IDENTIFICACIÓN, SÍNTESIS Y CRIBADO BIOLÓGICO DE NUEVAS CABEZAS DE SERIE A TRAVÉS DE UNA APROXIMACIÓN DE DISEÑO RACIONAL DE FÁRMACOS PARA EL ANTAGONISMO DE BRADICININA COMO ESTRATEGIA TERAPÉUTICA ANTIASMÁTICA

Investigadores principales: Dr. Juan Jesús Pérez González Escola Tècnica Superior d'Enginyeria Industrial UPC Dr. Josep Castells Boliart Institut Universitari de Ciència i Tecnologia. Mollet Duración: 3 años

1. Resumen El objetivo del presente estudio ha sido la identificación de nuevas cabezas de serie no peptídicas para el antagonismo del receptor B2 de la bradicinina. La bradicinina (BK) es una hormona peptídica lineal constituida por nueve aminoácidos con secuencia Arg1-Pro2-Pro3-Gly4Phe5-Ser6-Pro7-Phe8-Arg9. La bradicinina es liberada en respuesta a estados inflamatorios, traumas, quemadas, shocks, alergias y algunas enfermedades cardiovasculares. Esta hormona influye en el tono vascular y la permeabilidad, y actúa disminuyendo la presión sanguínea. Los efectos inflamatorios de la BK son mediados a través de receptores acoplados a proteínas G, los receptores de la cininas B1 y B2. Diferentes péptidos con actividad agonista y antagonista han sido descritos últimamente en la bibliografía científica, siendo el compuesto HOE140 (Icatibant) el antagonista peptídico más efectivo del receptor B2. Los efectos de carácter antiinflamatorio de los antagonistas del receptor B2 de la BK han sido demostrados en ensayos clínicos, indicando que estos compuestos podrían ser altamente beneficiosos en la terapia del asma. El proyecto se ha desarrollado siguiendo una estrategia combinada de modelado molecular y síntesis química. Partiendo del farmacóforo para el antagonismo del receptor B2 de la BK obtenido en un estudio previo llevado a cabo por nuestro grupo, se han diseñado hasta cuatro bibliotecas combinatorias focalizadas. La diversidad de las quimiotecas virtuales ha sido explorada in silico, para seleccionar el grupo de compuestos más pequeño que, cumpliendo los requerimientos estructurales definidos por el farmacóforo, ofrezcan la máxima diversidad estructural. Estos compuestos fueron sintetizados y determinada su afinidad con el receptor B2 de la BK. Con los resultados de actividad obtenidos se ha ido mejorando la hipótesis farmacofórica inicial de reconocimiento hacia el receptor B2 y se han 2

buscado nuevas estructuras químicas en bases de datos comerciales. Todo este proceso ha permitido la identificación de tres moléculas con perfil antagonista que pueden considerarse como nuevas cabezas de serie con potencial aplicación en el tratamiento del asma.

2. Resultados A lo largo del presente proyecto se diseñaron cuatro bibliotecas combinatorias focalizadas. Las tres primeras fueron diseñadas basándonos en el farmacóforo de tres puntos correspondiente a la unión con el receptor B2 desarrollado en el grupo de modelado molecular (1), y que corresponde a una revisión del que ya habíamos publicado anteriormente (2). Las tres primeras se diseñaron de forma secuencial a lo largo de los dos primeros años del proyecto. Las estructuras de estas quimiotecas fueron diseñadas de forma que existiese un grupo aromático, tal como precisa el farmacóforo y dejando a su vez dos puntos de diversidad en la biblioteca, como se muestra en la figura 1.

quimioteca 1

quimioteca 2

quimioteca 3

Figura 1. Estructura de las tres quimiotecas diseñadas a partir del farmacóforo de reconocimiento en el receptor B2 de bradicinina. Donde R1 y R2 representan las posiciones de diversidad de la quimioteca.

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El análisis de diversidad de las diferentes quimiotecas generadas permitió seleccionar un total de 24 compuestos, que se enviaron a un laboratorio externo para su evaluación farmacológica. Desafortunadamente, estos compuestos no presentaron ningún antagonismo hacia el receptor B2. Paralelamente, con el objetivo de disponer de mayores oportunidades de hallar nuevas moléculas bioactivas, se procedió al cribado virtual de varias quimiotecas comerciales. Dicho cribado se llevó a cabo empleando como plantilla los requerimientos estructurales impuestos por el farmacóforo anteriormente mencionado. El proceso permitió refinar el farmacóforo en términos de definición de los puntos farmacofóricos y asimismo del tipo de estructuras químicas que lo cumplen. En total se seleccionaron 34 compuestos, que fueron evaluados por un laboratorio externo. De todos ellos, el compuesto UPCBK029 mostró una actividad antagonista hacia el receptor B2 dentro del rango micromolar. A partir de este primer hit, se dispuso de una idea más precisa de los requerimientos de reconocimiento del receptor B2. Básicamente, hallamos que aunque la hipótesis farmacofórica era correcta, debía existir un impedimento estérico que imponía la restricción de que las estructuras para cumplir los tres puntos sean angulares (tipo bumerán) y no triangulares como inicialmente pensábamos. Con este conocimiento, por una parte se diseñó la cuarta biblioteca combinatoria focalizada, y tras el análisis de diversidad, de la misma sintetizamos y ensayamos cuatro compuestos nuevos con resultados negativos. Por otra parte, se efectuó una búsqueda de compuestos análogos al hit UPCBK029 en las bases de datos de estructuras químicas del programa SciFinder Scholar y, con posterioridad, en las bases de datos de los proveedores IBS y TimTec. Se hallaron 357 4

