QUÍMICA BIOLÓGICA GUÍA DE PROBLEMAS Nº3

VI-CINÉTICA ENZIMÁTICA

1. Para estudiar una reacción enzimática se preparó una serie de tubos con diferentes concentraciones de sustrato y una cantidad constante de enzima y se incubaron en buffer fosfato 20mM pH 7 y a 37ºC. Como el gráfico producto vs tiempo resultó ser lineal hasta 2 min. de incubación se tomó 1 min. como el tiempo óptimo. Se frenó la reacción por el agregado de NaOH 2N, y se determinó la concentración del producto formado. Concentración de S (mmoles/tubo) vi (µmol producto formado/min) 0.05 15.4 0.08 20.0 0.12 24.0 0.20 31.2 0.30 36.5 0.40 39.2 0.50 40.0 0.60 40.0 a) Calcule las concentraciones molares de sustrato. b) Indique como se obtuvieron las vi. c) Mediante observación estime el valor de Vm y Km. d) Calcule el valor de Vm y Km gráficamente por Lineweaver-Burk. e) Si la concentración de enzima se incrementa al doble, como varía la vi, Vm y Km para S= 0.08 mM? f) Expresar la Km obtenida en mM, µM, µmol S/ml, ng S/incubado, mg S/100ml, y la Vmax en µmolP/min, mmol P/100mlxmin, µmol P/ ml.min. Datos = Volumen de incubación: 500µl y Mr S: 550 2. La fosfatasa alcalina es una enzima que hidroliza grupos fosfatos de diversos sustratos en medio alcalino. Su actividad puede medirse utilizando un sustrato artificial p-nitrofenilfosfato (PNFP), formándose como productos p-nitrofenol (PNF) y fosfato inorgánico. Este último puede detectarse espectrofotométricamente a 405 nm. Fosfatasa alcalina pH 10

PNFP

⇔

PNF + P i

Para estudiar los parámetros cinéticos de la enzima de un extracto de placenta de rinoceronte, se realizó la mezcla de reacción en la cubeta del espectrofotómetro y se midió la variación de la absorbancia a distintos tiempos, según el siguiente cuadro:

Mezcla

ml PNFP (25 mM)

H2O (ml)

Enzima Buffer CO3= (ml) (ml)

Absorb. t=0 min

Absorb. t=5 min

Absorb. t=10 min

Absorb. t=15 min

1 2 3

0.1 0.2 0.5

0.9 0.8 0.5

3 3 3

0.02 0.04 0.08

0.07 0.12 0.20

0.12 0.20 0.33

0.17 0.26 0.39

1 1 1

Mediante una curva de calibración realizada con PNF se obtuvo un factor (f) = 2.5 umol/unidad de absorbancia, en las mismas condiciones del ensayo. a) Obtener gráficamente Km y Vm. b) Si el extracto poseía 2mg/ml de proteína, cual sería la actividad específica (AE)? c) Si se hubiese realizado una dilución al medio del extracto, cuáles serían los valores de Km, Vm y AE? 3. Cuando se produce un daño severo en el hígado, la enzima E1 es liberada al torrente sanguíneo. Luego de un ejercicio severo, la enzima del músculo E2, que cataliza la misma reacción que E1, es liberada a sangre. E1 y E2 pueden diferenciarse fácilmente debido a que poseen valores de Km distintos (Km E1= 0.3 M, Km E2= 0.02 M). Teniendo en cuenta los resultados que se muestran en la tabla , obtenidos al medir la enzima en la sangre de un paciente, establecer si el paciente ha sufridoun daño hepático o simplemente ha sido sometido a ejercicios bruscos? Concentración S (M) 5 x 10 -2 7 x 10 -2 1 x 10 -1 1.5 x 10 -1 2 x 10 -1 3 x 10 -1 6 x 10 -1

vi (µmol/ml suero.min) 43 57 75 100 120 150 200

4. A una mezcla de reacción conteniendo 2.2 ml de clorhidrato de bencilamina, buffer fosfato de pH 7.6 y 3 µg de enzima monoamina oxidasa mitocondrial de hígado de rata se le adiciona los inhibidores α-naftol o β-naftol. Luego se sigue la reacción espectrofotométricamente a 250 nm. La velocidad se mide en UA/min. Vf=2.5ml a) Que mide la absorbancia? b) A partir de los datos de la tabla calcular gráficamente Km, Vm, Ki y la naturaleza de la inhibición. 1/S 150 86 70 44

sin inh. 20 10 8 4

1/vi α-naftol 60 39 33 25

β-naftol 103 61 52 34

Datos = S estaba en mM, vi estaba en µmol P/min, α-naftol: 0.2mM, β-naftol: 200µM

