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Reacciones enzimáticas en sistemas homogéneos

Sergio Huerta Ochoa UAM-Iztapalapa

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Cinética enzimática vs mecanismo químico

• Un mecanismo cinético enzimático es el orden de la adición de substrato y liberación de producto en una reacción catalizada enzimáticamente

• Un mecanismo químico es la vía química de conversión de S → P, incluyendo las estructuras de cualquier intermediario

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Mecanismos de enzimas • Mecanismos – los detalles moleculares de las reacciones catalizadas • Los mecanismos enzimáticos son deducidos de: Experimentos cinéticos Estudios estructurales de la proteina Estudios de sistemas modelo no enzimáticos

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Modos químicos de catálisis enzimática Residuos de amino ácidos polares en sitios activos

• La cavidad del sitio activo de una enzima está señalada con amino ácidos hidrofóbicos • Residuos ionizables polares en el sitio activo participan en el mecanismo • Aniones y cationes de ciertos amino ácidos están comunmente involucrados en catálisis

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Aminoácidos más comunes en el sitio activo Cisteina Serina

Histidina Aspartato Glutamato Lisina

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Tipos de mecanismos catalíticos • Catálisis general ácido-base • Catálisis de energía de enlace • Catálisis covalente • Catálisis ión metal

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Catálisis ácido-base Muchas reacciones involucran la formación de intermediarios cargados, normalmente instables. Estos intermediarios pueden estar transientemente estabilizados en un sitio activo de una enzima por la interacción de residuos de amino ácidos actuando como ácidos débiles (donadores de protones) o bases débiles (aceptores de protones). Formas ácido general y base general de los amino ácidos más comunes y mejor caracterizados que están involucrados

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Catálisis ácido-base (cont...) • Los grupos funcionales precedentes potencialmente pueden servir como donadores o aceptores de protones. Esto depende de muchos factores incluyendo la naturaleza molecular del substrato, cualquier cofactor involucrado, y el pH del sitio activo. • Para catálisis ácido-base, la histidina es el amino ácido más versátil debido a su pKa (6.5)

lo cual significa que en la mayoría de las situaciones fisiológicas puede actuar como un donador o aceptor de protones. Generalmente estos amino ácidos interactuarán junto con el substrato, o en conjunción con agua u otros ácidos o bases orgánicas débiles que se encuentran en las células

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Reacciones catalíticas base general • Una base general (B:) puede remover un protón del agua y debido a eso generar el equivalente de OH- en una solución neutral

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Donadores de protones pueden también catalizar reacciones • Un ácido general (BH+) puede donar protones • Un enlace covalente puede romperse más fácilmente si uno de sus átomos está protonado

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Catálisis de energía de enlace • La energía de enlace cuenta para la reducción de la energía de activación de una reacción, y puede ser considerada como un mecanismo catalítico para una reacción. Varios factores catalíticos en el enlace de un substrato y la enzima pueden ser considerados: 1) limitación transiente del movimiento del substrato y la enzima por reducción del movimiento relativo (o entropia) de las dos moléculas, 2) la disrupción de solvatación de la envoltura de agua es termodinámicamente favorable, y 3) los cambios conformacionales del substrato y la enzima. Todos estos factores individualmente o en combinación son utilizados en algún grado por una enzima. Mientras en algunos casos estas fuerzas por si solas cuentan para la catálisis, frecuentemente son componentes de un proceso catalítico complejo involucrando factores discutidos para otros mecanismos catalíticos

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Catálisis covalente Enzyme O-

Enzyme R1

R1 C O

O C O-

R2

Enzyme O-

R2

Enzyme

C O HO

-

R1

R1 H+

R2

O C O O H

H

En la catálisis covalente, la enzima forma un intermediario covalente transiente con el sustrato de la reacción.

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Catálisis covalente •

Este mecanismo involucra el enlace covalente transiente del substrato a un residuo de amino ácido en el sitio activo. Generalmente esto es para el grupo hidroxil de una serina aunque las cadenas laterales de la:

treonina

cisteina

histidina

argenina

y lisina

pueden también estar involucradas

serina

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Catálisis covalente • Todo o parte de un substrato es unido covalentemente a la enzima para formar un reactivo intermediario • El grupo X puede ser transferido de A-X a B en dos etapas via el complejo ES covalente X-E

A-X + E

X-E + A

X-E + B

B-X + E

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La sacarosa fosforilasa exhibe catálisis covalente

Etapa uno: un residuo glucosil es transferido a la enzima *Sacarosa + Enz

Glucosyl-Enz + Fructosa

Etapa dos: la glucosa es donada al fosfato Glucosil-Enz + Pi

Glucosa 1-fosfato + Enz

*(la sacarosa esta compuesta de glucosa y fructosa)

