplia poblacio´n antes de que se establezca su uso como biomarcador del IM. Esto deberı´a realizarse con un procedimiento normalizado y utilizarse y validarse entre varios centros, idealmente en forma de prueba “en el lecho del paciente”. Hasta que eso suceda, es imposible predecir cua´les concentraciones de miARN se consideran normales/anormales. Asimismo, un miARN cardiaco especı´fico (tal como el miR-208) serı´a ideal y reducirı´a cualquier falta de certeza sobre el hecho de que la presencia de este miARN en plasma sea el resultado de alguna otra lesio´n tisular/patologı´a. Stephanie Dimmeler: En el uso clı´nico de rutina, precisamos valores de corte claros y mediciones confiables con variaciones diarias aceptables. Con las tecnologı´as actuales, las mediciones de cohortes existentes de muestras son posibles, pero los problemas de normalizacio´n au´n no se han resuelto. El uso de los miARN recombinantes para la cuantificacio´n o ajuste de miARN para la normalizacio´n en mediciones basadas en RCP no nos resulta suficiente para permitir una medicio´n de los miARN circulantes en el lecho del paciente. George A. Calin: Las concentraciones deberı´an interpretarse de forma cuantitativa y deberı´an usarse los intervalos de referencia en la poblacio´n normal y enferma. Mediante la RCP de transcripcio´n inversa cuantitativa, un me´todo altamente sensible de determinacio´n de perfiles, los miARN tambie´n estara´n presentes bajo condiciones especı´ficas en personas normales (por ejemplo, ¿podrı´an los atletas presentar miARN en plasma “similares al IMA” despue´s del entrenamiento intenso, y en que´ concentraciones? Thomas Thum: Si estos miARN fueran a usarse en la medicina clı´nica, existe una fuerte necesidad de definir

Q&A los lı´mites de referencia, que representa un gran esfuerzo dado el uso de un sistema de deteccio´n basado en RCP, y la comparabilidad entre los diferentes laboratorios serı´a un tanto difı´cil. Sin embargo, esto es posible en una forma semi cuantitativa. Los intervalos de referencia son necesarios no solo en controles sanos, tambie´n en individuos enfermos. ¿Cua´les son algunas de las tecnologı´as de vanguardia que se usan actualmente para medir el miARN? ¿Cua´les son los principales desafı´os o limitaciones analı´ticos y que´ tecnologı´as deben mejorarse para medir de forma confiable el miARN en el contexto clı´nico agudo y no agudo? ¿Considera que las pruebas de diagno´stico inmediato son una posibilidad? Katey Rayner: Actualmente, la forma ma´s ra´pida de medir el miARN es mediante la RCP cuantitativa. Una plataforma de diagno´stico en desarrollo para la medicio´n de material gene´tico (incluidos los miARN) es la Nanostring, si bien el tiempo actual de obtencio´n es ⬎24 h, que no resulta ideal en el diagno´stico del IM y se adapta mejor a las afecciones ma´s cro´nicas. El uso reciente de la prueba “RAPID GENE” de diagno´stico inmediato para determinar los genotipos de individuos para el alelo CYP2C19 (para guiar el tratamiento antiplaquetario durante la intervencio´n coronaria) nos indica que una prueba ra´pida en el lecho del paciente para medir las concentraciones de miARN constituye una posibilidad muy real. De hecho, las tecnologı´as usadas para la determinacio´n de genotipos y la deteccio´n de miARN no son tan diferentes; por tanto, esto puede volverse una realidad antes de lo que piensa. Stephanie Dimmeler: Au´n no. Actualmente, la mayorı´a de los laboratorios usan tecnologı´as basadas en RCP pero tambie´n existen otras tecnologı´as disponibles. La RCP es muy sensible pero tambie´n es difı´cil de normalizar; otras tecnologı´as pueden ser mejores con relacio´n a la reproducibilidad y la normalizacio´n; sin embargo, son menos sensibles. Este campo se encuentra en sus inicios y seguramente las tecnologı´as deben (y pueden) continuar desarrolla´ndose. George A. Calin: La tecnologı´a que ma´s se utiliza en laboratorios basados en CLIA para la medicina de transferencia es la RCP de transcripcio´n inversa cuantitativa, dado que es especı´fica, fa´cil de realizar, reproducible y de bajo costo. Una limitacio´n es la dificultad para encontrar normalizadores u´tiles que puedan usarse en varios grupos de muestras independientes. La alternativa propuesta es usar la adicio´n de miARN no humanos, que asume una calidad equivalente de las muestras, pero este no es el caso en la mayorı´a de las instancias. Una opcio´n alternativa, costosa pero de