5. La hidrólisis de fenil-β-galactósido por la β-D-galactosidasa es parcialmente inhibida por iones Be++. La vi expresadas como mol S/gr enzima.seg se determinaron en ausencia y en presencia de 1mM de cationes Be++, empleando las concentraciones de S indicadas en la tabla. El Mr de la enzima es 750.000. a) Determinar el tipo de inhibición b) Determinar el valor de Ki y Km. c) Cuál es la diferencia entre expresar Vm como µmol P/min y µmol P/min.mg enzima? Concentración S (M) 0.010 0.005 0.002 0.001 0.0005

vi (mol S/gr E x seg) sin Be++ con Be++ 0.000077 0.0000385 0.000625 0.0000300 0.000040 0.0000192 0.000025 0.0000122 0.000016 0.0000069

6. Se investigó el efecto del ácido aspártico sobre la reacción catalizada por la malato deshidrogenasa NAD dependiente . Para ello se prepararon 8 cubetas a las que se les agregó 0.1 ml de NAD+ (1mM) y 0.5 ml de buffer Tris pH 8.0. A las cuatro primeras cubetas se les agregó 0.2 ml de ácido aspártico (1mM) y a las restantes 0.2 ml de buffer. A las 8 cubetas se les agregó Malato y cantidad suficiente de agua para llegar a volumen final de 1.9 ml. La reacción se inició mediante el agregado de 0.1 ml de enzima y se la siguió espectrofotométricamente a 340 nm. Volumen agregado(ml) Malato (1mM) 0.1 0.2 0.4 0.5

vi (UA/min) con Aspártico sin Aspártico 0.009 0.016 0.017 0.028 0.029 0.043 0.033 0.050

a) Calcular la Vm de la reacción en presencia y ausencia de ácido aspártico. b) Calcular el Km para el Malato y la constante de equilibrio de disociación (Kd) entre el ácido aspártico y la enzima. 7. La enzima Polifenol Oxidasa (PPO) es responsable de la oxidación de sustratos fenólicos a quinonas en presencia de O2. Esta reacción produce el denominado pardeamiento de muchos vegetales y frutos durante el almacenado o procesamiento de los mismos, consecuentemente se observa una disminución de la cualidades organolépticas de los productos.

La caracterización de esta enzima en damasco mostró los siguientes resultados:

a. Cuál es a su criterio el pH óptimo de la enzima (fig. 1)? Podría seleccionar un rango de pH en el cual medir actividad enzimática? Cuál sería? Puedo con este gráfico establecer si la disminución de la actividad enzimática se debe a efectos del pH sobre la estabilidad (desnaturalización) o sobre la cinética (pk´s de los grupos ionizables/catalíticos del sitio activo, etc) de la enzima? Por que? b. Que otro experimento propone realizar para responder la última pregunta? c. Describa el efecto tiempo-temperatura observado en la fig. 2. A qué temperatura/s determinaría la actividad de la enzima, si el protocolo indica que la enzima y sustrato deben incubarse durante 40 minutos para formar una apreciable cantidad de producto? d. Puede considerar a la enzima termoestable? Por que? e. Las figuras 1 y 2 se realizaron utilizando Catecol como sustrato, sin embargo se comparó la especificidad de la enzima por este y otros sustratos, estudiándose también sus parámetros cinéticos (Tabla 1). Cuál es a su criterio el/los mejor/es sustrato/s de la enzima? Por qué? f. Al estudiar el efecto de diferentes inhibidores sobre la actividad de la PPO utilizando Catecol como sustrato se obtuvo el resultado de la Tabla 2. Cuál/es sería/n el/los mejor/es inhibidor/es? Por qué? Qué significa la columna correspondiente a I50 de la tabla 2? 8. a. En la Tabla 1 se observa el efecto de ciertos compuestos sobre la actividad enzimática de la Superóxido Dismutasa dependiente de Cu y Zn. Analice para cada compuesto el efecto sobre la actividad relativa, describa ese efecto y en función de ello diga que tipo de efector es.

b. El citocromo P450 de hígado induce la ruptura oxidativa de esteres y amidas a productos carbonílicos (Fig. 1). Se estudio la cinética de este clivaje y se obtuvo un gráfico de Lineweaver-Burk para el sustrato etil-heptanoato. Observe la figura y calcule el valor de Km y Vm, indicando unidades. c. Se realizó un nuevo ensayo con el cit. P450, esta vez utilizando diferentes sustratos (Tabla IV). Indique cual/es es/son a su criterio el mejor sustrato y porque?