compuestos análogos, de los que se seleccionaron 18 aplicando criterios de cumplimiento farmacofórico y después de analizar la diversidad química del conjunto restante. En los ensayos de competición con un antagonista de B2 se identificó que dos de estos compuestos mostraban antagonismo dentro del propio rango micromolar que el compuesto original, UPCBK029. Estos tres compuestos que presentan un EC50 del orden de 30 µM tendrían que permitir llegar a una cabeza de serie a corto plazo.

3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos La bradicinina es un péptido proinflamatorio de la familia de las cininas que interviene en su respuesta a través del receptor B2. En condiciones patofisiológicas, la bradicinina desencadena múltiples efectos propios de enfermedades respiratorias, como el asma o la rinitis: la contracción del músculo liso, un incremento de la permeabilidad vascular y de la secreción mucosa, así como la estimulación de los nervios colinérgicos y sensitivos. La relación entre las enfermedades respiratorias y la bradicinina fue puesta de manifiesto a través de un estudio que reveló que la inhalación de bradicinina causaba broncoconstricción en personas asmáticas. Posteriormente, se comprobó que la exposición a agentes alergénicos provoca elevados niveles de cininas, tanto a nivel nasal como de bronquios. Además, se comprobó que la broncoconstricción inducida por la bradicinina es inhibida por la acción del antagonista HOE140, un antagonista peptídico selectivo del receptor B2 (3).

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Con el fin de hallar nuevas terapias para el tratamiento de diferentes patologías asociadas al receptor B2, se han desarrollado antagonistas peptídicos y no peptídicos capaces de bloquear la acción de la bradicinina. Entre los antagonistas peptídicos del receptor B2 destaca el ya mencionado HOE140, un antagonista de segunda generación menos susceptible a la digestión enzimática que los antagonistas peptídicos que se habían desarrollado con anterioridad, ya que contiene aminoácidos no naturales en su secuencia aminoacídica. En la actualidad está aprobado para su comercialización para el tratamiento del angioedema hereditario agudo. Otros antagonistas peptídicos destacados son MEN16132 y B-9430. Se han diseñado asimismo antagonistas no peptídicos con una elevada afinidad por el receptor que presentan mejores propiedades como fármacos. Se han desarrollado diferentes grupos de antagonistas no peptídicos que se hallan en fase clínica. Algunos de ellos han demostrado ser efectivos en modelos animales de broncoconstricción y de inflamación de las vías respiratorias, como el grupo de antagonistas descubiertos por investigadores de Fujisawa FR173657 y FR184280, así como los compuestos LF 16-0687 (Anatibant) y MEN16132 (3). Estos compuestos, aunque aún no existen datos sobre su eficacia en humanos, son potencialmente adecuados como futuros agentes terapéuticos para enfermedades respiratorias de tipo inflamatorio (3). Los compuestos descritos en la bibliografía, como se ha mencionado antes, no presentan aún las propiedades óptimas para convertirse en fármacos y, en especial, sus estructuras son muy parecidas entre sí, por lo que es probable que tengan perfiles muy parecidos. Aún es necesario, por tanto, el desarrollo de nuevas estructuras antagonistas de este receptor. Los tres nuevos compuestos antagonistas surgidos como fruto de este trabajo de investigación, abren camino hacia una nueva familia de compuestos con capacidad de regular la activación

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del receptor B2 y, de este modo, a una posible futura aplicación en el tratamiento de enfermedades respiratorias como el asma o la rinitis.

4. Publicaciones 1. Corcho, F. Computational Studies on the Structure and Dynamics of Bioactive Peptides. Tesis doctoral UPC, Barcelona 2004. 2. Filizola M, Llorens O, Carteni-Farina M and Perez, JJ. New Insights into the Conformational Requirements of B2 Bradykinin Antagonism. Bioorg. Med. Chem., 1998. 6 ,1491-1500 3. Abraham, W.M., M. Scuri, and S.G. Farmer. Peptide and non-peptide bradykinin receptor antagonists: role in allergic airway disease. Eur J Pharmacol, 2006. 533, 1215-21.

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