gran poder, es la secuenciacio´n de ARN de volumen reducido que puede identificar los nuevos miARN que no se informaron anteriormente. Thomas Thum: La tecnologı´a ma´s aplicada es la deteccio´n de miARN en tiempo real. Otras tecnologı´as incluyen la deteccio´n en micromatriz y las tecnologı´as de microesferas, que se utilizan para los ana´lisis de clasificacio´n de ce´lulas activadas por fluorescencia. Pienso que las pruebas en el lecho del paciente pueden desarrollarse (en el transcurso de 2 h) pero como se menciona anteriormente, considero que los miARN se introducira´n en el diagno´stico de las afecciones cro´nicas con mayor probabilidad. ¿Ve como una posibilidad el uso de las pruebas de miARN circulantes para el IAM en 5 an˜os? De no ser ası´, ¿cua´les son los principales obsta´culos por vencer en nuestra comprensio´n de las pruebas de miARN? Katey Rayner: Para que el miARN circulante se convierta en una prueba ampliamente usada en el diagno´stico del IAM, la prueba debe mejorar y ser ma´s ra´pida (y quiza´s menos costosa) en relacio´n con lo que es en la actualidad. Un u´nico miARN probablemente no sea de mayor valor que las mediciones de troponina en este aspecto; sin embargo, un panel de varios miARN puede an˜adir confianza a las mediciones de marcadores cardı´acos e incluso acelerar las mediciones. Por el contrario, si puede identificarse un miARN o un panel de miARN que predicen la enfermedad coronaria inestable, esto serı´a de gran valor en el entorno clı´nico para dirigir el tratamiento. Para que cualquiera de estos escenarios se convierta en realidad, el rango de lı´mites “normales” debe determinarse de forma empı´rica para cada miARN circulante mediante un me´todo normalizado y disponible comercialmente. De forma ideal, esto podrı´a realizarse con una prueba en el lecho del paciente que proporcione resultados ra´pidos y precisos en ⬍1 h. Si se cumplieran estos criterios, los miARN circulantes podrı´an tener un inmenso poder en el contexto clı´nico para el diagno´stico de enfermedades coronarias agudas y cro´nicas, y podrı´a conducir a nuevos tratamientos que apunten a dichos miARN no regulados. Stephanie Dimmeler: No es probable para el IM pero quiza´s sı´ para otras manifestaciones. Los principales obsta´culos son el establecimiento de un me´todo ra´pido y sensible, pero so´lido y normalizado que pueda usarse en la pra´ctica diaria. Asimismo, debemos realizar pruebas e identificar factores de confusio´n que puedan afectar las mediciones. George A. Calin: Con la evolucio´n de la tecnologı´a de gran secuenciacio´n hacia la pra´ctica clı´nica, se identifiClinical Chemistry 60:6 (2014) 817

Q&A cara´n muchos miARN ma´s en los pro´ximos an˜os, de modo que es ampliamente posible que durante los pro´ximos 5 an˜os se detecten miARN como posibles indicadores de prono´stico en enfermedades agudas y estables. Un tema de importancia es la prediccio´n de enfermedades cro´nicas, para las cuales los miARN quiza´s podrı´an usarse de forma realista en los pro´ximos 5 an˜os.

Contribuciones de los autores: Todos los autores confirmaron que han contribuido al contenido intelectual de este documento y han cumplido con los siguientes 3 requerimientos: (a) contribuciones significativas a la concepcio´n y el disen˜o, la adquisicio´n de datos o el ana´lisis e interpretacio´n de estos; (b) redaccio´n o revisio´n del artı´culo en relacio´n con su contenido intelectual; y (c) aprobacio´n final del artı´culo publicado.

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Declaracio´n de los autores o posibles conflictos de intere´s: Tras la presentacio´n del manuscrito, todos los autores completaron el formulario de declaracio´n del autor. Declaraciones o posibles conflictos de intere´s: Empleo o liderazgo: E.P. Diamandis, Clinical Chemistry, AACC. Papel del consultor o asesor: S. Dimmeler, MiRagen. Propiedad de acciones: No se declara. Honorarios: No se declara. Financiamiento de la investigacio´n: S. Dimmeler, Deutsche Forschungsgemeinshaft (SFB834 B1). Testimonio de expertos: No se declara. Patentes: No se declara.

Previously published online at DOI: 10.1373/clinchem.2013.215491