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Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología La quimotripsina usa catálisis covalente para catalizar la hidrólisis de enlaces peptídicos H 2N O H2C

H2N

H

C

H

C NH

H2C

NH C H

H

Ser 195

Ser 195

C O

OH

H2N

C

O C

OH

H 2N

H

C O

NH

H2O

C H

Ser 195

O C

CH3

H C

H 2C

HN

H

O C

C O-

O

HN C

H 2C

Ser 195

C

H H

NH H

O- C O HO

O

C

C O

H2N H C O C CH3 OH H 2N C

O C OH

H CH3

H

O C

C

O-

H

C

H CH3

La Serina 195 en la quimotripsina forma un enlace covalente con el sustrato peptídico durante el rompimiento del enlace peptídico.

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Relative Activity 5

6

7

8 pH

9

10

11

Adapted from Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.162

pH Influences Chymotrypsin Activity

Asp 102

H–N

C

N

H–O–CH2

C C H CH2

Ser 195

His 57

Active Ser

H O C–O–H Asp 102

N

C

N–H

C C H CH2 His 57

- O–CH

2

Ser 195

Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.158

=

O C–O -

=

Charge Relay in Active Site

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pH 6

H

H–N

+

C

N–H

H+

H–N

C

C

pH 7

H

C

C

N C

H

H H

=

O C–O Asp 102

H–N

C

Inactive + N–H H–O–CH2

C C-H CH2

Ser 195

Adapted from Dressler & Potter (2000) Discovering Enzymes, p.163

Planta Piloto de Fermentaciones Imidazole on Histidine Is Affected by pH

His 57 Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.158

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Catálisis ion metal • Cerca de 1/3 de todas las enzimas conocidas requieren la presencia de metales para la actividad catalítica • Las metalo-enzimas - contienen cofactores metálicos fuertemente unidos tales como: Fe 2+ , Fe 3+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Mn 2+ , Co 2+ • Las enzimas activadas por metales – sólo vagamente enlazan los iones metales. Los iones son usualmente : Na + , K + , Mg 2+ , o Ca 2+

• Varios metales, todos positivamente cargados e incluyendo zinc, hierro, magnesio, manganeso y cobre, son conocidos para formar complejos con diferentes enzimas o substratos. Este complejo metal-substrato-enzima puede ayudar en la orientación del substrato en el sitio activo, y los metales son conocidos para mediar en las reacciones de oxidación-reducción por cambios reversibles en sus estados de oxidación (como Fe3+ a Fe2+)

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Resumen de mecanismos catalíticos • En general, más de un tipo de mecanismos catalíticos podrían ocurrir para una enzima particular vía varias combinaciones de catálisis: energías de enlace, ácidobase, covalente y metal. Las enzimas son increiblemente diversas en sus estructuras y los tipos de reacciones que catalizan, por lo tanto hay también una gran diversidad de mecanismos catalíticos utilizados, cuyas bases deben ser determinadas experimentalmente

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Concerted Planta Piloto de Mechanism Fermentaciones of Catalysis Departamento de Biotecnología

Carboxypeptidase A

+

N

(248) Tyr

(270) Glu 3 COO -

H

H O-

C

Substrate peptide chain

4

C

2

O-

ACTIVE SITE

H

N

R

C

Site for specificity 5

O1

His (196)

+ Zn

His (69)

COO Glu (72)

+Arg

C-terminus

Check for C-terminal

(145)

Juang RH (2004) BCbasics

Active site pocket

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Cavidades de enlace de substrato de Quimotripsina y Tripsina

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Mecanismo catalítico de quimotripsina

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Mecanismo de quimotripsina (cont...)

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Quimotripsina, última etapa y regeneración de la enzima activa

Planta Piloto de Fermentaciones Chymotrypsin Catalytic Mechanism A1 Departamento de Biotecnología Catalytic Triad His57 Asp102

Ser195

H

H [HOOC]

C N

C

N H

O C C

C N

O

Check substrate specificity

[NH2] C

Planta Piloto de Fermentaciones Chymotrypsin Catalytic Mechanism A2 Departamento de Biotecnología His57 Asp102

Ser195

H

H

O

First Transition State

Planta Piloto de Fermentaciones Chymotrypsin Catalytic Mechanism A3 Departamento de Biotecnología

H

H

O

Acyl-Enzyme Intermediate

Planta Piloto de Fermentaciones Chymotrypsin Catalytic Mechanism D1 Departamento de Biotecnología

H

O

Acyl-Enzyme Water Intermediate

Planta Piloto de Fermentaciones Chymotrypsin Catalytic Mechanism D2 Departamento de Biotecnología

H

O H

O

Second Transition State

Planta Piloto de Fermentaciones Chymotrypsin Catalytic Mechanism D3 Departamento de Biotecnología

H

O H

O

Deacylation